Name: dissection and immunohistochemistry of the drosophila adult leg to detect changes at the neuromuscular junction for an identified motor neuron
Uploaded: 2022-02-12T13:30:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron at JoVE.com

我们感谢埃里克·罗伯茨（Eric Roberts）在成像方面的建议。我们还要感谢罗德岛学院的信息技术服务，特别是迈克尔·凯恩和杰克·道格拉斯的摄像。抗dlg和抗brp的单克隆抗体分别由加州大学伯克利分校和维尔茨堡大学开发，并从发展研究杂交瘤库获得，该库由NIH的NICHD创建，维护在爱荷华大学生物系，爱荷华市，IA 52242，美国。这里报告的研究得到了罗德岛机构发展奖（IDeA）生物医学研究卓越网络的全力支持，该网络来自美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所，授权号为[P20GM103430]。

与该协议结合使用的制备工作溶液的程序在 表1中描述。
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
			<td colspan="3">制备</td>
			<td colspan="2">存储</td>
		</tr>
<tr>
<td>公共广播公司</td>
			<td colspan="3">通过在蒸馏水中稀释，从10倍PBS原液溶液中制作1x PBS的工作储备。 工作PBS储液的pH值应为7.2-7.4</td>
			<td colspan="2">4°C持续1个月以上，直到细菌污染可见。</td>
		</tr>
<tr>
<td>断续器</td>
			<td colspan="3">1x PBS溶液，含0.1%非离子表面活性剂。</td>
			<td colspan="2">4°C持续1个月以上，直到细菌污染可见。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">发</td>
			<td colspan="3">3.7%甲醛溶液由37%甲醛原液制成，并在1x PBS中稀释。</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">室温。每天进行清扫</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">注意：作为37%储备溶液提供的甲醛是一种潜在的致癌物质，应在通风橱中稀释。</td>
		</tr>
<tr>
<td>5% 新糖核酸</td>
			<td colspan="3">5%正常山羊血清稀释在PBT中。 使用的血清应与要使用的二抗的种类相匹配。</td>
			<td colspan="2">4°C数周，直到细菌污染可见</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1.用于对成年果蝇腿进行免疫细胞化学的解决方案。 
1. 组织的初始固定
<ol><li>为每个基因型和年龄选择大约10只苍蝇。在二氧化碳下的苍蝇垫上麻醉（图1A，B）。 注意：开始时要比必要的苍蝇多，以确保解剖后样本量足够大。</li>
	<li>使用画笔，将苍蝇转移到玻璃孔或皿中的冷甲醇中约30秒至1分钟（图1C）。甲醇溶解角质层碳氢化合物，苍蝇现在可以被淹没而不是漂浮在水溶液中。</li>
	<li>使用镊子，小心地将苍蝇转移到PBS。在冰冷的PBS中冲洗3次以除去多余的甲醇，并将苍蝇保持在PBS的冰上，直到解剖和固定。此时，解剖苍蝇并在尽可能短的时间内（<30分钟）固定。</li>
	<li>为了隔离腿部，将苍蝇转移到装满冷PBS的硅胶弹性体解剖皿中，使用两对#5 Dumont镊子去除coxa处的中胸腿，或用Vanna剪刀切割腿部（图1D）。将支腿转移到充满1 mL PBS的塑料24孔板中的孔中，并将板保持在冰上，直到所有腿都被移除并转移到孔中。 注意：每个井至少可以容纳20条腿。</li>
	<li>用1 mL FA溶液替换PBS溶液，并在螺母器上旋转30分钟（图1E）。螺母器设置应设置为中速（17 rpm）。在此期间，确保支腿完全浸没在FA溶液中，以便充分固定。</li>
	<li>要除去FA溶液，快速在1 mL PBS 3x中洗涤，然后在1 mL PBS中再洗涤3次，每次5分钟。在下述解剖步骤之前和期间，将组织保持在冰上的1 mL PBS中。</li>
</ol>2. 去除腿部角质层和抗体染色
<ol><li>去除腿部角质层<ol>
<li>解剖镊子是成功的关键。在#5超细镊子末端的两个爪子中引入轻微的平行弯曲，以提供一个斜面，允许角质层被表面抓住而不是戳，这可能会破坏组织（图1F，G）。 注：闭合时，平行弯曲的插脚仍应在整个插脚长度上相互接触（图2）。</li>
		<li>将支腿转移到PBS中的硅胶弹性体培养皿中进行解剖。调整腿部方向，使前侧朝上（有关腿部解剖学和方向信息，请参见 图3 ）。使用一对镊子，将胫骨段固定在硅胶弹性体皿上。使用其他镊子将斜面朝下，抓住股骨远端的角质层，然后向近端方向向大转子拉动。</li>
		<li>保持有条不紊地去除角质层，直到整个股骨近端可见裸肌（图1F，G，H）。 注意：仅使用镊子的斜面与腿部进行浅表接触，以避免拉扯肌肉。</li>
		<li>解剖所有支腿后，用FA替换PBS，在固定支腿后以中速摇动螺母30分钟（图1I）。在1mL PBS中快速洗涤样品3次，然后在PBT中洗涤3次，每次5分钟（图1J）。 注意：如果用单克隆抗体NC82（抗布鲁赫普氏仪）染色以标记活性区域，则在固定后20分钟，因为该抗原对较长时间的固定敏感。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig02v2.jpg"> 图 2.用于解剖成人腿的改良镊子。 （A）镊子的末端弯曲，然后在底部（箭头）变平，通过在磨刀石上锉削形成斜面。（B）相比之下，未经修饰的镊子的爪子不弯曲。比例尺 = 1 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="2"><li>抗体染色<ol>
<li>为了阻断组织以进行抗体染色，用由1 mL稀释在PBT中的5%NGS组成的封闭溶液代替1mL PBT。在室温下孵育解剖的腿4小时，或在4°C下过夜，同时以中速（17 rpm）在螺母上摇动。在所有孵育过程中，除了塑料盖外，还要用密封胶带盖住孔（图1J）。 注意：24孔板用于免疫细胞化学，而不是1.5 mL或2 mL微量离心机，因为以前尝试使用微量离心管导致腿部骨折和组织受损。</li>
		<li>除去封闭溶液，加入300mL在新鲜封闭溶液中稀释的一抗。使用的小体积抗体应足以覆盖组织。用实验室密封胶带和塑料盖重新密封孔，并在4°C下孵育过夜，并在螺母器上以中速振荡（图1J）。用于这些研究的工作抗体试剂信息和浓度如 表2所示。</li>
		<li>在1mLPBT中短暂洗涤一抗3次，然后3次，每次15分钟（图1J）。 注意：如果稀释的一抗在4°C下储存长达2周，则可以保存并重复使用。</li>
		<li>在1mL 5%NGS中再次阻断组织，在室温下或4 C过夜至少2小时（图1J）。</li>
		<li>除去5%NGS封闭溶液，加入300μL适当稀释的荧光偶联二抗。此外，加入 1 ： 2000 稀释的荧光偶联的蛋白以标记肌肉（ 图 1J ）。</li>
		<li>对于二抗孵育，请使用实验室密封胶带和盖子密封孔。此外，用铝箔包裹板以保护荧光团免受光照。在室温下孵育6-8小时或在4°C下孵育过夜。</li>
		<li>洗涤二抗和苷，如上述步骤 2 . 2 . 3 所述。在洗涤之间用铝箔盖板，以保护荧光团免受光照。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 安装腿
<ol><li>使用镊子将腿转移到载玻片上，并将前侧向上定向。用安装介质盖住支腿（图1K，L）。 注意：如果用剃须刀片切割底部孔加宽，则可以使用P1000移液器吸头吸出解剖的支腿。</li>
	<li>将粘土垫片添加到22x22 mm2 的盖玻片（#1.5厚度）中，方法是在建模粘土的小球上刮刮盖玻片角。每个角落应有少量1-2毫米厚的粘土（图1K）。</li>
	<li>要覆盖滑轨，请添加盖玻片，将粘土垫片朝向载玻片，然后小心地推动角落，直到盖玻片刚好接触到股骨表面。</li>
	<li>为了防止蒸发，用指甲油密封盖玻片的边缘，并在黑暗的地方（约10分钟）干燥，然后在4°C下储存直至成像。</li>
</ol>4. 成像
<ol><li>通过共聚焦显微镜成像（图1M）。包括透射光通道以更好地评估解剖的质量，并且应丢弃在感兴趣区域具有明显破坏的肌肉纤维的样品。<ol>
<li>开始成像z-stack，以20倍放大倍率，2倍变焦，总图像深度约为40毫米，对应于股骨的厚度。对于荧光信号检测，以与奈奎斯特采样一致的分辨率捕获图像（我们使用1024 x 1024像素，停留设置为8-10 μs /像素）。信号强度应在通过调整高电压增益设置实现的线性范围内。一旦为实验中的一系列样品设置了增益设置，就不应更改它们，以便可以比较样品之间的信号强度。</li>
	</ol>
</li>
	<li>对于突触胸顿和其他亚细胞结构的成像，以≥60倍放大倍率捕获共聚焦图像。探测器设置应在线性范围内，而对于以较低放大倍率拍摄的图像，像素密度、停留设置和 z 深度应相似（步骤 4.1）。</li>
</ol>

<ol>
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作者声明没有利益冲突。

果蝇成腿是研究神经变性的理想模型，相对简单，具有从神经母细胞谱系和刻板化模式映射的具有良好特征的MNs。一些报告以前使用腿部MNs研究神经退行性疾病21，22。这些研究利用GFP表达线与嵌合分析与可抑制细胞标记（MARCM）相结合，通过角质层成像，并记录了一系列形态变化。通过切除角质层的免疫细胞化学对成人NMJ进行成像，能够使用可用的抗体工具箱跟踪复杂的分子变化，从而实现进一步的表征。
该方案的免疫细胞化学部分是相对标准的，可以独立于基因型实施（参见23 ，了解用于 果蝇的一般抗体染色方法的出色描述）。此外，一旦捕获了图像并发表了详细的定量分析方法，就可以使用各种可用的ImageJ宏来确定荧光强度，轴突分支长度以及胸顿数和大小等参数（例如，参见24，25，26）。因此，解剖技术是这里描述的主要创新。在解剖之前，苍蝇被浸没在酒精中以剥离角质层碳氢化合物。乙醇和甲醇通常用于此目的;但是，我们只使用了甲醇。解剖成功的关键有几个因素：首先，使用带有斜角的改良镊子可以与角质层进行非常浅的接触。其次，使用能够达到60-100倍总放大倍率的解剖显微镜，使角质层表面清晰可见。对于最大放大倍率较低的显微镜，大多数常见品牌都可以使用2倍物镜，与现有镜片结合使用时应该足够了。第三，初始固定步骤使角质层变脆，更容易拉开，而不会损坏下面的肌肉。在此步骤中过度固定会使整个腿过于僵硬，无法有效解剖。因此，初始固定应限制在30分钟以内。甲醛固定剂的渗透性不足以在短时间内有效地交联下层组织，因此需要第二个固定步骤。在第二次固定之前，组织应保持在冰上以防止降解和形态变化。第四，我们发现在冷敷时解剖样本也很重要，可能是出于类似的原因，角质层很脆，一小块更容易去除。
通过实践，我们发现约50%的解剖可以在没有明显组织损伤的情况下使用。虽然这个百分比相对于其他一些组织来说似乎很低，但解剖过程很快，许多腿可以在30-60分钟内处理。因此，即使最初成功率较低，也可以为每个实验组获得4-5个好样品。然而，如果基因型和/或年龄导致实质性致死，则限制可能是在任何给定时间可用的苍蝇数量。
另一个限制是，由于尺寸的原因，我们无法解剖超出股骨近端区域的腿部其他区域。因此，我们可以可靠地研究确定的MN心轴支配TILM，并且有可能在解剖时对腿部定向方式发生微小变化，从而解剖胫骨压低肌上方的角质层。然而，在解剖过程中，在不破坏轴突结构的情况下，进入腿部的其他区域已被证明更加困难。
在这里，我们提出了解剖方法，以检测使用免疫细胞化学支配tilm的已定义MNs在成人NMJ上的变化。腿部是一个简单的系统，仅由约 50 MN 支配，包含 14 块肌有良好的解剖结构。解剖的腿部制剂可以跨基因型使用，并且一套抗体可用于NMJ可视化，而无需在突变背景中构建报告基因构建体的基因型复杂储备。这种方法将能够更详细地表征NMJ对MN疾病和其他年龄相关疾病的变化。

运动神经元 （MN） 疾病包括一组异质性疾病，包括导致肌肉萎缩和麻痹的进行性变性，这是主要的临床表型1。虽然罕见，全球患病率为每10万人4.5人，但预计随着人口老龄化，这一患病率将会增加2。肌萎缩性侧索硬化症 （ALS） 是最常见的 MN 疾病 （MND），通常在诊断后短时间内致命，目前尚无改善疾病的治疗方法3。MNDs具有共同的症状前期，伴有早期分子生物标志物改变和患者功能成像改变4。在非人类疾病模型中也观察到早期症状前细胞病理学5，6，7，8。研究神经肌肉接头的早期变化对于了解MN疾病的发病机制非常重要，并可能有助于开发早期诊断和潜在的治疗方法。
果蝇中存在丰富的遗传和分子工具，用于剖析神经肌肉接头的结构和功能（NMJ，参见9，了解特征良好的幼虫NMJ的综述）。这些工具与较短的寿命相结合，使果蝇成为研究NMJ神经退行性变化的绝佳模型。具体而言，支配成人肌肉的MNs存在于约90天的成人寿命中，并且受到正常的衰老过程10，11，12，13的影响。因此，成虫 MNs 提供了研究缓慢退行性变化的机会，与幼虫 NMJs 相比，幼虫 NMJ 在前仅存在短短约 1 周的时间段 14 ， 15 。
在这里，我们描述了一种解剖程序，该程序使我们能够对成人腿部的MNs进行免疫细胞化学分析。每条成年腿由约50 MNs支配，这些MNs突触到相关的腿部肌肉上以驱动运动。腿部解剖学、机械生理学和神经生物学已得到很好的描述16，17，18。腿部MNs的轴突乔木以前已经通过使用二分Gal4 / UAS系统通过角质层在回填或遗传标记的细胞群中成像来表征，并且先前已经发表过成像方法19。这里介绍的解剖方法保留了轴突分支形态，并允许我们利用各种抗体来标记NMJ的不同分子成分。我们之前的工作集中在上胸（第3）腿中定义的MN的投影上，该MN支配胫骨提肌（tilm），并显示出一致的树突模式和胸顿数。最初，我们研究了果蝇超氧化物歧化酶1（dsod1）突变体的年龄依赖性变化，并发现了与NMJ20的拆除一致的改变。这些解剖方法提供了更好地表征NMJ其他ALS模型的缓慢退行性变化，衰老和其他MN相关疾病的基础研究的机会。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig01.jpg"> 图 1.解剖腿的工作流程摘要。 有关详细步骤，请参阅协议。（A，B）选择苍蝇并麻醉。（C）将苍蝇转移到甲醇中并用PBS洗涤。（D）在用解剖显微镜（〜30倍放大倍率）可视化时，在髋臼的底部移除中胸腿;比例尺 = 500 μm。（E）然后将支腿固定在3.7%甲醛/ PBS（FA）溶液中，在24孔板的孔内30分钟，然后通过PBS洗涤除去FA。（F， G， H）将腿转移到硅胶弹性体解剖托盘上，并使用斜面镊子从股骨近端取出一块角质层，同时在80x的解剖显微镜下可视化;比例尺 = 50 μm。（I）腿部在解剖后固定在FA中，然后在PBS中洗涤，然后用PBT（PBS + 0.1%非离子表面活性剂）洗涤。（J）腿部接受免疫细胞化学染色。（K，L）将支腿转移到载玻片上，在安装介质中清除，并覆盖有含有粘土垫片的盖玻片;比例尺 = 2 mm 和 500 μm。（M）腿部通过共聚焦显微镜成像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td>Hydrophobic, ultra-low attachment surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x objective accessory</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>110AL2X</td>
			<td>Screw-on attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ATP5A primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14748</td>
			<td>Mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-bruchpilot primary antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82</td>
			<td>Mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-discs large primary antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td>Mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hrp primary antibody</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>123-605-021</td>
			<td>Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>04-263</td>
			<td>Mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td>Objectives (NA):&#160; 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>160-190 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Dumont #5SF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td>37% stock stabilized with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>115-545-146</td>
			<td>Alexa Fluor 488 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB036768</td>
			<td>0.2 mm filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory sealing tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-254</td>
			<td>Parafilm M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-123</td>
			<td>76mm x 25mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S36972</td>
			<td>Slowfade Diamond mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>215680010</td>
			<td>Triton-X 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S06622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34055</td>
			<td>Alexa Fluor 555- conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpening stone</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>29008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>2423610</td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunohistochemistry of the drosophila adult leg to detect changes at the neuromuscular junction for an identified motor neuron

黑腹果蝇 代表了一种遗传上可处理的模型，用于研究神经元结构和功能以及疾病状态的后续变化。特征良好的幼虫神经肌肉接头通常用于此类研究。然而，在过程中，幼虫的快速发育以及肌肉组织分解和神经系统重塑使得该模型对于研究缓慢的年龄依赖性退行性变化（如肌萎缩性侧索硬化症中发生的变化）是有问题的。或者，成年苍蝇存活90天，成年腿可用于通过角质层使用体内荧光成像来研究成年寿命 期间 的运动神经元变化。在这里，我们描述了一种腿部解剖技术与免疫细胞化学相结合，该技术允许研究已识别的成人腿部运动神经元的神经肌肉连接处的分子变化。这些技术可以与无数标记突触前和突触后结构的抗体结合使用。这些程序一起可以更完整地表征成年苍蝇中缓慢的年龄依赖性变化，并且可以应用于多个运动神经元疾病模型。

图 4 显示了用抗 hrp ，抗 dlg 和素染色的中胸腿的代表性示例。对于从股骨近端部分切除角质层的解剖，在肌腱附近将出现刻板状的乔木，这很容易通过自发荧光检测到。请注意，抗体渗透到腿部的距离发生在角质层被切除区域之外的短距离内（图4A）。当存在强烈的荧光信号时，可以有效地对这些区域进行成像。在低倍率（20倍，2倍变焦）下成像，可以轻松确定1）去除了多少角质层，以及2）解剖过程中是否发生了损伤。增加的放大倍率（60倍）显示刻板投影到tilm上（图4B）。我们的工作集中在一个MN上，可能来自I-MN谱系，该谱系支配股骨近端的tilm（框， 图4B 和 图4C）。进一步增加放大倍率（100倍，2倍变焦）可以有效地可视化突触布顿（图4D）。
为了研究成年NMJ随时间变化的形态变化，我们之前使用dsod1突变体作为ALS的模型。Bouton肿胀发生在相对于dsod1nulland dsod1+的老化dsod1H71Y突变体中（图5A，B）。 在幼虫NMJ中，单克隆抗体NC82通常用于标记活性区，这些结构可以在成体NMJ上轻松可视化（图5C）。弱阳性HRP轴突分支在dsod1H71Y突变体中丰富，这些分支通常显示出弱和弥漫的BRP定位（箭头）。
对于神经变性很重要，市售抗体可以检测通常在聚集体中发现的泛素化蛋白，并且我们已经在老年突变 dsod1 苍蝇的MNs末端轴突内以及肌肉内检测到泛素化聚集体（图6A）。此外，标记线粒体的抗体也可以检测随年龄变化的形态变化（图6B）。
对于某些制剂，解剖过程中的肌肉损伤会使样品无法使用。起初，这种损害可能很常见，但在实践中会有所改善。良好解剖的示例如图 7A，C所示， 而较差的解剖如图 7B，D所示。解剖不良会导致相差显微镜检测的肌肉纤维紊乱（ 图 7B ）或荧光共轭的蛋白（ 图 7D ，箭头）显示的肌肉纤维缺失。使用素标记肌肉和透射光图像的组合可以帮助检测这种肌肉损伤，这在解剖显微镜下观察时可能并不明显。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig03.jpg"> 图 3. 果蝇 腿的解剖学。 （A）上胸腿前侧的示意图，其特征在于存在刷毛，与后侧突出的裸露角质层形成对比。分段式腿由髋关节 （Cx）、转子 （Tr）、股骨 （Fe）、胫骨 （Ti）、5 个跗骨节段 （Ta1-5） 和爪 （Cl） 组成，顺序从近端 （Pr） 到远端 （Di）。也需指股骨的背侧 （D） 和腹侧 （V）。比例尺 = 100 μm。（B） 包含胫骨提肌 （tilm）、胫骨压低肌 （tidm）、长肌 2 （ltm2） 和胫骨减压器 （tirm） 的股骨示意图以及股骨近端支配股骨的轴突突突。这些刻板的轴突突投影被认为来自I谱系神经母细胞16，第二次乔木是最容易通过解剖（盒装）获得的。比例尺 = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig04.jpg"> 图 4.解剖的胸上股骨揭示了支配股骨的刻板MN结构。 免疫细胞化学用于标记神经元（ HRP ），椎间盘大（ DLG ）和肌肉（苷）。Z-stack通过共聚焦显微镜成像通过整个股骨捕获，并显示为最大系列投影。（A）还包括透射光通道，以说明在解剖过程中没有发生可检测到的肌肉损伤。在20倍放大倍率下拍摄图像，比例尺=50μm。（B）已确定的与tilm相关的心轴（盒状区域，中心），比例尺= 20μm;和（C）在60倍放大倍率下，比例尺= 20μm。（D）DLG周围的胸花在野生动物中以100倍放大倍率和2倍变焦成像时很明显;比例尺 = 2 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig05.jpg"> 图 5.步子形态中年龄依赖性变化的示例，可以使用腿部解剖技术进行检测。布顿肿胀见于老化的 dsod1H71Y 突变体。（A）来自年轻（新关闭，第0天成年）和老年（第10天）苍蝇的HRP染色布顿的代表性图像，比例尺= 1μm。（B）使用ImageJ中的测量函数从各自的基因型中量化Bouton大小。p<0.0001（具有事后图基检验的双因子方差分析）。（C）标有单克隆抗体NC82（抗布鲁赫普洛特）的突触布顿内的活性区;比例尺 = 1 μm。图修改自20<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig06.jpg"> 图 6.与神经退行性疾病相关的常见标志物用于果蝇腿部制剂。（A）在老化的dsod1H71Y苍蝇的末端轴突和肌肉中检测到亚细胞多泛素聚集体。使用抗多泛素（FK2）的免疫细胞化学可检测老化的dsod1H71Y/H71Y中的穿刺（箭头），比例尺= 20μm（左）和5μm（右）。（B）肿胀的线粒体可以使用抗ATP5A检测，比例尺= 1μm。图修改自20<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig07v2.jpg"> 图 7.好解剖和差解剖的示例。 （A）不破坏潜在肌肉结构的解剖。（B）解剖效果差的例子，显示肌肉纤维磨损（箭头），不能用于分析。两个样品均通过相差显微镜成像。比例尺 = 50 μm。（ C ）通过共聚焦显微镜用 HRP （绿色）和素（蓝色）成像的良好解剖示例。（D）解剖不良的TILM缺失的背肌纤维缺失（箭头）。比例尺 = 50 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig07large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>抗体/染色</td>
			<td>稀释*</td>
		</tr>
<tr>
<td>抗 ATP5A</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>反布鲁赫领航员 （nc82）</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
<tr>
<td>抗半胱氨酸串蛋白 （ab49）</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>防盘大 （4F3）</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
<tr>
<td>抗热血红素</td>
			<td>1:550</td>
		</tr>
<tr>
<td>抗多泛素 （FK2）</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>反回购 （8D12）</td>
			<td>1:5</td>
		</tr>
<tr>
<td>山羊抗小鼠二抗</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
<tr>
<td>法洛丁</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>*稀释在5%的NGS中</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2.抗体和稀释液。 这些研究中使用的抗体的商业供应商列在材料清单中。

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Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

我们描述了一种解剖技术，该技术保留了神经肌肉接头的结构，并能够对成年 果蝇 腿中的运动神经元进行详细的免疫细胞化学研究。

果蝇成腿的解剖和免疫组织化学，以检测已识别运动神经元的神经肌肉接头处的变化

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

该手术的总体目标是展示果蝇成年腿的解剖方法。这种技术去除角质层的一部分，以保留神经元和肌肉结构的方式暴露下层组织。该过程使我们能够使用标准的免疫细胞化学技术表征已识别的运动神经元心轴的神经肌肉接头。解剖对于研究在相对较长的时间内发生的缓慢退行性变化特别有用。时间方面是一个重要的考虑因素，因为果蝇幼虫的神经肌肉接头在开始前稳定了大约五到七天。相反，成年神经元存在于成年苍蝇的整个生命中，对于野生型实验室饲养的果蝇黑色素食尸鬼来说大约需要90天。该技术非常灵活，可以应用于不同疾病模型的一系列基因型，并利用果蝇可用的一系列抗体作为模型系统。该手术的总体目标是展示果蝇成年腿的解剖方法。这种技术去除角质层的一部分，以保留神经元和肌肉结构的方式暴露下层组织。使用画笔，将苍蝇转移到玻璃孔或盘子中的冷甲醇中约30秒至一分钟。甲醇使角质层碳氢化合物溶解，苍蝇现在可以被淹没而不是漂浮在水溶液中。使用镊子，小心地将苍蝇转移到PBS。在冰冷的PBS中冲洗三次以除去多余的甲醇，并将苍蝇保持在PBS冰上，直到解剖和固定。此时，应在尽可能短的时间内解剖和固定苍蝇，最好是在30分钟以内。将苍蝇转移到装有冷PBS的硅弹性体解剖皿中。使用两对五号杜蒙镊子去除髋关节处的上胸腿，或用Vannas剪刀剪断腿部。将腿转移到充满一密耳PBS的塑料24孔板中的井中，并将板保持在冰上，直到所有腿都被移除并转移到井中。我们通常每口井使用20条腿。将PBS溶液更换为一毫升FA溶液，并在螺母器上旋转30分钟。螺母器设置应设置为中速。在此期间，确保支腿完全浸没在溶液中。要去除FA溶液，在一密耳PBS中快速洗涤三次，然后在一密耳PBS中再洗涤三次，每次洗涤五分钟。在解剖步骤之前和期间，将组织保持在冰上一密耳PBS中。为了简要概述果蝇腿部解剖结构，需要指明腿部，包括髋关节、转子、股骨、胫骨和五个睑板段。在这里，我们看到腿部的前视图，通过存在感觉刷毛而不是后侧存在的裸露角质层来识别。还指明了近端-远端轴和背-腹轴的方向。该解剖手术从股骨近端去除一小块角质层，因此可以研究在背侧突出的轴突乔木，支配胫骨提肌。我们之前的工作集中在指示的心轴上，它起源于假定的神经母细胞眼谱系。在手术的这一部分中，我们从股骨前侧切除角质层。解剖镊子对于成功至关重要，我们发现，在五号超细镊子的末端引入轻微的弯曲提供了一个斜面，允许角质层被浅表抓住，而不是被戳破，这可能会破坏组织。将支腿转移到PBS中的硅胶弹性体培养皿中进行解剖。使用一对镊子，将胫骨段固定在硅胶弹性体皿上，如右手边所示。使用其他镊子将斜面朝下，抓住股骨远端的角质层，然后向近端方向拉向大转子。保持有条不紊地去除角质层，直到裸露的肌肉在整个股骨近端可见。解剖所有腿后，用FA溶液代替PBS，在中速螺母上摇晃30分钟。之后，在一密耳PBS中快速洗涤样品三次，然后在PBT溶液中洗涤三次，每次五分钟。要阻断组织，用封闭溶液代替1密耳PBT，该溶液由一密耳5%正常山羊血清在PBT中稀释。在室温下孵育解剖的腿四小时，或在四摄氏度下过夜。除去封闭溶液，并用在封闭溶液中稀释的一抗代替。在这里，我们使用1到200稀释度的抗光盘。将盘子放回摇摇杯上，以四度孵育过夜。一抗孵育后，在一密耳PBT中洗涤一抗三次，然后三次，每次15分钟。在室温下再次在一个磨5%正常山羊血清中再次阻断组织至少两个小时，或在四摄氏度下过夜。除去封闭溶液并加入300微升适当稀释的荧光偶联二抗。此外，加入一至 2000 稀释的荧光偶联的素以标记肌肉。要孵化，请用实验室密封胶带和盖子密封孔。此外，用铝箔包裹板以保护荧光团免受光照。在室温下孵育六到八小时，或在四摄氏度下孵育过夜。要去除未结合的二抗，请以与前面描述的类似方式进行PBT洗涤，以洗涤一抗。完成此步骤后，现在可以对示例进行装载和映像。将支腿前侧朝上，并在需要时用额外的安装介质覆盖。轻轻刮擦盖板的角落滑过粘土球。由此产生的粘土将用作滑块和盖玻片之间的垫片，因此组织不会被压碎。向下按盖板，直到它接触到腿的顶部。用指甲油密封边缘，并以四度储存直至成像。使用书面协议第四节中描述的成像参数通过共聚焦显微镜进行图像。为了帮助验证解剖方案，我们首先通过相差显微镜在低放大倍率下成像。这是面板A上的一个例子，左边是好的解剖，右边是肌肉纤维被破坏的坏解剖。图C显示了肌肉未被破坏的良好解剖的共聚焦图像。相比之下，图D显示了在解剖过程中腿部受损，其中肌肉纤维缺失，如箭头所示。在这里，我们用抗辣根过氧化物酶染色成像的腿部以检测神经元过程，这里显示为绿色，抗椎间盘大，这有助于突触后谷氨酸受体聚集，以红色显示，素标记肌肉，以蓝色显示。当用透射光通道以20倍放大倍率拍摄时，很容易看到解剖区域。请注意，抗体部分穿透到未分离的区域，并且可以通过角质层看到，如白色箭头所示。每个腿部运动神经元在支配肌肉时都会做出刻板的投射。我们的工作重点是支配胫骨提肌的运动神经元，这里显示为盒装区域，并由白色箭头指示。在右上角2倍变焦的60倍放大倍率下，我们可以有效地对绿色显示的布顿和以红色显示的周围DLG进行成像。进一步增加变焦，或步进到100倍物镜，可以量化胸花大小和形态，如右下角所示。使用这种解剖技术结合免疫细胞化学，我们发现与箭头所示的野生型对照相比，在ALS的Sod1突变模型中存在H依赖性胸顿肿胀，如图所示的老年H71Y腿。布顿大小在右侧的蜂群图中量化。我们进一步发现，在H71Y突变体的弱染色HRP轴突（以绿色显示）中，活性区标记Bruchpilot（以红色显示）减少。为了研究神经变性，泛素化的蛋白质聚集体通常由抗体FK2检测到，并在这里显示为FK2阳性的puncta，在右侧的老年Sod H71苍蝇的轴突和肌肉中，由箭头指示。最后，线粒体可以通过使用抗ATP5a单克隆抗体的免疫细胞化学来可视化，如胫骨提肌内的红色所示。我们发现线粒体在H71Y突变体中随着年龄的增长而变大。一旦掌握，解剖的腿部准备和相关抗体染色将允许您在不同时间点分析您喜欢的突变体的成人神经肌肉接头处的分子变化。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

在活动区域​​的解剖和影像果蝇神经肌肉交界处

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

科研

神经科学

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

幼虫，蛹和成人的解剖和免疫组化<em&gt;果蝇</em&gt;视网膜

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

连续光漂白划定单雪旺细胞在神经肌肉接头处

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

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全山神经肌肉交界分析的 横向解剖阿布多米尼斯 肌肉

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

检测<em&gt;原位</em&gt;蛋白质 - 蛋白质复合物的<em&gt;果蝇</em&gt;幼虫神经肌肉接头使用接近结扎分析

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

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神经肌肉接头处：测量突触大小，碎片和改变突触蛋白密度利用共聚焦荧光显微镜

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

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为什么量化事项：表型的表征在<em&gt;果蝇</em&gt;幼虫神经肌肉接头

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Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

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一个简单的一步解剖协议成人全安装准备<em&gt;果蝇</em&gt;脑

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

测量神经肌肉接头功能

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...