Name: absolute quantitation of inositol pyrophosphates by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry
Uploaded: 2021-08-13T13:45:00
Duration: 9 min 22 s
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Ce projet a reçu un financement du Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (convention de subvention n° 864246, à HJJ). DQ reconnaît le soutien financier du programme Brigitte-Schlieben-Lange. AS est soutenu par la subvention MR/T028904/1 du programme MRC.

1. Mise en place du système CE-ESI-MS
<ol><li>Mettre en place un système CE-ESI-MS composé d’un système CE commercial - et d’un spectromètre de masse en tandem triple quadripolaire, équipé d’une source d’ionisation par électropulvérisation (ESI) Agilent Jet Stream (AJS). Un kit de pulvérisation CE-ESI-MS et une pompe isocratique LC (chromatographie liquide) sont nécessaires.</li>
	<li>Connectez le séparateur de flux de gaine 1:100 (inclus dans le kit de pulvérisation CE-MS) et la sortie de pompe LC isocratique.</li>
	<li>Assurez-vous que le flacon d’entrée du système CE est à la même hauteur que l’extrémité du pulvérisateur de l’analyseur de masse.</li>
	<li>Utilisez MassHunter Workstation (version 10.1) ou un logiciel MS comparable pour contrôler l’ensemble du système, ainsi que pour l’acquisition et l’analyse des données.</li>
</ol>2. Préparation du tampon, du capillaire et du système CE-MS
<ol><li>Préparer le tampon de fonctionnement CE : Ajuster le pH de 40 mM d’acétate d’ammonium à 9,0 avec de l’hydroxyde d’ammonium. Une fiole jaugée de 250 mL est recommandée. Filtrer les 250 ml de tampon avec des filtres à membrane de 0,2 μm de la taille d’un pores. Assurez-vous de n’utiliser que de l’eau désionisée ultra-pure et des réactifs de qualité MS. REMARQUE: Ce tampon peut être conservé à température ambiante pendant 2-3 semaines ou pendant plusieurs mois dans un réfrigérateur.</li>
	<li>Préparer le liquide de gaine : Mélanger 100 mL d’eau ultra-pure et 100 mL d’isopropanol de qualité LC-MS dans une bouteille de 250 mL. Changez le liquide de gaine au moins une fois par semaine. Ajoutez une référence de masse dans le liquide de la gaine lors de l’utilisation d’un spectromètre de masse à haute résolution.</li>
	<li>Installer le liquide de gaine : Purger à 5 mL/min pendant 5 min et régler le débit à 1 mL/min (10 μL/min dans le pulvérisateur CE-MS). La pression de la pompe sera d’environ 180 bars. Assurez-vous que le tube de recyclage se reconnecte dans la bouteille de liquide de la gaine pour réutiliser le solvant.</li>
	<li>Préparer le capillaire: Achetez un capillaire CE-MS (50 μm i.d. et 365 μM o.d. avec une longueur de 125 cm) avec une fenêtre de détection UV. L’utilisateur peut également obtenir des capillaires de silice fusionnés à barres beaucoup moins chers auprès de distributeurs spécialisés. Couper un capillaire d’une longueur de 100 cm. Coupez correctement les deux extrémités capillaires avec un coupe-colonne capillaire avec une lame diamantée rotative et retirez 2-3 cm de revêtement de polyimide sur les deux extrémités avec un briquet. Nettoyez la surface capillaire avec de l’isopropanol.</li>
	<li>Installer le capillaire : Faites correspondre le capillaire dans la cassette CE-MS. Cliquez sur le bouton Change Cassette (Changer de cassette) et installez la cassette dans le périphérique CE. L’extrémité d’entrée du capillaire est environ 2 mm plus basse que l’électrode. Assurez-vous que l’extrémité d’entrée est plus basse que la surface de l’échantillon pendant le processus d’injection.</li>
	<li>Activer le capillaire : Avant la première utilisation, rincer le capillaire avec 1 M de NaOH, suivi d’eau pendant 10 min, et de tampon CE pendant 15 min.</li>
	<li>Insérez l’extrémité capillaire dans le pulvérisateur CE-MS : Insérez doucement le capillaire dans le pulvérisateur CE-MS et assurez-vous que l’extrémité capillaire dépasse d’environ 0,1 mm de l’extrémité du pulvérisateur. Assurez-vous d’effectuer un réglage précis de l’extrémité de sortie capillaire avec une loupe et la vis de réglage dans le pulvérisateur. Réinsérez le pulvérisateur dans la source d’ions et évitez de toucher la vis de réglage. Le MS est en mode veille lors de l’exécution de cette opération.</li>
	<li>Vérifiez le spray ESI: Vérifiez la stabilité du pulvérisateur ESI en mode balayage complet. La fluctuation des électrophérogrammes ioniques totaux doit se situer à moins de 5%.</li>
	<li>Effectuer un essai avec les étalons InsP : Utiliser un mélange de 2 μM d’étalons InsP 3-InsP 8 (ajusté par RMN quantitative 31P15,27) pour des essais avec une injection à 50 mbar pendant 10 s (10 nL). Définissez les paramètres ESI et MS détaillés comme indiqué dans le tableau 1. Le courant CE est d’environ 26 μA. La largeur de crête est d’environ 0,4-0,5 min. Assurez-vous que le rapport signal/bruit atteint au moins 400.</li>
</ol>3. Extraction de phosphates solubles d’inositol à partir de cellules de mammifères
REMARQUE: Les cellules HCT116NIH étaient un cadeau aimable de Stephen Shears28. Les cellules HCT116UCL provenaient du laboratoire26 de Saiardi.
<ol><li>Cellules d’ensemencement<ol><li>Culture de cellules HCT116NIH ou HCT116UCL dans des flacons T75 à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 % d’humidité élevée (ci-après appelée conditions standard) dans le milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, complétée par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS).</li>
		<li>Laver les cultures mères HCT116NIH et HCT116 UCL avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (5 mL) et incuber les cellules avec de l’acide tétraacétique trypsine-éthylènediamine (EDTA) (3mL , 0,25%) dans des conditions standard jusqu’à ce qu’elles soient complètement détachées. Éteindre l’activité de la trypsine en ajoutant du milieu (7 mL), recueillir les cellules dans un tube à centrifuger et centrifuger (200 x g, 3 min).</li>
		<li>Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un milieu (10 mL). Comptez les cellules et déterminez la viabilité via l’exclusion du bleu trypan.</li>
		<li>Ensemencer les cellules (6 millions de cellules HCT116 par essai) dans une boîte de 150 mm et ajuster 20 ml de milieu de culture cellulaire au total. Prémélanger le milieu et les cellules dans un tube centrifuge avant l’ensemencement pour obtenir une répartition égale des cellules dans la boîte. Préparez une boîte parallèle lorsque la normalisation par numéro de cellule est nécessaire.</li>
		<li>Culture des cellules dans des conditions normales pendant 72 h. Les cellules atteindront environ 80% à 90% de confluence.</li>
	</ol></li>
	<li>Modulation des niveaux de phosphate d’inositol avec NaF et récolte cellulaire<ol><li>Traitement NaF: Ajouter NaF (10 mM) 1 h avant de récolter dans le milieu. Mélanger le milieu en faisant tourbillonner la plaque/pipetage et incuber les cellules pendant 60 min dans des conditions standard.</li>
		<li>Après le traitement NaF, retirez le milieu des cellules et placez les cellules sur de la glace.</li>
		<li>Lavez les cellules deux fois avec du PBS (5 mL, 4 °C) et retirez complètement le PBS de la capsule.</li>
		<li>Ajouter de l’acide perchlorique (PA) (1 mL, 1 M, 4 °C). Assurez-vous de couvrir toute la surface avec du PA (les cellules deviendront blanches lorsque les protéines précipiteront). Incuber les cellules pendant 10 min sur une table basculante à 4 °C.</li>
		<li>Recueillir le PA dans un tube à centrifuger et éliminer les débris contaminants par centrifugation (17 000 x g, 5 min, 4 °C). Ajoutez le surnageant aux perles TiO2 préparées pour le retrait des InsPs.</li>
		<li>Laver la capsule post-extraction deux fois avec du PBS (5 mL, t.r.) pour la désacidification; retirer complètement le PBS du plat.</li>
		<li>Solubiliser les protéines sur la plaque par l’ajout d’un tampon de lyse cellulaire (1,5 mL, r.t.; 0,1% de dodécylsulfate de sodium [SDS] dans 0,1 M NaOH). Incuber le plat pendant 15 min sur une table basculante à r.t. Transférer le lysat cellulaire dans un tube à centrifuger et centrifuger (17 000 x g, 5 min, 4 °C). Conserver le surnageant à -80 °C jusqu’à ce que la concentration en protéines soit déterminée par le dosage des protéines DC en utilisant l’albumine sérique bovine comme étalon (généralement, une boîte de 150 mm contient environ 10 mg de protéines).</li>
		<li>Détermination du nombre de cellules à partir de boîtes parallèles : Récolter les cellules de la capsule parallèle via la trypsine comme décrit à l’étape 3.1.2 (utiliser 5 ml de trypsine-EDTA pour la boîte de 150 mm) et retirer le milieu. Remettez en suspension la pastille de cellule dans du PBS (5 mL), mélangez correctement et comptez les cellules. Effectuez cette étape juste avant la récolte par trempe directe pour obtenir un nombre représentatif de cellules. De plus, mesurez le volume des cellules avec une méthode appropriée (par exemple, avec une machine multidimensionnelle).</li>
	</ol></li>
	<li>EnrichissementTiO2 en phosphates d’inositol NOTE: Pour éviter la décomposition acide des composés phosphorylés, effectuer toutes les étapes d’enrichissement jusqu’à élution sur glace et refroidir tous les réactifs à 4 °C. Gardez le temps d’extraction au minimum (1,5-2 h). Effectuez toutes les étapes d’extraction avec 1 M PA.<ol><li>Préparation des billes : Laver les billes de TiO2 (5 mg par échantillon) avec du ddH2O (1 mL) et centrifuger (3 500 x g, 1 min, 4 °C). RetirerddH2Oet laver les billes avec du PA (1 mL). Éliminer le PA par centrifugation (3 500 x g, 1 min, 4 °C). Remettez les billes en suspension dans du PA (50 μL par échantillon).</li>
		<li>Ajouter le surnageant contenant des composés phosphorylés (comparer rubrique 3.2, étape 3.2.5) à la suspension de billes, vortex, puis faire pivoter l’échantillon pendant 20 min à 4 °C.</li>
		<li>Centrifuger l’échantillon (3 500 x g, 1 min, 4 °C) et jeter le surnageant. Laver les billes avec du PA (500 μL) et une centrifugeuse (3 500 x g, 1 min, 4 °C). Jetez le surnageant et répétez l’étape de lavage.</li>
		<li>Ajouter NH4OH (200 μL, 3%) aux billes et remettre en suspension. Faire pivoter l’échantillon pendant 5 min à r.t.</li>
		<li>Centrifuger l’échantillon (3 500 x g, 1 min) et transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger.</li>
		<li>Répéter les étapes d’élution 3.3.4 et 3.3.5 et combiner les éluants. Jetez les perles.</li>
		<li>Centrifuger les éluants combinés (17 000 x g, 1 min, 4 °C) pour éliminer les résidus insolubles.</li>
		<li>Sécher complètement le surnageant sous évaporation sous vide (70 min, 60 °C, V-AQ). AjouterddH2O(50 μL) aux extraits séchés contenant des InsPs. Vortex pour mélanger l’échantillon jusqu’à dissolution complète. Conserver l’échantillon à -20 °C jusqu’à l’analyse CE-ESI-MS.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Exécution des exécutions CE-ESI-MS
<ol><li>Préparer un mélange d’étalons internes contenant 40 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 80 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 80 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 400 μM [13 C 6]InsP 6 et 400 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5. Déterminer les concentrations de solutions SIL IS par RMN quantitative 31P et 1H, à l’aide d’un étalon de référence certifié, c’est-à-dire l’acide phosphoacétique. NOTE: Tous les étalons internes (IS) SIL ci-dessus avec des puretés supérieures à 96% ont été synthétisés et fournis par le groupeFiedler 15,27. Comme pour les nucléotides, ces IS pourraient transporter de nombreuses molécules d’eau cristalline et divers contre-ions. Au lieu de peser la substance et de calculer la concentration, il est recommandé de déterminer la concentration de solutions étalons en 13C6 par RMN quantitative 31P.</li>
	<li>Mélanger 10 μL de l’échantillon avec 0,5 μL de mélange d’étalons internes dans un flacon d’échantillon CE. 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 20 μM [13 C 6]InsP 6, et 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 sont les concentrations finales à l’intérieur des échantillons.</li>
	<li>Lorsque vous utilisez le système de réapprovisionnement, cliquez sur le bouton Changer de bouteille , mettez les 250 ml de tampon d’exécution CE préparés dans le flacon d’électrolyte et cliquez sur Nettoyer les tubes. Conservez l’aiguille de réapprovisionnement dans un flacon d’eau.</li>
	<li>Définissez les paramètres ESI et MS comme indiqué dans le tableau 1. Optimisez les paramètres de la source à l’aide d’un optimiseur de source avec un mélange de normes de polyphosphate d’inositol. Obtenez les paramètres de surveillance des réactions multiples (MRM) à l’aide de Masshunter Optimizer avec toutes les normes. Ajustez les paramètres ESI et MS/MS pour différentes instrumentations.</li>
	<li>Exécutez les extraits InsP et vérifiez le résultat (Figure 2). Définissez une séquence lorsqu’il y a plus d’échantillons.</li>
	<li>Laissez le MS en mode veille après les mesures. N’éteignez pas la pompe LC. L’écoulement du liquide de gaine protège l’aiguille du pulvérisateur. Remplacez le pulvérisateur CE-ESI-MS par un pulvérisateur LC-ESI-MS lorsqu’il n’y a pas d’alimentation en liquide de gaine.</li>
</ol>5. Analyse des données
<ol><li>Ouvrez le logiciel d’analyse quantitative (pour QQQ), créez un lot pour tous les échantillons.</li>
	<li>Créez une nouvelle méthode à partir des données MRM acquises. Définir les [13C6]InsP comme étalons internes - (ISTD). Vérifiez la configuration du composé MRM, la configuration du temps de rétention, la configuration ISTD, la configuration de la concentration et la configuration du qualificatif. Passez la validation et quittez pour appliquer la méthode au lot actuel. Enregistrez la méthode.</li>
	<li>Vérifier si chaque pic du lot est correctement intégré; Sinon, intégrez manuellement le pic.</li>
	<li>Exportez les résultats dans une feuille de calcul. Effectuer la quantification des (pyro)phosphates d’inositol en comparant la réponse maximale de l’analyte avec la réponse maximale respective du SIL IS avec les concentrations connues. Les courbes d’étalonnage théoriques et expérimentales sont présentées dans le tableau 2 pour 5-PP-InsP 5, InsP 6 et Ins(1,3,4,5,6)P 5 avec la plage linéaire. NOTE: La condition préalable à l’application de la courbe d’étalonnage théorique est l’utilisation d’un motif isotopique de haute qualité d’analytes ciblés et avec une concentration crédible. Évaluez la plage linéaire. Une courbe d’étalonnage est essentielle pour la quantification absolue lorsque l’acquisition complète des étalons isotopiques mentionnés ci-dessus n’est pas pratique.</li>
	<li>Avec la concentration mesurée dans la solution d’extrait InsP et son volume, calculer les quantités absolues. En outre, normalisez la quantité par le nombre de cellules ou la teneur en protéines. Calculer la concentration cellulaire en fonction du nombre de cellules et du volume cellulaire moyen de HCT116 (1,68 fL).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stephens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection,+purification,+structural+characterization,+and+metabolism+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate(s)+and+bisdiphosphoinositol+tetrakisphosphate(s).">The detection, purification, structural characterization, and metabolism of diphosphoinositol pentakisphosphate(s) and bisdiphosphoinositol tetrakisphosphate(s).</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 4009-4015 (1993).</li><li>Menniti, F. S., Miller, R. N., Putney, J. W., Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+inositol+polyphosphate+pyrophosphates+in+pancreatoma+cells.">Turnover of inositol polyphosphate pyrophosphates in pancreatoma cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 3850-3856 (1993).</li><li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+Why+so+many+phosphates.">Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates.</a> Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).</li><li>Irvine, R. F., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+in+the+water:+the+return+of+the+inositol+phosphates.">Back in the water: the return of the inositol phosphates.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (5), 327-338 (2001).</li><li>Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+inositol+pyrophosphates+on+cellular+energy+dynamics.">Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics.</a> Science. 334 (6057), 802-805 (2011).</li><li>Wild, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+eukaryotic+phosphate+homeostasis+by+inositol+polyphosphate+sensor+domains.">Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains.</a> Science. 352 (6288), 986-990 (2016).</li><li>Chakraborty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+inhibit+Akt+signaling,+thereby+regulating+insulin+sensitivity+and+weight+gain.">Inositol pyrophosphates inhibit Akt signaling, thereby regulating insulin sensitivity and weight gain.</a> Cell. 143 (6), 897-910 (2010).</li><li>Bittner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+caged+inositol+pyrophosphate+InsP8+directly+modulates+intracellular+Ca2++oscillations+and+controls+C2AB+domain+localization.">Photolysis of caged inositol pyrophosphate InsP8 directly modulates intracellular Ca2+ oscillations and controls C2AB domain localization.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (24), (2020).</li><li>Hauke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+cell-permeant+caged+inositol+pyrophosphates+controls+oscillations+of+cytosolic+calcium+in+a+&#946;-cell+line.">Photolysis of cell-permeant caged inositol pyrophosphates controls oscillations of cytosolic calcium in a &#946;-cell line.</a> Chemical Science. 10 (9), 2687-2692 (2019).</li><li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking.">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14206-14211 (2002).</li><li>Koldobskiy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-mediated+apoptosis+requires+inositol+hexakisphosphate+kinase-2.">p53-mediated apoptosis requires inositol hexakisphosphate kinase-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (49), 20947 (2010).</li><li>Rao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+hexakisphosphate+kinase-1+mediates+assembly/disassembly+of+the+CRL4-signalosome+complex+to+regulate+DNA+repair+and+cell+death.">Inositol hexakisphosphate kinase-1 mediates assembly/disassembly of the CRL4-signalosome complex to regulate DNA repair and cell death.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16005 (2014).</li><li>Williams, S. P., Gillaspy, G. E., Perera, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+possible+functions+of+inositol+pyrophosphates+in+plants.">Biosynthesis and possible functions of inositol pyrophosphates in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 67 (2015).</li><li>Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+between+signalling+and+metabolism.">Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism.</a> The Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).</li><li>Harmel, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+13C-labeled+myo-inositol+to+interrogate+inositol+phosphate+messengers+by+NMR.">Harnessing 13C-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR.</a> Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).</li><li>Qiu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+inositol+phosphate+metabolism+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Analysis of inositol phosphate metabolism by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nature Communications. 11 (1), 6035 (2020).</li><li>Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+analysis+of+soluble+inositol+polyphosphates+from+yeast.">Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).</li><li>Wilson, M. S. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+radioactive+labelling+to+elucidate+inositol+polyphosphate+signalling.">Importance of radioactive labelling to elucidate inositol polyphosphate signalling.</a> Phosphate Labeling and Sensing in Chemical Biology. , 67-87 (2017).</li><li>Wilson, M. S. C., Bulley, S. J., Pisani, F., Irvine, R. F., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+purification+of+inositol+phosphates+from+biological+samples+reveals+that+no+phytate+is+present+in+human+plasma+or+urine.">A novel method for the purification of inositol phosphates from biological samples reveals that no phytate is present in human plasma or urine.</a> Open Biology. 5 (3), 150014 (2015).</li><li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity:+analysis+by+gel+electrophoresis.">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PloS One. 4 (5), 5580 (2009).</li><li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphate+InsP8+acts+as+an+intracellular+phosphate+signal+in+arabidopsis.">Inositol pyrophosphate InsP8 acts as an intracellular phosphate signal in arabidopsis.</a> Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).</li><li>Riemer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITPK1+is+an+InsP6/ADP+phosphotransferase+that+controls+systemic+phosphate+homeostasis+in+Arabidopsis.">ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls systemic phosphate homeostasis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Whitfield, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATP-responsive+metabolic+cassette+comprised+of+inositol+tris/tetrakisphosphate+kinase+1+(ITPK1)+and+inositol+pentakisphosphate+2-kinase+(IPK1)+buffers+diphosphosphoinositol+phosphate+levels.">An ATP-responsive metabolic cassette comprised of inositol tris/tetrakisphosphate kinase 1 (ITPK1) and inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPK1) buffers diphosphosphoinositol phosphate levels.</a> The Biochemical Journal. 477 (14), 2621-2638 (2020).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+interaction+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+quantitative+analysis+of+mammalian-derived+inositol+poly/pyrophosphates.">Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates.</a> Journal of chromatography. A. 1573, 87-97 (2018).</li><li>Mantilla, B. S., Amaral, L. D. D., Jessen, H. J., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=the+inositol+pyrophosphate+biosynthetic+pathway+of+Trypanosoma+cruzi.">the inositol pyrophosphate biosynthetic pathway of Trypanosoma cruzi.</a> ACS Chemical Biology. 16 (2), 283-292 (2021).</li><li>Wilson, M. S. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+phosphates+purification+using+titanium+dioxide+beads.">Inositol phosphates purification using titanium dioxide beads.</a> Bio-Protocol. 8 (15), 2959 (2018).</li><li>Puschmann, R., Harmel, R. K., Fiedler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+chemoenzymatic+synthesis+of+inositol+pyrophosphates.">Scalable chemoenzymatic synthesis of inositol pyrophosphates.</a> Biochemistry. 58 (38), 3927-3932 (2019).</li><li>Gu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KO+of+5-InsP7+kinase+activity+transforms+the+HCT116+colon+cancer+cell+line+into+a+hypermetabolic,+growth-inhibited+phenotype.">KO of 5-InsP7 kinase activity transforms the HCT116 colon cancer cell line into a hypermetabolic, growth-inhibited phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 11968-11973 (2017).</li><li>Gu, C., Wilson, M. S. C., Jessen, H. J., Saiardi, A., Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+Pyrophosphate+Profiling+of+Two+HCT116+Cell+Lines+Uncovers+Variation+in+InsP8+Levels.">Inositol Pyrophosphate Profiling of Two HCT116 Cell Lines Uncovers Variation in InsP8 Levels.</a> PloS One. 11 (10), 0165286 (2016).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Présenté ici est une méthode pratique et sensible pour la quantification des pyrophosphates d’inositol hautement chargés dans les cellules de mammifères. En combinant cette approche d’analyse avec l’extraction InsP de pointe actuelle avec de l’acide perchlorique suivie d’un enrichissement avec TiO2, l’analyse CE-ESI-MS présente des avantages sans précédent. En ce qui concerne son débit, sa sensibilité, sa stabilité, sa quantification absolue, l’identification des isomères et l’indépendance de la matrice, cette méthode se démarque des autres approches. Ce protocole est applicable aux cellules de mammifères, mais en effet, cette stratégie réussit dans de nombreux échantillons différents (par exemple, levure, plantes, parasites, tissus de souris, etc.).
Le protocole d’extraction appliqué récupère complètement les PP-InsP et InsP6 des extraits de cellules de mammifères16,19. Il extraira également de nombreux autres métabolites anioniques, en particulier les espèces contenant des phosphates, par exemple les phosphates de sucre et les nucléotides. L’évaluation de la récupération et de la décomposition des analytes de l’utilisateur avec ce protocole serait nécessaire.
En général, le système CE-ESI-MS fonctionne bien et peut accueillir environ 200 échantillons chaque semaine en utilisant ce protocole. Contrairement à la CLHP, cependant, l’EC a longtemps été considérée comme une méthode pour les experts et les personnes spécialisées, ce qui a restreint son marché et limité son application. Ainsi, un dispositif CE-ESI-MS est généralement absent dans les facultés d’analyse. Les personnes qui souhaitent effectuer une analyse CE-ESI-MS manquent probablement d’expérience en CE et passeront plus de temps à dépanner. Ici, les étapes critiques sont mises en évidence. Tout d’abord, la qualité de la coupe capillaire. La sensibilité et la stabilité du spray ESI reposent principalement sur une coupe capillaire de première classe. Deuxièmement, l’extrémité de sortie capillaire doit être exactement à 0,1 mm de l’extrémité du pulvérisateur. L’aiguille du pulvérisateur et le capillaire CE doivent être dans le sens axial. La qualité de la pulvérisation ESI est essentielle pour la quantification; Des essais techniques doivent être effectués pour évaluer la répétabilité. 
Avec le protocole décrit, la limite de quantification (LOQ) pour les PP-InsPs est de 40 nM avec une injection à 50 mbar pendant 10 s (10 nL). Il existe plusieurs approches pour augmenter encore la sensibilité de la méthode. Tout d’abord, une injection à 100 mbar pendant 20 s (40 nL) permettra toujours d’obtenir une bonne forme de pic et une résolution suffisante pour les régioisomères 5-PP-InsP 5 et 1-PP-InsP5. Deuxièmement, les extraits InsP peuvent être dissous dans une plus petite quantité d’eau. Troisièmement, le temps de séjour pourrait être augmenté en utilisant moins de transitions MRM pour la quantification. De plus, une source d’ions CE-MS utilisant un débit liquide à gaine ultra-faible augmenterait considérablement la sensibilité.
Le tampon CE avec pH 9 offre la meilleure résolution entre InsP6-InsP 8. En augmentant le pH à 9,7, la résolution parmi InsP3-InsP 6 s’améliorera considérablement. En raison de l’excellente résolution, une longueur capillaire plus courte de 72 cm est recommandée pour augmenter encore le débit. En outre, une température de cassette CE plus élevée à 40 °C diminue la viscosité du tampon électrophorétique aqueux et accélère leur mouvement sous EOF. Selon les différentes demandes de recherche, les modifications de cette méthode peuvent faciliter davantage l’analyse InsPs et PP-InsPs. Par conséquent, les protocoles CE-ESI-MS décrits ont le potentiel d’ouvrir de nouvelles voies de recherche dans cette famille multiforme de molécules de signalisation.

Depuis la découverte initiale des pyrophosphates de myo-inositol (PP-InsPs) en 19931,2, des progrès significatifs ont été réalisés pour élucider leur biosynthèse, leur renouvellement et leurs fonctions3. Les pyrophosphates d’inositol sont omniprésents dans les cellules eucaryotes4 et servent de molécules de signalisation métabolique impliquées de manière critique dans, par exemple, l’homéostasie du phosphate5,6, la sensibilité à l’insuline 7, les oscillations calciques8,9, le trafic vésiculaire 10, l’apoptose 11, la réparation de l’ADN 12, la signalisation immunitaire 13 et autres. La pléthore de processus importants sous le contrôle des pyrophosphates d’inositol nécessite une compréhension plus profonde de leur abondance cellulaire, fluctuation, et localisation.
Bien que les InsP et les PP-InsP aient attiré l’attention de toutes les disciplines, l’analyse de leur abondance est couramment effectuée à l’aide d’une méthode développée au cours des années 80, consistant à marquer les cellules avec de l’inositol tritié, à résoudre les PP-InsP extraits par chromatographie à échange d’anions forts Sax-HPLC avec comptage ultérieur de la scintillation. Les nouvelles méthodes basées sur la spectrométrie de masse font toujours face à des défis importants: les pyrophosphates d’inositol avec jusqu’à huit unités de phosphate abritent des esters de phosphate et des anhydrides, conduisant à une charge négative importante et une perte potentielle de phosphate lors de l’ionisation. Quatre grands types de PP-InsP sont présents chez les mammifères (Figure 1) : 1,5-(PP)2-InsP 4 (ou 1,5-InsP8), 5-PP-InsP 5 (ou 5-InsP 7), 1-PP-InsP 5 (ou 1-InsP7) et 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (ou5-PP-InsP 4)3,14. Les niveaux physiologiques de PP-InsP sont généralement dans la gamme nano- à faible-micromolaire, avec 5-PP-InsP 5 comme le plus abondant avec des concentrations cellulaires de 0,5 à 5 μM. 1,5-(PP)2-InsP 4 et 1-PP-InsP 5 sont estimés représenter jusqu’à environ 10% du pool 5-PP-InsP5 et restent difficiles à tracer dans de nombreuses cellules 15. La 5-PP-InsP4 avec un groupe OH libre est encore plus faible en abondance et ne devient généralement détectable que lorsque les hydrolases de phosphate sont inhibées par le fluorure de sodium (NaF)16.
La densité de charge élevée des PP-InsP rend leur séparation difficile, et l’apparition de régisomères PP-InsP complique encore ces efforts. En conséquence, la plupart des expériences reposaient sur la quantification par marquage radioactif métabolique des cellules à l’aide de [3H]-inositol, car le fond de fond de la matrice est exclu et une sensibilité élevée est atteinte17,18. Cependant, cette méthode est coûteuse, prend du temps et ne permet pas de distinguer correctement les régiomères PP-InsP apparentés. De plus, le marquage [3H]-inositol ne tient pas compte de la synthèse endogène de l’inositol à partir du glucose. Une méthode d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) est une alternative peu coûteuse largement appliquée, mais limitée dans sa sensibilité 19,20,21,22. D’autres approches évitant le radiomarquage ont été publiées, notamment la chromatographie ionique suivie de la dérivatisation post-colonne par détection UV23, de la chromatographie par interaction hydrophile (HILIC)24 ou de l’échange d’anions faibles (WAX) couplé à la spectrométrie de masse (MS)25. Cependant, ils ne sont pas (encore) à égalité avec le protocole classique [3H]-inositol SAX-HPLC.
Récemment, la spectrométrie de masse par électronébulisation par électronébulisation capillaire (CE-ESI-MS) a été introduite en tant que stratégie transformatrice pour l’analyse du métabolisme des InsPs et des PP-InsPs, répondant à toutes les exigences décrites ci-dessus16. Combiné à l’extraction InsP de pointe actuelle par l’acide perchlorique suivie d’un enrichissement avec des billes de dioxyde de titane26, CE-ESI-MS a réussi dans tous les organismes testés jusqu’à présent, de la levure aux plantes et aux mammifères. Le profilage simultané des InsP et des PP-InsP, y compris tous les régiomères possibles, a été facilement réalisé. Les étalons internes marqués aux isotopes stables (SIL) ont permis une quantification absolue rapide et précise, indépendamment des effets de matrice. Parce que la SEP peut capturer les différences de masse isotopique, CE-ESI-MS peut également être appliqué pour étudier les voies de synthèse cellulaire compartimentées des InsP et des PP-InsP, par exemple, en nourrissant les cellules avec [13 C 6]-myo-inositol ou [13C6]-D-glucose.
Décrit ici est un protocole détaillé étape par étape pour la quantification absolue des PP-InsP et InsP à partir de cellules de mammifères par CE-ESI-MS. Outre le principal isomère 5-PP-InsP 5, le 1,5-(PP)2-InsP 4 et le 1-PP-InsP5 sont également quantifiés dans cette étude, malgré leur abondance plus faible. Deux lignées cellulaires HCT116 provenant de différents laboratoires (NIH, UCL) sont étudiées, et il est validé que les cellules HCT116UCL contiennent des niveaux 7 fois plus élevés de 1,5-(PP)2-InsP 4 que dans HCT116NIH, tandis que les concentrations de 5-PP-InsP5 sont comparables. De plus, la synthèse de 1-PP-InsP5 dans HCT116UCL n’est pas significativement augmentée. De plus, l’augmentation des niveaux de PP-InsP en bloquant leur déphosphorylation à l’aide de fluorure de sodium est étudiée quantitativement.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm tissue culture dishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>168381</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>623201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>260836</td>
			<td>for the DC protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE fused silica capillary</td>
			<td>CS Chromatographie</td>
			<td>105180</td>
			<td>50 &#181;M i.d. 360 &#181;M o.d.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700</td>
			<td>10 mL, 1000 &#181;L, 200 &#181;L, 10 &#181;L pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94550, 94525, 94010, 94005</td>
			<td>50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6829,0500</td>
			<td>sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1677373</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23209</td>
			<td>albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000116</td>
			<td>DC protein assay reagents package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td>high glucose, pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106, 10500064 (heat inactivated)</td>
			<td>10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.2</td>
			<td>99.95% LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH, 10%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6756.1</td>
			<td>for preparation of 3% NH4OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9216.1</td>
			<td>for preparation of 1 M perchloric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>20760.02</td>
			<td>for preparation of cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 beads</td>
			<td>GL Sciences</td>
			<td>5020-75000</td>
			<td>5 &#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>trypan blue stain (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure (Type 1) water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>ZRQSVP3WW</td>
			<td>model: Direct-Q 3 UV Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30105893</td>
			<td>model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td>model: LUNA-II Automated Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1401</td>
			<td>model: UNIVERSAL 320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge with cooling</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-1647P</td>
			<td>model: Microstar 17R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7100A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE/MS Adapter Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1603A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE/MS Sprayer Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1607A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>LUNA Cell Counting Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5305000304</td>
			<td>model: Concentrator plus complete system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESI source</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>AJS ESI</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0088</td>
			<td>model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice box</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>should provide enough space for samples, dishes, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isocratic LC system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7110B 1260 Iso Pump</td>
			<td>model: Infinity II Quaternary system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G6495C</td>
			<td>triple quadrupole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30086375</td>
			<td>model: SPARK 10 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10072332</td>
			<td>for serological pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705884, 705880, 705878, 705872, 705870</td>
			<td>various pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>H5500</td>
			<td>model: Mini LabRoller Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortix capillary column cutter</td>
			<td>SGT</td>
			<td>S0020</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube shaker (vortex mixer)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HXH6.1</td>
			<td>model: Rotilabo-Mini Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tilt table</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S0600</td>
			<td>model: EDURO MiniMix Nutating Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FSGPD05</td>
			<td>model: Isotemp GPD 05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation Optimizer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation Qualitative Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QQQ Quantitaion Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantitation of inositol pyrophosphates by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) sont un groupe important de molécules de signalisation intracellulaire. Dérivées des phosphates d’inositol (InsPs), ces molécules présentent la présence d’au moins un groupement pyrophosphate énergétique sur le cycle myo-inositol. Ils existent omniprésents chez les eucaryotes et fonctionnent comme des messagers métaboliques surveillant l’homéostasie du phosphate, la sensibilité à l’insuline et la charge énergétique cellulaire. En raison de l’absence de chromophore dans ces métabolites, d’une densité de charge très élevée et d’une faible abondance, leur analyse nécessite un traceur radioactif, et elle est donc alambiquée et coûteuse. Ici, l’étude présente un protocole détaillé pour effectuer une quantification absolue et à haut débit des pyrophosphates d’inositol à partir de cellules de mammifères par spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire par ionisation par électronébulisation capillaire (CE-ESI-MS). Cette méthode permet le profilage sensible de toutes les espèces de PP-InsPs biologiquement pertinentes dans les cellules de mammifères, ce qui permet la séparation de base des régioisomères. Les concentrations cellulaires absolues de PP-InsPs, y compris les isomères mineurs, et la surveillance de leurs changements temporels dans les cellules HCT116 dans plusieurs conditions expérimentales sont présentées.

Les résultats présentés ici visent à illustrer le potentiel de l’analyse CE-ESI-MS. Les chiffres rapportés sont descriptifs d’une exécution CE-ESI-MS techniquement impeccable. Tout d’abord, un mélange d’étalons pyrophosphate d’inositol (Figure 1) et d’un extrait de cellules de mammifères (Figure 2) sont présentés. Deuxièmement, une comparaison de deux lignées cellulaires HCT116 (Figure 3) et de cellules HCT116 traitées au NaF (Figure 4) est fournie.
Les électrophérogrammes ioniques extraits (EIE) des étalons d’inositol (pyro)phosphate à une concentration de 2 μM sont représentés à la figure 1. Le métabolisme des pyrophosphates d’inositol chez les mammifères avec leurs structures simplifiées est inséré. Les quatre pyrophosphates d’inositol chez les mammifères, 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, 1-PP-InsP 5, et5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 sont bien distingués en utilisant la méthode décrite. Une exécution ce-ESI-MS de HCT116UCL est représentée à la figure 2. À l’aide d’étalons internes marqués aux isotopes stables (SIL), une quantification absolue peut être facilement obtenue en comparant la réponse du signal avec le SIL dopé de concentration connue. Les EIE intégrés du phosphate d’inositol de InsP5 à (PP)2-InsP 4 et les EIE non intégrés de leurs profils isotopiques sont affichés. Les DSR de tous les analytes de six répétitions techniques se situent dans les 4 %. Avec la concentration mesurée et le volume d’extraits, la quantité d’analytes peut être calculée. Avec le nombre de cellules et le volume cellulaire, ou la teneur en protéines, la concentration cellulaire absolue (μM) ou la quantité normalisée par la teneur en protéines (pmol / mg de protéines) sont généralement les résultats finaux d’une telle analyse.
Selon une étude antérieure, deux lots de cellules HCT116 divergentes ont une variation des niveaux d’InsP 8, les cellules HCT116UCL contiennent des niveaux 6 fois plus élevés d’InsP8 que les cellules HCT116NIH 29. Avec la méthode CE-MS, le 1,5-(PP)2-InsP 4 dans HCT116 NIH pourrait être facilement quantifié (Figure 3), et les cellules HCT116UCL contiennent des niveaux 7 fois plus élevés d’InsP8 que dans HCT116NIH. De plus, l’accumulation significative de 1,5-(PP)2-InsP4 dans les cellulesUCL HCT116 est parallèle à une augmentation significative de la 1-PP-InsP5, qui est maintenant représentée quantitativement sur la figure 3.
Les niveaux de PP-InsPs augmentent en inhibant leur déphosphorylation à l’aide de fluorure de sodium. L’analyse CE-ESI-MS de cellules HCT116NIH traitées au NaF a démontré l’élévation de -5-PP-InsP 5 ainsi qu’une réduction de l’InsP 6 et l’apparition de 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (Figure 4). En outre, l’élévation des niveaux InsP8 est perceptible, tandis que 1-PP-InsP5 diminue dans une certaine mesure. Le 1-PP-InsP5 n’est pas complètement absent dans le HCT116NIH traité au NaF, mais la plupart du temps sous la limite de détection ou de quantification.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig01.jpg"> Figure 1 : Électrophérogrammes ioniques (EIE) extraits typiques des étalons d’inositol (pyro)phosphate dans l’analyse CE-ESI-MS utilisant le protocole décrit. La concentration de chaque analyte est de 2 μM. Le volume de l’échantillon injecté est d’environ 10 nL avec une injection à 50 mbar pendant 10 s. Les inserts montrent le métabolisme des pyrophosphates d’inositol chez les mammifères. IPPK: inositol pentakisphosphate 2-kinase, IP6K: inositol hexakisphosphate kinase, PPIP5K: diphosphoinositol pentakisphosphate kinase, DIPP1: diphosphoinositolpolyphosphate phosphohydrolase 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig02.jpg"> Figure 2 : Profil InsP représentatif des cellules UCL HCT116. (A) EIE des principaux (pyro)phosphates d’inositol dans HCT116 NIH et SIL enrichis 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4 (1), 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5 (2), 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP5 (3), 20 μM [13C 6]InsP 6 (4), et 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 (5). Les inserts montrent six répétitions techniques de l’analyse InsP par CE-ESI-MS, les données sont présentées comme des moyennes ± SD. (B) Concentration cellulaire de PP-InsPs et InsPs dans les lignées cellulaires humaines HCT116UCL et (C) quantité de PP-InsPs et InsPs normalisée par la teneur en protéines. Les données sont des moyens ± SEM issus de trois expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig03.jpg"> Figure 3 : Variation des niveaux d’InsP8 entre deux cellules HCT116 divergentes. (A) EIE du pyrophosphate d’inositol dans HCT116 UCL et HCT116NIH. L’InsP8 dans HCT116UCL est nettement plus abondant que dans HCT116NIH. (B) Rapport du pyrophosphate d’inositol à InsP6 (%) dans les deux cellules HCT116. Les cellules HCT116UCL contiennent des niveaux 7 fois plus élevés d’InsP8 par rapport à HCT116NIH, tandis que les niveaux 5-PP-InsP5 sont égaux. Les données sont des moyens ± SEM issus de trois expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig04.jpg"> Figure 4 : Niveaux d’inositol (pyro)phosphate dans les cellules HCT116NIH, avec traitement NaF. (A) EIE de l’inositol (pyro)phosphate dans HCT116NIH avec traitement au fluorure de sodium (NaF, 10 mM). Les niveaux de pyrophosphate d’inositol, y compris 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, et5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 augmentent en bloquant leur déphosphorylation à l’aide de NaF. (B) Niveaux d’inositol (pyro)phosphate (les quantités sont normalisées par la teneur en protéines) dans les cellules HCT116NIH non traitées et traitées par NaF. Les données sont des moyens ± SEM issus de trois expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : paramètres CE-ESI-MS. Les paramètres Source et iFunnel sont optimisés par Source et iFunnel Optimizer. Les paramètres MSM pour les (pyro)phosphates d’inositol sont optimisés par MassHunter Optimizer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/Table1.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Équation de régression théorique et expérimentale. La concentration de [13 C 6]5-PP-InsP 5 [13 C 6]InsP 6 et [13C 6]Ins (1, 3, 4, 5, 6)P5 est de 4 μM, 20 μM et 20 μM, respectivement. Pour l’équation de régression, la concentration de 5-PP-InsP 5 est de 0,04 μM, 0,1 μM, 0,2 μM, 0,4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM. InsP 6 et Ins (1, 3, 4, 5,6)P 5 concentration est à 0,2 μM,0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 120 μM. x est la concentration, y est (Area InsP)12C/(Area InsP)13C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/Table%202.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

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Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Une procédure de spectrométrie de masse par électronébulisation par électronébulisation capillaire pour la quantification absolue des pyrophosphates d’inositol à partir d’extraits de cellules de mammifères est décrite.

Quantification absolue des pyrophosphates d’inositol par spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire par ionisation électrospray

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

Cela fournit des résultats de haute qualité pour le métabolisme du phosphate d’inositol dans tous les organismes que nous avons testés jusqu’à présent. Il fournira également un aperçu de la nouvelle voie de biosynthèse cellulaire dont nous sommes actuellement au courant. L’analyse du métabolisme du phosphate d’inositol par CE-ESI-MS est plus rapide, très sensible, et capable de fournir des informations de structure pour les assemblages de phosphate d’inositol.Pour commencer, mettez en place un système de spectrométrie de masse par électronébulisation par électronébulisation capillaire ou CE-ESI-MS composé d’un système CE commercial et d’un spectromètre de masse en tandem triple quadripolaire, équipé d’une source ESI Agilent Jet Stream. Ensuite, connectez le séparateur de flux de gaine 1:100 et la sortie de la pompe de chromatographie liquide isocratique, et assurez-vous que le flacon d’entrée du système CE est à la même hauteur que l’extrémité du pulvérisateur de l’analyseur de masse. Ensuite, utilisez la version MassHunter Workstation ou un logiciel MS similaire pour contrôler l’ensemble du système et l’acquisition et l’analyse des données.Après avoir préparé le tampon de fonctionnement CE et le liquide de gaine, installez le liquide de gaine en purgeant à cinq millilitres par minute pendant cinq minutes. Réglez ensuite le débit à un millilitre par minute et la pression de la pompe à 180 bars. Assurez-vous que le tube recyclé se connecte à la bouteille de liquide de la gaine pour réutiliser le solvant.Ensuite, à l’aide d’un coupe-colonne capillaire avec une lame diamantée rotative, coupez correctement les deux extrémités d’un capillaire CE-MS avec une fenêtre de détection UV. Ensuite, retirez deux à trois centimètres de revêtement de polyimide aux deux extrémités avec un briquet et nettoyez la surface capillaire avec de l’isopropanol. Pour installer le capillaire, faites correspondre le capillaire dans la cassette CE-MS.Cliquez ensuite sur le bouton Changer de cassette et installez la cassette dans le périphérique CE. Pour activer le capillaire, rincez d’abord le capillaire avec un hydroxyde de sodium molaire, suivi d’eau pendant 10 minutes, puis d’un tampon CE pendant 15 minutes. Ensuite, insérez le capillaire dans le pulvérisateur CE-MS.À l’aide d’une loupe et de la vis de réglage dans le pulvérisateur, ajustez précisément la sortie capillaire, en veillant à ce que l’extrémité capillaire dépasse d’environ 0,1 millimètre de la pointe du pulvérisateur. Vérifiez la stabilité du pulvérisateur ESI en mode Analyse complète. La fluctuation des électrophérogrammes ioniques totaux devrait être dans les 5%Ensuite, effectuer un essai avec les étalons de phosphate d’inositol.Après avoir préparé le mélange d’étalons internes, mélanger 10 microlitres de l’échantillon avec 0,5 microlitre du mélange d’étalons internes et un flacon d’échantillon CE. Lorsque vous utilisez le système de réapprovisionnement, cliquez sur le bouton Changer de bouteille. Mettez les 250 millilitres préparés de tampon CE dans la bouteille d’électrolyte.Cliquez ensuite sur Clean Tubes en gardant l’aiguille de réapprovisionnement dans un flacon d’eau. Définissez les paramètres ESI et MS. Ensuite, optimisez les paramètres de la source à l’aide d’un optimiseur de source avec un mélange de normes de polyphosphate d’inositol et de plusieurs paramètres de surveillance des réactions à l’aide de MassHunter Optimizer avec toutes les normes.Ensuite, effectuez une exécution pour les extraits de phosphate d’inositol et vérifiez les résultats. Définissez une séquence lorsqu’il y a plus d’échantillons. Après la mesure, laissez le MS en mode veille et n’éteignez pas la pompe de chromatographie liquide.Remplacez le pulvérisateur CE-ESI-MS par un pulvérisateur LC-ESI-MS lorsqu’il n’y a pas d’alimentation en liquide de gaine. Pour l’analyse des données, ouvrez le logiciel d’analyse quantitative et créez un lot pour tous les échantillons. Ensuite, créez une nouvelle méthode à partir des données de surveillance de réaction multiple acquises et définissez les phosphates d’inositol de carbone 13 comme étalons internes.Ensuite, vérifiez le composé de surveillance des réactions multiples, le temps de rétention, les normes internes, la concentration et la configuration du qualificatif. Passez la validation et la sortie pour appliquer la méthode au lot actuel. Enregistrez la méthode.Vérifiez ensuite si chaque pic du lot est correctement intégré. Sinon, intégrez manuellement le pic. Exportez les résultats dans une feuille de calcul, et quantifiez les pyrophosphates d’inositol, en comparant la réponse de pointe anolyte avec la réponse de crête respective des étalons internes marqués isotopiques stables avec des concentrations connues.Enfin, avec la concentration mesurée dans le phosphate d’inositol, solution d’extrait et son volume, calculer les quantités absolues et normaliser davantage la quantité par le nombre de cellules ou la teneur en protéines. Calculer la concentration cellulaire en fonction du nombre de cellules et du volume cellulaire moyen des cellules HCT116. Les électrophérogrammes ioniques extraits des étalons pyrophosphate d’inositol à une concentration de deux micromoles sont montrés ici.Le métabolisme des pyrophosphates d’inositol chez les mammifères avec leurs structures simplifiées est inséré. Une série de cellules HCT116 de l’University College London ou de l’UCL est présentée ici. CE-MS a été utilisé pour quantifier la variation des niveaux IP8 entre les cellules HCT116 de l’UCL et celles des NIH.Les cellules HCT116 de l’UCL contiennent des niveaux d’IP8 sept fois plus élevés que ceux des NIH. L’accumulation significative de 1 ,5-IP8 dans les cellules HCT116 UCL s’accompagne d’une augmentation considérable de la 1-IP7. L’analyse CE-ESI-MS de cellules HCT116 traitées au fluorure de sodium provenant des NIH a démontré une élévation de 5-IP7, ainsi qu’une réduction de IP6 et une apparition de 5-PPIP4.Bien que les niveaux de 1-IP7 aient diminué dans une certaine mesure, il n’est pas complètement absent dans les cellules traitées au fluorure de sodium, mais surtout sous la limite de détection. Il est important de former un grade CE-ESI-MS stable. Nous vous recommandons de vérifier la répétabilité et la sensibilité du système avant les mesures.Cette technique permet de fournir le métabolisme du phosphate d’inositol, implants et tissus, et offre également l’occasion d’étudier de près le pyrophosphate d’inositol biologiquement pertinent.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Introducteur Electrophorèse Capillaire-Spectrométrie de masse pour Metabolic Profiling des échantillons biologiques

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

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