Name: dissection and immunohistochemistry of the drosophila adult leg to detect changes at the neuromuscular junction for an identified motor neuron
Uploaded: 2022-02-12T13:30:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron at JoVE.com

نشكر إريك روبرتس على المشورة بشأن التصوير. ونود أيضا أن نشكر خدمات تكنولوجيا المعلومات في كلية رود آيلاند، ولا سيما مايكل كين وجيك دوغلاس على تصوير الفيديو. تم تطوير الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للdlg ومكافحة brp من قبل جامعة كاليفورنيا في بيركلي وجامعة فيرزبورغ، وتم الحصول عليها من بنك Hybridoma الدراسات التنموية، التي أنشأتها NICHD من المعاهد القومية للصحة والحفاظ عليها في جامعة أيوا، قسم البيولوجيا، مدينة أيوا، IA 52242، الولايات المتحدة الأمريكية. تم دعم البحث المبلغ عنه هنا بشكل كامل من قبل شبكة جائزة رود آيلاند للتنمية المؤسسية (IDeA) للتميز في البحوث الطبية الحيوية من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم المنحة [P20GM103430].

ويرد وصف لإجراءات إعداد حلول العمل المستخدمة بالاقتران مع هذا البروتوكول في الجدول 1.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>الكاشف</td>
			<td colspan="3">اعداد</td>
			<td colspan="2">خزن</td>
		</tr>
<tr>
<td>برنامج تلفزيوني</td>
			<td colspan="3">جعل مخزون العمل من برنامج تلفزيوني 1x من محلول الأسهم PBS 10x عن طريق التخفيف في الماء المقطر.  يجب أن يكون رقم الحموضة لمخزون PBS العامل 7.2- 7.4</td>
			<td colspan="2">4 درجة مئوية لمدة 1+ أشهر حتى يظهر التلوث البكتيري.</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBT</td>
			<td colspan="3">1x حل برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ غير الأيونية السطحي.</td>
			<td colspan="2">4 درجة مئوية لمدة 1+ أشهر حتى يظهر التلوث البكتيري.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">الاتحاد الإنجليزي لكرة القدم</td>
			<td colspan="3">3.7٪ حل الفورمالديهايد المصنوع من مخزون الفورمالديهايد 37٪ والمخفف في برنامج تلفزيوني 1x.</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">درجة حرارة الغرفة. جعل الطازجة كل يوم من تشريح</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">تنبيه: الفورمالديهايد الموردة كحل الأسهم 37٪ هو مادة مسرطنة محتملة وينبغي أن تضعف في غطاء محرك السيارة الدخان.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5٪ NGS</td>
			<td colspan="3">5٪ مصل الماعز العادي المخفف في PBT.  يجب أن يتطابق المصل المستخدم مع أنواع الأجسام المضادة الثانوية التي سيتم استخدامها.</td>
			<td colspan="2">4 درجة مئوية لعدة أسابيع حتى يظهر التلوث البكتيري</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1 - الجداول حلول لأداء الكيمياء المناعية للساق Drosophila الكبار.
1. التثبيت الأولي للأنسجة
<ol><li>حدد ما يقرب من 10 ذباب لكل نوع وراثي وعمر. تخدير على منصة ذبابة تحت ثاني أكسيد الكربون (الشكل 1A، B). ملاحظة: ابدأ بالذباب أكثر من اللازم لضمان حجم عينة كبير بما فيه الكفاية بعد تشريح.</li>
	<li>باستخدام فرشاة الطلاء، نقل الذباب إلى الميثانول البارد في بئر زجاجي أو طبق لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة تقريبا (الشكل 1C). يقوم الميثانول بتشحيم الهيدروكربونات القطعية ويمكن الآن غمر الذباب بدلا من تعويمه في المحاليل المائية.</li>
	<li>مع ملقط، نقل الذباب بعناية إلى برنامج تلفزيوني. شطف 3x في الجليد الباردة PBS لإزالة الميثانول الزائد والحفاظ على الذباب في برنامج تلفزيوني على الجليد حتى تشريح والتثبيت. عند هذه النقطة، تشريح الذباب وإصلاح في أقصر وقت ممكن (<30 دقيقة).</li>
	<li>لعزل الساقين، نقل الذباب إلى طبق تشريح الاستومر السيليكون مليئة برنامج تلفزيوني الباردة، وإزالة الساقين metathoracic في كوكسا باستخدام اثنين من أزواج من ملقط دومون # 5 أو قطع الساقين مع مقص فانا (الشكل 1D). نقل الساقين إلى بئر في لوحة بلاستيكية 24 بئر مليئة 1 مل من برنامج تلفزيوني والحفاظ على لوحة على الجليد حتى تتم إزالة جميع الساقين ونقلها إلى الآبار. ملاحظة: يمكن لكل بئر أن يحمل ما لا يقل عن 20 ساقا.</li>
	<li>استبدال حل برنامج تلفزيوني مع 1 مل من حل الاتحاد الانجليزي وتدوير على نوتاتور لمدة 30 دقيقة (الشكل 1E). يجب ضبط إعداد نوتاتور بسرعة متوسطة (17 دورة في الدقيقة). تأكد من أن الساقين مغمورتان تماما في محلول FA خلال هذا الوقت لتثبيت مناسب.</li>
	<li>لإزالة محلول FA، اغسل في 1 مل من PBS 3x بسرعة تليها 3 يغسل إضافية لمدة 5 دقائق كل في 1 مل من برنامج تلفزيوني. عقد الأنسجة في 1 مل من برنامج تلفزيوني على الجليد قبل، وخلال خطوات تشريح المذكورة أدناه.</li>
</ol>2. إزالة قطع الساق وتلطيخ الأجسام المضادة
<ol><li>إزالة كندل الساق<ol>
<li>ملقط تشريح حاسمة للنجاح. إدخال الانحناءات موازية طفيفة في كلا الشقين في نهاية # 5 ملقط غرامة فائقة لتوفير شطبة التي تسمح للكفاح أن أمسك سطحيا بدلا من أن تكون مطعون، والتي يمكن أن تدمر الأنسجة (الشكل 1F، G). ملاحظة: يجب أن لا تزال الشقات المنحنية بالتوازي تجري اتصالات مع بعضها البعض طوال طول الشق عند إغلاقها (الشكل 2).</li>
		<li>نقل الساقين إلى طبق الاستومر السيليكون في برنامج تلفزيوني لتشريح. توجيه الساق بحيث يواجه الجانب الأمامي (انظر الشكل 3 لتشريح الساق ومعلومات التوجيه). باستخدام زوج واحد من ملقط، عقد الجزء الساق ضد طبق الاستومر السيليكون. باستخدام ملقط أخرى عقدت الجانب شطبة أسفل، والاستيلاء على قطعة من الجلد على الطرف القاصي من عظم الفخذ وسحب في الاتجاه القريب نحو trochanter.</li>
		<li>الحفاظ على إزالة الجلد منهجيا حتى العضلات العارية مرئية في جميع أنحاء نهاية قريبة من عظم الفخذ (الشكل 1F، G، H). ملاحظة: فقط إجراء اتصال سطحي مع الساقين باستخدام الجانب مشطوف من ملقط لتجنب سحب العضلات.</li>
		<li>مرة واحدة يتم تشريح جميع الساقين، واستبدال برنامج تلفزيوني مع الاتحاد الانجليزي لمرحلة ما بعد إصلاح الساقين لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز على نوتاتور بسرعة متوسطة (الشكل 1I). غسل العينات في 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 3 مرات سريعة ثم 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل في PBT (الشكل 1J). ملاحظة: إذا تلطيخ مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة NC82 (المضادة للbruchpilot) لتسمية المناطق النشطة، بعد الإصلاح لمدة 20 دقيقة كما هذا المستضد حساسة لتثبيتات أطول.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig02v2.jpg"> الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم ملقط معدلة تستخدم لتشريح الساقين الكبار. (أ) يتم ثني نهايات ملقط ثم بالارض في أسفل (السهم) خلق شطبة عن طريق الإيداع على حجر شحذ. (ب) وعلى النقيض من ذلك، فإن شوكات ملقط غير معدلة ليست عازمة. شريط المقياس = 1 مم <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig02large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<ol start="2"><li>تلطيخ الأجسام المضادة<ol>
<li>لمنع أنسجة تلطيخ الأجسام المضادة، استبدل 1 مل من PBT بمحلول مانع يتكون من 1 مل من 5٪ NGS مخفف في PBT. حضانة تشريح الساقين لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في حين هزاز على نوتاتور بسرعة متوسطة (17 دورة في الدقيقة). أثناء جميع الحضانات، قم بتغطية الآبار بشريط الختم بالإضافة إلى الغطاء البلاستيكي (الشكل 1J). ملاحظة: تستخدم 24 لوحة بئر في الكيمياء المناعية بدلا من 1.5 مل أو 2 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق لأن المحاولات السابقة لاستخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيق أدت إلى كسر في الساقين وتلف الأنسجة.</li>
		<li>إزالة حل حظر وإضافة 300 مل من الأجسام المضادة الأولية المخففة في حل حظر جديدة. يجب أن يكون الحجم الصغير من الأجسام المضادة المستخدمة كافيا لتغطية الأنسجة. إعادة ختم الآبار مع مختبر ختم الشريط وغطاء من البلاستيك واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع اهتزاز على نوتاتور بسرعة متوسطة (الشكل 1J). ويرد وصف لمعلومات كاشفات الجسم المضاد العاملة والتركيزات المستخدمة في هذه الدراسات في الجدول 2.</li>
		<li>غسل الأجسام المضادة الأولية في 1 مل من PBT لمدة 3 مرات لفترة وجيزة ثم 3 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما (الشكل 1J). ملاحظة: يمكن حفظ الأجسام المضادة الأولية المخففة وإعادة استخدامها إذا تم تخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.</li>
		<li>كتلة الأنسجة مرة أخرى في 1 مل من 5٪ NGS لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 C (الشكل 1J).</li>
		<li>إزالة 5٪ NGS حظر الحل وإضافة 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الفلورية المخففة المناسبة اقتران الثانوية. بالإضافة إلى ذلك، إضافة 1:2000 تخفيف phalloidin مضان مترافق لتسمية العضلات (الشكل 1J).</li>
		<li>بالنسبة لاحتضانات الأجسام المضادة الثانوية، فقم بختم الآبار بشريط الختم المختبري والغطاء. أيضا، لوحات التفاف في رقائق الألومنيوم لحماية الفلوروفوريس من الضوء. حضانة لمدة 6-8 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 °C.</li>
		<li>غسل الأجسام المضادة الثانوية والثالويدين كما هو موضح في الخطوة 2.2.3 أعلاه. تغطية لوحات مع رقائق الألومنيوم بين يغسل لحماية الفلوروفوريس من الضوء.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. تصاعد الساقين
<ol><li>نقل الساقين إلى شريحة باستخدام ملقط وتوجيه الجانب الأمامي لأعلى. تغطية الساقين مع تصاعد وسائل الإعلام (الشكل 1K، L). ملاحظة: يمكن يستنشق الساقين تشريح مع تلميح ماصة P1000 إذا تم توسيع تتحمل أسفل عن طريق قطع مع شفرة حلاقة.</li>
	<li>إضافة الفواصل الطين إلى 22x22 مم2 coverslip (# 1.5 سمك) عن طريق كشط زوايا coverslip عبر كرة صغيرة من الطين النمذجة. يجب أن يكون لكل زاوية كمية صغيرة من الطين سمكها 1-2 مم (الشكل 1K).</li>
	<li>لتغطية الشريحة، أضف الغطاء مع الفواصل الطينية التي تواجه نحو الشريحة ودفع بعناية على الزوايا حتى يغطي فقط يمس سطح عظم الفخذ.</li>
	<li>لمنع التبخر، قم بختم حواف الغطاء بطلاء الأظافر والسماح بالجفاف في مكان مظلم (حوالي 10 دقائق) قبل تخزينه عند 4 درجات مئوية حتى التصوير.</li>
</ol>4. التصوير
<ol><li>الصورة بواسطة المجهر البؤري (الشكل 1M). وتشمل قناة ضوء المنقولة لتقييم أفضل لنوعية تشريح والعينات مع ألياف العضلات تعطلت بشكل واضح في مجال الاهتمام ينبغي التخلص منها.<ol>
<li>بدء التصوير z-مداخن مع التكبير 20x مع التكبير 2x وعمق الصورة الإجمالية من ~ 40 ملم المقابلة لسمك عظم الفخذ. للكشف عن الإشارة الفلورية، التقط الصور بدقات تتفق مع عينات Nyquist (نستخدم 1024 × 1024 بكسل مع إعداد ثابت من 8-10 ميكروس/بكسل). يجب أن تكون كثافة الإشارة في النطاق الخطي الذي يتحقق عن طريق ضبط إعدادات كسب الجهد العالي. بمجرد تعيين إعدادات الكسب لسلسلة من العينات داخل التجربة ، لا ينبغي تغييرها بحيث يمكن مقارنة كثافة الإشارة بين العينات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لتصوير نوبات متشابك وغيرها من البنية دون الخلوية، والتقاط الصور confocal في التكبير ≥60x. وينبغي أن تكون إعدادات الكاشف في النطاق الخطي، في حين ينبغي أن تكون كثافة البكسل وإعدادات الإسهاب وعمق z متشابهة للصور الملتقطة عند التكبير الأدنى (الخطوة 4-1).</li>
</ol>

<ol>
	<li>McDermott, C. J., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+motor+neurone+disease.">Diagnosis and management of motor neurone disease.</a> BMJ. 336 (7645), 658-662 (2008).</li><li>Global Collaborators, G. B. D. M. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+burden+of+motor+neuron+diseases+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">Global, regional, and national burden of motor neuron diseases 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> Lancet Neurology. 17 (12), 1083-1097 (2018).</li><li>Foster, L. A., Salajegheh, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+Neuron+Disease:+Pathophysiology,+Diagnosis,+and+Management.">Motor Neuron Disease: Pathophysiology, Diagnosis, and Management.</a> American Journal of Medicine. 132 (1), 32-37 (2019).</li><li>Bede, P., Pradat, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Biomarkers+and+Clinical+Indicators+in+Motor+Neuron+Disease.">Editorial: Biomarkers and Clinical Indicators in Motor Neuron Disease.</a> Frontiers in Neurology. 10, 1318 (2019).</li><li>Clark, J. A., Southam, K. A., Blizzard, C. A., King, A. E., Dickson, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+degeneration,+distal+collateral+branching+and+neuromuscular+junction+architecture+alterations+occur+prior+to+symptom+onset+in+the+SOD1(G93A)+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal degeneration, distal collateral branching and neuromuscular junction architecture alterations occur prior to symptom onset in the SOD1(G93A) mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 76, 35-47 (2016).</li><li>Martineau, E., Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+neuromuscular+remodeling+precedes+motor-unit+loss+in+a+mouse+model+of+ALS.">Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Shahidullah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+synapse+structure+and+function+precede+motor+neuron+degeneration+in+Drosophila+models+of+FUS-related+ALS.">Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).</li><li>Tremblay, E., Martineau, E., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+Synaptic+Alterations+at+the+Neuromuscular+Junction+in+an+ALS+Mouse+Model:+When+Motor+Units+Matter.">Opposite Synaptic Alterations at the Neuromuscular Junction in an ALS Mouse Model: When Motor Units Matter.</a> Journal of Neuroscience. 37 (37), 8901-8918 (2017).</li><li>Harris, K. P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission,+Development,+and+Plasticity+of+Synapses.">Transmission, Development, and Plasticity of Synapses.</a> Genetics. 201 (2), 345-375 (2015).</li><li>Beramendi, A., Peron, S., Casanova, G., Reggiani, C., Cantera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+in+abdominal+muscles+of+Drosophila+melanogaster+during+adulthood+and+aging.">Neuromuscular junction in abdominal muscles of Drosophila melanogaster during adulthood and aging.</a> Journal of Comparative Neurology. 501 (4), 498-508 (2007).</li><li>Banerjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniature+neurotransmission+is+required+to+maintain+Drosophila+synaptic+structures+during+ageing.">Miniature neurotransmission is required to maintain Drosophila synaptic structures during ageing.</a> Nature Communications. 12 (1), 4399 (2021).</li><li>Liao, S., Broughton, S., Nassel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+Senescence+and+Aging-Related+Changes+in+Motor+Neurons+and+Brain+Neuromodulator+Levels+Are+Ameliorated+by+Lifespan-Extending+Reproductive+Dormancy+in+Drosophila.">Behavioral Senescence and Aging-Related Changes in Motor Neurons and Brain Neuromodulator Levels Are Ameliorated by Lifespan-Extending Reproductive Dormancy in Drosophila.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 111 (2017).</li><li>Mahoney, R. E., Rawson, J. M., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-dependent+change+in+the+set+point+of+synaptic+homeostasis.">An age-dependent change in the set point of synaptic homeostasis.</a> Journal of Neuroscience. 34 (6), 2111-2119 (2014).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+adult+neuromuscular+system.">Development of the adult neuromuscular system.</a> International Review of Neurobiology. 43, 221-239 (1999).</li><li>Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metamorphosis+of+the+central+nervous+system+of+Drosophila.">Metamorphosis of the central nervous system of Drosophila.</a> Journal of Neurobiology. 21 (7), 1072-1084 (1990).</li><li>Baek, M., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+and+birth+date+specify+motor+neuron+targeting+and+dendritic+architecture+in+adult+Drosophila.">Lineage and birth date specify motor neuron targeting and dendritic architecture in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).</li><li>Enriquez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+individual+adult+motor+neuron+morphologies+by+combinatorial+transcription+factor+codes.">Specification of individual adult motor neuron morphologies by combinatorial transcription factor codes.</a> Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).</li><li>Soler, C., Daczewska, M., Da Ponte, J. P., Dastugue, B., Jagla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+muscles+and+tendons+of+the+Drosophila+leg.">Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg.</a> Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).</li><li>Guan, W., Venkatasubramanian, L., Baek, M., Mann, R. S., Enriquez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualize+Drosophila+Leg+Motor+Neuron+Axons+Through+the+Adult+Cuticle.">Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58365 (2018).</li><li>Agudelo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+degeneration+of+an+identified+adult+leg+motor+neuron+in+a+Drosophila+SOD1+model+of+ALS.">Age-dependent degeneration of an identified adult leg motor neuron in a Drosophila SOD1 model of ALS.</a> Biology Open. 9 (10), (2020).</li><li>Fernius, J., Starkenberg, A., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bar-coding+neurodegeneration:+identifying+subcellular+effects+of+human+neurodegenerative+disease+proteins+using+Drosophila+leg+neurons.">Bar-coding neurodegeneration: identifying subcellular effects of human neurodegenerative disease proteins using Drosophila leg neurons.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 10 (8), 1027-1038 (2017).</li><li>Sreedharan, J., Neukomm, L. J., Brown, R. H., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+TDP-43-Mediated+Motor+Neuron+Degeneration+Requires+GSK3,+hat-trick,+and+xmas-2.">Age-Dependent TDP-43-Mediated Motor Neuron Degeneration Requires GSK3, hat-trick, and xmas-2.</a> Current Biology. 25 (16), 2130-2136 (2015).</li><li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes.">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Guirado, R., Carceller, H., Castillo-Gomez, E., Castren, E., Nacher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+images+for+molecular+quantification+in+immunohistochemistry.">Automated analysis of images for molecular quantification in immunohistochemistry.</a> Heliyon. 4 (6), 00669 (2018).</li><li>Castells-Nobau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Algorithms+for+High-throughput+and+Multi-parametric+Quantification+of+Drosophila+Neuromuscular+Junction+Morphology.">Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55395 (2017).</li><li>Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+image+analysis+pipeline+for+Drosophila+motor+neurons.">Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons.</a> Biology Methods and Protocols. 4 (1), (2019).</li></ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

الساق البالغة Drosophila هو نموذج مثالي لدراسة التنكس العصبي نظرا البساطة النسبية مع MNs تتميز بشكل جيد تعيينها من الأنساب neuroblast وأنماط التشجير النمطية. وقد استخدمت عدة تقارير سابقا MNs الساق لدراسة الأمراض العصبية21,22. استخدمت هذه الدراسات خطوط التعبير عن GFP جنبا إلى جنب مع تحليل الفسيفساء مع علامة الخلية القابلة للقمع (MARCM) للصورة من خلال السفاح ووثقت سلسلة من التغييرات المورفولوجية. تصوير NMJs الكبار عن طريق الكيمياء المناعية مع كتل استئصال تمكن من مزيد من التوصيف مع القدرة على تتبع التغيرات الجزيئية المعقدة باستخدام صندوق أدوات من الأجسام المضادة المتاحة.
جزء الكيمياء المناعية من هذا البروتوكول هو معيار نسبيا ويمكن تنفيذها مستقلة عن النمط الجيني (انظر23 للحصول على وصف ممتاز لأساليب تلطيخ الأجسام المضادة العامة للاستخدام مع Drosophila). وعلاوة على ذلك، يمكن تحديد معلمات مثل كثافة الفلورسينس، وطول فرع المحور، وأرقام وحجم بوتون باستخدام مجموعة متنوعة من وحدات الماكرو المتاحة ImageJ بمجرد التقاط الصور ونشر أساليب مفصلة للتحليل الكمي (على سبيل المثال، انظر 24،25،26). وبالتالي ، فإن تقنية التشريح هي الابتكار الرئيسي الموصوف هنا. قبل تشريح، يتم غمر الذباب في الكحول لتجريد الهيدروكربونات مقطعي. ويستخدم الإيثانول والميثانول عادة لهذا الغرض؛ ومع ذلك، استخدمنا الميثانول فقط. حاسمة لنجاح تشريح عدة عوامل: أولا، باستخدام ملقط المعدلة مع شطبة يسمح للاتصال سطحية جدا مع كتل. ثانيا، باستخدام مجهر تشريح قادر على التكبير الكلي 60-100x بحيث يكون سطح السفاح مرئيا بوضوح. بالنسبة للمجاهر ذات الحد الأقصى الأدنى من التكبير ، تتوفر أهداف 2x لمعظم العلامات التجارية الشائعة ويجب أن تكون كافية عند دمجها مع العدسات الموجودة. ثالثا، خطوة التثبيت الأولي يجعل الجلد هشة وأسهل لسحب بعيدا دون الإضرار العضلات تحت. الإفراط في التثبيت في هذه الخطوة يجعل الساق بأكملها قاسية جدا لتشريح فعال. لذلك، يجب أن يقتصر التثبيت الأولي إلى 30 دقيقة. فإن مثبت الفورمالديهايد لا تخترق ما يكفي لتقاطع الأنسجة الكامنة بشكل فعال خلال هذه الفترة القصيرة، وبالتالي خطوة التثبيت الثاني ضروري. قبل التثبيت الثاني ، يجب الاحتفاظ بالأنسجة على الجليد لمنع التدهور والتغيرات في مورفولوجيا. رابعا، وجدنا تشريح العينات في حين أن البرد مهم أيضا، من المرجح لأسباب مماثلة في أن الجلد هش ويمكن إزالة قطعة صغيرة بسهولة أكبر.
مع الممارسة، نجد ~ 50٪ من تشريح ستكون قابلة للاستخدام في أي ضرر الأنسجة ملحوظ. على الرغم من أن هذه النسبة المئوية قد تبدو منخفضة بالنسبة لبعض الأنسجة الأخرى ، فإن إجراء التشريح سريع ، ويمكن معالجة العديد من الساقين في 30-60 دقيقة. لذلك، حتى لو كانت معدلات النجاح منخفضة في البداية، فمن الممكن الحصول على عينات جيدة 4-5 لكل مجموعة تجريبية. ومع ذلك، قد يكون الحد من عدد الذباب المتاحة في أي وقت من الأوقات إذا كانت الأنماط الجينية و / أو العمر يؤدي إلى فتك كبير.
وهناك قيد آخر هو أننا لم نتمكن من تشريح مناطق أخرى من الساق خارج المنطقة القريبة من عظم الفخذ بسبب الحجم. وهكذا، يمكننا دراسة تحديد MN arbors innervating TILM موثوق بها، وأنه من الممكن تشريح لطيف فوق عضلة الاكتئاب الساق مع تغييرات صغيرة على الطريقة التي يتم توجيه الساق عند تشريح. ومع ذلك ، فقد ثبت أن الوصول إلى مناطق أخرى من الساق أكثر صعوبة دون تعطيل العمارة المحورية أثناء التشريح.
هنا، نقدم طرق تشريح للكشف عن التغيرات في NMJ الكبار لMNs محددة الداخلية tilm باستخدام الكيمياء المناعية. الساق مفيدة كنظام بسيط، ت الداخلي من قبل ~ 50 MNs فقط وتحتوي على 14 العضلات مع التشريح وصفت جيدا. يمكن استخدام إعداد الساق تشريح عبر الأنماط الجينية ومجموعة من الأجسام المضادة متاحة لتصور NMJ دون الحاجة إلى بناء مخزونات معقدة جينيا من بنيات الجينات مراسل في خلفيات متحولة. وسيمكن هذا النهج من تحديد وصف أكثر تفصيلا للتغيرات في ال NMJ لأمراض MN وغيرها من الحالات المرتبطة بالعمر.

تشمل أمراض الخلايا العصبية الحركية (MN) مجموعة من الحالات غير المتجانسة التي تشمل الانحطاط التدريجي مما يؤدي إلى إهدار العضلات والشلل كنمط الظاهري السريري الأساسي1. وعلى الرغم من ندرة الانتشار العالمي بنسبة 4.5 لكل 000 100، فمن المتوقع أن يزداد هذا الانتشار مع شيخوخة السكان(2). التصلب الجانبي الضموري (ALS) هو مرض MN الأكثر شيوعا (MND) وعادة ما يكون قاتلا في غضون فترة قصيرة من التشخيص مع عدم وجود علاجات تعديل المرض المتاحة3. تشترك MNDs في مرحلة مشتركة طويلة قبل أعراض مع تغييرات العلامات الحيوية الجزيئية المبكرة وتغييرات التصوير الوظيفي التي شوهدت في المرضى4. كما لوحظ الأمراض الخلوية في وقت مبكر قبل أعراض في نماذج الأمراض غير البشرية5،6،7،8. دراسة التغيرات المبكرة عند التقاطع العصبي العضلي مهم لفهم مسببات الأمراض مرض MN ويمكن أن تساعد في تطوير التشخيص المبكر والعلاجات المحتملة.
توجد ثروة من الأدوات الوراثية والجزيئية في Drosophila لتشريح بنية ووظيفة التقاطع العصبي العضلي (NMJ ، see9 لمراجعة NMJ اليرقات ذات السمات الجيدة). هذه الأدوات جنبا إلى جنب مع عمر قصير جعل Drosophila نموذجا ممتازا لدراسة التغيرات العصبية في NMJ. على وجه التحديد، MNs الداخلية عضلات الكبار موجودة طوال عمر البالغين ~ 90 يوما وتخضع لعمليات الشيخوخة العادية10،11،12،13. ولذلك توفر MNs الكبار فرصة لدراسة التغيرات التنكسية البطيئة على النقيض من NMJs اليرقات التي توجد لفترة قصيرة ~ 1 أسبوع فقط قبل التحول14،15.
هنا، نقوم بوصف إجراء تشريح يسمح لنا بإجراء تحليل كيميائي مناعي لل MNs في ساق البالغين. يتم تنشيط كل ساق بالغة من قبل ~ 50 MNs ، والتي متشابكة على الساق المرتبطة العضلات لدفع الحركة. وقد وصفت جيدا تشريح الساق، وعلم وظائف الأعضاء الميكانيكية، وعلم الأعصاب16،17،18. وقد سبق أن تميزت أربورات أكسون من MNs الساق عن طريق التصوير من خلال كتيكل في مجموعات الخلايا مملوءة بالظهر أو المسمى وراثيا باستخدام نظام Gal4/UAS ثنائي الأطراف وقد نشرت أساليب التصوير سابقا19. تحافظ طرق التشريح المعروضة هنا على مورفولوجيا متفرعة المحور العصبي وتسمح لنا باستغلال مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة لتسمية المكونات الجزيئية المختلفة ل NMJ. وقد ركز عملنا السابق على إسقاطات MN محددة في الساق metathoracic (3) ، الذي innervates عضلة الساق ليفاتور (tilm) ويظهر أنماط التشجير متسقة وأرقام بوتون. في البداية درسنا التغيرات المعتمدة على العمر في Drosophila superoxide dismutase 1 (dsod1) المسوخ ووجدت تعديلات تتفق مع تفكيك NMJ20. توفر طرق التشريح هذه الفرصة لتوصيف أفضل للتغيرات التنكسية البطيئة في NMJ لنماذج ALS الأخرى والدراسات الأساسية للشيخوخة وغيرها من الأمراض المرتبطة بال MN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig01.jpg"> الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 ملخص سير العمل لتشريح الساقين. راجع البروتوكول للحصول على خطوات تفصيلية. (أ، ب) يتم اختيار الذباب وتخديره. (ج) يتم نقل الذباب إلى الميثانول وغسلها مع برنامج تلفزيوني. (د) تتم إزالة الساقين metathoracic في قاعدة كوكسا في حين تصور مع المجهر تشريح (~ 30x التكبير)؛ شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ه) ثم يتم إصلاح الساقين في حل 3.7٪ الفورمالديهايد / PBS (FA) لمدة 30 دقيقة داخل آبار من لوحات 24 بئرا ومن ثم تتم إزالة الاتحاد الإنجليزي عن طريق يغسل مع برنامج تلفزيوني. (واو، ز، ح) يتم نقل الساقين إلى صواني تشريح الاستومر السيليكون ويتم إزالة قطعة من الجلد من عظم الفخذ القريب باستخدام ملقط مشطوف في حين تصور تحت المجهر تشريح في 80x; شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (I) الساقين هي مرحلة ما بعد تشريح ثابتة في الاتحاد الانجليزي وغسلها في برنامج تلفزيوني ثم PBT (PBS + 0.1٪ غير الأيونية السطحي). (J) الساقين تتعرض لتلطيخ الكيميائية المناعية. (ك، ل) يتم نقل الساقين إلى شريحة زجاجية، مسح في وسائل الإعلام المتصاعدة، وتغطي مع غطاء يحتوي على الفواصل الطينية. أشرطة المقياس = 2 مم و 500 ميكرومتر. (M) يتم تصوير الساقين عن طريق المجهر confocal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td>Hydrophobic, ultra-low attachment surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x objective accessory</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>110AL2X</td>
			<td>Screw-on attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ATP5A primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14748</td>
			<td>Mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-bruchpilot primary antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82</td>
			<td>Mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-discs large primary antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td>Mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hrp primary antibody</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>123-605-021</td>
			<td>Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>04-263</td>
			<td>Mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td>Objectives (NA):&#160; 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>160-190 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Dumont #5SF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td>37% stock stabilized with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>115-545-146</td>
			<td>Alexa Fluor 488 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB036768</td>
			<td>0.2 mm filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory sealing tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-254</td>
			<td>Parafilm M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-123</td>
			<td>76mm x 25mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S36972</td>
			<td>Slowfade Diamond mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>215680010</td>
			<td>Triton-X 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S06622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34055</td>
			<td>Alexa Fluor 555- conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpening stone</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>29008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>2423610</td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunohistochemistry of the drosophila adult leg to detect changes at the neuromuscular junction for an identified motor neuron

Drosophila melanogaster يمثل نموذجا وراثيا لدراسة بنية الخلايا العصبية ووظيفتها، والتغيرات اللاحقة في حالات المرض. غالبا ما يستخدم التقاطع العصبي العضلي اليرقاتي المميز جيدا لمثل هذه الدراسات. ومع ذلك ، فإن التطور السريع لليرقات يليه انحلال العضلات وإعادة عرض الجهاز العصبي أثناء التحول يجعل هذا النموذج إشكاليا لدراسة التغيرات التنكسية البطيئة المعتمدة على العمر مثل تلك التي تحدث في التصلب الجانبي الضموري. بدلا من ذلك، يعيش الذباب البالغ لمدة 90 يوما ويمكن استخدام ساق البالغين لدراسة تغيرات الخلايا العصبية الحركية على مدار عمر البالغين باستخدام التصوير الفلوري في الجسم الحي من خلال السفاح. هنا، ونحن نصف تقنية تشريح الساق إلى جانب الكيمياء المناعية، والذي يسمح لدراسة التغيرات الجزيئية في تقاطع العصبية والعضلية من الخلايا العصبية الحركية الساق الكبار المحددة. ويمكن أن يقترن هذه التقنيات مع عدد لا يحصى من الأجسام المضادة وضع العلامات على حد سواء قبل وبعد الهياكل متشابك. معا هذه الإجراءات تسمح وصفا أكثر اكتمالا للتغيرات البطيئة التي تعتمد على العمر في الذباب الكبار ويمكن تطبيقها عبر نماذج مرض الخلايا العصبية الحركية متعددة.

يظهر الشكل 4 مثالا تمثيليا لساق ميتاثوراسيك ملطخة بمضادات الهرب، ومكافحة الدلغ، وال phalloidin. بالنسبة للتشريحات التي تزيل الجلد من الجزء القريب من عظم الفخذ ، ستكون الأربوريات النمطية واضحة بالقرب من الوتر الذي يتم اكتشافه بسهولة عن طريق الفلورة الذاتية. لاحظ أن اختراق الأجسام المضادة في الساق يحدث لمسافة قصيرة خارج المنطقة التي تمت إزالة كتل فيها (الشكل 4A). ويمكن تصوير هذه المناطق بشكل فعال عندما تكون إشارة الفلورسينس قوية موجودة. التصوير عند التكبير المنخفض (20x مع التكبير 2x) يسمح بسهولة تحديد 1) كم هو إزالة كتل، و 2) ما إذا كان الضرر حدث أثناء تشريح. زيادة التكبير (60x) يظهر الإسقاطات النمطية على tilm (الشكل 4B). وقد ركز عملنا على MN واحد، المستمدة على الأرجح من النسب I-MN التي innervate tilm في عظم الفخذ القريبة (مربع، الشكل 4B والشكل 4C). زيادة التكبير كذلك (100x مع 2x التكبير) يسمح لتصور فعال من boutons متشابك (الشكل 4D).
لدراسة التغيرات المورفولوجية في NMJ الكبار مع مرور الوقت، استخدمنا سابقا المسوخ dsod1 كنموذج ل ALS. يحدث تورم بوتون في المسوخ dsod1H71Y الذين تتراوح أعمارهم بين نسبة إلى dsod1nulland dsod1 + (الشكل 5A، B). في NMJ اليرقات ، وغالبا ما يستخدم الأجسام المضادة أحادية النسيلة NC82 لتسمية المناطق النشطة ، وهذا يمكن تصور هذه الهياكل بسهولة في NMJ الكبار (الشكل 5C). فروع محور المحور HRP ضعيفة الإيجابية وفيرة في المسوخ dsod1H71Y وهذه الفروع غالبا ما تظهر تعريب BRP ضعيفة ومنتشرة (الأسهم).
مهم للتجدد العصبي، يمكن للأجسام المضادة المتاحة تجاريا الكشف عن البروتينات في كل مكان غالبا ما توجد في المجاميع، ولقد اكتشفنا المجاميع في كل مكان داخل محاور المحطة الطرفية من MNs في الذباب dsod1 متحولة العمر وكذلك داخل العضلات (الشكل 6A). أيضا، يمكن للأجسام المضادة وضع العلامات الميتوكوندريا أيضا الكشف عن التغيرات المورفولوجية مع التقدم في السن (الشكل 6B).
بالنسبة لبعض التحضيرات، فإن تلف العضلات أثناء التشريح يجعل العينة غير صالحة للاستخدام. في البداية ، يمكن أن يكون هذا الضرر حدثا شائعا ، ولكن يحدث التحسن مع الممارسة. ومن الأمثلة على التشريح الجيد الشكل 7 ألف، جيم، بينما تظهر عمليات التشريح السيئة في الشكل 7B، دال. تشريح الفقراء يسبب عدم تنظيم ألياف العضلات كما تم الكشف عنها عن طريق المجهر النقيض المرحلة (الشكل 7B) أو ألياف العضلات المفقودة تصورها phalloidin الفلورسنت المترافقة (الشكل 7D، السهم). الجمع بين استخدام phalloidin لتسمية العضلات، والصور الخفيفة المنقولة يمكن أن تساعد على الكشف عن مثل هذا الضرر العضلات التي قد لا تكون واضحة عند عرض تحت المجهر تشريح.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig03.jpg"> الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن تشريح الساق دروسوفيلا . (أ) رسم تخطيطي للجانب الأمامي من الساق الميتاثوراسيكية ، يتميز بوجود شعيرات على النقيض من بشرة عارية بارزة موجودة على الجانب الخلفي. وتتألف الساق مجزأة من كوكسا (CX)، trochanter (Tr)، عظم الفخذ (Fe)، الساق (Ti)، 5 شرائح القطران (Ta1-5)، ومخلب (Cl) من أجل من قريب (العلاقات العامة) إلى البعيدة (دي). كما يشار إلى جانبي عظم الفخذ الظهري (D) والبطين (V). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) رسم تخطيطي لعظم الفخذ الذي يحتوي على ليفاتور الساق (tilm) ، والاكتئاب الساق (tidm) ، وعضلات الوتر الطويلة 2 (ltm2) وعضلات إعادة تنشيط الساق (tirm) وإسقاطات المحور في عظم الفخذ القريب الداخلي للبلسم. ويفترض أن هذه الإسقاطات المحورية النمطية مشتقة من الأرومات العصبية من سلالة I16، والتشجير الثاني هو أسهل الوصول إليها عن طريق التشريح (محاصر). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig04.jpg"> الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال تشريح عظم الفخذ metathoracic كشفت النمطية MN العمارة innervating tilm. تم استخدام الكيمياء المناعية لوضع علامة على الخلايا العصبية (HRP) والأقراص الكبيرة (DLG) والعضلات (phalloidin). تم التقاط Z-مداخن عن طريق التصوير المجهري confocal من خلال عظم الفخذ بأكمله وأظهرت كعرض سلسلة الحد الأقصى. (أ) كما أدرجت قناة ضوئية منقولة لتوضيح عدم حدوث أي تلف في العضلات يمكن اكتشافه أثناء التشريح. تم التقاط الصورة في 20x التكبير، شريط مقياس = 50 ميكرومتر. (ب) المشتلات المحددة المرتبطة بالبلسم (المنطقة المعلبة، الوسط)، شريط المقياس = 20 ميكرومتر؛ و (ج) عند التكبير 60x، شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (د) DLG المحيطة boutons كان واضحا في الحيوانات البرية نوع عندما صورت في التكبير 100x مع التكبير 2x؛ شريط المقياس = 2 ميكرومتر <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig05.jpg"> الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم مثال على التغيرات التي تعتمد على العمر في مورفولوجيا بوتون التي يمكن اكتشافها باستخدام تقنية تشريح الساق. وينظر بوتون تورم في المسوخ dsod1H71Y الذين تتراوح أعمارهم بين. (أ) صور تمثيلية من boutons الملون HRP من الشباب (eclosed حديثا، اليوم 0 البالغين) والذباب القديم (اليوم 10)، شريط مقياس = 1 ميكرومتر. (ب) تم قياس أحجام بوتون كميا من الأنماط الجينية ذات الصلة باستخدام وظيفة القياس داخل ImageJ. ع<0.0001 (2-اتجاه ANOVA مع اختبار توكي ما بعد مخصص). (ج) المناطق النشطة داخل بوتونات متشابك المسمى مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة NC82 (المضادة للbruchpilot)؛ شريط المقياس = 1 ميكرومتر. الشكل المعدل من20Please <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig05large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig06.jpg"> الشكل 6 - الأرقام 6- الأرقام 10 علامات مشتركة المرتبطة الأمراض العصبية المستخدمة في الاستعدادات الساق Drosophila. (أ) يتم الكشف عن المجاميع متعددة الخلايا في محاور المحطة الطرفية والعضلات من الذباب dsod1H71Y الذين تتراوح أعمارهم بين. يكشف علم الكيمياء المناعية باستخدام مضاد البوليبيكيتين (FK2) عن puncta (أسهم) في dsod1H71Y/H71Y القديمة، وشريط المقياس = 20 ميكرومتر (يسار) و5 ميكرومتر (يمين). (ب) يمكن الكشف عن الميتوكوندريا منتفخة باستخدام المضادة ATP5A، شريط مقياس = 1 ميكرومتر. الشكل المعدل من20Please <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig06large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig07v2.jpg"> الشكل 7 - الأرقام 7- الأرقام التي تم أمثلة على التشريح الجيد والفقير. (أ) تشريح التي لم تعطل بنية العضلات الكامنة. (ب) مثال على سوء تشريح التي أظهرت ألياف العضلات المتوترة (السهم) ، ولا يمكن استخدامها للتحليل. تم تصوير كلتا العينتين عن طريق المجهر على النقيض من المرحلة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ج) مثال على تشريح جيد مصور بالمنظار المجهري البؤري مع HRP (أخضر) وphalloidin (أزرق). (د) تشريح الفقراء في عداد المفقودين ألياف العضلات الظهرية من تيلم في عداد المفقودين (السهم). شريط المقياس = 50 ميكرومتر <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig07large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الأجسام المضادة / وصمة عار</td>
			<td>التخفيف*</td>
		</tr>
<tr>
<td>مكافحة ATP5A</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>مضادة للبروشبلوت (nc82)</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
<tr>
<td>بروتين سلسلة مضادة للسيستين (ab49)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>مكافحة الأقراص الكبيرة (4F3)</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
<tr>
<td>مكافحة hrp</td>
			<td>1:550</td>
		</tr>
<tr>
<td>مكافحة البوليبيكيتين (FK2)</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>مكافحة الريبو (8D12)</td>
			<td>1:5</td>
		</tr>
<tr>
<td>الماعز المضادة للفأرة الأجسام المضادة الثانوية</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
<tr>
<td>فالويدين</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>* تمييع في 5٪ NGS</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2 - الأرباح الأجسام المضادة و المخففات. ويرد الموردون التجاريون للأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسات في قائمة المواد.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron at JoVE.com

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

نحن نصف تقنية تشريح تحافظ على بنية التقاطع العصبي العضلي وتمكن من دراسة كيميائية مناعية مفصلة للخلايا العصبية الحركية في ساق دروسوفيلا البالغة.

تشريح والكيمياء المناعية من الساق الكبار Drosophila للكشف عن التغيرات في تقاطع العصبية والعضلية لخلية عصبية محركية محددة

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

الهدف العام لهذا الإجراء هو إظهار طرق تشريح الساق الكبار من Drosophila. تزيل هذه التقنية جزءا من الشرج ، مما يعرض الأنسجة الأساسية بطريقة تحافظ على بنية الخلايا العصبية والعضلات. يسمح لنا هذا الإجراء بتوصيف التقاطع العصبي العضلي ل أربور الخلايا العصبية الحركية المحددة ، باستخدام التقنيات الكيميائية المناعية القياسية.تشريح مفيد بشكل خاص لدراسة التغيرات التنكسية البطيئة التي تحدث على مدى فترات طويلة نسبيا من الزمن. الجانب الزمني هو اعتبار مهم ، لأن التقاطع العصبي العضلي المميز ليرقات Drosophila مستقر لمدة خمسة إلى سبعة أيام تقريبا قبل ظهور التحول. على العكس من ذلك ، فإن الخلايا العصبية البالغة موجودة طوال حياة ذبابة الكبار ، ما يقرب من 90 يوما لDrosophila melanogaster البرية من النوع ، التي تربى في المختبر.هذه التقنية مرنة ويمكن تطبيقها على مجموعة من الأنماط الجينية لنماذج الأمراض المختلفة ، والاستفادة من مجموعة من الأجسام المضادة المتاحة ل Drosophila كنظام نموذجي. الهدف العام لهذا الإجراء هو إظهار طرق تشريح الساق الكبار من Drosophila. هذه التقنية يزيل جزءا من كتل، وفضح الأنسجة الكامنة في الطريقة التي تحافظ على الهندسة العصبية والعضلات.باستخدام فرشاة الطلاء، نقل الذباب إلى الميثانول البارد في بئر زجاجي أو طبق لمدة 30 ثانية تقريبا إلى دقيقة واحدة. يقوم الميثانول بتشحيم الهيدروكربونات القطعية، ويمكن الآن غمر الذباب بدلا من تعويمه في المحاليل المائية. مع ملقط، نقل الذباب بعناية إلى برنامج تلفزيوني.شطف ثلاث مرات في الجليد البارد PBS لإزالة الميثانول الزائد، والحفاظ على الذباب في برنامج تلفزيوني على الجليد حتى تشريح والتثبيت. عند هذه النقطة ، يجب تشريح الذباب وإصلاحه في أقصر وقت ممكن ، ويفضل أن يكون أقل من 30 دقيقة. نقل الذباب إلى طبق تشريح الاستومر السيليكون مليئة برنامج تلفزيوني الباردة.إزالة الساقين metathoracic في كوكسا باستخدام اثنين من أزواج من ملقط دومون رقم خمسة، أو قطع الساقين مع مقص فاناس. نقل الساقين إلى بئر في البلاستيك، 24 لوحة بئر مليئة ميل واحد من برنامج تلفزيوني، والحفاظ على لوحة على الجليد حتى تتم إزالة جميع الساقين ونقلها إلى الآبار. نحن عادة استخدام 20 الساقين في البئر.استبدل حل PBS بحل واحد من المليلتر FA، وتناوب على جهاز نوتاتور لمدة 30 دقيقة. إعداد نوتاتور هو أن يتم تعيين بسرعة متوسطة. تأكد من أن الساقين مغمورتان بالكامل في المحلول خلال هذا الوقت.لإزالة حل الاتحاد الانجليزي، يغسل في برنامج تلفزيوني واحد مليون ثلاث مرات بسرعة، تليها ثلاثة يغسل إضافية لمدة خمس دقائق لكل منهما في برنامج تلفزيوني واحد ميل. عقد الأنسجة في برنامج تلفزيوني واحد ميل على الجليد، قبل وأثناء خطوات تشريح. لتقديم لمحة موجزة عن تشريح الساق Drosophila ، يشار إلى شرائح الساق ، بما في ذلك كوكسا ، trochanter ، عظم الفخذ ، الساق ، وخمسة أجزاء من القطران.هنا نرى وجهة نظر الأمامية للساق، المعترف بها من خلال وجود شعيرات الحسية بدلا من الجلد عارية موجودة على الجانب الخلفي. كما يشار إلى اتجاه المحور القريب البعيدة والمحور الظهري البطني. يزيل إجراء التشريح هذا قطعة صغيرة من الجلد من عظم الفخذ القريب ، بحيث يمكن دراسة أربور المحور ، الذي يعرض الظهر ، وينقح عضلة الساق.وقد ركز عملنا السابق على أربور المشار إليها، التي تنشأ من النسب العين الأرومية العصبية المفترضة. في هذا الجزء من الإجراء، نقوم بإزالة كتيكل من الجانب الأمامي من عظم الفخذ. ملقط تشريح حاسمة للنجاح، ولقد وجدنا أن إدخال منحنى طفيف في نهاية عدد خمسة ملقط غرامة فائقة يوفر شطبة الذي يسمح للكفاح أن أمسك سطحيا، بدلا من أن تكون مطعون، والتي يمكن أن تدمر الأنسجة.نقل الساقين إلى طبق الاستومر السيليكون في برنامج تلفزيوني لتشريح. باستخدام زوج واحد من ملقط، دبوس الجزء الساق إلى طبق الاستومر السيليكون كما هو مبين هنا على الجانب الأيمن. باستخدام ملقط أخرى عقدت الجانب شطبة أسفل، والاستيلاء على قطعة من الجلد على الطرف القاصي من عظم الفخذ وسحب في الاتجاه القريب نحو trochanter.الحفاظ على إزالة الجلد منهجيا حتى العضلات العارية مرئية في جميع أنحاء نهاية قريبة من عظم الفخذ. مرة واحدة يتم تشريح جميع الساقين، واستبدال برنامج تلفزيوني مع حل الاتحاد الانجليزي ل postfix الساقين لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز على نوتاتور بسرعة متوسطة. بعد ذلك، غسل العينات في برنامج تلفزيوني واحد مليون لمدة ثلاث مرات سريعة، ثم ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منهما في حل PBT.لمنع الأنسجة، واستبدال واحد مل PBT مع حل حجب تتكون من واحد ميل 5٪ مصل الماعز العادي المخفف في PBT. حضانة تشريح الساقين لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. إزالة حل حظر واستبدال مع الأجسام المضادة الأساسية التي يتم تخفيفها في حل حظر.هنا ، نحن نستخدم أقراص مضادة كبيرة في تخفيف واحد إلى 200. وضع لوحات مرة أخرى على شاكر واحتضان في أربع درجات بين عشية وضحاها. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية، اغسل الأجسام المضادة الأولية في PBT واحد لمدة ثلاث مرات لفترة وجيزة، ثم ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما.كتلة الأنسجة مرة أخرى في طاحونة واحدة 5٪ مصل الماعز العادي لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. إزالة حل حجب وإضافة 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة الفلورسنت المناسب. بالإضافة إلى ذلك، إضافة واحدة إلى عام 2000 تخفيف phalloidin مترافقة مضان لتسمية العضلات.لاحتضان، وختم الآبار مع مختبر ختم الشريط والغطاء. أيضا، لوحات التفاف في رقائق الألومنيوم لحماية الفلوروفوريس من الضوء. احتضان لمدة ست إلى ثماني ساعات في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المنضمة، قم بإجراء عمليات غسل باستخدام PBT بطريقة مماثلة تم وصفها سابقا عند غسل الأجسام المضادة الأولية. بعد هذه الخطوة، العينات جاهزة الآن ليتم تحميلها وصورها. ترتيب الساقين الجانب الأمامي لأعلى، وتغطي مع وسائل الإعلام تصاعد إضافية إذا لزم الأمر.كشط بلطف زوايا زلة غطاء عبر كرة الطين. الطين الناتج سيكون بمثابة فاصل بين الشريحة وزلة الغطاء ، بحيث لا يتم سحق الأنسجة. اضغط لأسفل على زلة الغطاء حتى يتم لمس الجزء العلوي من الساقين.ختم حواف مع طلاء الأظافر وتخزينها في أربع درجات حتى التصوير. الصورة بواسطة المجهر البؤري باستخدام معلمات التصوير الموضحة في القسم الرابع من البروتوكول المكتوب. للمساعدة في التحقق من صحة بروتوكول التشريح ، نقوم أولا بتصوير الساقين عن طريق المجهر التبايني المرحلي عند التكبير المنخفض.هنا مثال على لوحة A من تشريح جيدة على اليسار، وتشريح سيئة على اليمين التي تعطلت ألياف العضلات. لوحة C يظهر صورة confocal من تشريح جيدة في العضلات التي لم تتعطل. في المقابل، تظهر اللوحة D ساقا تالفة أثناء التشريح، حيث تكون ألياف العضلات مفقودة، كما يشير السهم.هنا، لطخنا الساقين المصورة مع peroxidase المضادة للجلجل للكشف عن العمليات العصبية، كما هو موضح هنا في الأخضر، وأقراص مضادة كبيرة، مما يسهل تجمع مستقبلات الغلوتامات postynaptic، كما هو مبين في الأحمر، وphalloidin لتسمية العضلات، كما هو موضح باللون الأزرق. عند التقاطها في 20X التكبير مع قناة ضوء المرسلة، فمن السهل أن نرى المنطقة تشريح. لاحظ أن الأجسام المضادة تخترق جزئيا المناطق غير المقتطعة ، ويمكن رؤيتها من خلال البشرة كما هو مبين في السهم الأبيض.كل من الخلايا العصبية الحركية الساق جعل التوقعات النمطية عند تنشيط العضلات. يركز عملنا على الخلايا العصبية الحركية التي ت الداخلي عضلة الساق ليفاتور، كما هو موضح هنا كمنطقة محاصر وأشار إليها السهم الأبيض. في أعلى تكبير 60X مع 2X التكبير على أعلى اليمين، يمكننا أن صورة بشكل فعال boutons، هو مبين باللون الأخضر، والمحيطة DLG هو مبين باللون الأحمر.زيادة التكبير أكثر من ذلك ، أو يخطو إلى هدف 100X ، يسمح للقياس الكمي لحجم بوتون ومورفولوجيا كما هو مبين في أسفل اليمين. باستخدام تقنية التشريح هذه جنبا إلى جنب مع الكيمياء المناعية ، وجدنا أن هناك تورم بوتون يعتمد على H في نموذج متحول sod1 من ALS ، كما هو موضح هنا في الساقين H71Y القديمة ، مقارنة بعناصر التحكم في النوع البري كما هو مبين في السهام. يتم قياس أحجام بوتون في مؤامرة سرب النحل إلى اليمين.وجدنا كذلك انخفاضا في علامة المنطقة النشطة Bruchpilot ، الموضحة باللون الأحمر ، داخل محاور HRP الملطخة بشكل ضعيف ، الموضحة باللون الأخضر ، من المسوخ H71Y. لدراسة التنكس العصبي ، غالبا ما يتم الكشف عن مجاميع البروتين في كل مكان من قبل الأجسام المضادة FK2 ، وتظهر هنا على أنها puncta إيجابية FK2 ، في محاور عصبية وعضلات ذباب sod H71 الذي يبلغ من العمر على الجانب الأيمن ، المشار إليه بالسهام. وأخيرا، يمكن تصور الميتوكوندريا عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام جسم مضاد ATP5a أحادي النسيلة، كما هو موضح هنا باللون الأحمر داخل عضلة الساق.وجدنا أن الميتوكوندريا تصبح مكبرة مع التقدم في السن في المسوخ H71Y. بمجرد إتقانها ، سيسمح لك إعداد الساق التشريحي وتلطيخ الأجسام المضادة المرتبطة به بتحليل التغيرات الجزيئية عند تقاطع الأعصاب العضلية للبالغين للمتحول المفضل لديك في نقاط زمنية مختلفة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

تشريح والمناعية من اليرقات، العذراء وتعليم الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; شبكية العين

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

صور متتابعة تبيض لتحديد خلايا شوان واحدة عند تقاطع الاعصاب

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

تشريح العضلات Abdominis المستعرض لتحليل تقاطع العصبية والعضلية جبل كامل

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

الكشف عن<em&gt; في الموقع</em&gt; مجمعات البروتين البروتين في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقية الموصل العصبي العضلي عن طريق القرب ربط الفحص

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

على الموصل العصبي العضلي: قياس المشبك الحجم، التغييرات تجزئة ومتشابك الكثافة البروتين عن طريق متحد البؤر مضان المجهر

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات عصبي عضلي مفرق

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

الطريقة الكهربية لالردود تسجيل بين الخلايا الجهد ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء وInterneurons إلى النور المحفزات<em&gt; في فيفو</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

قياس الأداء الوظيفي الوصلات العصبية العضلية

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...