Name: transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles
Uploaded: 2021-08-12T15:00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

Prosedürde konjugasyon ve rehberlik için E. coli WM3064 +pRL27 suşu sağladığı için Junbeom Lee'ye, mutant kütüphane üretimi sırasında sorun gidermeye yardımcı olduğu için Kathrin Hüffmeier'e ve böcek toplama ve izin alımını desteklediği için Prof. André Rodrigues'e minnettarız. Ayrıca Rebekka Janke ve Dagmar Klebsch'e böceklerin toplanması ve yetiştirisinde destekleri için teşekkür ediyoruz. Brezilyalı yetkilileri böcek örneklerine erişim, toplama ve ihracat için aşağıdaki izinleri verdiği için kabul ediyoruz: SISBIO yetkilendirme Nr. 45742-1, 45742-7 ve 45742-10, CNPq süreci nº 01300.004320/2014-21 ve 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF ve 20BR035212/DF). Bu araştırma, Alman Bilim Vakfı (DFG) Araştırma Hibeleri FL1051/1-1 ve KA2846/6-1 tarafından finanse edildi.

<ol>
	<li>Cain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+advances+in+transposon-insertion+sequencing.">A decade of advances in transposon-insertion sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).</li><li>Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+and+analysis+of+transposon+insertion+sequencing+experiments.">The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).</li><li>Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+querying+bacterial+genomes+with+transposon-insertion+sequencing.">Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing.</a> RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-producing+symbionts+dynamically+transition+between+plant+pathogenicity+and+insect-defensive+mutualism.">Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism.</a> Nature Communications. 8 (1), 15172 (2017).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiont+dynamics+and+strain+diversity+in+the+defensive+mutualism+between+Lagria+beetles+and+Burkholderia.">Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia.</a> Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antifungal+polyketide+associated+with+horizontally+acquired+genes+supports+symbiont-mediated+defense+in+Lagria+villosa+beetles.">An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles.</a> Nature Communications. 9 (1), 2478 (2018).</li><li>. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2012)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FeatureCounts:+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Gayt&#225;n, M. O., Mart&#237;nez-Santos, V. I., Soto, E., Gonz&#225;lez-Pedrajo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+three+secretion+system+in+attaching+and+effacing+pathogens.">Type three secretion system in attaching and effacing pathogens.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129 (2016).</li><li>Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+and+anti-host+effectors.">Type VI secretion and anti-host effectors.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).</li><li>Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+and+bacterial+pathogenicity:+From+molecules+to+disease.">Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease.</a> Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).</li><li>Silva, A. J., Benitez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+biofilms+and+cholera+pathogenesis.">Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330 (2016).</li><li>Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, &. #. 1. 9. 3. ;., Larz&#225;bal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+system+in+pathogenic+Escherichia+coli:+structure,+role+in+virulence,+and+acquisition.">Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1965 (2019).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+Type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068 (2010).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kill+and+cure:+genomic+phylogeny+and+bioactivity+of+Burkholderia+gladioli+bacteria+capable+of+pathogenic+and+beneficial+lifestyles.">Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles.</a> Microbial Genomics. 7 (1), 000515 (2021).</li><li>Takeshita, K., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riptortuspedestris+and+Burkholderia+symbiont:+an+ideal+model+system+for+insect-microbe+symbiotic+associations.">Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations.</a> Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).</li><li>Powell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+host+colonization+determinants+in+a+bacterial+gut+symbiont.">Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).</li><li>Brooks, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+discovery+of+colonization+determinants+in+the+squid+symbiont+Vibrio+fischeri.">Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).</li><li>Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+genetic+manipulation+of+Burkholderia+gladioli+pathovar+cocovenenans.">Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans.</a> BMC Research Notes. 3 (308), (2010).</li><li>Garcia, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+thailandensis:+Genetic+manipulation.">Burkholderia thailandensis: Genetic manipulation.</a> Current Protocols in Microbiology. 45, 1-15 (2017).</li><li>Headd, B., Bradford, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conjugation+window+in+an+Escherichia+coli+K-12+strain+with+an+IncFII+plasmid.">The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid.</a> Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948 (2020).</li><li>Van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+A+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).</li><li>Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-defined+transposon+mutant+library+of+Burkholderia+thailandensis.">Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis.</a> mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).</li><li>Wong, Y. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+essential+genes+in+Burkholderia+cenocepacia+J2315+identified+by+genome-wide+TraDIS.">Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1288 (2016).</li><li>Moule, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+saturation+mutagenesis+of+Burkholderia+pseudomallei+K96243+predicts+essential+genes+and+novel+targets+for+antimicrobial+development.">Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development.</a> mBio. 5 (1), 00926 (2014).</li><li>Ding, Q., Tan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Himar1+transposon+for+efficient+random+mutagenesis+in+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans.">Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1842 (2017).</li><li>Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+site+preference+of+Mu,+Tn5,+and+Tn7+transposons.">Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons.</a> Mobile DNA. 3, 3 (2012).</li><li>Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+Tn5+target+specificity:+Preference+for+insertion+at+G/C+pairs.">Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs.</a> Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).</li><li>Ar&#225; Ujo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+and+transposon+mutagenesis+of+Burkholderia+seminalis+TC3.4.2R3+identify+genes+contributing+to+suppression+of+orchid+necrosis+caused+by+B.+gladioli.">Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli.</a> Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).</li><li>Dobritsa, A. P., Samadpour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reclassification+of+Burkholderiainsecticola+as+Caballeroniainsecticola+comb.+nov.+and+reliability+of+conserved+signature+indels+as+molecular+synapomorphies.">Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).</li><li>Ohbayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect's+intestinal+organ+for+symbiont+sorting.">Insect's intestinal organ for symbiont sorting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).</li><li>Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+conjugated+polyyne+biosynthesis+in+phytopathogenic+bacteria.">The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).</li><li>Atkins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+of+Burkholderia+pseudomallei,+auxotrophic+in+the+branched+chain+amino+acid+biosynthetic+pathway,+is+attenuated+and+protective+in+a+murine+model+of+melioidosis.">A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis.</a> Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).</li></ol>

Yazarlar, çalışmayla ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

L. villosa böcekleri ve B. gladioli bakterileri arasındaki simbiyotik etkileşimde önemli konak kolonizasyon faktörlerini belirlemek için bir B. gladioli transposon mutant kütüphanesi oluşturulmuştır. Protokoldeki başlıca adımlar konjugasyon, konakçı enfeksiyonu, DNA kütüphanesi hazırlama ve sıralamaydı.
Burkholderia'nın birçok türü konjugasyon24,25ile genetik modifikasyona elverişliolduğundan,transposon ve antibiyotik ekleme kasetini taşıyan plazmid, E. coli'denhedef B. gladioli Lv-StA suşuna başarıyla konjuge edildi. Elektroporasyon ile önceki dönüşüm girişimleri çok düşük bir şekilde neredeyse hiç B. gladioli transformantı vermedi. Hedef organizmanın çok sayıda dönüştürücüyu verimli bir şekilde elde etmesi için dönüşüm tekniğini optimize etmek tavsiye edilir.
B. gladioli Lv-StA'da bir tur konjugasyon ve 40 konjugasyon noktası 3.736 geni bozdu. Geçmişe bakıldığında, 7.468 genin çoğunu bozmak ve doymuş bir kütüphane elde etmek için birden fazla konjugasyon turu gerekli olacaktır. Özellikle, konjugasyon sırasında kuluçka süresinin B. gladioli'ninüstel büyüme aşamasının sonu olan 12-18 saati aşmasına izin verilmedi. Bakteri hücrelerinin üstel büyüme evresinin ötesinde konjugasyona izin vermek, transkonjugant elde etme şansını azaltır26. Bu nedenle, konjugasyon süresi bakteri türlerinin büyümesine göre ayarlanmalıdır.
Bir konakta mutant kütüphanelerinin enfeksiyonunu içeren bir deneyi başarıyla gerçekleştirmek için, kolonileşme sırasında bakteriyel popülasyon darboğaz boyutunu ve enfeksiyondan önce kütüphanedeki mutantların çeşitliliğini değerlendirmek önemlidir1,2,27. Deneye hazırlanırken, kütüphanedeki her bir mutantın örneklenme ve kolonileştirmesine izin verme şansının yüksek olması için enfekte olması gereken minimum böcek sayısını tahmin ettik. Deney süresince yaklaşık in vivo bakteriyel üretim süresi ve nesil sayısı da hesaplandı. İn vitro kültür daha sonra kuluçka süresi ayarlanarak benzer sayıda nesile kadar büyüdü. Model olmayan diğer konaklarda benzer bir enfeksiyon deneyi için, bir laboratuvar kültürünü ve konak organizmaların sabit bir kaynağını koruma yeteneği arzu edilir.
Mutant kütüphane in vivo ve in vitro ve örnek toplamanın büyümesinin ardından transposon ekleme dizilimi için değiştirilmiş bir DNA kütüphanesi hazırlama protokolü gerçekleştirildi. Protokoldeki değişiklik, özel PCR astarları tasarlamayı ve ekleme kasetini içeren DNA parçalarını seçmek için PCR adımları eklemeyi içeriyordu. Protokol özelleştirildiğinden, protokoldeki ek PCR döngüleri, aşırı örnekleme ve son kitaplıklarda karma bağdaştırıcı bağdaştırıcısı parçaları elde etme riskini artırdı. Bu nedenle, bu parçaların çıkarılmasına yardımcı olduğu için iki PCR'den sonra son bir temizleme adımı (boyut seçimi olmadan) önerilir. DNA kütüphanelerinin boyut dağılımı hala beklenenden daha genişti. Bununla birlikte, sıralama derinliğinin artırılması biyoinformatik analizi sırasında filtrelenen yeterli veriyi sağlayarak tatmin edici sonuçlar elde etti.
Transposon aracılı mutajensis tek bir deneyde binlerce rastgele ekleme ürettiğinden, bakteri üremesi için gerekli genlerin bozulduğu mutantlar hariç hepsini içeren doymuş bir mutant kütüphanesi oluşturmak mümkündür. Burkholderia sp ile ilgili diğer çalışmalarda temel genlerin tahminleri göz önüne alındığında, büyük olasılıkla doymuş bir mutant kütüphanesi ile çalışmadık. 28,29. Doymayan bir kütüphane, hedefli mutajensis kullanarak daha fazla çalışma için çeşitli aday genlerin araştırılmasına yardımcı olur. Deneylerden önce, bazı transposonların genom30'dakibelirli locilerde mutantların bolluğunu artıran belirli ekleme hedef bölgelerine sahip olduğunu hatırlamak da önemlidir. Mariner transposons ekleme için AT siteleri hedef bilinmektedir31, ve Tn5 transposons bir GC önyargı vardır32,33. Transposon eklemeleri için sıcak noktaları tanımak için biyoinformatik analizi sırasındaki adımların dahil etmesi, herhangi bir dağıtım önyargısını değerlendirmeye yardımcı olacaktır.
Aksiliklere eğilimli olsa da, iyi tasarlanmış bir transposon ekleme dizileme deneyi, bakterilerdeki birçok koşullu önemli geni tek bir deneyde tanımlamak için güçlü bir araç olabilir. Örneğin, Burkholderia seminalis'te orkide yaprağı nekrozunun bastırılması için önemli olan bir düzine gen transposon mutajensis ve genomik34birleştirilerek tanımlanmıştır. Burkholderia'nınötesinde, çeşitli yapışma ve hareketlilik genleri ve taşıyıcıları, Apis mellifera (Honeybee)22'nin Snodgrassella alvi symbionts'unda ve Euprymna scolopes'un Vibrio fischerii payandalarında (Hawaii bobtail kalamar)23 transposon eklemeli mutagenesis yaklaşımını kullanarak önemli kolonileşme faktörleri olarak tanımlanmıştır.
Alternatif bir yaklaşım olarak transposon mutajensis, sıralama yerine seçici ortam kullanılarak bireysel mutantların taranarak takip edilebilir. Hareketlilik, biyoaktif ikincil metabolitlerin üretimi veya spesifik auxotrophies gibi eksiklikleri tanımlamak için fenotipik tarama veya biyoassaylar mümkündür. Örneğin, burkholderia insecticola (Caballeronia35cinsine yeniden atanmıştır) transposon mutant kütüphanesinin taranmasının, symbiontların Riptortus pedestris'ikolonileştirmek için hareketlilik genleri kullandığı, böcek konakçılarının36. Ayrıca, transposon mutajensis ve fenotipik tarama kullanılarak, burkholderia caryophylli37'debiyoaktif ikincil metabolit karyosenentin için biyosentetik gen kümesi tanımlanmıştır. Transposon mutajensis ve taramadan sonra Burkholderia psödomallei'nin bir auxotrophic mutant'ı tanımlanmıştır ve insanlarda ve hayvanlarda tehlikeli bir hastalık olan melioidoza karşı olası bir zayıflatılmış aşı adayıdır38. Bu nedenle, transposon mutajensis ve dizileme, patojenik veya karşılıklı ilişkilerde ilgili konakçılarla etkileşimleri için önemli olan bakterilerin moleküler özelliklerinin incelenmesinde değerli bir yaklaşımdır.

Burkholderia gladioli, Lagria villosa böcekleri ile simbiyotik bir ilişkiye girebilir ve böcekkonağınınmikrobiyal antagonistlerine karşı savunmada önemli bir rol oynar 4,5,6. Dişi böcekler, üreme sistemine özel bez aksesuarında B. gladioli'nin çeşitli suşlarını barındırır. Yumurtlama üzerine dişiler, B. gladioli tarafından üretilen antimikrobiyal bileşiklerin entomopatojenik mantarlar tarafından enfeksiyonları inhibe ettiği yumurta yüzeyinde B. gladioli hücrelerini lekeler4,6. Geç embriyonik gelişim sırasında veya larvalar yumurtadan çıktıktan sonra, bakteri larvaların dorsal yüzeyindeki kbüler invaginasyonları kolonizasyona eder. Bu özel lokalizasyona ve symbiontların dikey iletim rotasına rağmen, L. villosa muhtemelen B. gladioli'yi ortamdan yatay olarak da edinebilir4. Ayrıca, L. villosa4,6ile ilişkili olarak en az üç B. gladioli türü bulunmuştur. Bunlar arasında, B. gladioli Lv-StA in vitroekimi için uygun olan tek kişidir.
B. gladioli Lv-StA 8.56 Mb 6 genom boyutuna sahiptir ve 7.468 gen içerir. Bu genlerden hangisi B. gladioli bakterilerinin böcek konağını kolonileştirmesi için önemlidir? Busoruyucevaplamak için, koşullu olarak gerekli mikrobiyal genleri tanımlamak için keşif yöntemi olan transposon ekleme dizilimlerini (Tn-seq) kullandık 1,2,3. Bir Tn5 transposon kullanılarak B. gladioli Lv-StA'dan oluşan bir mutant kütüphanesi oluşturuldu. Escherichia coli donör hücrelerinden B. gladioli Lv-StA'ya konjugasyon yoluyla, Tn5 transposonunu taşıyan bir pRL27 plazmid ve ters tekrarlarla çevrili bir antibiyotik direnç kaseti aktarılmıştır (Şekil 1). Böylece, 3.736 symbiont geninin bozulmalarını ayrı ayrı taşıyan bir dizi mutant üretilmiştir (Şekil 2).
Mutant havuzu, kolonizasyon faktörlerini tanımlamak için böcek yumurtalarına bulaştı ve kontrol olarak King's B (KB) ortamında in vitro olarak da yetiştirildi. Kolonizasyon için yeterli zaman sağladıktan sonra, yumurtadan çıkmış larvalar toplandı ve DNA ekstraksiyonu için birikti. Transposon kesici ucu ve B. gladioli Lv-StA'nın yan genomik bölgesini içeren DNA parçaları, dizileme için değiştirilmiş bir DNA kütüphanesi hazırlama protokolü kullanılarak seçildi. B. gladioli Lv-StA'nın yumurta yüzeyi üzerinden bulaştığında L. villosa larvalarını kolonileştirmesi için çok önemli olan belirli genleri tanımlamak için DESeq2 ile analizlerin ardından kalite işlemeyi okuyun.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6- Diaminopimelic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22391</td>
			<td>For E.coli WM3064+ pRL27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>Size selection in step 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (NaOCl) 12%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2 v.2.4.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer-S</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>For PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutadapt v.2.10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T834.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>R0182</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Di-Sodium salt</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC v.0.11.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts v.2.0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>7530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>26899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PO27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (soybean)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2365</td>
			<td>For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD &#39;Hot&#39; Taq- DNA Polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 145 x 20 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>XH90.1</td>
			<td>For selecting transconjugants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 90 x 16 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>N221.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Quality check after DNA library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HP57.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v.0.36</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris -HCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9090.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2366</td>
			<td>For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>GM 70 HD</td>
			<td>For shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Ligation step 6.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles

Genlerin aktivitelerini manipüle ederek işlevini çıkarıcı olmak, çoğu biyolojik işlemin genetik temellerini anlamak için önemli bir araçtır. Moleküler mikrobiyolojideki gelişmeler, genlerin manipülasyonu için çeşitli mutajensis tekniklerinin ortaya çıkışını görmüştür. Bunlar arasında, transposon ekleme dizilimi (Tn-seq), birçok aday genin işlevselliğini aynı anda hedefsiz bir şekilde değerlendirmek için değerli bir araçtır. Teknik, çeşitli patojenik mikroplarda ve birkaç faydalı simpiontlarda ökaryotik konakların kolonizasyonu için moleküler mekanizmaları tanımlamak için anahtar olmuştur.
Burada, Tn-seq, lagria villosaböceğinin karşılıklı burkholderia gladioli ortakyaşamında kolonileşme faktörlerini tanımlamak için bir yöntem olarak kurulmuştur. Konjugasyon ile, Tn5 transposon aracılı antibiyotik direnci kasetinin yerleştirilmesi B. gladioli'derastgele genomik yerlerde gerçekleştirilir. Gen bozulmalarının bakterilerin böcek konağını kolonileştirme yeteneği üzerindeki etkisini tanımlamak için, üretilen B. gladioli transposon-mutant kütüphanesi böcek yumurtaları üzerinde aşılanırken, sıvı kültür ortamında bir kontrol in vitro olarak yetiştirilir. Kolonizasyon için yeterli zaman sağladıktan sonra, in vivo ve in vitro yetiştirilen kütüphanelerden DNA çıkarılır. DNA kütüphanesi hazırlama protokolünün ardından, DNA örnekleri transposon ekleme dizilimi için hazırlanır. Transposon-insert kenarını ve yan bakteriyel DNA'yı içeren DNA parçaları seçilir ve mutasyon bölgeleri transposon-insert kenarından uzağa dizilerek belirlenir. Son olarak, in vivo ve in vitro kütüphaneler arasındaki her bir mutantın frekanslarını analiz ederek ve karşılaştırarak, böcek kolonizasyonu sırasında spesifik symbiont genlerinin önemi tahmin edilebilir.

Konakçı ile ilişkili bakteriler, yapışkanlık, hareketlilik, kemotaksi, stres yanıtları veya belirli taşıyıcılar da dahil olmak üzere bir ilişki kurmak için çeşitli faktörler kullanabilir. Patojen konak etkileşimleri için önemli faktörler rapor edilmiş olsa da, burkholderia19,20cinsinin üyeleri de dahil olmak üzere çeşitli bakteriler13, 14 ,15,16,17 ,18, daha az çalışma koloniizasyon için faydalı symbiontlar tarafından kullanılan moleküler mekanizmaları araştırdı21,22,23 . Transposon ekleme dizilimini kullanarak amaç, B. gladioli'nin L. villosa böceklerini kolonileştirmesini sağlayan moleküler faktörleri tanımlamaktı.
Transposon aracılı mutajensis, bir Tn5 transposon ve ters tekrar bölgeleri tarafından kuşatılmış bir kanamycin direnç kaseti taşıyan pRL27 plazmid kullanılarak gerçekleştirildi. Plazmid, plazmid donör E. coli WM3064 suşu ile konjugasyon yapılarak hedef B. gladioli Lv-StA hücrelerine sokuldu (Şekil 1'degösterildiği gibi). Konjugasyondan sonra B. gladioli alıcısı ve E. coli donör hücrelerini içeren konjugasyon karışımı kanamycin içeren seçici agar plakaları üzerine kaplandı. Plakalarda DAP bulunmaması donör E. coli hücrelerini ve başarılı B. gladioli Lv-StA transkonjugantları için seçilen kanamycin varlığını ortadan kaldırdı. 100.000 transkonjugant kolonisinin hasatından elde edilen havuzlu B. gladioli Lv-StA mutant kütüphanesi, değiştirilmiş bir DNA kütüphanesi hazırlama kiti ve özel astarlar kullanılarak sıralama için hazırlandı. Şekil 2, DNA kütüphanesi hazırlama adımlarını vurgulamaktadır. Sıralama 4 Mio eşleştirilmiş okuma sağladı; B. gladioli Lv-StA'daki 7.468 genden 3.736'sı bozuldu.
Konakta kolonizasyon kusurlu olan mutantları tanımlamak için, B. gladioli Lv-StA mutant kütüphanesi böcek yumurtalarına bulaştı ve kontrol olarak KB ortamında in vitro olarak yetiştirildi. In vivo kolonizasyon darboğaz boyutu deneyden önce hesaplandı. Bilinen sayıda B. gladioli Lv-StA hücresi böcek yumurtasına bulaştı ve taze yumurtadan çıkan ilk başlangıç larvalarındaki kolonileşen hücrelerin sayısı, her larvadan bir süspansiyonun kaplaılması ve kişi başına koloni oluşturan birimlerin sayılmasıyla elde edildi. Bu hesaplamalar, kolonileşen hücrelerin sayısının, kütüphanedeki mutantların tamamını veya yüksek bir yüzdesini konak sahibini kolonileştirme yetenekleri için değerlendirmek için yeterli olduğundan emin olmak için yapılmıştır. Ek olarak, in vitro ve in vivo koşullar arasındaki büyüme süresi, bu örnekleri karşılaştırılabilir hale getirmek için bakteri nesillerinin sayısına göre normalleştirildi.
Yumurtalar yumurtadan çıktıktan sonra 13 havuzda 1.296 larva toplandı. İlgili in vitro mutant kültürleri yetiştirildi ve gliserol stokları olarak depolandı. In vivo ve in vitro yetiştirilen mutant kütüphanelerinin DNA'sı bir ultrasonicator'da çıkarıldı ve parçalandı. Şekil 3, parçaların çoğunluğunun beklendiği gibi 100 ila 400 bp arasında yayıldığı yamyulan DNA'nın boyut dağılımını göstermektedir. Bu adımı sıralama için değiştirilmiş DNA kütüphanesi hazırlama protokolü izledi. Protokolün her adımında, adımların doğru bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlamak ve DNA kayıplarını izlemek için kalan DNA konsantrasyonu kontrol edildi. Sıralamadan önce yapılan bir kalite kontrolü (Bkz. Malzeme Tablosu),DNA kütüphanelerinin beklenmedik şekilde büyük (>800 bp) DNA parçaları içerdiğini ve bunun in vivo kütüphanelerde daha belirgin olduğunu ortaya koydu. Sıralama şeritlerindeki parçaların kümelenmesindeki zorluk göz önüne alındığında, istenen okuma sayısına elde etmek için sıralama derinliğini in vivo kütüphanelerde 10 Mio eşleştirilmiş okumalara çıkarmak gerekiyordu. Sıralama sonuçlarının analizi, in vivo kütüphanelerde ortalama 4 Mio ve in vitro kütüphanelerinde 3.1 Mio okumasının, bu deney için tatmin edici olan 5' Read-1(Tablo 9)ucundaki Transposon kenarını içerdiğini ortaya koydu. Orijinal kütüphanedeki B. gladioli genomuna 24.224 benzersiz eklemenin dağılımı Şekil 4'te gösterilmiştir. DESeq2 kullanılarak yapılan bir analiz, 271 mutantın bolluğunun in vivo ve in vitro koşullar arasında önemli ölçüde farklı olduğunu ortaya koydu.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig03.jpg"> Şekil 3: Bir mutant ve DNA kütüphanelerinin agarose jelleri. (A) X şeridindeki bir mutantın duyulmamış DNA'sı ve ölçek için 1 kbp merdiveni olan agarose jel. (B) Yamlu DNA kütüphanesi ile jel. İlk şeritteki merdivenin bant boyutları sol tarafta belirtilir. A, b ve c'nin ilk üç şeridi in vivo kütüphanelerin yamlu DNA parçalarınıiçerir. Lanes d, e, f ve g, in vitro kütüphanelerin yamuğunda DNA parçaları içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig04.jpg"> Şekil 4: Burkholderia gladioli Lv-StA genomunda yer alan dört replicon genelinde orijinal kütüphanedeki benzersiz ekleme alanlarının konumu. X ekseni boyunca her çubuk bir ekleme yerinde bulunur. y ekseni boyunca bir çubuğun yüksekliği, bu siteyle ilişkili okuma sayısına karşılık gelir. İki kromozom ve iki plazmidin tam uzunlukta gösterildiğini ve bu nedenle x ekseninde farklı ölçeklere sahip olduğunu unutmayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Kralın B orta / agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pepton (soya fasulyesi)</td>
			<td>20 g/M</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>1,5 g/M</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>1,5 g/M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agar</td>
			<td>15 g/M</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Damıtılmış suda çözünmüş</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">LB orta/agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tryptone</td>
			<td>10 g/M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maya özü</td>
			<td>5 g/M</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>10 g/M</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Damıtılmış suda çözünmüş</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Ortam bileşenleri.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hayır.</td>
			<td>Astar</td>
			<td colspan="2">Sıra</td>
			<td>PCR tavlama sıcaklığı( °C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>tpnRL17–1RC</td>
			<td colspan="2">5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3'</td>
			<td rowspan="2">58.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>tpnRL13–2RC</td>
			<td colspan="2">5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Konjugasyonun başarısını onaylamak için primerler.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parça</td>
			<td>Hacim (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HPLC arıtılmış su</td>
			<td>4.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Tampon S (yüksek özgüllük)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP'ler (2 mM)</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Astar 1 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Astar 2 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq (5 U/μL)</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mastermix toplamı</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Şablon</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Konjugasyonun başarısını onaylamak için PCR master mix. Kısaltmalar: HPLC = yüksek performanslı sıvı kromatografisi; dNTP'ler = deoksinükleozit trifosfat.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adım -ları</td>
			<td>Sıcaklık °C</td>
			<td>Saat</td>
			<td>Döngü</td>
		</tr>
<tr>
<td>İlk Denatürasyon</td>
			<td>95</td>
			<td>3 dk</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denatürasyon</td>
			<td>95</td>
			<td>40 sn</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Tavlama</td>
			<td>58.2</td>
			<td>40 sn</td>
			<td>30 ila 35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Uzantı</td>
			<td>72</td>
			<td>1-2 dk</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Son Uzantı</td>
			<td>72</td>
			<td>4 dk</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tutmak</td>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4: Konjugasyonun başarısını onaylamak için PCR koşulları.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Astar</td>
			<td colspan="2">Sıra</td>
			<td>Tm °C</td>
			<td>Kullanmak</td>
			<td>Kaynak</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transposon spesifik biyotinilasyonlu astar</td>
			<td colspan="2">5'-Biotin-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3'</td>
			<td>63.5</td>
			<td>6.7.1. PCR I</td>
			<td>Töre</td>
		</tr>
<tr>
<td>Değiştirilmiş Evrensel PCR astarı</td>
			<td colspan="2">5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3'</td>
			<td>62</td>
			<td>6.10.1. PCR II</td>
			<td>Töre</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dizin astarı</td>
			<td colspan="3">Üretici kılavuzuna bakın</td>
			<td>6.7.1. PCR I ve 6.10.1. PCR II</td>
			<td>Illumina için NEBNext Multiplex Oligos (İndeks primer seti 1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bağdaştırıcı</td>
			<td colspan="3">Üretici kılavuzuna bakın</td>
			<td>6.5. Adaptör ligasyonu</td>
			<td>Illumina için NEBNext Ultra II DNA kütüphanesi hazırlık kiti</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 5: DNA kütüphanesi hazırlığı sırasında PCR I ve II için astarlar ve adaptör. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PCR karışımı</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adaptörle liglenmiş DNA parçaları</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Ultra II Q5 ana karışımı</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>İndeks astarı (10 pmol/ μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transposon spesifik biyotinillenmiş astar (10 pmol/ μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam birim</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 6: DNA kütüphanesi hazırlığı-PCR I master mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adım -ları</td>
			<td>Sıcaklık</td>
			<td>Saat</td>
			<td>Döngü</td>
		</tr>
<tr>
<td>İlk Denatürasyon</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 sn</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denatürasyon</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 sn</td>
			<td rowspan="3">6'dan 12'ye</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tavlama</td>
			<td>65 °C</td>
			<td>30 sn</td>
		</tr>
<tr>
<td>Uzantı</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>30 sn</td>
		</tr>
<tr>
<td>Son Uzantı</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 dk</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tutmak</td>
			<td>16 °C</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 7: DNA kütüphanesi hazırlama-PCR I ve II koşulları.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PCR karışımı</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Boncuk tarafından seçilen DNA</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Ultra II Q5 ana karışımı</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dizin astarı</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Değiştirilmiş evrensel PCR astarı</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam birim</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 8: DNA kütüphanesi hazırlama-PCR II ana karışımı.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Kitaplık</td>
			<td>Invivo-1</td>
			<td>Invivo-2</td>
			<td>Invivo-3</td>
			<td>Invitro-1</td>
			<td>Invitro-2</td>
			<td>Invitro-3</td>
			<td>Özgün kitaplık</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Hayır. okuma sayısı (PE)</td>
			<td>56,57,710</td>
			<td>39,19,051</td>
			<td>30,65,849</td>
			<td>35,73,494</td>
			<td>28,83,440</td>
			<td>36,61,956</td>
			<td>46,09,410</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Hayır. Tn içeren okumaların sayısı – 5' Read-1'in sonundaki kenar</td>
			<td>54,15,880</td>
			<td>37,31,169</td>
			<td>29,36,247</td>
			<td>33,00,499</td>
			<td>27,35,705</td>
			<td>33,50,402</td>
			<td>41,53,270</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bowtie2 genel hizalama oranı (%) (yalnızca Okuma-1)</td>
			<td>95.53%</td>
			<td>83.71%</td>
			<td>89.87%</td>
			<td>80.79%</td>
			<td>78.00%</td>
			<td>73.06%</td>
			<td>74.92%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Benzersiz ekleme sayısı</td>
			<td>8,539</td>
			<td>4,134</td>
			<td>7,183</td>
			<td>18,930</td>
			<td>18,421</td>
			<td>20,438</td>
			<td>24,224</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Vurulan gen sayısı</td>
			<td>1575</td>
			<td>993</td>
			<td>1450</td>
			<td>2793</td>
			<td>2597</td>
			<td>3037</td>
			<td>3736</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 9: Kitaplık başına sıralama çıktısı ve transposon ekleme sıklığının özeti. Kısaltma: PE = eşleştirilmiş uç.

Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Bu, Burkholderia faydalı bir symbiont'taki aday böcek kolonizasyon faktörlerini tanımlamak için uyarlanmış bir yöntemdir. Böcek konağı transposon mutajensis yoluyla oluşturulan rastgele bir mutant kütüphanesi ile enfektedir ve kolonileşmeden sonra kütüphane karmaşıklığı in vitroyetiştirilen bir kontrol ile karşılaştırılır.

Lagria villosa Böcekleri burkholderia gladioli Symbiont Bakteriyel Kolonizasyon Faktörlerini Elucidate için Bir Araç Olarak Transposon-ekleme Dizileme

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

Bu protokol simbiyotik bakteriler üzerinde, bu durumda, özellikle Burkholderia üzerinde genetik manipülasyon yapmak ve bir böcek konağını kolonileştirmek için gerekli genleri tanımlamak için yararlıdır. Transposon ekleme dizilimi, tek bir deneyde aynı anda çok sayıda koşullu temel geni tanımlamak için güçlü bir araçtır. Steril bir başlık altında Kanamycin ve DAP ile desteklenmiş 10 mililitre LB ortamında E.coli donörün taze donör kültürünü aşılayarak başlayın.Inoculate Burkholderia gladioli suş Beş mililitre KB ortamında bir alıcı hücreleri. Kültürleri 250 RPM'de bir çalkalayıcıda bir gecede 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bir gecede büyümeden sonra, hücreleri peletmek ve süpernatantı atmak için altı dakika boyunca her bir kültürün dört mililitresini 9.600 kez G'de santrifüjleyin.Steril bir kaputun altında, peletlenmiş hücre kültürlerini DAP içeren KB ortamında yıkayın. Ve son olarak, kültürleri dört mililitre KB artı DAP ortamında ayrı ayrı yeniden dirildirin. Taze 15 mililitrelik bir tüpte, yıkanmış E.coli donör hücrelerinin 250 mikrolitresini yıkanmış Burkholderia gladioli suşu A alıcı hücrelerinin bir mililitresi ile karıştırın.Bu konjugasyon hücresi karışımının 10 mikrolitresini DAP içeren KB agar plakalarında tespit edin. Plakanın steril kaputta bir saat boyunca oda sıcaklığında bozulmadan dinlenmesine izin verin. Plakaları 30 santigrat derecede konjugasyon noktalarıyla 12 ila 18 saat boyunca kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, steril bir kaputun altındaki plakalara iki ila dört mililitre 1X PBS ekleyin ve büyüyen bakteriyel konjugasyon noktalarını agardan serbest bırakmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Daha sonra konjuge hücre karışımını iki mililitre mikroyakıt tüpüne pipetle ekleyin. hücreleri iki dakika boyunca 9.600 kez G'de santrifüjleyarak peletleyin.Süpernatantı atın ve peleti yukarı ve aşağı borulayarak 1X PBS'nin bir mililitresinde iki kez yıkayın. Son peleti 1X PBS'nin 1.200 mikrolitresinde yeniden sunun. İyice karıştırın ve kanamycin ile desteklenmiş büyük KB agar plakalarına 100 mikrolitre hücre karışımını yayın ve bir gecede 30 santigrat derecede kuluçkaya yayın.Üç plakadaki transkonjugant kolonilerinin toplam sayısını sayın ve tüm plakalarda elde edilen yaklaşık mutant sayısını hesaplamak için tahminde bulunma. Temsili bir kütüphane elde etme şansını artırmak için, toplam koloni sayısının genomdaki toplam gen sayısından birkaç kat daha fazla olduğundan emin olun. Konjugasyonun başarısını doğrulamak için, yazıda açıklandığı gibi 10 ila 20 örnek koloni kullanarak ekleme kasetini hedefleyen bir PCR gerçekleştirin.Steril bir kaputun altında, ağar üzerine bir ila iki mililitre 1X PBS ekleyerek kolonileri plakalardan kazıyın. Plakalardan kazınmış hücre karışımını 50 mililitrelik tüplere bir araya koyun. Kütüphaneyi iyice karıştırmak için girdaplayın ve sonra havuza alınmış mutant kütüphanesinin bir mililitresini birkaç kriyo tüpüne bölün.Tüplere bir mililitre% 70 gliserol ekleyin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bir L.villosa yumurta debriyajı seçin ve debriyaj 100'den fazla yumurta içeriyorsa devam eden yumurta sayısını sayın. Tüm yumurta debriyajını sterilize etmek için, % 70 etanol 200 mikrolitre ekleyin ve yumurtaları beş dakika hafifçe yıkayın, ardından etanolleri çıkarın ve yumurtaları iki kez otomatik kapatılmış suyla yıkayın.200 mikrolitre % 12 çamaşır suyu ekleyin ve yumurtaları 30 saniye boyunca hafifçe yıkayın. Çamaşır suyunu hemen çıkarın ve yumurtaları 200 mikrolitre otoklavlı su ile üç kez tekrar yıkayın. PBS'deki yıkanmış mutant kütüphanesinin mikroliter başına altı hücreye iki kez 10 kez kullanarak sterilize edilmiş yumurta debriyajındaki yumurtaları enfekte edin.Enfekte böcek larvaları yumurtadan çıktıktan iki gün sonra, 1,5 mililitre mikrofuge tüpü başına 100 saniye instar larva toplayın ve eksi 80 santigrat derecede depolayın. İn vitro kontrol kütüphanesini oluşturmak için, kanamycin içeren 10 mililitre KB ortamda mutant kütüphanesinin mikrolitresi başına altı hücreye iki çarpı 10'luk 250 mikrolitre aşılayın. In vivo ve in vitro büyümüş mutant kütüphanelerinden DNA çıkardıktan sonra, DNA'yı bir ultrasonicator ile paylaşın.DNA'nın istenen boyut aralığına yamuğuna yayılıp yatıştırılmadığını kontrol etmek için, 40 dakika boyunca 250 voltta çalışan%1,6 agarose jelin üzerinde bire bir oranında jel yükleme boyası ile karıştırıldıktan sonra duyulmamış ve yamtulan DNA'nın beş mikrolitresini yükleyin. Adaptör ligasyonu için gerekli parça uçlarını hazırlamak için, 50 mikrolitrelik parçalanmış DNA'ya enzim karışımının üç mikrolitresini ve yedi mikrolitre reaksiyon tamponunu ekleyerek başlayın ve pipetleme ile iyice karıştırın. Isıtılmış kapağı 75 santigrat dereceden büyük veya eşit olan bir termosikler ayarlayın ve numuneleri 20 santigrat derecede 30 dakika ve 65 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya bırakın, ardından sıcaklığı dört santigrat derecede tutun.Adaptör ligasyonu için, son hazırlık adımının ürünlerine 30 mikrolitre ligasyon ana karışımı, bir mikrolitre ligasyon arttırıcı ve 2,5 mikrolitre seyreltilmiş adaptör ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın ve numuneyi ısıtılmış kapak kapalıyken termosikler içinde 20 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. 15 dakika sonra enzimin üç mikrolitresini ekleyin.Pipetleme yaparak iyice karıştırın ve numuneyi 47 santigrat dereceden büyük veya eşit derecede ısıtılmış bir termosikler içinde 37 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. 250 baz çiftinden oluşan adaptör ligli DNA hedefleme parçalarının boyutunu seçmek için manyetik boncuk çözeltisini girdaplayarak başlayın ve kullanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığına yerleştirin. Liglenmiş DNA karışımının 96,5 mikrolitresine 0,3 kez boncuk ekleyin ve iyice pipetleyarak karıştırın.Boncuk karışımını beş dakika kuluçkaya yatırın. Boncukları aşağı çekmek ve istenmeyen boyuttaki DNA parçalarını çıkarmak için tüpleri manyetik bir standa yerleştirin. Boncukların beş dakika yerleşmesine izin verin ve ardından berrak süpernatantı yeni bir mikroyapı tüpüne aktarın.Süpernatant içine 0,15 kat taze boncuk ekleyin ve iyice pipetleme yaparak karıştırın. Boncuk karışımını beş dakika kuluçkaya yatırın ve ardından hedef DNA'ya bağlı boncukları aşağı çekmek için tüpleri manyetik bir standa yerleştirin. Beş dakika bekleyin ve sonra boncukları tutarak üstnatant atın.Manyetik standdaki boncuklarla, 200 mikrolitre taze hazırlanmış% 80 etanol ekleyin ve boncukları bozmadan etanol atmadan önce 30 saniye bekleyin. Tüpleri standdan çıkarın ve 0,1X TE veya Düşük TE'nin 17 mikrolitresini ekleyin, ardından 10 kez pipetleyarak karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya bırakın. Tüpü manyetik standa yerleştirin ve PCR-1 için boyut tarafından seçilen DNA'nın 15 mikrolitresini alın.Vortex streptavidin boncukları ve en az 30 dakika oda sıcaklığında yerleştirin. Boncuklardan 32 mikrolitre alın ve 500 mikrolitre 1X bağlama ile yıkayın ve tamponu yıkayın. 32 mikrolitre 2X bağlama ekleyin ve tamponu yıkayın ve boncukları yeniden depoleyin.Buna, temizlenmiş PCR-1 ürünlerinden 32 mikrolitre ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatır. Boncuk DNA karışımını iki dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin.Pipet, takma kenarını içeren biotin etiketli DNA olarak süpernatantı boncuklardaki streptavidin'e bağlar. Boncukları 500 mikrolitre 1X bağlama ve yıkama tamponu ile yıkayın ve ardından boncukları 200 mikrolitre Düşük TE ile yıkayın. DNA'ya bağlı boncukları 17 mikrolitre Düşük TE'de yeniden dirilt. Bir ultrasonicator ayıklanmış ve parçalanmış in vivo ve in vitro büyümüş mutant kütüphanelerinin DNA'sı, parçaların çoğunun 100 ila 400 baz çifti arasında yayıldığını gösterdi. Burkholderia gladioli suşu A genomunun dört replikononu boyunca transposon aracılı eklemelerin yeri podda görülebilir.Sıralama çıktısının bir özeti ve üç kopya in vivo ve in vitro kütüphanede isabet eden benzersiz ekleme ve genlerin sayısı tabloda gözlemlenebilir. Hatırlanması gereken önemli şey, enfeksiyon sırasında kütüphanenin uygun bir temsilini elde etmek için konak kolonizasyonu sırasında nüfus darboğaz boyutunu hesaplamaktır. Ayrıca, in vitro ve konakta uyumlu sayıda bakteriyel nesil için ayarlayın.Transposon mutant kütüphanesi oluşturulduktan sonra, fenotipik farklılıklara dayanarak mutantları kurtarmak için seçici medyada taranabilir. Böylece bir durum için önemli olan spesifik genler tanımlanabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Rotorod Rat Yürüyüş Kalitatif Analiz için bir yöntem olarak kullanımı

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Bir Aracı Olarak Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobu (CLEM) microinjected Moleküller ve Ökaryotik Alt hücresel Hedefler Visualize&#39;a


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

İYİ: tetradların Barkod Etkin Sıralama

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

c-FOS Protein Immünohistolojik Algılama: Belirli Fizyolojik Yanıtları ilgilendim Merkez Pathways bir Marker Olarak Faydalı Aracı<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...