Name: transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles
Uploaded: 2021-08-12T15:00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

Vi är tacksamma mot Junbeom Lee för att ha tillhandahållit E. coli WM3064 +pRL27-stammen för konjugation och vägledning i förfarandet, Kathrin Hüffmeier för att ha hjälpt till med felsökning under mutantbiblioteksgenerering och prof. André Rodrigues för att stödja insektsinsamling och tillståndsförvärv. Vi tackar också Rebekka Janke och Dagmar Klebsch för stödet vid insamling och uppfödning av insekterna. Vi bekräftar de brasilianska myndigheterna för att bevilja följande tillstånd för tillgång, insamling och export av insektsprover: SISBIO-tillstånd nr 45742-1, 45742-7 och 45742-10, CNPq process nº 01300.004320/2014-21 och 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF och 20BR035212/DF). Denna forskning stöddes av finansiering från German Science Foundation (DFG) Research Grants FL1051/1-1 och KA2846/6-1.

<ol>
	<li>Cain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+advances+in+transposon-insertion+sequencing.">A decade of advances in transposon-insertion sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).</li><li>Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+and+analysis+of+transposon+insertion+sequencing+experiments.">The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).</li><li>Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+querying+bacterial+genomes+with+transposon-insertion+sequencing.">Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing.</a> RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-producing+symbionts+dynamically+transition+between+plant+pathogenicity+and+insect-defensive+mutualism.">Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism.</a> Nature Communications. 8 (1), 15172 (2017).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiont+dynamics+and+strain+diversity+in+the+defensive+mutualism+between+Lagria+beetles+and+Burkholderia.">Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia.</a> Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antifungal+polyketide+associated+with+horizontally+acquired+genes+supports+symbiont-mediated+defense+in+Lagria+villosa+beetles.">An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles.</a> Nature Communications. 9 (1), 2478 (2018).</li><li>. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2012)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FeatureCounts:+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Gayt&#225;n, M. O., Mart&#237;nez-Santos, V. I., Soto, E., Gonz&#225;lez-Pedrajo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+three+secretion+system+in+attaching+and+effacing+pathogens.">Type three secretion system in attaching and effacing pathogens.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129 (2016).</li><li>Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+and+anti-host+effectors.">Type VI secretion and anti-host effectors.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).</li><li>Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+and+bacterial+pathogenicity:+From+molecules+to+disease.">Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease.</a> Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).</li><li>Silva, A. J., Benitez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+biofilms+and+cholera+pathogenesis.">Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330 (2016).</li><li>Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, &. #. 1. 9. 3. ;., Larz&#225;bal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+system+in+pathogenic+Escherichia+coli:+structure,+role+in+virulence,+and+acquisition.">Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1965 (2019).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+Type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068 (2010).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kill+and+cure:+genomic+phylogeny+and+bioactivity+of+Burkholderia+gladioli+bacteria+capable+of+pathogenic+and+beneficial+lifestyles.">Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles.</a> Microbial Genomics. 7 (1), 000515 (2021).</li><li>Takeshita, K., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riptortuspedestris+and+Burkholderia+symbiont:+an+ideal+model+system+for+insect-microbe+symbiotic+associations.">Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations.</a> Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).</li><li>Powell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+host+colonization+determinants+in+a+bacterial+gut+symbiont.">Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).</li><li>Brooks, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+discovery+of+colonization+determinants+in+the+squid+symbiont+Vibrio+fischeri.">Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).</li><li>Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+genetic+manipulation+of+Burkholderia+gladioli+pathovar+cocovenenans.">Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans.</a> BMC Research Notes. 3 (308), (2010).</li><li>Garcia, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+thailandensis:+Genetic+manipulation.">Burkholderia thailandensis: Genetic manipulation.</a> Current Protocols in Microbiology. 45, 1-15 (2017).</li><li>Headd, B., Bradford, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conjugation+window+in+an+Escherichia+coli+K-12+strain+with+an+IncFII+plasmid.">The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid.</a> Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948 (2020).</li><li>Van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+A+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).</li><li>Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-defined+transposon+mutant+library+of+Burkholderia+thailandensis.">Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis.</a> mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).</li><li>Wong, Y. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+essential+genes+in+Burkholderia+cenocepacia+J2315+identified+by+genome-wide+TraDIS.">Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1288 (2016).</li><li>Moule, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+saturation+mutagenesis+of+Burkholderia+pseudomallei+K96243+predicts+essential+genes+and+novel+targets+for+antimicrobial+development.">Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development.</a> mBio. 5 (1), 00926 (2014).</li><li>Ding, Q., Tan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Himar1+transposon+for+efficient+random+mutagenesis+in+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans.">Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1842 (2017).</li><li>Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+site+preference+of+Mu,+Tn5,+and+Tn7+transposons.">Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons.</a> Mobile DNA. 3, 3 (2012).</li><li>Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+Tn5+target+specificity:+Preference+for+insertion+at+G/C+pairs.">Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs.</a> Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).</li><li>Ar&#225; Ujo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+and+transposon+mutagenesis+of+Burkholderia+seminalis+TC3.4.2R3+identify+genes+contributing+to+suppression+of+orchid+necrosis+caused+by+B.+gladioli.">Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli.</a> Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).</li><li>Dobritsa, A. P., Samadpour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reclassification+of+Burkholderiainsecticola+as+Caballeroniainsecticola+comb.+nov.+and+reliability+of+conserved+signature+indels+as+molecular+synapomorphies.">Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).</li><li>Ohbayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect's+intestinal+organ+for+symbiont+sorting.">Insect's intestinal organ for symbiont sorting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).</li><li>Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+conjugated+polyyne+biosynthesis+in+phytopathogenic+bacteria.">The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).</li><li>Atkins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+of+Burkholderia+pseudomallei,+auxotrophic+in+the+branched+chain+amino+acid+biosynthetic+pathway,+is+attenuated+and+protective+in+a+murine+model+of+melioidosis.">A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis.</a> Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt i avseende studien.

Ett B. gladioli transposon mutant bibliotek genererades för att identifiera viktiga värd kolonisering faktorer i symbiotiska interaktionen mellan L. villosa skalbaggar och B. gladioli bakterier. De viktigaste stegen i protokollet var konjugation, värdinfektion, DNA-biblioteksförberedelse och sekvensering.
Eftersom många stammar av Burkholderia är mottagliga för genetisk modifiering genom konjugation24,25, plasmiden som bär transposon och antibiotikainsättningskassett konjugerades framgångsrikt i mål B. gladioli Lv-StA stam från E. coli. Tidigare försök till omvandling genom elektroporation gav mycket låg till nästan inga B. gladioli transformanter. Det är lämpligt att optimera omvandlingstekniken för målorganismen för att effektivt ge ett stort antal transformatorer.
En omgång konjugation och 40 konjugationsfläckar störde 3 736 gener i B. gladioli Lv-StA. Med facit i hand skulle flera konjugationsrundor vara nödvändiga för att störa de flesta av de 7 468 generna och få ett mättat bibliotek. Särskilt fick inkubationstiden under konjugation inte överstiga 12-18 h, vilket är slutet på den exponentiella tillväxtfasen av B. gladioli. Att tillåta konjugation bortom bakteriecellernas exponentiella tillväxtfas minskar chanserna att lyckas få transkonjuganter26. Därför bör konjugationsperioden justeras efter bakteriearternas tillväxt.
För att framgångsrikt utföra ett experiment som involverar infektion av mutantbibliotek i en värd är det viktigt att bedöma bakteriepopulationens flaskhalsstorlek under koloniseringen och mångfalden av mutanter i biblioteket före infektion1,2,27. Som förberedelse för experimentet uppskattade vi det minsta antalet skalbaggar som måste infekteras för att ha en hög chans att varje mutant i biblioteket provtas och får kolonisera. Den ungefärliga bakteriegenereringstiden in vivo och antalet generationer under experimentets varaktighet beräknades också. In vitro-kulturen växte sedan upp till ett jämförbart antal generationer genom att justera inkubationstiden. För ett liknande infektionsexperiment hos andra icke-modellvärdar är förmågan att upprätthålla en laboratoriekultur och en konstant källa till värdorganismerna önskvärd.
Efter tillväxten av mutanta biblioteket in vivo och in vitro och prov samling, genomfördes ett modifierat DNA bibliotek förberedelse protokoll för transposon insättning sekvensering. Ändringen i protokollet innebar att designa anpassade PCR-primers och lägga till PCR-steg för att välja för DNA-fragment som innehåller insättningskassetten. Eftersom protokollet har anpassats ökade ytterligare PCR-cykler i protokollet risken för överamplifiering och erhållande av hybridiserade nätverkskortsfragment i slutbiblioteken. Därför rekommenderas ett slutligt rensningssteg (utan storleksval) efter de två PCR: erna, eftersom det hjälper till att ta bort dessa fragment. Storleksfördelningen av DNA-biblioteken var fortfarande bredare än väntat. Att öka sekvenseringsdjupet gav dock tillräckliga data som filtrerades under bioinformatikanalysen, vilket gav tillfredsställande resultat.
Eftersom transposonmedierad mutagenes genererar tusentals slumpmässiga införanden i ett enda experiment är det möjligt att generera ett mättat bibliotek av mutanter som innehåller alla utom de mutanter där gener som är väsentliga för bakterietillväxt har störts. Vi fungerade troligen inte med ett mättat mutantbibliotek, med tanke på uppskattningarna av väsentliga gener i andra studier på Burkholderia sp. 28,29. Ett icke-mättat bibliotek hjälper ändå till att utforska olika kandidatgener för ytterligare studier med hjälp av riktad mutagenes. Före experimenten är det också viktigt att komma ihåg att vissa transposoner har specifika insättningsmålplatser som ökar överflödet av mutanter vid vissa lokus igenomet 30. Mariner transpoons är kända för att rikta in sig på AT-platser för insättning31, och Tn5 transposoner har en GC bias32,33. Att inkludera steg under bioinformatikanalys för att känna igen hotspots för transposoninfogningar hjälper till att bedöma eventuella distributionsfördomar.
Även om det är utsatt för bakslag kan ett väl utformat transposoninsättningssekvenseringsexperiment vara ett kraftfullt verktyg för att identifiera många villkorligt viktiga gener i bakterier inom ett enda experiment. Till exempel identifierades ett dussin gener i Burkholderia seminalis viktigt för undertryckandet av orkidéblad nekros genom att kombinera transposon mutagenes och genomik34. Bortom Burkholderiahar flera vidhäftnings- och motilitetsgener och transportörer identifierats som viktiga koloniseringsfaktorer i Snodgrassella alvi symbionter av Apis mellifera (Honeybee)22, och i Vibrio fischerii symbionts av Euprymna scolopes (Hawaiian bobtail squid)23 med hjälp av transposon-insertion mutagenesis strategi.
Som ett alternativt tillvägagångssätt kan transposon mutagenesis följas av screening för enskilda mutanter med selektiva medier istället för sekvensering. Fenotypisk screening eller bioassays för att identifiera brister, såsom motility, produktion av bioaktiva sekundära metaboliter, eller specifika auxotrophies, är genomförbara. Till exempel har screening av en Burkholderia insecticola (omplacerad till släktet Caballeronia35) transposon mutantbibliotek varit nyckeln till att identifiera att symbionterna använder motilitetsgener för att kolonisera Riptortus piedestris, deras insekt värd36. Med hjälp av transposon mutagenes och fenotypisk screening identifierades dessutom det biosyntetiska genklustret för den bioaktiva sekundära metaboliten caryoynencin i Burkholderia caryophylli37. En auxotrophic mutant av Burkholderia pseudomallei identifierades efter transposon mutagenes och screening och är en möjlig försvagad vaccin kandidat mot melioidosis, en farlig sjukdom hos människor och djur38. Således är transposon mutagenes och sekvensering ett värdefullt tillvägagångssätt för att studera de molekylära egenskaperna hos bakterier som är viktiga för interaktionerna med sina respektive värdar i patogena eller mutualistiska associationer.

Burkholderia gladioli kan delta i en symbiotisk associering med Lagria villosabaggar, som spelar en viktig roll i försvaret mot mikrobiella antagonister hos insektsvärden4,5,6. Kvinnliga skalbaggar hus flera stammar av B. gladioli i specialiserade körtlar tillbehör till reproduktionssystemet. Vid äggläggning utstryker kvinnor B. gladioliceller på äggytan där antimikrobiella föreningar som produceras av B. gladioli hämmar infektioner av entomopathogenicsvampar 4,6. Under sen embryonal utveckling eller tidigt efter larvernas kläckning koloniserar bakterierna cuticular invaginations på larvernas dorsala yta. Trots denna specialiserade lokalisering och vertikala överföringsväg av symbionterna, kan L. villosa förmodligen också förvärva B. gladioli horisontellt från miljön4. Dessutom har minst tre stammar av B. gladioli hittats i samband med L. villosa4,6. Bland dessa är B. gladioli Lv-StA den enda som är mottaglig för odling in vitro.
B. gladioli (född 1977) Lv-StA har en genomstorlek på 8,56 Mb6 och innehåller 7 468 gener. Vilka av dessa gener är viktiga för B. gladioli bakterier att kolonisera skalbaggen värd? För att svara på denna fråga använde vi transposon-insättningssekvensering (Tn-seq), en explorativ metod för att identifiera villkorligt väsentliga mikrobiella gener1,2,3. Ett mutantt bibliotek av B. gladioli Lv-StA skapades med hjälp av en Tn5 transposon. Genom konjugation från Escherichia coli donatorceller till B. gladioli Lv-StA överfördes en pRL27 plasmid som bär Tn5 transposon och en antibiotikaresistenskassett flankerad av inverterade upprepningar (Figur 1). Därmed genererades en uppsättning mutanter som individuellt bär störningar av 3 736 symbionta gener (figur 2).
Mutantpoolen smittades på skalbaggeägg för att identifiera koloniseringsfaktorerna och odlades som en kontroll också in vitro i King's B (KB) medium. Efter att ha tillåtit tillräckligt med tid för kolonisering samlades kläckta larver och poolades för DNA-extraktion. Fragment av DNA som innehåller transposoninsatsen och den flankerande genomiska regionen B. gladioli Lv-StA valdes med hjälp av ett modifierat DNA-biblioteksprepareringsprotokoll för sekvensering. Läskvalitetsbearbetning följt av analys med DESeq2 utfördes för att identifiera specifika gener som är avgörande för B. gladioli Lv-StA att kolonisera L. villosa larver när de överförs via äggytan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6- Diaminopimelic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22391</td>
			<td>For E.coli WM3064+ pRL27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>Size selection in step 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (NaOCl) 12%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2 v.2.4.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer-S</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>For PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutadapt v.2.10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T834.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>R0182</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Di-Sodium salt</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC v.0.11.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts v.2.0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>7530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>26899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PO27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (soybean)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2365</td>
			<td>For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD &#39;Hot&#39; Taq- DNA Polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 145 x 20 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>XH90.1</td>
			<td>For selecting transconjugants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 90 x 16 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>N221.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Quality check after DNA library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HP57.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v.0.36</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris -HCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9090.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2366</td>
			<td>For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>GM 70 HD</td>
			<td>For shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Ligation step 6.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles

Att härleda genens funktion genom att manipulera deras aktivitet är ett viktigt verktyg för att förstå de genetiska grunderna för de flesta biologiska processer. Framsteg inom molekylär mikrobiologi har sett framväxten av olika mutagenestekniker för manipulering av gener. Bland dem är transposon-insättningssekvensering (Tn-seq) ett värdefullt verktyg för att samtidigt bedöma funktionaliteten hos många kandidatgener på ett obefläckat sätt. Tekniken har varit nyckeln till att identifiera molekylära mekanismer för kolonisering av eukaryota värdar i flera patogena mikrober och några fördelaktiga symbionter.
Här är Tn-seq etablerad som en metod för att identifiera koloniseringsfaktorer i en mutualistisk Burkholderia gladioli symbiont av skalbaggen Lagria villosa. Genom konjugation utförs Tn5 transposonmedierad insättning av en antibiotikaresistenskassett på slumpmässiga genomiska platser i B. gladioli. För att identifiera effekten av genstörningar på bakteriernas förmåga att kolonisera skalbaggens värd, vaccinerar det genererade B. gladioli transposon-mutantbiblioteket på skalbaggeäggen, medan en kontroll odlas in vitro i ett flytande odlingsmedium. Efter att ha tillåtit tillräckligt med tid för kolonisering extraheras DNA från in vivo- och in vitro-odlade bibliotek. Efter ett DNA-biblioteksprepareringsprotokoll förbereds DNA-proverna för transposoninsättningssekvensering. DNA-fragment som innehåller transposon-insert kanten och flankerande bakteriellt DNA väljs, och mutationsplatserna bestäms genom sekvensering bort från transposon-insert kanten. Slutligen, genom att analysera och jämföra frekvenserna för varje mutant mellan in vivo- och in vitro-biblioteken, kan vikten av specifika symbionta gener under skalbaggekoloniseringen förutsägas.

Värdrelaterade bakterier kan använda flera faktorer för att upprätta en association, inklusive de medlande vidhäftning, motilitet, kemotaxis, stressresponser eller specifika transportörer. Medan faktorer som är viktiga för patogen-värd interaktioner har rapporterats för flera bakterier13,14,15,16,17,18, inklusive medlemmar av släktet Burkholderia19,20, färre studier har utforskat de molekylära mekanismerna som används av fördelaktiga symbionter för kolonisering21,22,23 . Med hjälp av transposon insättningssekvensering, syftet var att identifiera molekylära faktorer som gör det möjligt för B. gladioli att kolonisera L. villosa skalbaggar.
Transposon-medierad mutagenes utfördes med pRL27 plasmid, som bär en Tn5 transposon och en kanamycin motstånd kassett flankerad av inverterade repetition platser. Plasmiden introducerades i mål B. gladioli Lv-StA-cellerna genom konjugation med plasmiddonatorn E. coli WM3064-stammen (som visas i figur 1). Efter konjugation, konjugation blandning som innehåller B. gladioli mottagare och E. coli givaren celler pläterades på selektiva agar plattor som innehåller kanamycin. Frånvaron av DAP på plattorna eliminerade givaren E. coli celler, och förekomsten av kanamycin valt för framgångsrika B. gladioli Lv-StA transconjugants. Det poolade B. gladioli Lv-StA mutantbiblioteket som erhållits genom att skörda de 100 000 transkonjuganta kolonierna förbereddes för sekvensering med hjälp av ett modifierat DNA-biblioteksberedningskit och anpassade primers. Figur 2 belyser förberedelsestegen för DNA-biblioteket. Sekvensering gav 4 Mio parade läsningar; 3 736 gener av 7 468 gener i B. gladioli Lv-StA stördes.
För att identifiera mutanter som var koloniserings-defekta i värden smittades B. gladioli Lv-StA mutantbiblioteket på skalbaggeäggen och odlades in vitro i KB medium som en kontroll. Flaskhalsstorleken in vivo-koloniseringen beräknades före experimentet. Ett känt antal B. gladioli Lv-StA celler smittades på skalbagge ägg, och antalet koloniserande celler i nykläckta första instar larver erhölls genom plätering en suspension från varje larva och räkna kolonibildande enheter per individ. Dessa beräkningar gjordes för att säkerställa att antalet koloniserande celler är tillräckligt för att bedöma hela eller en hög andel av mutanterna i biblioteket för deras förmåga att kolonisera värden. Dessutom normaliserades tillväxttiden mellan in vitro- och in vivo-tillstånd baserat på antalet bakteriegenerationer för att göra dessa prover jämförbara.
Efter att äggen kläckts samlades 1 296 larver i 13 pooler. Motsvarande in vitro-mutantkulturer odlades och lagrades som glycerolbestånd. DNA från in vivo och in vitro odlade mutant bibliotek extraherades och fragmenteras i en ultraljudsbehandling. Figur 3 visar storleksfördelningen av det savda DNA:t, där majoriteten av fragmenten sträcker sig mellan 100 och 400 bp, som förväntat. Detta steg följdes av det modifierade DNA-bibliotekets förberedelseprotokoll för sekvensering. Vid varje steg i protokollet kontrollerades koncentrationen av återstående DNA för att säkerställa att stegen utfördes korrekt och för att spåra förluster av DNA. En kvalitetskontroll (se materialförteckningen)före sekvenseringen visade att DNA-biblioteken innehöll oväntat stora (>800 bp) DNA-fragment, och detta var mer uttalat i in vivo-biblioteken. Med tanke på svårigheten att optimera klustring av fragment i sekvenseringsbanorna var det nödvändigt att öka sekvenseringsdjupet till 10 Mio-parade läsningar i in vivo-biblioteken för att uppnå önskat antal läsningar. Analysen av sekvenseringsresultaten visade att i genomsnitt 4 miljoner läser i in vivo-biblioteken och 3,1 Mio läser i in vitro-biblioteken innehöll Transposon-kanten i 5' slutet av Läs-1 (Tabell 9), vilket var tillfredsställande för detta experiment. Fördelningen av de 24 224 unika insättningarna över B. gladioligenomet i det ursprungliga biblioteket visas i figur 4. En analys utförd med DESeq2 visade att överflöd av 271 mutanter var betydligt olika mellan in vivo- och in vitro-förhållandena. 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig03.jpg"> Figur 3:Agarosageler från en mutant-och DNA-bibliotek. Gelmedavsjuvt DNA-bibliotek. Stegens bandstorlekar i det första körfältet anges på vänster sida. De tre första körfälten a, b och c innehåller uppsaxade DNA-fragment från in vivobiblioteken . Körfält d, e, f och g innehåller uppsjutna DNA-fragment av in vitro-biblioteken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig04.jpg"> Figur 4: Placering av unika insättningsplatser i det ursprungliga biblioteket över de fyra repliconerna i Burkholderia gladioli Lv-StA-genomet. Varje stapel längs x-axeln finns på en insättningsplats. Höjden på en stapel längs y-axeln motsvarar antalet läsningar som är associerade med den platsen. Observera att de två kromosomerna och två plasmiderna visas i full längd och därmed har olika skalor på x-axeln. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Kungens B-medium/ agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptone (sojaböna)</td>
			<td>20 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>1,5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>1,5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agar</td>
			<td>15 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Upplöst i destillerat vatten</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">LB medium/agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tryptone (olika)</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Jästextrakt</td>
			<td>5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl (NaCl)</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Upplöst i destillerat vatten</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Mediekomponenter.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nej.</td>
			<td>Grundfärger</td>
			<td colspan="2">Sekvens</td>
			<td>PCR glödgningstemperatur. (°C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>tpnRL17–1RC</td>
			<td colspan="2">5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3'</td>
			<td rowspan="2">58.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>tpnRL13–2RC</td>
			<td colspan="2">5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Primers för att bekräfta framgången med konjugation.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponent</td>
			<td>Volym (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HPLC-renat vatten</td>
			<td>4.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x buffert S (hög specificitet)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP (2 mM)</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 1 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 2 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq (5 U/μL)</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mastermix totalt</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mall</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: PCR master mix för att bekräfta framgången med konjugation. Förkortningar: HPLC = högpresterande vätskekromatografi; dNTPs = deoxynucleoside triphosphate.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trappsteg</td>
			<td>Temperatur °C</td>
			<td>Tid</td>
			<td>Cykler</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inledande denaturering</td>
			<td>95</td>
			<td>3 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturering</td>
			<td>95</td>
			<td>40-talet</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Glödgning</td>
			<td>58.2</td>
			<td>40-talet</td>
			<td>30 till 35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Förlängning</td>
			<td>72</td>
			<td>1-2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Slutlig förlängning</td>
			<td>72</td>
			<td>4 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hålla</td>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 4: PCR-villkor för att bekräfta konjugeringens framgång.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Grundfärger</td>
			<td colspan="2">Sekvens</td>
			<td>Tm °C</td>
			<td>Använda</td>
			<td>Källa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transposonspecifik biotinylerad primer</td>
			<td colspan="2">5'-Biotin-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3'</td>
			<td>63.5</td>
			<td>6.7.1. PCR I</td>
			<td>Sed</td>
		</tr>
<tr>
<td>Modifierad universell PCR-primer</td>
			<td colspan="2">5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3'</td>
			<td>62</td>
			<td>6.10.1. PCR II</td>
			<td>Sed</td>
		</tr>
<tr>
<td>Index primer</td>
			<td colspan="3">Se tillverkarens handbok</td>
			<td>6.7.1. PCR I & 6.10.1. PCR II</td>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos för Illumina (Indexprimrar set 1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adapter</td>
			<td colspan="3">Se tillverkarens handbok</td>
			<td>6.5. Adapter ligatur</td>
			<td>NEBNext Ultra II DNA-biblioteksförberedelsesats för Illumina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 5: Primers och adapter för PCR I och II under FÖRBEREDELSE AV DNA-bibliotek. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PCR-blandning</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adapter-ligated DNA-fragment</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Ultra II Q5 master mix</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indexprimer (10 pmol/ μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transposonspecifik biotinylerad primer (10 pmol/ μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total volym</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 6: FÖRBEREDELSE AV DNA-bibliotek-PCR I master mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trappsteg</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Tid</td>
			<td>Cykler</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inledande denaturering</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturering</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">6 till 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glödgning</td>
			<td>65 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Förlängning</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Slutlig förlängning</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hålla</td>
			<td>16 °C</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 7: FÖRBEREDELSE AV DNA-bibliotek-PCR I- och II-förhållanden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PCR-blandning</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pärlvalt DNA</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Ultra II Q5 master mix</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Index primer</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Modifierad universell PCR-primer</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total volym</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 8: FÖRBEREDELSE AV DNA-bibliotek-PCR II master mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Bibliotek</td>
			<td>Invivo-1</td>
			<td>Invivo-2</td>
			<td>Invivo-3</td>
			<td>Invitro-1 (olika)</td>
			<td>Invitro-2 (olika)</td>
			<td>Invitro-3 (olika)</td>
			<td>Ursprungligt bibliotek</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Nej. av läsningar (PE)</td>
			<td>56,57,710</td>
			<td>39,19,051</td>
			<td>30,65,849</td>
			<td>35,73,494</td>
			<td>28,83,440</td>
			<td>36,61,956</td>
			<td>46,09,410</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Nej. av läsningar som innehåller Tn – kant i 5' slutet av Läs-1</td>
			<td>54,15,880</td>
			<td>37,31,169</td>
			<td>29,36,247</td>
			<td>33,00,499</td>
			<td>27,35,705</td>
			<td>33,50,402</td>
			<td>41,53,270</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bowtie2 total inriktningshastighet (%) (endast skriv-1)</td>
			<td>95.53%</td>
			<td>83.71%</td>
			<td>89.87%</td>
			<td>80.79%</td>
			<td>78.00%</td>
			<td>73.06%</td>
			<td>74.92%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antal unika infogningar</td>
			<td>8,539</td>
			<td>4,134</td>
			<td>7,183</td>
			<td>18,930</td>
			<td>18,421</td>
			<td>20,438</td>
			<td>24,224</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antal gener som drabbats</td>
			<td>1575</td>
			<td>993</td>
			<td>1450</td>
			<td>2793</td>
			<td>2597</td>
			<td>3037</td>
			<td>3736</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 9: Sammanfattning av sekvenseringsutgång och transposoninsättningsfrekvens per bibliotek. Förkortning: PE = paired-end.

Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Detta är en anpassad metod för att identifiera kandidat insekt kolonisering faktorer i en Burkholderia fördelaktig symbiont. Skalbaggen värd är infekterad med ett slumpmässigt mutantbibliotek genereras via transposon mutagenes, och bibliotekets komplexitet efter kolonisering jämförs med en kontroll som odlas in vitro.

Transposon-insättningssekvensering som ett verktyg för att belysa bakteriekoloniseringsfaktorer i en Burkholderia gladioli Symbiont av Lagria villosa Beetles

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

Detta protokoll är användbart för att utföra genetisk manipulation på symbiotiska bakterier, i detta fall specifikt på Burkholderia, och identifiera de gener som är väsentliga för att kolonisera en insektsvärd. Transposon insättningssekvensering är ett kraftfullt verktyg för att identifiera ett stort antal villkorligt väsentliga gener samtidigt i ett enda experiment. Börja med att vaccinera en ny donatorkultur av E.coli-donator i 10 milliliter LB-medium kompletterat med Kanamycin och DAP under en steril huva.Inokulera Burkholderia gladioli stam A mottagarceller i fem milliliter KB medium. Inkubera kulturerna vid 30 grader Celsius över natten på en shaker vid 250 RPM. Efter över natten tillväxt, centrifugera fyra milliliter av var och en av kulturerna vid 9, 600 gånger G i sex minuter för att pelleta cellerna och kassera supernatanten.Tvätta de pelleterade cellkulturerna i KB-medium som innehåller DAP under en steril huva. Och slutligen, återanvänd kulturerna separat i fyra milliliter KB plus DAP medium. Blanda 250 mikroliter av de tvättade E.coli-donatorcellerna med en milliliter av den tvättade Burkholderia gladioli-stammen A-mottagarcellerna i ett färskt rör på 15 milliliter.Spot 10 mikroliter av denna konjugationscellblandning på KB agarplattor som innehåller DAP. Låt plattan vila ostört i den sterila huven i rumstemperatur i en timme. Inkubera plattorna med konjugationsfläckarna vid 30 grader Celsius i 12 till 18 timmar.Efter inkubation, tillsätt två till fyra milliliter 1X PBS på plattorna under en steril huva och använd en cellskrapa för att frigöra de odlade bakteriella konjugationsfläckarna från agaren. Sedan pipett den konjugerade cellblandningen i två milliliter mikrofugerör. Pellet cellerna genom att centrifugera vid 9, 600 gånger G i två minuter.Kassera supernaten och tvätta pelleten två gånger i en milliliter 1X PBS genom att leda upp och ner. Återanvänd den slutliga pelleten i 1 200 mikroliter 1X PBS. Blanda väl och sprid 100 mikroliter av cellblandningen på stora KB-agarplattor kompletterade med Kanamycin och inkubera vid 30 grader Celsius över natten.Räkna det totala antalet transkonjuganta kolonier på de tre plattorna och extrapolera för att beräkna det ungefärliga antalet mutanter som erhållits i alla plattor. För att öka chanserna att få ett representativt bibliotek, se till att det totala antalet kolonier är flera gånger högre än det totala antalet gener i genomet. För att bekräfta konjugationens framgång, utför en PCR som riktar in sig på insättningskassetten med hjälp av 10 till 20 provkolonier som beskrivs i manuskriptet.Skrapa kolonierna från plattorna under en steril huva genom att lägga till en till två milliliter 1X PBS på agaren. Slå ihop cellblandningen som skrapats bort från plattorna till 50 milliliter rör. Virvelbiblioteket att blanda noggrant, och sedan dela en milliliter av det poolade mutantbiblioteket i flera cryo-rör.Tillsätt en milliliter 70% glycerol till rören och förvara vid minus 80 grader Celsius. Välj en L.villosa äggkoppling och räkna antalet ägg som fortsätter om kopplingen innehåller mer än 100 ägg. För att sterilisera hela äggkopplingen, tillsätt 200 mikroliter 70% etanol och tvätta försiktigt äggen i fem minuter, ta sedan bort etanolen och tvätta äggen två gånger med autoklaverat vatten.Tillsätt 200 mikroliter med 12% blekmedel och tvätta försiktigt äggen i 30 sekunder. Ta omedelbart bort blekmedlet och tvätta äggen igen tre gånger med 200 mikroliter autoklaverat vatten. Infektera äggen i den steriliserade äggkopplingen med två gånger 10 till de sex cellerna per mikroliter i det tvättade mutantbiblioteket i PBS.Två dagar efter att de infekterade skalbaggslarverna kläcker, samla 100 sekunder instar larver per 1,5 milliliter mikrofugerör och lagra vid minus 80 grader Celsius. För att generera in vitro-kontrollbiblioteket, inokulera 250 mikroliter på två gånger 10 till de sex cellerna per mikroliter i mutantbiblioteket i 10 milliliter KB-medium som innehåller Kanamycin. Efter att ha extraherat DNA från in vivo och in vitro odlade mutanta bibliotek, dela DNA med en ultraljudspump.För att kontrollera om DNA:t var uppstjutet till önskat storleksområde, ladda fem mikroliter av det oskadliga och uppsvjutna DNA:t efter blandning med gelbelastningsfärgning i ett 1-till-1-förhållande på en 1,6%agarose gel som körs vid 250 volt i 40 minuter. För att förbereda de fragmentändar som krävs för adapterligering, börja med att lägga till tre mikroliter av enzymblandningen och sju mikroliter reaktionsbuffert till 50 mikroliter av det savda DNA:t och blanda väl genom pipetting. Ställ in en termocyklist med ett uppvärmt lock på mer än eller lika med 75 grader Celsius och inkubera proverna i 30 minuter vid 20 grader Celsius och 30 minuter vid 65 grader Celsius och håll sedan temperaturen vid fyra grader Celsius.För adapterligning, tillsätt 30 mikroliter ligation master mix, en mikroliter ligation förstärkare och 2,5 mikroliter utspädd adapter till produkterna i slutprepareringssteget. Blanda noggrant genom att pipetting och inkubera provet i 15 minuter vid 20 grader Celsius i termocyklisten med det uppvärmda locket av. Efter 15 minuter tillsätt tre mikroliter av enzymet.Blanda väl genom att pipetting och inkubera provet i 15 minuter vid 37 grader Celsius i en termocyklist med locket uppvärmt på större än eller lika med 47 grader Celsius. Om du vill välja storleken på adaptern ligated DNA-målfragment på 250 baspar börjar du med att virka den magnetiska pärllösningen och placera den vid rumstemperatur i 30 minuter före användning. Tillsätt 0,3 gånger pärlor till 96,5 mikroliter av den ligaterade DNA-blandningen och blanda genom pipettering noggrant.Inkubera pärlblandningen i fem minuter. Placera rören på ett magnetiskt stativ för att dra ner pärlorna och ta bort DNA-fragment av oönskad storlek. Låt pärlorna sätta sig i fem minuter och överför sedan den klara supernaten till ett nytt mikrofugerör.Tillsätt 0,15 gånger färska pärlor till supernaten och blanda genom att pipetting väl. Inkubera pärlblandningen i fem minuter och placera sedan rören på ett magnetiskt stativ för att dra ner pärlor som är bundna till mål-DNA. Vänta i fem minuter och kassera sedan supernaten och behållit pärlorna.Med pärlorna på magnetstativet, tillsätt 200 mikroliter nyberedd 80% etanol och vänta i 30 sekunder innan du kasserar etanolen utan att störa pärlorna. Ta bort rören från stativet och tillsätt 17 mikroliter 0,1X TE eller Low TE, blanda sedan genom att pipetting 10 gånger och inkubera blandningen vid rumstemperatur i två minuter. Placera röret på magnetstativet och ta 15 mikroliter av det storleksvalda DNA:t för PCR-1.Vortex streptavidin pärlor och placera dem i rumstemperatur i minst 30 minuter. Ta 32 mikroliter av pärlorna och tvätta dem med 500 mikroliter 1X bindning och tvättbuffert. Tillsätt 32 mikroliter 2X bindning och tvätta bufferten och återanvänd pärlorna.Lägg till 32 mikroliter av de rengjorda PCR-1-produkterna. Blanda noggrant och inkubera i rumstemperatur i 30 minuter. Placera pärlans DNA-blandning på ett magnetiskt stativ i två minuter.Pipetten ut supernatanten som biotin-märkt DNA som innehåller insättningskanten binder till streptavidin på pärlorna. Tvätta pärlorna med 500 mikroliter 1X bindning och tvättbuffert och tvätta sedan pärlorna med 200 mikroliter låg TE. Återanvänd de DNA-bundna pärlor i 17 mikroliter låg TE. DNA från in vivo och in vitro odlade mutanta bibliotek extraheras och fragmenteras i en ultraljudspump visade majoriteten av fragmenten spänner mellan 100 och 400 baspar. Platsen för transposon-medierade infogningar över de fyra replicons av Burkholderia gladioli stam En genom kan observeras i kapseln.En sammanfattning av sekvenseringsutgången och antalet unika infogningar och gener som träffar i de tre replikerade in vivo- och in vitro-biblioteken kan observeras i tabellen. Det viktiga att komma ihåg är att beräkna befolkningens flaskhalsstorlek under värdkoloniseringen för att få en lämplig representation av biblioteket under infektionen. Justera också för ett kompatibelt antal bakteriegenerationer in vitro och i värden.Efter att ha genererat transposon mutant biblioteket, Det kan screenas på selektiva medier för att återställa mutanter baserat på fenotypiska skillnader. Specifika gener som är viktiga för ett tillstånd kan därmed identifieras.

Research

JoVE Journal

Biology

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Användning av Rotorod som en metod för kvalitativ analys av Walking i Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Ett mikroflödessystem enhet för att kvantifiera Bakteriella chemotaxis i stabila koncentrationsgradienter

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Korrelat ljus-och elektronmikroskopi (FÖRHUNGRA) som ett verktyg för att visualisera mikroinjiceras molekyler och deras Eukaryota Sub-cellulära mål


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic Biotest som screeningmetod för flyktiga ämnen värdväxt

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

BÄST: Barcode Enabled sekvensering av Tetrads

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

C-FOS Protein Immunohistological Detection: ett användbart verktyg som en markör centralbanks involverade i specifika fysiologiska reaktioner<em&gt; In Vivo</em&gt; och<em&gt; Ex vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

En enkel Bioanalys för utvärdering av Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection (LAM) som ett verktyg för transkriptions Profilering av enskilda celltyper

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...