Name: dissection and immunohistochemistry of the drosophila adult leg to detect changes at the neuromuscular junction for an identified motor neuron
Uploaded: 2022-02-12T13:30:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron at JoVE.com

Agradecemos a Eric Roberts por sus consejos sobre imágenes. También deseamos agradecer a los Servicios de Tecnología de la Información en Rhode Island College y, en particular, a Michael Caine y Jake Douglas por la videografía. Los anticuerpos monoclonales anti-dlg y anti-brp fueron desarrollados por UC-Berkeley y Universitaetsklinikim Wuerzburg respectivamente, y se obtuvieron del Developmental Studies Hybridoma Bank, creado por el NICHD de los NIH y mantenido en la Universidad de Iowa, Departamento de Biología, Iowa City, IA 52242, EE. UU. La investigación reportada aquí fue apoyada completamente por la Red de Excelencia en Investigación Biomédica del Premio de Desarrollo Institucional de Rhode Island (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención [P20GM103430].

Los procedimientos para preparar soluciones de trabajo utilizados junto con este protocolo se describen en la Tabla 1.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Reactivo</td>
			<td colspan="3">Preparación</td>
			<td colspan="2">Almacenamiento</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td colspan="3">Haga un stock de trabajo de 1x PBS a partir de una solución de stock de PBS 10x diluyendo en agua destilada.  El pH de la culata de PBS en funcionamiento debe ser de 7,2 a 7,4</td>
			<td colspan="2">4 °C durante más de 1 mes hasta que la contaminación bacteriana sea visible.</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBT</td>
			<td colspan="3">1x solución de PBS con surfactante no iónico al 0,1%.</td>
			<td colspan="2">4 °C durante más de 1 mes hasta que la contaminación bacteriana sea visible.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">FA</td>
			<td colspan="3">Solución de formaldehído al 3,7% hecha de un stock de formaldehído al 37% y diluida en 1x PBS.</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Temperatura ambiente. Hacer fresco cada día de disección</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">PRECAUCIÓN: El formaldehído suministrado como solución madre al 37% es un carcinógeno potencial y debe diluirse en una campana extractora de humos.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5% NGS</td>
			<td colspan="3">5% de suero normal de cabra diluido en PBT.  El suero utilizado debe coincidir con la especie del anticuerpo secundario que se va a utilizar.</td>
			<td colspan="2">4 °C durante varias semanas hasta que la contaminación bacteriana sea visible</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Soluciones para la realización de inmunocitoquímica de la pierna adulta de Drosophila . 
1. Fijación inicial de los tejidos
<ol><li>Seleccione aproximadamente 10 moscas para cada genotipo y edad. Anestesiar en una almohadilla de mosca bajo dióxido de carbono (Figura 1A, B). NOTA: Comience con más moscas de las necesarias para garantizar un tamaño de muestra lo suficientemente grande después de la disección.</li>
	<li>Usando un pincel, transfiera las moscas al metanol frío en un pozo o plato de vidrio durante aproximadamente 30 segundos a 1 minuto (Figura 1C). El metanol solubiliza los hidrocarburos cuticulares y las moscas ahora pueden sumergirse en lugar de flotar en soluciones acuosas.</li>
	<li>Con fórceps, transfiera cuidadosamente las moscas a PBS. Enjuague 3x en PBS helado para eliminar el exceso de metanol y mantenga las moscas en PBS en hielo hasta la disección y fijación. En este punto, diseccionar moscas y fijar en el menor tiempo posible (<30 minutos).</li>
	<li>Para aislar las piernas, transfiera las moscas a un plato de disección de elastómero de silicona lleno de PBS frío, retire las patas metatorácicas en la coxa usando dos pares de pinzas Dumont # 5 o corte las piernas con tijeras Vanna (Figura 1D). Transfiera las patas a un pozo en una placa de plástico de 24 pocillos llena de 1 ml de PBS y mantenga la placa en hielo hasta que todas las patas se retiren y se transfieran a los pozos. NOTA: Cada pozo puede contener al menos 20 patas.</li>
	<li>Reemplace la solución de PBS con 1 ml de solución de FA y gire sobre un nutator durante 30 minutos (Figura 1E). El ajuste del nutator debe ajustarse a una velocidad media (17 rpm). Asegúrese de que las patas estén completamente sumergidas en la solución de FA durante este tiempo para una fijación adecuada.</li>
	<li>Para eliminar la solución de FA, lave en 1 ml de PBS 3x rápidamente seguido de 3 lavados adicionales durante 5 minutos cada uno en 1 ml de PBS. Mantenga los tejidos en 1 ml de PBS en hielo antes y durante los pasos de disección que se describen a continuación.</li>
</ol>2. Eliminación de la cutícula de la pierna y tinción de anticuerpos
<ol><li>Extracción de la cutícula de la pierna<ol>
<li>Las pinzas de disección son fundamentales para el éxito. Introduzca ligeras curvas paralelas en ambas puntas al final de las pinzas súper finas # 5 para proporcionar un bisel que permita que la cutícula se agarre superficialmente en lugar de pincharse, lo que puede arruinar el tejido (Figura 1F, G). NOTA: Las puntas dobladas en paralelo aún deben hacer contacto entre sí a lo largo de la longitud de la punta cuando están cerradas (Figura 2).</li>
		<li>Transfiera las piernas a un plato de elastómero de silicona en PBS para la disección. Oriente una pierna de modo que el lado anterior esté hacia arriba (consulte la Figura 3 para obtener información sobre la anatomía y la orientación de la pierna). Usando un par de fórceps, sostenga el segmento de tibia contra el plato de elastómero de silicona. Usando las otras pinzas sostenidas biseladas hacia abajo, agarre un trozo de cutícula en el extremo distal del fémur y tire en la dirección proximal hacia el trocánter.</li>
		<li>Mantenga metódicamente la extirpación de la cutícula hasta que el músculo desnudo sea visible en todo el extremo proximal del fémur (Figura 1F, G, H). NOTA: Solo haga contacto superficial con las piernas usando el lado biselado de los fórceps para evitar tirar del músculo.</li>
		<li>Una vez que todas las piernas estén diseccionadas, reemplace PBS con FA para posfijar las piernas durante 30 minutos con agitación en un nutator a velocidad media (Figura 1I). Lave las muestras en 1 ml de PBS para 3 veces rápido y luego 3 veces durante 5 minutos cada una en PBT (Figura 1J). NOTA: Si se tiñe con anticuerpo monoclonal NC82 (anti-bruchpilot) para etiquetar zonas activas, posfijar durante 20 minutos, ya que este antígeno es sensible a fijaciones más largas.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig02v2.jpg"> Figura 2. Fórceps modificados utilizados para diseccionar piernas adultas. (A) Los extremos de las pinzas se doblan y luego se aplanan en la parte inferior (flecha) creando un bisel mediante la limado sobre una piedra afilada. (B) En contraste, las puntas de los fórceps no modificados no están dobladas. Barra de escala = 1 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="2"><li>Tinción de anticuerpos<ol>
<li>Para bloquear los tejidos para la tinción de anticuerpos, reemplace 1 ml de PBT con una solución de bloqueo que consiste en 1 ml de NGS al 5% diluido en PBT. Incubar las patas diseccionadas durante 4 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C mientras se balancea sobre un nutator a velocidad media (17 rpm). Durante todas las incubaciones, cubra los pozos con cinta de sellado además de la cubierta de plástico (Figura 1J). NOTA: Se utilizan placas de 24 pocillos para inmunocitoquímica en lugar de microcentrífuga de 1,5 ml o 2 ml porque los intentos anteriores de usar tubos de microcentrífuga resultaron en piernas rotas y tejido dañado.</li>
		<li>Retire la solución de bloqueo y agregue 300 ml de anticuerpos primarios diluidos en una solución de bloqueo fresca. El pequeño volumen de anticuerpos utilizado debe ser suficiente para cubrir los tejidos. Vuelva a sellar los pozos con cinta de sellado de laboratorio y tapa de plástico e incube durante la noche a 4 °C con agitación en un nutator a velocidad media (Figura 1J). La información y las concentraciones de reactivos de anticuerpos de trabajo utilizadas para estos estudios se describen en la Tabla 2.</li>
		<li>Lave los anticuerpos primarios en 1 ml de PBT durante 3 veces brevemente y luego 3 veces durante 15 minutos cada una (Figura 1J). NOTA: Los anticuerpos primarios diluidos se pueden guardar y reutilizar si se almacenan a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.</li>
		<li>Bloquee los tejidos nuevamente en 1 ml de NGS al 5% durante al menos 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 C (Figura 1J).</li>
		<li>Retire la solución bloqueadora de NGS al 5% y agregue 300 μL de los anticuerpos secundarios conjugados fluorescentes diluidos apropiados. Además, agregue 1:2000 dilución de faloidina conjugada con fluorescencia para etiquetar el músculo (Figura 1J).</li>
		<li>Para incubaciones secundarias de anticuerpos, selle los pozos con cinta de sellado de laboratorio y tapa. Además, envuelva las placas en papel de aluminio para proteger los fluoróforos de la luz. Incubar durante 6-8 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Lave los anticuerpos secundarios y la faloidina como se describe en el paso 2.2.3 anterior. Cubra las placas con papel de aluminio entre lavados para proteger los fluoróforos de la luz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Patas de montaje
<ol><li>Transfiera las piernas a un tobogán con fórceps y oriente el lado anterior hacia arriba. Cubra las patas con medios de montaje (Figura 1K, L). NOTA: Las patas disecadas se pueden aspirar con una punta de pipeta P1000 si el orificio inferior se ensancha cortando con una cuchilla de afeitar.</li>
	<li>Agregue espaciadores de arcilla a una cubierta de 22x22 mm2 (espesor # 1.5) raspando las esquinas de la cubierta a través de una pequeña bola de arcilla de modelado. Cada esquina debe tener una pequeña cantidad de arcilla de 1-2 mm de espesor (Figura 1K).</li>
	<li>Para cubrir la diapositiva, agregue la cubierta con los espaciadores de arcilla mirando hacia la diapositiva y empuje cuidadosamente las esquinas hasta que la cubierta toque la superficie del fémur.</li>
	<li>Para evitar la evaporación, selle los bordes de la funda con esmalte de uñas y deje secar en un lugar oscuro (aproximadamente 10 minutos) antes de almacenar a 4 ° C hasta la toma de imágenes.</li>
</ol>4. Imágenes
<ol><li>Imagen por microscopio confocal (Figura 1M). Incluir un canal de luz transmitido para evaluar mejor la calidad de la disección y se deben descartar muestras con fibras musculares visiblemente alteradas en el área de interés.<ol>
<li>Comience a crear imágenes de pilas z con un aumento de 20x con zoom de 2x y una profundidad total de imagen de ~ 40 mm correspondiente al grosor del fémur. Para la detección de señales fluorescentes, capture imágenes a resoluciones consistentes con el muestreo de Nyquist (estamos utilizando 1024 x 1024 píxeles con un ajuste de permanencia de 8-10 μs / píxel). La intensidad de la señal debe estar en el rango lineal que se logra ajustando los ajustes de ganancia de alto voltaje. Una vez que se establecen los ajustes de ganancia para una serie de muestras dentro de un experimento, no deben alterarse para que las intensidades de la señal se puedan comparar entre muestras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para obtener imágenes de boutones sinápticos y otras estructuras subcelulares, capture imágenes confocales a un aumento de ≥60x. La configuración del detector debe estar en el rango lineal, mientras que la densidad de píxeles, la configuración de permanencia y la profundidad z deben ser similares para las imágenes capturadas con un aumento más bajo (paso 4.1).</li>
</ol>

<ol>
	<li>McDermott, C. J., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+motor+neurone+disease.">Diagnosis and management of motor neurone disease.</a> BMJ. 336 (7645), 658-662 (2008).</li><li>Global Collaborators, G. B. D. M. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+burden+of+motor+neuron+diseases+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">Global, regional, and national burden of motor neuron diseases 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> Lancet Neurology. 17 (12), 1083-1097 (2018).</li><li>Foster, L. A., Salajegheh, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+Neuron+Disease:+Pathophysiology,+Diagnosis,+and+Management.">Motor Neuron Disease: Pathophysiology, Diagnosis, and Management.</a> American Journal of Medicine. 132 (1), 32-37 (2019).</li><li>Bede, P., Pradat, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Biomarkers+and+Clinical+Indicators+in+Motor+Neuron+Disease.">Editorial: Biomarkers and Clinical Indicators in Motor Neuron Disease.</a> Frontiers in Neurology. 10, 1318 (2019).</li><li>Clark, J. A., Southam, K. A., Blizzard, C. A., King, A. E., Dickson, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+degeneration,+distal+collateral+branching+and+neuromuscular+junction+architecture+alterations+occur+prior+to+symptom+onset+in+the+SOD1(G93A)+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal degeneration, distal collateral branching and neuromuscular junction architecture alterations occur prior to symptom onset in the SOD1(G93A) mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 76, 35-47 (2016).</li><li>Martineau, E., Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+neuromuscular+remodeling+precedes+motor-unit+loss+in+a+mouse+model+of+ALS.">Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Shahidullah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+synapse+structure+and+function+precede+motor+neuron+degeneration+in+Drosophila+models+of+FUS-related+ALS.">Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).</li><li>Tremblay, E., Martineau, E., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+Synaptic+Alterations+at+the+Neuromuscular+Junction+in+an+ALS+Mouse+Model:+When+Motor+Units+Matter.">Opposite Synaptic Alterations at the Neuromuscular Junction in an ALS Mouse Model: When Motor Units Matter.</a> Journal of Neuroscience. 37 (37), 8901-8918 (2017).</li><li>Harris, K. P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission,+Development,+and+Plasticity+of+Synapses.">Transmission, Development, and Plasticity of Synapses.</a> Genetics. 201 (2), 345-375 (2015).</li><li>Beramendi, A., Peron, S., Casanova, G., Reggiani, C., Cantera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+in+abdominal+muscles+of+Drosophila+melanogaster+during+adulthood+and+aging.">Neuromuscular junction in abdominal muscles of Drosophila melanogaster during adulthood and aging.</a> Journal of Comparative Neurology. 501 (4), 498-508 (2007).</li><li>Banerjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniature+neurotransmission+is+required+to+maintain+Drosophila+synaptic+structures+during+ageing.">Miniature neurotransmission is required to maintain Drosophila synaptic structures during ageing.</a> Nature Communications. 12 (1), 4399 (2021).</li><li>Liao, S., Broughton, S., Nassel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+Senescence+and+Aging-Related+Changes+in+Motor+Neurons+and+Brain+Neuromodulator+Levels+Are+Ameliorated+by+Lifespan-Extending+Reproductive+Dormancy+in+Drosophila.">Behavioral Senescence and Aging-Related Changes in Motor Neurons and Brain Neuromodulator Levels Are Ameliorated by Lifespan-Extending Reproductive Dormancy in Drosophila.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 111 (2017).</li><li>Mahoney, R. E., Rawson, J. M., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-dependent+change+in+the+set+point+of+synaptic+homeostasis.">An age-dependent change in the set point of synaptic homeostasis.</a> Journal of Neuroscience. 34 (6), 2111-2119 (2014).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+adult+neuromuscular+system.">Development of the adult neuromuscular system.</a> International Review of Neurobiology. 43, 221-239 (1999).</li><li>Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metamorphosis+of+the+central+nervous+system+of+Drosophila.">Metamorphosis of the central nervous system of Drosophila.</a> Journal of Neurobiology. 21 (7), 1072-1084 (1990).</li><li>Baek, M., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+and+birth+date+specify+motor+neuron+targeting+and+dendritic+architecture+in+adult+Drosophila.">Lineage and birth date specify motor neuron targeting and dendritic architecture in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).</li><li>Enriquez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+individual+adult+motor+neuron+morphologies+by+combinatorial+transcription+factor+codes.">Specification of individual adult motor neuron morphologies by combinatorial transcription factor codes.</a> Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).</li><li>Soler, C., Daczewska, M., Da Ponte, J. P., Dastugue, B., Jagla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+muscles+and+tendons+of+the+Drosophila+leg.">Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg.</a> Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).</li><li>Guan, W., Venkatasubramanian, L., Baek, M., Mann, R. S., Enriquez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualize+Drosophila+Leg+Motor+Neuron+Axons+Through+the+Adult+Cuticle.">Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58365 (2018).</li><li>Agudelo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+degeneration+of+an+identified+adult+leg+motor+neuron+in+a+Drosophila+SOD1+model+of+ALS.">Age-dependent degeneration of an identified adult leg motor neuron in a Drosophila SOD1 model of ALS.</a> Biology Open. 9 (10), (2020).</li><li>Fernius, J., Starkenberg, A., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bar-coding+neurodegeneration:+identifying+subcellular+effects+of+human+neurodegenerative+disease+proteins+using+Drosophila+leg+neurons.">Bar-coding neurodegeneration: identifying subcellular effects of human neurodegenerative disease proteins using Drosophila leg neurons.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 10 (8), 1027-1038 (2017).</li><li>Sreedharan, J., Neukomm, L. J., Brown, R. H., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+TDP-43-Mediated+Motor+Neuron+Degeneration+Requires+GSK3,+hat-trick,+and+xmas-2.">Age-Dependent TDP-43-Mediated Motor Neuron Degeneration Requires GSK3, hat-trick, and xmas-2.</a> Current Biology. 25 (16), 2130-2136 (2015).</li><li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes.">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Guirado, R., Carceller, H., Castillo-Gomez, E., Castren, E., Nacher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+images+for+molecular+quantification+in+immunohistochemistry.">Automated analysis of images for molecular quantification in immunohistochemistry.</a> Heliyon. 4 (6), 00669 (2018).</li><li>Castells-Nobau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Algorithms+for+High-throughput+and+Multi-parametric+Quantification+of+Drosophila+Neuromuscular+Junction+Morphology.">Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55395 (2017).</li><li>Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+image+analysis+pipeline+for+Drosophila+motor+neurons.">Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons.</a> Biology Methods and Protocols. 4 (1), (2019).</li></ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

La pierna adulta de Drosophila es un modelo ideal para estudiar la neurodegeneración dada la relativa simplicidad con MN bien caracterizadas mapeadas a partir de linajes de neuroblastos y patrones de arborización estereotipados. Varios informes han utilizado previamente las MN de piernas para el estudio de la enfermedad neurodegenerativa21,22. Estos estudios utilizaron líneas que expresan GFP combinadas con análisis de mosaico con un marcador celular represible (MARCM) para obtener imágenes a través de la cutícula y documentaron una serie de cambios morfológicos. La obtención de imágenes de NMJ adultos por inmunocitoquímica con cutícula resecada permite una caracterización adicional con la capacidad de rastrear cambios moleculares complejos utilizando una caja de herramientas de anticuerpos disponibles.
La parte de inmunocitoquímica de este protocolo es relativamente estándar y se puede implementar independientemente del genotipo (ver23 para una excelente descripción de los métodos generales de tinción de anticuerpos para su uso con Drosophila). Además, parámetros como la intensidad de la fluorescencia, la longitud de la rama del axón y el número y tamaño del bouton se pueden determinar utilizando una variedad de macros ImageJ disponibles una vez que se capturan las imágenes y se han publicado métodos detallados para el análisis cuantitativo (por ejemplo, ver24,25,26). Por lo tanto, la técnica de disección es la principal innovación descrita aquí. Antes de la disección, las moscas se sumergen en un alcohol para eliminar los hidrocarburos cuticulares. Tanto el etanol como el metanol se usan comúnmente para este propósito; sin embargo, solo hemos utilizado metanol. Críticos para el éxito de la disección son varios factores: Primero, el uso de fórceps modificados con un bisel permite un contacto muy superficial con la cutícula. En segundo lugar, utilizando un microscopio de disección capaz de un aumento total de 60-100x para que la superficie de la cutícula sea claramente visible. Para microscopios con un aumento máximo más bajo, los objetivos 2x están disponibles para las marcas más comunes y deberían ser suficientes cuando se combinan con lentes existentes. En tercer lugar, el paso de fijación inicial hace que la cutícula sea frágil y más fácil de alejar sin dañar el músculo debajo. La fijación excesiva en este paso hace que toda la pierna esté demasiado rígida para una disección efectiva. Por lo tanto, la fijación inicial debe limitarse a 30 minutos. El fijador de formaldehído no penetrará lo suficiente como para reticular eficazmente el tejido subyacente durante este corto período y, por lo tanto, es necesario un segundo paso de fijación. Antes de la segunda fijación, los tejidos deben mantenerse en hielo para evitar la degradación y los cambios en la morfología. Cuarto, hemos encontrado que diseccionar muestras mientras que el frío también es importante, probablemente por razones similares en que la cutícula es frágil y una pieza pequeña se puede quitar más fácilmente.
Con la práctica, encontramos que ~ 50% de las disecciones serán utilizables sin daño tisular discernible. Aunque este porcentaje puede parecer bajo en relación con algunos otros tejidos, el procedimiento de disección es rápido y muchas piernas se pueden procesar en 30-60 minutos. Por lo tanto, incluso si las tasas de éxito son bajas inicialmente, es factible obtener 4-5 buenas muestras para cada grupo experimental. Sin embargo, una limitación puede ser el número de moscas disponibles en un momento dado si los genotipos y / o la edad resultan en una letalidad sustancial.
Otra limitación es que no hemos podido diseccionar otras zonas de la pierna más allá de la región proximal del fémur debido al tamaño. Por lo tanto, podemos estudiar los cenadores MN identificados que inervan el TILM de manera confiable y es posible diseccionar la cutícula por encima del músculo depresor de la tibia con pequeños cambios en la forma en que se orienta la pierna al diseccionar. Sin embargo, el acceso a otras regiones de la pierna ha resultado más difícil sin interrumpir la arquitectura axonal durante la disección.
Aquí, presentamos métodos de disección para detectar cambios en la NMJ adulta para MNs definidas que inervan el tilm utilizando inmunocitoquímica. La pierna es útil como un sistema simple, inervada por solo ~ 50 MN y que contiene 14 músculos con una anatomía bien descrita. La preparación de la pierna diseccionada se puede utilizar en todos los genotipos y un conjunto de anticuerpos están disponibles para la visualización de NMJ sin la necesidad de construir existencias genotípicamente complejas de construcciones de genes reporteros en fondos mutantes. Este enfoque permitirá una caracterización más detallada de los cambios en el NMJ para las enfermedades de MN y otras afecciones relacionadas con la edad.

Las enfermedades de la neurona motora (MN) abarcan un grupo de afecciones heterogéneas que incluyen la degeneración progresiva que conduce al desgaste muscular y la parálisis como fenotipo clínico primario1. Aunque es raro con una prevalencia global de 4,5 por 100.000, se espera que esta prevalencia aumente con el envejecimiento de la población2. La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es la enfermedad MN (EMN) más común y suele ser mortal en un corto período de tiempo desde el diagnóstico sin tratamientos modificadores de la enfermedad disponibles3. Las ETN comparten en común una fase presintomática prolongada con cambios tempranos en los biomarcadores moleculares y cambios en la imagen funcional observados en los pacientes4. La patología celular presintomática temprana también se observa en modelos de enfermedades no humanas5,6,7,8. El estudio de los cambios tempranos en la unión neuromuscular es importante para comprender la patogénesis de la enfermedad de MN y puede ayudar a desarrollar diagnósticos tempranos y posibles terapias.
Existe una gran cantidad de herramientas genéticas y moleculares en Drosophila para diseccionar la estructura y función de la unión neuromuscular (NMJ, ver9 para una revisión de la NMJ larvaria bien caracterizada). Estas herramientas combinadas con una corta vida útil hacen de Drosophila un excelente modelo para estudiar los cambios neurodegenerativos en el NMJ. Específicamente, las NM que inervan los músculos adultos están presentes a lo largo de la vida adulta de ~ 90 días y están sujetas a procesos normales de envejecimiento10,11,12,13. Por lo tanto, las NM adultas brindan la oportunidad de estudiar cambios degenerativos lentos en contraste con las NMJ larvales que existen solo durante un corto período de tiempo de ~ 1 semana antes de la metamorfosis14,15.
Aquí, describimos un procedimiento de disección que nos permite realizar análisis inmunocitoquímicos de las EM en la pierna adulta. Cada pierna adulta está inervada por ~ 50 MNs, que hacen sinapsis en la pierna muscular asociada para impulsar la locomoción. La anatomía de las piernas, la fisiología mecánica y la neurobiología han sido bien descritas16,17,18. Los cenadores axónicos de las MN de las patas se han caracterizado previamente por imágenes a través de la cutícula en poblaciones celulares rellenas o genéticamente marcadas utilizando el sistema bipartito Gal4/UAS y los métodos de imagen se han publicado anteriormente19. Los métodos de disección presentados aquí preservan la morfología de ramificación del axón y nos permiten explotar una amplia gama de anticuerpos para etiquetar diferentes componentes moleculares del NMJ. Nuestro trabajo anterior se ha centrado en las proyecciones de un MN definido en la pierna metatorácica (3ª), que inerva el músculo elevador de la tibia (tilm) y muestra patrones de arborización consistentes y números de bouton. Inicialmente estudiamos los cambios dependientes de la edad en los mutantes de la superóxido dismutasa 1 (dsod1) de Drosophila y encontramos alteraciones consistentes con el desmantelamiento de la NMJ20. Estos métodos de disección ofrecen la oportunidad de caracterizar mejor los cambios degenerativos lentos en el NMJ para otros modelos de ELA, estudios básicos del envejecimiento y otras enfermedades asociadas a la EMN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig01.jpg"> Figura 1. Resumen del flujo de trabajo para diseccionar piernas. Consulte el protocolo para conocer los pasos detallados. (A,B) Las moscas son seleccionadas y anestesiadas. (C) Las moscas se transfieren a metanol y se lavan con PBS. (D) Las patas metatorácicas se eliminan en la base de la coxa mientras se visualizan con un microscopio de disección (~ 30x de aumento); barra de escala = 500 μm. (E) Las patas se fijan en una solución de formaldehído/PBS (FA) al 3,7% durante 30 minutos dentro de pocillos de placas de 24 pocillos y luego se elimina la FA mediante lavados con PBS. (F, G, H) Las piernas se transfieren a bandejas de disección de elastómero de silicona y se extrae un trozo de cutícula del fémur proximal utilizando fórceps biselados mientras se visualiza bajo un microscopio de disección a 80x; barra de escala = 50 μm. (I) Las patas se fijan después de la disección en FA y se lavan en PBS y luego en PBT (PBS + 0.1% surfactante no iónico). (J) Las piernas son sometidas a tinción inmunocitoquímica. (K,L) Las patas se transfieren a un portaobjetos de vidrio, se limpian en medios de montaje y se cubren con una funda que contiene espaciadores de arcilla; barras de escala = 2 mm y 500 μm. (M) Las piernas se visualizan mediante microscopía confocal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td>Hydrophobic, ultra-low attachment surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x objective accessory</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>110AL2X</td>
			<td>Screw-on attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ATP5A primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14748</td>
			<td>Mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-bruchpilot primary antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82</td>
			<td>Mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-discs large primary antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td>Mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hrp primary antibody</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>123-605-021</td>
			<td>Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>04-263</td>
			<td>Mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td>Objectives (NA):&#160; 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>160-190 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Dumont #5SF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td>37% stock stabilized with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>115-545-146</td>
			<td>Alexa Fluor 488 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB036768</td>
			<td>0.2 mm filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory sealing tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-254</td>
			<td>Parafilm M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-123</td>
			<td>76mm x 25mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S36972</td>
			<td>Slowfade Diamond mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>215680010</td>
			<td>Triton-X 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S06622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34055</td>
			<td>Alexa Fluor 555- conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpening stone</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>29008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>2423610</td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunohistochemistry of the drosophila adult leg to detect changes at the neuromuscular junction for an identified motor neuron

Drosophila melanogaster representa un modelo genéticamente tratable para estudiar la estructura y función neuronal, y los cambios posteriores en los estados de enfermedad. La unión neuromuscular larvaria bien caracterizada se utiliza a menudo para tales estudios. Sin embargo, el rápido desarrollo larvario seguido de histólisis muscular y remodelación del sistema nervioso durante la metamorfosis hace que este modelo sea problemático para el estudio de cambios degenerativos lentos dependientes de la edad como los que ocurren en la esclerosis lateral amiotrófica. Alternativamente, las moscas adultas viven durante 90 días y la pata adulta se puede usar para estudiar los cambios en las neuronas motoras en el transcurso de la vida adulta utilizando imágenes fluorescentes in vivo a través de la cutícula. Aquí, describimos una técnica de disección de piernas junto con inmunocitoquímica, que permite el estudio de cambios moleculares en la unión neuromuscular de las neuronas motoras de piernas adultas identificadas. Estas técnicas se pueden combinar con una miríada de anticuerpos que marcan estructuras pre y postsinápticas. Juntos, estos procedimientos permiten una caracterización más completa de los cambios lentos dependientes de la edad en moscas adultas y se pueden aplicar a través de múltiples modelos de enfermedades de neuronas motoras.

La Figura 4 muestra un ejemplo representativo de una pierna metatorácica teñida con anti-hrp, anti-dlg y faloidina. Para las disecciones que eliminan la cutícula de la porción proximal del fémur, los cenadores estereotipados serán evidentes cerca del tendón que se detecta fácilmente por autofluorescencia. Tenga en cuenta que la penetración de anticuerpos en la pierna ocurre a una corta distancia más allá de la región en la que se ha eliminado la cutícula (Figura 4A). Estas regiones se pueden visualizar de manera efectiva cuando hay una fuerte señal de fluorescencia. Las imágenes a bajo aumento (20x con un zoom de 2x) permiten una fácil determinación de 1) cuánta cutícula se elimina y 2) si se produjo daño durante la disección. El aumento de la ampliación (60x) muestra proyecciones estereotipadas en la tilm (Figura 4B). Nuestro trabajo se ha centrado en un MN, probablemente derivado del linaje I-MN que inerva la tilm en el fémur proximal (recuadro, Figura 4B y Figura 4C). Aumentar aún más la ampliación (100x con zoom de 2x) permite una visualización efectiva de los boutons sinápticos (Figura 4D).
Para estudiar los cambios morfológicos en el NMJ adulto a lo largo del tiempo, hemos utilizado previamente mutantes dsod1 como modelo de ELA. La hinchazón de Bouton ocurre en mutantes dsod1H71Y envejecidos en relación con dsod1nulland dsod1+ (Figura 5A, B). En la NMJ larval, el anticuerpo monoclonal NC82 se usa a menudo para etiquetar zonas activas y estas estructuras se pueden visualizar fácilmente en la NMJ adulta (Figura 5C). Las ramas de axones HRP débilmente positivas son abundantes en mutantes dsod1H71Y y estas ramas a menudo muestran una localización BRP débil y difusa (flechas).
Importante para la neurodegeneración, los anticuerpos disponibles comercialmente pueden detectar proteínas ubiquitinadas que a menudo se encuentran en agregados, y hemos detectado agregados ubiquitinados dentro de axones terminales de MNs en moscas dsod1 mutantes envejecidas , así como dentro del músculo (Figura 6A). Además, los anticuerpos que marcan las mitocondrias también pueden detectar cambios morfológicos con la edad (Figura 6B).
Para algunas preparaciones, el daño muscular durante la disección hace que la muestra sea inutilizable. Al principio, tal daño puede ser una ocurrencia común, pero la mejora ocurre con la práctica. Ejemplos de buenas disecciones se muestran en la Figura 7A, C, mientras que las disecciones deficientes se muestran en la Figura 7B, D. Las disecciones deficientes causan la desorganización de las fibras musculares según lo detectado por la microscopía de contraste de fase (Figura 7B) o las fibras musculares faltantes visualizadas por la faloidina conjugada fluorescente (Figura 7D, flecha). La combinación del uso de faloidina para etiquetar el músculo y las imágenes de luz transmitidas puede ayudar a detectar dicho daño muscular que puede no ser evidente cuando se ve bajo un microscopio de disección.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig03.jpg"> Figura 3. Anatomía de la pierna de Drosophila . (A) Diagrama del lado anterior de una pierna metatorácica, caracterizado por la presencia de cerdas en contraste con la cutícula desnuda prominente presente en el lado posterior. La pierna segmentada está compuesta por la coxa (Cx), trocánter (Tr), fémur (Fe), tibia (Ti), 5 segmentos tarsianos (Ta1-5) y garra (Cl) en orden desde proximal (Pr) hasta distal (Di). También están indicados los lados dorsal (D) y ventral (V) del fémur. Barra de escala = 100 μm. (B) Diagrama del fémur que contiene los músculos elevador de tibia (tilm), depresor de tibia (tidm), músculo tendón largo 2 (ltm2) y reductor de tibia (tirm) y proyecciones de axones en el fémur proximal que inerva el tilm. Se presume que estas proyecciones axonales estereotipadas se derivan de neuroblastos del linaje I16, y la segunda arborización es la más fácil de acceder por disección (en caja). Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig04.jpg"> Figura 4. El fémur metatorácico diseccionado reveló una arquitectura estereotipada de MN que inerva la tilm. La inmunocitoquímica se utilizó para marcar neuronas (HRP), discos grandes (DLG) y músculos (faloidina). Las pilas Z se capturaron mediante imágenes de microscopía confocal a través de todo el fémur y se mostraron como una proyección de serie máxima. (A) También se incluyó un canal de luz transmitido para ilustrar que no se produjo daño muscular detectable durante la disección. La imagen fue capturada a un aumento de 20x, barra de escala = 50 μm. (B) Cenadores identificados asociados con el tilm (área en caja, centro), barra de escala = 20 μm; y (C) a un aumento de 60x, barra de escala = 20 μm. (D) DLG que rodean a los boutons era evidente en animales de tipo salvaje cuando se fotografiaban a un aumento de 100x con zoom de 2x; barra de escala = 2 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig05.jpg"> Figura 5. Ejemplo de cambios dependientes de la edad en la morfología del bouton que se pueden detectar utilizando la técnica de disección de piernas. La hinchazón de Bouton se observa en mutantes dsod1H71Y envejecidos. (A) Imágenes representativas de boutones manchados de HRP de moscas jóvenes (recién eclosadas, adultos del día 0) y viejas (día 10), barra de escamas = 1 μm. (B) Los tamaños de Bouton se cuantificaron a partir de los genotipos respectivos utilizando la función de medida dentro de ImageJ. p<0.0001 (ANOVA de 2 vías con prueba de Tukey post-hoc). (C) Zonas activas dentro de boutones sinápticos marcados con anticuerpo monoclonal NC82 (anti-bruchpilot); barra de escala = 1 μm. Figura modificada de20Por <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig05large.jpg" target="_blank">favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig06.jpg"> Figura 6. Marcadores comunes asociados con la enfermedad neurodegenerativa utilizados en las preparaciones de piernas de Drosophila. (A) Se detectan agregados poliubiquitinados subcelulares en axones terminales y músculos de moscas dsod1H71Y envejecidas. La inmunocitoquímica con antipoliubiquitina (FK2) detecta puntúas (flechas) en dsod1H71Y/H71Y envejecido, barra de escala = 20 μm (izquierda) y 5 μm (derecha). (B) Las mitocondrias inflamadas se pueden detectar usando anti-ATP5A, barra de escamas = 1 μm. Figura modificada de20Por <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig06large.jpg" target="_blank">favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62844/62844fig07v2.jpg"> Figura 7. Ejemplos de disecciones buenas y malas. (A) Disección que no interrumpió la arquitectura muscular subyacente. (B) Un ejemplo de una disección deficiente que mostró fibras musculares deshilachadas (flecha) y no pudo usarse para el análisis. Ambas muestras fueron fotografiadas por microscopía de contraste de fase. Barra de escala = 50 μm. (C) Ejemplo de una buena disección fotografiada por microscopía confocal con HRP (verde) y faloidina (azul). (D) Falta una mala disección de las fibras musculares dorsales del TILM (flecha). Barra de escala = 50 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62844/62844fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Anticuerpo/Tinción</td>
			<td>Dilución*</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-ATP5A</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-bruchpilot (nc82)</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteína de cadena anticisteína (ab49)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antidiscos grandes (4F3)</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-hrp</td>
			<td>1:550</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-poliubiquitina (FK2)</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-repo (8D12)</td>
			<td>1:5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
<tr>
<td>Faloidina</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>*Diluir en 5% NGS</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2. Anticuerpos y diluciones. Los proveedores comerciales de los anticuerpos utilizados en estos estudios se enumeran en la Lista de materiales.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron at JoVE.com

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Describimos una técnica de disección que preserva la arquitectura de la unión neuromuscular y permite un estudio inmunocitoquímico detallado de las neuronas motoras en la pierna adulta de Drosophila .

Disección e inmunohistoquímica de la pierna adulta de Drosophila para detectar cambios en la unión neuromuscular de una neurona motora identificada

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar los métodos de disección para la pierna adulta de Drosophila. Esta técnica elimina una porción de la cutícula, exponiendo el tejido subyacente de una manera que preserva la arquitectura neuronal y muscular. Este procedimiento nos permite caracterizar la unión neuromuscular para los cenadores de neuronas motoras identificados, utilizando técnicas químicas inmunocíticas estándar.La disección es particularmente útil para el estudio de cambios degenerativos lentos que ocurren durante períodos de tiempo relativamente largos. El aspecto del tiempo es una consideración importante, porque la unión neuromuscular bien caracterizada de las larvas de Drosophila es estable durante aproximadamente cinco a siete días antes del inicio de la metamorfosis. Por el contrario, las neuronas adultas están presentes durante toda la vida de una mosca adulta, aproximadamente 90 días para un Drosophila melanogaster de tipo salvaje y criado en laboratorio.La técnica es flexible y se puede aplicar a una variedad de genotipos para diferentes modelos de enfermedad, y utilizar una gama de anticuerpos disponibles para Drosophila como sistema modelo. El objetivo general de este procedimiento es demostrar los métodos de disección para la pierna adulta de Drosophila. Esta técnica elimina una porción de la cutícula, exponiendo el tejido subyacente de una manera que preserva la arquitectura neuronal y muscular.Con un pincel, transfiera las moscas al metanol frío en un pozo de vidrio o plato durante aproximadamente 30 segundos a un minuto. El metanol solubiliza los hidrocarburos cuticulares, y las moscas ahora pueden sumergirse en lugar de flotar en soluciones acuosas. Con fórceps, transfiera cuidadosamente las moscas a PBS.Enjuague tres veces en PBS helado para eliminar el exceso de metanol y mantenga las moscas en PBS en hielo hasta la disección y fijación. En este punto, las moscas deben ser diseccionadas y fijadas en el menor tiempo posible, preferiblemente menos de 30 minutos. Transfiera las moscas a un plato de disección de elastómero de silicona lleno de PBS frío.Retire las piernas metatorácicas en la coxa usando dos pares de pinzas Dumont número cinco, o corte las piernas con tijeras Vannas. Transfiera las patas a un pozo en una placa de plástico de 24 pocillos llena de una mil de PBS, y mantenga la placa en hielo hasta que todas las patas se retiren y se transfieran a los pozos. Normalmente usamos 20 patas por pozo.Reemplace la solución de PBS con una solución de FA de mililitros y gire sobre un nutator durante 30 minutos. El ajuste del nutator debe ajustarse a una velocidad media. Asegúrese de que las piernas estén completamente sumergidas en la solución durante este tiempo.Para eliminar la solución de FA, lave en un mil PBS tres veces rápidamente, seguido de tres lavados adicionales durante cinco minutos cada uno en un mil PBS. Mantenga los tejidos en un mil PBS en hielo, antes y durante los pasos de disección. Para proporcionar una breve descripción de la anatomía de la pierna de Drosophila, se indican los segmentos de las piernas, incluidos la coxa, el trocánter, el fémur, la tibia y cinco segmentos tarsales.Aquí vemos una vista anterior de la pierna, reconocida por la presencia de cerdas sensoriales en oposición a la cutícula desnuda presente en el lado posterior. También se indica la orientación del eje proximal-distal y del eje dorsal-ventral. Este procedimiento de disección elimina un pequeño trozo de cutícula del fémur proximal, de modo que se pueden estudiar los cenadores de axones, que se proyectan dorsalmente, inervando el músculo elevador de la tibia.Nuestro trabajo previo se ha centrado en el cenador indicado, originario del presunto linaje ocular neuroblasto. En esta parte del procedimiento, eliminamos la cutícula del lado anterior del fémur. Las pinzas de disección son críticas para el éxito, y hemos encontrado que la introducción de una ligera curva al final de las pinzas súper finas número cinco proporciona un bisel que permite que la cutícula se agarre superficialmente, en lugar de ser pinchada, lo que puede arruinar el tejido.Transfiera las piernas a un plato de elastómero de silicona en PBS para la disección. Usando un par de fórceps, fije el segmento de tibia al plato de elastómero de silicona como se muestra aquí en el lado derecho. Usando las otras pinzas sostenidas biseladas hacia abajo, agarre un trozo de cutícula en el extremo distal del fémur y tire en la dirección proximal hacia el trocánter.Mantenga la extirpación metódica de la cutícula hasta que el músculo desnudo sea visible en todo el extremo proximal del fémur. Una vez que todas las piernas estén diseccionadas, reemplace PBS con solución de FA para posfijar las piernas durante 30 minutos con agitación en un nutator a velocidad media. Después, lave las muestras en un mil PBS por tres veces rápido, y luego tres veces durante cinco minutos cada una en solución de PBT.Para bloquear los tejidos, reemplace un mil PBT con una solución de bloqueo que consiste en un mil 5% de suero de cabra normal diluido en PBT. Incubar las patas diseccionadas durante cuatro horas a temperatura ambiente, o durante la noche a cuatro grados centígrados. Retire la solución de bloqueo y reemplácela con el anticuerpo primario que se diluye en la solución de bloqueo.Aquí, estamos usando discos anti grandes en una dilución de uno a 200. Vuelva a colocar las placas en una coctelera e incube a cuatro grados durante la noche. Después de la incubación primaria de anticuerpos, lave los anticuerpos primarios en un mil PBT durante tres veces brevemente, y luego tres veces durante 15 minutos cada una.Bloquee los tejidos nuevamente en un molino de suero de cabra 5% normal durante al menos dos horas a temperatura ambiente, o durante la noche a cuatro grados centígrados. Retire la solución de bloqueo y agregue 300 microlitros de los anticuerpos secundarios conjugados fluorescentes diluidos apropiados. Además, agregue una a 2000 dilución de faloidina conjugada de fluorescencia para etiquetar el músculo.Para incubar, selle los pozos con cinta de sellado de laboratorio y tapa. Además, envuelva las placas en papel de aluminio para proteger los fluoróforos de la luz. Incubar durante seis a ocho horas a temperatura ambiente, o durante la noche a cuatro grados centígrados.Para eliminar el anticuerpo secundario no unido, realice lavados con PBT de una manera similar a la descrita anteriormente al lavar el anticuerpo primario. Después de este paso, las muestras ya están listas para ser montadas y fotografiadas. Coloque las patas del lado anterior hacia arriba y cúbralas con medios de montaje adicionales si es necesario.Raspe suavemente las esquinas de un deslizamiento de cubierta a través de una bola de arcilla. La arcilla resultante servirá como espaciador entre el tobogán y el deslizamiento de la cubierta, para que los tejidos no se trituren. Presione hacia abajo en el resbalón de la cubierta hasta que toque la parte superior de las piernas.Selle los bordes con esmalte de uñas y guárdelos a cuatro grados hasta obtener la imagen. Imagen por microscopía confocal utilizando los parámetros de imagen descritos en la sección cuatro del protocolo escrito. Para ayudar a validar el protocolo de disección, primero obtenemos imágenes de las piernas mediante microscopía de contraste de fase a bajo aumento.Aquí hay un ejemplo en el panel A de una buena disección a la izquierda y una mala disección a la derecha en la que se interrumpieron las fibras musculares. El panel C muestra una imagen confocal de una buena disección en la que no se ha interrumpido el músculo. En contraste, el panel D muestra una pierna dañada durante la disección, en la que faltan fibras musculares, como lo indica la flecha.Aquí, teñimos una imagen de las piernas con peroxidasa anti rábano picante para detectar procesos neuronales, que se muestran aquí en verde, anti discos grandes, lo que facilita la agrupación de receptores de glutamato postsinápticos, que se muestran en rojo, y faloidina para etiquetar el músculo, que se muestra en azul. Cuando se captura a un aumento de 20X con un canal de luz transmitido, es fácil ver el área diseccionada. Tenga en cuenta que los anticuerpos penetran parcialmente en áreas no diseccionadas y se pueden ver a través de la cutícula como lo indica la flecha blanca.Cada una de las neuronas motoras de la pierna hace proyecciones estereotipadas cuando inerva el músculo. Nuestro trabajo se centra en las neuronas motoras que inervan el músculo elevador de la tibia, que se muestra aquí como la región en caja e indicada por la flecha blanca. Con un aumento más alto de 60X con zoom 2X en la parte superior derecha, podemos obtener imágenes efectivas de boutons, que se muestran en verde, y DLG circundantes que se muestran en rojo.Aumentar aún más el zoom, o pasar a un objetivo de 100X, permite la cuantificación del tamaño y la morfología del bouton como se muestra en la parte inferior derecha. Usando esta técnica de disección combinada con inmunocitoquímica, encontramos que hay hinchazón de bouton dependiente de H en un modelo mutante sod1 de ELA, que se muestra aquí en piernas H71Y envejecidas, en comparación con los controles de tipo salvaje como lo indican las flechas. Los tamaños de Bouton se cuantifican en la parcela de enjambre de abejas a la derecha.Además, encontramos una reducción en el marcador de zona activa Bruchpilot, mostrado en rojo, dentro de axones HRP débilmente teñidos, mostrados en verde, de mutantes H71Y. Para estudiar la neurodegeneración, los agregados de proteínas ubiquitinadas a menudo son detectados por el anticuerpo FK2, y se muestran aquí como puntos FK2 positivos, en los axones y músculos de las moscas H71 envejecidas en el lado derecho, indicados por las flechas. Finalmente, las mitocondrias se pueden visualizar mediante inmunocitoquímica utilizando un anticuerpo monoclonal anti ATP5a, como se muestra aquí en rojo dentro del músculo elevador de la tibia.Encontramos que las mitocondrias se agrandan con la edad en los mutantes H71Y. Una vez dominado, la preparación de la pierna diseccionada y la tinción de anticuerpos asociada le permitirán analizar los cambios moleculares en la unión neuromuscular adulta para su mutante favorito en varios puntos de tiempo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Investigación

Neurociencias

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

La disección e inmunohistoquímica de larva, pupa y adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Disección Del Músculo Transverso Abdominis Para El Análisis De La Unión Neuromuscular De Montaje Completo

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detección de<em&gt; In Situ</em&gt; Complejos proteína-proteína en la<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...