Name: absolute quantitation of inositol pyrophosphates by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry
Uploaded: 2021-08-13T13:45:00
Duration: 9 min 22 s
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इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (एचजेजे को अनुदान समझौता संख्या 864246) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से धन प्राप्त हुआ है। डीक्यू ब्रिगिट-श्लीबेन-लैंग-प्रोग्रामम से वित्तीय सहायता को स्वीकार करता है। एएस एमआरसी कार्यक्रम अनुदान एमआर / टी028904/1 द्वारा समर्थित है।

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	<li>Stephens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection,+purification,+structural+characterization,+and+metabolism+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate(s)+and+bisdiphosphoinositol+tetrakisphosphate(s).">The detection, purification, structural characterization, and metabolism of diphosphoinositol pentakisphosphate(s) and bisdiphosphoinositol tetrakisphosphate(s).</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 4009-4015 (1993).</li><li>Menniti, F. S., Miller, R. N., Putney, J. W., Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+inositol+polyphosphate+pyrophosphates+in+pancreatoma+cells.">Turnover of inositol polyphosphate pyrophosphates in pancreatoma cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 3850-3856 (1993).</li><li>Shears, S. 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M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking.">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14206-14211 (2002).</li><li>Koldobskiy, M. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+possible+functions+of+inositol+pyrophosphates+in+plants.">Biosynthesis and possible functions of inositol pyrophosphates in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 67 (2015).</li><li>Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+between+signalling+and+metabolism.">Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism.</a> The Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).</li><li>Harmel, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+13C-labeled+myo-inositol+to+interrogate+inositol+phosphate+messengers+by+NMR.">Harnessing 13C-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR.</a> Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).</li><li>Qiu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+inositol+phosphate+metabolism+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Analysis of inositol phosphate metabolism by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nature Communications. 11 (1), 6035 (2020).</li><li>Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+analysis+of+soluble+inositol+polyphosphates+from+yeast.">Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).</li><li>Wilson, M. S. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+radioactive+labelling+to+elucidate+inositol+polyphosphate+signalling.">Importance of radioactive labelling to elucidate inositol polyphosphate signalling.</a> Phosphate Labeling and Sensing in Chemical Biology. , 67-87 (2017).</li><li>Wilson, M. S. C., Bulley, S. J., Pisani, F., Irvine, R. F., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+purification+of+inositol+phosphates+from+biological+samples+reveals+that+no+phytate+is+present+in+human+plasma+or+urine.">A novel method for the purification of inositol phosphates from biological samples reveals that no phytate is present in human plasma or urine.</a> Open Biology. 5 (3), 150014 (2015).</li><li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity:+analysis+by+gel+electrophoresis.">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PloS One. 4 (5), 5580 (2009).</li><li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphate+InsP8+acts+as+an+intracellular+phosphate+signal+in+arabidopsis.">Inositol pyrophosphate InsP8 acts as an intracellular phosphate signal in arabidopsis.</a> Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).</li><li>Riemer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITPK1+is+an+InsP6/ADP+phosphotransferase+that+controls+systemic+phosphate+homeostasis+in+Arabidopsis.">ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls systemic phosphate homeostasis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Whitfield, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATP-responsive+metabolic+cassette+comprised+of+inositol+tris/tetrakisphosphate+kinase+1+(ITPK1)+and+inositol+pentakisphosphate+2-kinase+(IPK1)+buffers+diphosphosphoinositol+phosphate+levels.">An ATP-responsive metabolic cassette comprised of inositol tris/tetrakisphosphate kinase 1 (ITPK1) and inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPK1) buffers diphosphosphoinositol phosphate levels.</a> The Biochemical Journal. 477 (14), 2621-2638 (2020).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+interaction+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+quantitative+analysis+of+mammalian-derived+inositol+poly/pyrophosphates.">Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates.</a> Journal of chromatography. A. 1573, 87-97 (2018).</li><li>Mantilla, B. S., Amaral, L. D. D., Jessen, H. J., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=the+inositol+pyrophosphate+biosynthetic+pathway+of+Trypanosoma+cruzi.">the inositol pyrophosphate biosynthetic pathway of Trypanosoma cruzi.</a> ACS Chemical Biology. 16 (2), 283-292 (2021).</li><li>Wilson, M. S. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+phosphates+purification+using+titanium+dioxide+beads.">Inositol phosphates purification using titanium dioxide beads.</a> Bio-Protocol. 8 (15), 2959 (2018).</li><li>Puschmann, R., Harmel, R. K., Fiedler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+chemoenzymatic+synthesis+of+inositol+pyrophosphates.">Scalable chemoenzymatic synthesis of inositol pyrophosphates.</a> Biochemistry. 58 (38), 3927-3932 (2019).</li><li>Gu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KO+of+5-InsP7+kinase+activity+transforms+the+HCT116+colon+cancer+cell+line+into+a+hypermetabolic,+growth-inhibited+phenotype.">KO of 5-InsP7 kinase activity transforms the HCT116 colon cancer cell line into a hypermetabolic, growth-inhibited phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 11968-11973 (2017).</li><li>Gu, C., Wilson, M. S. C., Jessen, H. J., Saiardi, A., Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+Pyrophosphate+Profiling+of+Two+HCT116+Cell+Lines+Uncovers+Variation+in+InsP8+Levels.">Inositol Pyrophosphate Profiling of Two HCT116 Cell Lines Uncovers Variation in InsP8 Levels.</a> PloS One. 11 (10), 0165286 (2016).</li></ol>

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

यहां प्रस्तुत स्तनधारी कोशिकाओं में अत्यधिक चार्ज इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट की मात्रा के लिए एक व्यावहारिक और संवेदनशील विधि है। इस विश्लेषण दृष्टिकोण को परक्लोरिक एसिड के साथ वर्तमान अत्याधुनिक इंएसपी निष्कर्षण के साथ संयोजित करने के बाद टीआईओ2 के साथ संवर्धन, सीई-ईएसआई-एमएस विश्लेषण के अभूतपूर्व फायदे हैं। इसकी थ्रूपुट, संवेदनशीलता, स्थिरता, पूर्ण मात्रा, आइसोमर पहचान और मैट्रिक्स इन-निर्भरता के संबंध में, यह विधि अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में अलग है। यह प्रोटोकॉल स्तनधारी कोशिकाओं पर लागू होता है, लेकिन वास्तव में यह रणनीति कई अलग-अलग नमूनों (जैसे, खमीर, पौधे, परजीवी, माउस ऊतक, आदि) में सफल होती है।
लागू निष्कर्षण प्रोटोकॉल स्तनधारी सेल अर्क16,19 से पीपी-इनएसपी और आईएनएसपी 6 को पूरी तरह से पुनर्प्राप्त करता है। यह कई अन्य आयनिक मेटाबोलाइट्स, विशेष रूप से फॉस्फेट युक्त प्रजातियों, जैसे, चीनी फॉस्फेट और न्यूक्लियोटाइड को भी निकाल देगा। इस प्रोटोकॉल के साथ उपयोगकर्ता के विश्लेषणों के लिए वसूली और अपघटन का मूल्यांकन आवश्यक होगा।
आम तौर पर, सीई-ईएसआई-एमएस सिस्टम सुचारू रूप से चलता है और इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके हर हफ्ते लगभग 200 नमूने समायोजित कर सकता है। एचपीएलसी के विपरीत, हालांकि, सीई को लंबे समय तक विशेषज्ञों और विशेष व्यक्तियों के लिए एक विधि के रूप में माना जाता है, जिसने इसके बाजार को प्रतिबंधित कर दिया और इसके आवेदन को सीमित कर दिया। इस प्रकार, एक सीई-ईएसआई-एमएस डिवाइस आमतौर पर विश्लेषणात्मक संकायों में अनुपस्थित होता है। जो लोग सीई-ईएसआई-एमएस विश्लेषण करना चाहते हैं, उनके पास शायद सीई अनुभव की कमी है और वे समस्या निवारण में अधिक समय बिताएंगे। यहां, महत्वपूर्ण कदमों पर प्रकाश डाला गया है। सबसे पहले और सबसे महत्वपूर्ण केशिका कटौती की गुणवत्ता है। ईएसआई स्प्रे की संवेदनशीलता और स्थिरता ज्यादातर प्रथम श्रेणी के केशिका कटौती पर निर्भर करती है। दूसरे, केशिका आउटलेट अंत स्प्रेयर टिप से ठीक 0.1 मिमी बाहर होना चाहिए। स्प्रेयर सुई और सीई केशिका अक्षीय दिशा में होनी चाहिए। ईएसआई स्प्रे की गुणवत्ता मात्रा निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है; पुनरावृत्ति का मूल्यांकन करने के लिए तकनीकी रन किए जाने चाहिए। 
वर्णित प्रोटोकॉल के साथ, पीपी-इनएसपी के लिए मात्रा (एलओक्यू) की सीमा 40 एनएम है जिसमें 10 सेकंड (10 एनएल) के लिए 50 एमबार पर इंजेक्शन है। विधि संवेदनशीलता को और बढ़ाने के लिए कई दृष्टिकोण हैं। सबसे पहले, 20 एस (40 एनएल) के लिए 100 एमबार पर एक इंजेक्शन अभी भी एक अच्छा चरम आकार और रेजियोइसोमर्स 5-पीपी-इनएसपी5 और 1-पीपी-इनएसपी5 के लिए पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन का परिणाम होगा। दूसरे, INSP अर्क को पानी की थोड़ी मात्रा में भंग किया जा सकता है। तीसरा, मात्रा निर्धारित करने के लिए कम एमआरएम संक्रमण का उपयोग करते समय रहने का समय बढ़ाया जा सकता है। इसके अलावा, अल्ट्रा-लो शीथ तरल प्रवाह का उपयोग करके सीई-एमएस आयन स्रोत संवेदनशीलता में काफी वृद्धि करेगा।
पीएच 9 के साथ सीई रनिंग बफर इनएसपी6-इनएसपी 8 के बीच सबसे अच्छा रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। पीएच को 9.7 तक बढ़ाते समय, InsP 3-Insp 6 के बीच रिज़ॉल्यूशन में काफी सुधार होगा। उत्कृष्ट रिज़ॉल्यूशन के कारण, थ्रूपुट को और बढ़ाने के लिए 72 सेमी की छोटी केशिका लंबाई की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, 40 डिग्री सेल्सियस पर एक उच्च सीई कैसेट तापमान जलीय इलेक्ट्रोफोरेटिक बफर की चिपचिपाहट को कम करता है और ईओएफ के तहत उनके आंदोलन को तेज करता है। विभिन्न शोध मांगों के अनुसार, इस पद्धति के संशोधन इंएसपी और पीपी-इनएसपी विश्लेषण को और सुविधाजनक बना सकते हैं। इसलिए, वर्णित सीई-ईएसआई-एमएस प्रोटोकॉल में सिग्नलिंग अणुओं के इस बहुमुखी परिवार में नए शोध के रास्ते खोलने की क्षमता है।

1993 1,2 में मायो-इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट्स (पीपी-इनएसपी) की प्रारंभिक खोजके बाद से, उनके जैवसंश्लेषण, टर्नओवरऔर कार्यों को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण प्रगति हुई है। इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट सर्वव्यापी रूप से यूकेरियोटिक कोशिकाओं4 में होते हैं और चयापचय सिग्नलिंग अणुओं के रूप में काम करते हैं, जैसे, फॉस्फेट होमियोस्टेसिस 5,6, इंसुलिन संवेदनशीलता7, कैल्शियम दोलन 8,9, वेसिकुलर ट्रैफिकिंग10, एपोप्टोसिस11, डीएनए मरम्मत12, प्रतिरक्षा सिग्नलिंग13 , और अन्य। इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट्स के नियंत्रण में महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं की अधिकता उनके सेलुलर बहुतायत, उतार-चढ़ाव और स्थानीयकरण की गहरी समझ की मांग करती है।
यद्यपि INSP और PP-InsPs ने विषयों में ध्यान आकर्षित किया, उनकी बहुतायत का विश्लेषण नियमित रूप से 80 के दशक के दौरान विकसित एक विधि का उपयोग करके किया जाता है, जिसमें ट्राइटिटेड इनोसिटोल के साथ लेबलिंग कोशिकाएं शामिल होती हैं, जो बाद में सिंटिलेशन काउंटिंग के साथ मजबूत आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी सैक्स-एचपीएलसी द्वारा निकाले गए पीपी-इनएसपी को हल करती हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित नए तरीकों को अभी भी महत्वपूर्ण चुनौतियों का सामना करना पड़ता है: आठ फॉस्फेट इकाइयों के साथ इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट फॉस्फेट एस्टर और एनहाइड्राइड को परेशान करते हैं, जिससे आयनीकरण के दौरान एक महत्वपूर्ण नकारात्मक चार्ज और संभावित फॉस्फेट हानि होती है। स्तनधारियों में पाए जाने वाले पीपी-इनएसपी के चार प्रमुख प्रकार हैं (चित्रा 1): 1,5-(पीपी)2-इंएसपी 4 (या 1,5-इंएसपी8),5-पीपी-इनएसपी 5 (या 5-इनएसपी7), 1-पीपी-इनएसपी5 (या 1-इनएसपी7), और 5-पीपी-इन्स (1,3,4,6)पी4 (या 5-पीपी-इनएसपी4)3,14। पीपी-इनएसपी के शारीरिक स्तर आम तौर पर नैनो-से-कम-माइक्रोमोलर रेंज में होते हैं, जिसमें 5-पीपी-इनएसपी5 0.5 - 5 μM की सेलुलर सांद्रता के साथ सबसे प्रचुर मात्रा में होता है। 1,5-(PP)2-Insp4 और 1-PP-Insp5 को 5-PP-Insp5 पूल के लगभग 10% तक माना जाता है और कई कोशिकाओं15 में पता लगाना मुश्किल रहता है। एक मुक्त ओएच समूह के साथ 5-पीपी-इनएसपी4 बहुतायत में भी कम है और आमतौर पर केवल तभी पता लगाने योग्य हो जाता है जब फॉस्फेट हाइड्रोलेज़ को सोडियम फ्लोराइड (एनएएफ) 16 के साथ बाधित किया जाता है।
पीपी-इनएसपी का उच्च चार्ज घनत्व उनके पृथक्करण को मुश्किल बनाता है, और पीपी-इनएसपी रेजियोइसोमर्स की घटना इन प्रयासों को और जटिल बनाती है। नतीजतन, अधिकांश प्रयोग [3एच]-इनोसिटोल का उपयोग करके कोशिकाओं के चयापचय रेडियोधर्मी लेबलिंग द्वारा मात्रा निर्धारित करने पर निर्भर थे, क्योंकि मैट्रिक्स से पृष्ठभूमि को बाहर रखा गया है और उच्च संवेदनशीलता17,18 हासिल की गई है। हालांकि, यह विधि महंगी, समय लेने वाली है, और संबंधित पीपी-इंएसपी रेजियोइसोमर्स को ठीक से अलग करने की अनुमति नहीं देती है। इसके अलावा, [3एच]-इनोसिटोल लेबलिंग ग्लूकोज से अंतर्जात इनोसिटोल संश्लेषण के लिए जिम्मेदार नहीं है। एक पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) आधारित विधि एक व्यापक रूप से लागू सस्ती विकल्प है लेकिन इसकी संवेदनशीलता 19,20,21,22 में सीमित है। रेडियोलेबलिंग से बचने वाले अन्य दृष्टिकोण प्रकाशित किए गए हैं, जिनमें आयन क्रोमैटोग्राफी के बाद पोस्ट-कॉलम डेरिवेटाइजेशन यूवी-डिटेक्शन23, हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी (एचआईएलआईसी) 24, या मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) 25 के साथ युग्मित कमजोर आयन एक्सचेंज (वैक्स) शामिल हैं। हालांकि, वे क्लासिक [3एच]-इनोसिटोल एसएएक्स-एचपीएलसी प्रोटोकॉल के बराबर नहीं हैं।
हाल ही में, केशिका वैद्युतकणसंचलन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सीई-ईएसआई-एमएस) को इंएसपी और पीपी-इनएसपी चयापचय के विश्लेषण के लिए एक परिवर्तनकारी रणनीति के रूप में पेश किया गया था,जो 16 से ऊपर चर्चा की गई सभी आवश्यकताओं को पूरा करता है। परक्लोरिक एसिड द्वारा वर्तमान अत्याधुनिक इंएसपी निष्कर्षण के साथ संयुक्त टाइटेनियम डाइऑक्साइड मोतियों26 के साथ संवर्धन, सीई-ईएसआई-एमएस खमीर से लेकर पौधों और स्तनधारियों तक अब तक परीक्षण किए गए हर जीव में सफल रहा। सभी संभावित रिजियोइसोमर्स सहित इनएसपी और पीपी-इनएसपी की एक साथ प्रोफाइलिंग आसानी से हासिल की गई थी। स्थिर आइसोटोप-लेबल (एसआईएल) आंतरिक मानकों ने मैट्रिक्स प्रभावों के बावजूद, तेजी से और सटीक पूर्ण मात्रा को सक्षम किया। क्योंकि एमएस आइसोटोपिक द्रव्यमान अंतर को पकड़ सकता है, सीई-ईएसआई-एमएस को इंएसपी और पीपी-इनएसपी के कंपार्टमेंटल सेलुलर संश्लेषण मार्गों का अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को [13सी6]-मायो-इनोसिटोल या [13सी6]-डी-ग्लूकोज के साथ खिलाकर।
यहां वर्णित सीई-ईएसआई-एमएस द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं से पीपी-इनएसपी और इंएसपी की पूर्ण मात्रा के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल है। प्रमुख 5-पीपी-इनएसपी5 आइसोमर के अलावा, 1,5-(पीपी)2-इनएसपी4 और 1-पीपी-इनएसपी 5 को भी इस अध्ययन में निर्धारित कियागया है, उनकी कम बहुतायत के बावजूद। विभिन्न प्रयोगशालाओं (एनआईएच, यूसीएल) से दो एचसीटी 116 सेल लाइनों का अध्ययन किया जाता है, और यह मान्य है कि एचसीटी 116यूसीएल कोशिकाओं में एचसीटी 116एनआईएच में पाए जाने वाले 1,5-(पीपी) 2-इनएसपी 4 के 7 गुना अधिक स्तर होते हैं, जबकि 5-पीपी-इनएसपी5 सांद्रता तुलनीय होती है। इसके अलावा, एचसीटी 116यूसीएल में 1-पीपी-इंएसपी5 संश्लेषण में काफी वृद्धि नहीं हुई है। इसके अलावा, सोडियम फ्लोराइड का उपयोग करके उनके डीफॉस्फोराइलेशन को अवरुद्ध करके पीपी-इनएसपी स्तरों की वृद्धि का मात्रात्मक अध्ययन किया जाता है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm tissue culture dishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>168381</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>623201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>260836</td>
			<td>for the DC protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE fused silica capillary</td>
			<td>CS Chromatographie</td>
			<td>105180</td>
			<td>50 &#181;M i.d. 360 &#181;M o.d.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700</td>
			<td>10 mL, 1000 &#181;L, 200 &#181;L, 10 &#181;L pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94550, 94525, 94010, 94005</td>
			<td>50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6829,0500</td>
			<td>sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1677373</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23209</td>
			<td>albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000116</td>
			<td>DC protein assay reagents package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td>high glucose, pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106, 10500064 (heat inactivated)</td>
			<td>10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.2</td>
			<td>99.95% LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH, 10%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6756.1</td>
			<td>for preparation of 3% NH4OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9216.1</td>
			<td>for preparation of 1 M perchloric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>20760.02</td>
			<td>for preparation of cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 beads</td>
			<td>GL Sciences</td>
			<td>5020-75000</td>
			<td>5 &#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>trypan blue stain (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure (Type 1) water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>ZRQSVP3WW</td>
			<td>model: Direct-Q 3 UV Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30105893</td>
			<td>model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td>model: LUNA-II Automated Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1401</td>
			<td>model: UNIVERSAL 320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge with cooling</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-1647P</td>
			<td>model: Microstar 17R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7100A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE/MS Adapter Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1603A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE/MS Sprayer Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1607A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>LUNA Cell Counting Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5305000304</td>
			<td>model: Concentrator plus complete system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESI source</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>AJS ESI</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0088</td>
			<td>model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice box</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>should provide enough space for samples, dishes, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isocratic LC system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7110B 1260 Iso Pump</td>
			<td>model: Infinity II Quaternary system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G6495C</td>
			<td>triple quadrupole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30086375</td>
			<td>model: SPARK 10 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10072332</td>
			<td>for serological pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705884, 705880, 705878, 705872, 705870</td>
			<td>various pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>H5500</td>
			<td>model: Mini LabRoller Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortix capillary column cutter</td>
			<td>SGT</td>
			<td>S0020</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube shaker (vortex mixer)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HXH6.1</td>
			<td>model: Rotilabo-Mini Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tilt table</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S0600</td>
			<td>model: EDURO MiniMix Nutating Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FSGPD05</td>
			<td>model: Isotemp GPD 05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation Optimizer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation Qualitative Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QQQ Quantitaion Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantitation of inositol pyrophosphates by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry

इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट (पीपी-इनएसपी) इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग अणुओं का एक महत्वपूर्ण समूह है। इनोसिटोल फॉस्फेट (इनएसपी) से प्राप्त, इन अणुओं में मायो-इनोसिटोल रिंग पर कम से कम एक ऊर्जावान पाइरोफॉस्फेट मोइटी की उपस्थिति होती है। वे यूकेरियोट्स में सर्वव्यापी रूप से मौजूद हैं और फॉस्फेट होमियोस्टेसिस, इंसुलिन संवेदनशीलता और सेलुलर ऊर्जा चार्ज का सर्वेक्षण करने वाले चयापचय दूतों के रूप में काम करते हैं। इन मेटाबोलाइट्स में क्रोमोफोर की अनुपस्थिति, बहुत अधिक चार्ज घनत्व और कम बहुतायत के कारण, उनके विश्लेषण के लिए रेडियोधर्मी ट्रेसर की आवश्यकता होती है, और इस प्रकार यह जटिल और महंगा है। यहां, अध्ययन केशिका वैद्युतकणसंचलन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सीई-ईएसआई-एमएस) द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं से इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट की पूर्ण और उच्च थ्रूपुट मात्रा करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह विधि स्तनधारी कोशिकाओं में सभी जैविक रूप से प्रासंगिक पीपी-इंएसपी प्रजातियों की संवेदनशील प्रोफाइलिंग को सक्षम करती है, जिससे रेजियोइसोमर्स के बेसलाइन पृथक्करण को सक्षम किया जा सकता है। मामूली आइसोमर्स सहित पीपी-इनएसपी की पूर्ण सेलुलर सांद्रता, और कई प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत एचसीटी 116 कोशिकाओं में उनके अस्थायी परिवर्तनों की निगरानी प्रस्तुत की जाती है।

यहां दिखाए गए परिणाम सीई-ईएसआई-एमएस विश्लेषण की क्षमता को चित्रित करने का लक्ष्य रखते हैं। रिपोर्ट किए गए आंकड़े तकनीकी रूप से निर्दोष सीई-ईएसआई-एमएस रन के वर्णनात्मक हैं। सबसे पहले, इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट मानकों (चित्रा 1) और एक स्तनधारी कोशिका निकालने (चित्रा 2) का मिश्रण प्रस्तुत किया जाता है। दूसरे, दो एचसीटी 116 सेल लाइनों (चित्रा 3) और एनएएफ-उपचारित एचसीटी 116 (चित्रा 4) कोशिकाओं की तुलना प्रदान की जाती है।
2 μM की सांद्रता पर इनोसिटोल (पाइरो) फॉस्फेट मानकों के निकाले गए आयन इलेक्ट्रोफेरोग्राम (ईआईई) चित्र 1 में दिखाए गए हैं। स्तनधारियों में इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट्स का चयापचय उनकी सरलीकृत संरचनाओं के साथ डाला जाता है। स्तनधारियों में चार इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट, 1,5-(पीपी)2-इनएसपी 4, 5-पीपी-इनएसपी5, 1-पीपी-इनएसपी 5, और5-पीपी-इन्स (1,3,4,6)पी4 वर्णित विधि का उपयोग करके अच्छी तरह से प्रतिष्ठित हैं। एचसीटी 116यूसीएल के सीई-ईएसआई-एमएस रन को चित्र 2 में दर्शाया गया है। स्थिर आइसोटोप-लेबल (एसआईएल) आंतरिक मानकों की सहायता से, ज्ञात एकाग्रता के स्पाइक्ड-इन एसआईएल के साथ सिग्नल प्रतिक्रिया की तुलना करके एक पूर्ण मात्रा आसानी से प्राप्त की जा सकती है। InsP5 से (PP)2-Insp4 तक इनोसिटोल फॉस्फेट के एकीकृत EIEs और उनके समस्थानिक पैटर्न के गैर-एकीकृत EIEs प्रदर्शित किए जाते हैं। छह तकनीकी दोहराव से सभी विश्लेषणों के आरएसडी 4% के भीतर हैं। मापा एकाग्रता और अर्क की मात्रा के साथ, विश्लेषणों की मात्रा की गणना की जा सकती है। सेल की गिनती और सेल की मात्रा, या प्रोटीन सामग्री के साथ, पूर्ण सेलुलर एकाग्रता (μM) या प्रोटीन सामग्री (pmol / mg प्रोटीन) द्वारा सामान्यीकृत मात्रा आमतौर पर इस तरह के विश्लेषण के अंतिम परिणाम हैं।
पहले के एक अध्ययन के अनुसार, अलग-थलग एचसीटी 116 कोशिकाओं के दो बैचों में इंएसपी8 स्तरों की भिन्नता होती है, एचसीटी 116यूसीएल कोशिकाओं में एचसीटी 116एनआईएच कोशिकाओं29 की तुलना में इंएसपी8 का 6 गुना अधिक स्तर होता है। सीई-एमएस विधि के साथ, एचसीटी 116एनआईएच में 1,5-(पीपी)2-इनएसपी 4 को आसानी से परिमाणित किया जा सकता है (चित्रा 3), और एचसीटी 116यूसीएल कोशिकाओं में एचसीटी 116एनआईएच की तुलना में इंएसपी8 के 7 गुना उच्च स्तर होते हैं। इसके अलावा, एचसीटी 116यूसीएल कोशिकाओं में 1,5-(पीपी)2-इनएसपी 4 का महत्वपूर्ण संचय काफी वृद्धि 1-पीपी-इनएसपी5 द्वारा समानांतर है, जिसे अब मात्रात्मक रूप से चित्रा 3 में दिखाया गया है।
पीपी-इनएसपी का स्तर सोडियम फ्लोराइड का उपयोग करके उनके डीफॉस्फोराइलेशन को रोककर बढ़ता है। एनएएफ-उपचारित एचसीटी 116एनआईएच कोशिकाओं के सीई-ईएसआई-एमएस विश्लेषण ने -5-पीपी-इनएसपी5 ऊंचाई के साथ-साथ इंएसपी6 में कमी और 5-पीपी-इन्स (1,3,4,6) पी4 (चित्रा 4) की उपस्थिति का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, INSP8 स्तरों की ऊंचाई ध्यान देने योग्य है, जबकि 1-PP-Insp5 कुछ हद तक कम हो जाती है। 1-पीपी-इनएसपी5 एनएएफ-उपचारित एचसीटी 116एनआईएच में पूरी तरह से अनुपस्थित नहीं है, लेकिन ज्यादातर या तो पता लगाने या मात्रा निर्धारित करने की सीमा के तहत है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig01.jpg"> चित्रा 1: वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके सीई-ईएसआई-एमएस विश्लेषण में इनोसिटोल (पाइरो) फॉस्फेट मानकों के विशिष्ट निकाले गए आयन इलेक्ट्रोफेरोग्राम (ईआईई)। प्रत्येक विश्लेषण की सांद्रता 2 μM है। इंजेक्शन नमूना मात्रा ca. 10 nL है जिसमें 10 सेकंड के लिए 50 mbar पर एक इंजेक्शन होता है। इंसर्ट स्तनधारियों में इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट के चयापचय को दिखाते हैं। आईपीपीके: इनोसिटोल पेंटाकिसफॉस्फेट 2-काइनेज, आईपी 6 के: इनोसिटोल हेक्साकिसफॉस्फेट काइनेज, पीपीआईपी 5 के: डिफॉस्फोइनोसिटोल पेंटाकिसफॉस्फेट किनेज, डीआईपीपी 1: डिफॉस्फोइनोसिटोलपोलीफॉस्फेट फॉस्फोहाइड्रोलेस 1। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig02.jpg"> चित्र 2: एचसीटी 116यूसीएल कोशिकाओं का प्रतिनिधि इंएसपी प्रोफाइल। (ए) एचसीटी 116एनआईएच में मुख्य इनोसिटोल (पाइरो) फॉस्फेट के ईआईई और स्पाइक्ड एसआईएल आईएसएस 2 μM [13C6]1,5-(PP)2-Insp 4 (1), 4 μM [13C6]5-PP-InsP 5 (2), 4 μM [13C6]InsP 6 (4), 20 μM [13C6]InsP6 (4), 20 और 20 μM [13C6] Ins (1,3,4,5,6)P5 (5). सीई-ईएसआई-एमएस द्वारा इंएसपी विश्लेषण के छह तकनीकी दोहराव दिखाते हैं, डेटा को एसडी ± साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। (बी) मानव सेल लाइनों एचसीटी 116यूसीएल में पीपी-इनएसपी और इंएसपी की सेलुलर एकाग्रता और (सी) पीपी-इनएसपी और इनएसपी राशि प्रोटीन सामग्री द्वारा सामान्यीकृत होती है। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एसईएम ± साधन हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig03.jpg"> चित्रा 3: दो अलग-अलग एचसीटी 116 कोशिकाओं के बीच INSP 8 स्तरों में भिन्नता। (ए) एचसीटी 116 यूसीएल और एचसीटी 116 एनआईएच में इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट के ईआईई। एचसीटी 116यूसीएल में आईएसपी8 एचसीटी 116एनआईएच की तुलना में स्पष्ट रूप से अधिक प्रचुर मात्रा में है। (बी) दोनों एचसीटी116 कोशिकाओं में इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट और इनएसपी 6 (%) का अनुपात। एचसीटी 116यूसीएल कोशिकाओं में एचसीटी 116एनआईएच की तुलना में आईएसपी8 का 7 गुना अधिक स्तर होता है, जबकि 5-पीपी-इंएसपी5 स्तर बराबर होते हैं। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एसईएम ± साधन हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig04.jpg"> चित्रा 4: एनएएफ उपचार के साथ एचसीटी 116एनआईएच कोशिकाओं में इनोसिटोल (पाइरो) फॉस्फेट का स्तर। (ए) सोडियम फ्लोराइड उपचार (एनएएफ, 10 एमएम) के साथ एचसीटी 116एनआईएच में इनोसिटोल (पाइरो) फॉस्फेट के ईआईई। 1,5-(पीपी)2-इनएसपी 4, 5-पीपी-इनएसपी 5, और 5-पीपी-इन्स (1,3,4,6)पी4 सहित इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट का स्तर एनएएफ का उपयोग करके उनके डीफॉस्फोराइलेशन को अवरुद्ध करके बढ़ता है। (बी) अनुपचारित और एनएएफ-उपचारित एचसीटी 116एनआईएच कोशिकाओं में इनोसिटोल (पायरो) फॉस्फेट का स्तर (मात्रा प्रोटीन सामग्री द्वारा सामान्यीकृत होती है)। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एसईएम ± साधन हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
तालिका 1: CE-ESI-MS पैरामीटर सेटिंग्स। स्रोत पैरामीटर और iFunnel पैरामीटर स्रोत और iFunnel ऑप्टिमाइज़र द्वारा अनुकूलित किए जाते हैं। इनोसिटोल (पाइरो) फॉस्फेट के लिए एमएसएम पैरामीटर सेटिंग्स मासहंटर ऑप्टिमाइज़र द्वारा अनुकूलित की जाती हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/Table1.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
तालिका 2: सैद्धांतिक और प्रयोगात्मक प्रतिगमन समीकरण। [13C6]5-PP-InsP5 [13C6] InsP6, और [13C6] Ins (1, 3, 4, 5, 6) P5 की सांद्रता क्रमशः 4 μM, 20 μM, और 20 μM है। प्रतिगमन समीकरण के लिए, 5-PP-InsP5 एकाग्रता 0.04 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM, InsP 6 और Ins (1, 3, 4, 5, 6) P 5 एकाग्रता 0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 5 μM, 10, 3, 4, 5, 5) P 5 एकाग्रता 0.2 μM, 2 μM, 24 μM, 24 μM, InsP 6 और Ins (1, 3, 4, 5, 6) P 5 एकाग्रता 0.2 μM, 2 μM, 24 μM पर है। InsP 6 और Ins (1, 3, 4, 5, 6) P 5 एकाग्रता 0.2 μM, 0.4, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM, InsP 6 और Ins (1, 3, 4, 5, 6) P 5 एकाग्रता 0.2 μM, 2 μM, 24 μM, 24 μM, InsP 6 और Ins (1, 3, 4, 5, 6) P 5 एकाग्रता 0.2 μM, 0.4, 5, 6) P 5 एकाग्रता 0.2 μM, 2 μM, 0.5 μM, 24 μM पर है। InsP 6 और Ins (1, 3, 4, 5, 6) P5 एकाग्रता 0.2 μM, 0.4 μM, 2.5 m, 24 μM, 24 μM, InsP6 और Ins (1, 3, 4, 40 μM, 80 μM, 120 μm. x एकाग्रता है, y (क्षेत्र Insp)12C/(क्षेत्र Insp)13C है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/Table%202.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

स्तनधारी कोशिका अर्क से इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट की पूर्ण मात्रा के लिए केशिका वैद्युतकणसंचलन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है।

केशिका वैद्युतकणसंचलन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट्स की पूर्ण मात्रा

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

यह अब तक हमारे द्वारा परीक्षण किए गए सभी जीवों में इनोसिटोल फॉस्फेट चयापचय के लिए उच्च गुणवत्ता वाले परिणाम प्रदान करता है। यह नए सेलुलर बायोसिंथेटिक मार्ग में अंतर्दृष्टि भी प्रदान करेगा जिसके बारे में हम वर्तमान में जानते हैं। सीई-ईएसआई-एमएस द्वारा इनोसिटोल फॉस्फेट चयापचय का विश्लेषण तेज, अत्यधिक संवेदनशील है, और इनोसिटोल फॉस्फेट असेंबली के लिए संरचना की जानकारी प्रदान करने में सक्षम है।शुरू करने के लिए, एक केशिका वैद्युतकणसंचलन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री या सीई-ईएसआई-एमएस सिस्टम स्थापित करें जिसमें एक वाणिज्यिक सीई सिस्टम और एक ट्रिपल क्वाड्रोपोल टेंडम मास स्पेक्ट्रोमीटर शामिल है, जो एक एगिलेंट जेट स्ट्रीम ईएसआई स्रोत से लैस है। इसके बाद, शीथ प्रवाह 1: 100 स्प्लिटर और आइसोक्रेटिक तरल क्रोमैटोग्राफी पंप आउटलेट को कनेक्ट करें, और सुनिश्चित करें कि सीई सिस्टम इनलेट शीशी द्रव्यमान विश्लेषक के स्प्रेयर टिप के समान ऊंचाई पर है। फिर, पूरे सिस्टम और डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण को नियंत्रित करने के लिए मासहंटर वर्कस्टेशन संस्करण या इसी तरह के एमएस सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।सीई रनिंग बफर और शीथ लिक्विड तैयार करने के बाद, पांच मिनट के लिए पांच मिलीलीटर प्रति मिनट पर शुद्ध करके शीथ तरल स्थापित करें। फिर प्रवाह दर को एक मिलीलीटर प्रति मिनट और पंप दबाव को 180 बार पर सेट करें। सुनिश्चित करें कि पुनर्नवीनीकरण टयूबिंग विलायक का पुन: उपयोग करने के लिए म्यान तरल बोतल से वापस जुड़ता है।इसके बाद, एक घूर्णन हीरे के ब्लेड के साथ एक केशिका कॉलम कटर का उपयोग करके, यूवी-डिटेक्शन विंडो के साथ सीई-एमएस केशिका के दोनों सिरों को ठीक से काट लें। फिर हल्के से दोनों सिरों पर दो से तीन सेंटीमीटर पॉलीमाइड कोटिंग हटा दें, और आइसोप्रोपेनोल के साथ केशिका सतह को साफ करें। केशिका स्थापित करने के लिए, सीई-एमएस कैसेट में केशिका का मिलान करें।फिर कैसेट बदलें बटन पर क्लिक करें और कैसेट को सीई डिवाइस में इंस्टॉल करें। केशिका को सक्रिय करने के लिए, पहले केशिका को एक मोलर सोडियम हाइड्रॉक्साइड के साथ फ्लश करें, इसके बाद 10 मिनट के लिए पानी, और फिर 15 मिनट के लिए सीई रनिंग बफर। इसके बाद, सीई-एमएस स्प्रेयर में केशिका डालें।एक मैग्निफाइंग ग्लास और स्प्रेयर में समायोजन स्क्रू का उपयोग करके, केशिका आउटलेट को ठीक से समायोजित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि केशिका अंत स्प्रेयर टिप से लगभग 0.1 मिलीमीटर बाहर निकलता है। पूर्ण स्कैन मोड के तहत ईएसआई स्प्रेयर की स्थिरता की जाँच करें। कुल आयन इलेक्ट्रोफेरोग्राम का उतार-चढ़ाव 5% के भीतर होना चाहिए, फिर, इनोसिटोल फॉस्फेट मानकों के साथ एक परीक्षण रन करें।आंतरिक मानकों के मिश्रण को तैयार करने के बाद, आंतरिक मानकों के मिश्रण के 0.5 माइक्रोलीटर और सीई नमूना शीशी के साथ नमूने के 10 माइक्रोलीटर मिलाएं। पुनःपूर्ति प्रणाली का उपयोग करते समय, बोतल बदलें बटन पर क्लिक करें। तैयार 250 मिलीलीटर सीई रनिंग बफर को इलेक्ट्रोलाइट बोतल में डालें।फिर पानी की शीशी में पुनःपूर्ति सुई रखते हुए क्लीन ट्यूब पर क्लिक करें। ESI और MS पैरामीटर सेट करें। फिर इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट मानकों के मिश्रण के साथ स्रोत ऑप्टिमाइज़र का उपयोग करके स्रोत मापदंडों को अनुकूलित करें, और सभी मानकों के साथ मासहंटर ऑप्टिमाइज़र का उपयोग करके कई प्रतिक्रिया निगरानी सेटिंग्स।इसके बाद, इनोसिटोल फॉस्फेट अर्क के लिए एक रन करें और परिणामों की जांच करें। अधिक नमूने होने पर एक अनुक्रम सेट करें। माप के बाद, एमएस को स्टैंडबाय मोड पर रहने दें और तरल क्रोमैटोग्राफी पंप को बंद न करें।शीथ तरल आपूर्ति नहीं होने पर सीई-ईएसआई-एमएस स्प्रेयर को एलसी-ईएसआई-एमएस स्प्रेयर से बदलें। डेटा विश्लेषण के लिए, मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और सभी नमूनों के लिए एक बैच बनाएं। इसके बाद, अधिग्रहित एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी डेटा से एक नई विधि बनाएं, और कार्बन -13 इनोसिटोल फॉस्फेट को आंतरिक मानकों के रूप में सेट करें।फिर, एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी यौगिक, अवधारण समय, आंतरिक मानकों, एकाग्रता और क्वालीफायर सेटअप की जांच करें। विधि को वर्तमान बैच पर लागू करने के लिए सत्यापन और निकास पास करें. विधि सहेजें।फिर जांचें कि बैच में प्रत्येक शिखर सही ढंग से एकीकृत है या नहीं। अन्यथा, मैन्युअल रूप से शिखर को एकीकृत करें। परिणामों को एक स्प्रेडशीट में निर्यात करें, और ज्ञात सांद्रता के साथ आंतरिक मानकों को लेबल किए गए स्थिर आइसोटोप की संबंधित चरम प्रतिक्रिया के साथ एनोलाइट पीक प्रतिक्रिया की तुलना करके, इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट्स की मात्रा निर्धारित करें।अंत में, इनोसिटोल फॉस्फेट में मापा एकाग्रता के साथ, समाधान निकालें और इसकी मात्रा, पूर्ण मात्रा की गणना करें और सेल गणना या प्रोटीन सामग्री द्वारा मात्रा को और सामान्य करें। सेल की गिनती और एचसीटी 116 कोशिकाओं की औसत सेल मात्रा के आधार पर सेलुलर एकाग्रता की गणना करें। दो माइक्रोमोल्स की एकाग्रता पर इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट मानकों के निकाले गए आयन इलेक्ट्रोफेरोग्राम यहां दिखाए गए हैं।स्तनधारियों में इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट्स का चयापचय उनकी सरलीकृत संरचनाओं के साथ डाला जाता है। यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन या यूसीएल से एचसीटी 116 कोशिकाओं का सीई-ईएसआई-एमएस रन यहां दिखाया गया है। सीई-एमएस का उपयोग यूसीएल और एनआईएच से एचसीटी 116 कोशिकाओं के बीच आईपी 8 स्तरों में भिन्नता को निर्धारित करने के लिए किया गया था।यूसीएल से एचसीटी 116 कोशिकाओं में एनआईएच की तुलना में आईपी 8 के सात गुना अधिक स्तर होते हैं। एचसीटी 116 यूसीएल कोशिकाओं में 1, 5-आईपी 8 का महत्वपूर्ण संचय 1-आईपी 7 में काफी वृद्धि के समानांतर है। एनआईएच से सोडियम फ्लोराइड उपचारित एचसीटी 116 कोशिकाओं के सीई-ईएसआई-एमएस विश्लेषण ने आईपी 6 में कमी और 5-पीपीआईपी 4 की उपस्थिति के साथ 5-आईपी 7 की ऊंचाई का प्रदर्शन किया।यद्यपि 1-आईपी 7 का स्तर कुछ हद तक कम हो गया है, यह सोडियम फ्लोराइड उपचारित कोशिकाओं में पूरी तरह से अनुपस्थित नहीं है, लेकिन ज्यादातर पहचान की सीमा के तहत है। एक स्थिर सीई-ईएसआई-एमएस ग्रेड बनाना महत्वपूर्ण है। हम माप से पहले सिस्टम की पुनरावृत्ति और संवेदनशीलता की जांच करने की सलाह देते हैं।यह तकनीक इनोसिटोल फॉस्फेट चयापचय, प्रत्यारोपण और ऊतकों को प्रदान करने की अनुमति देती है, और जैविक रूप से प्रासंगिक इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट का बारीकी से अध्ययन करने का अवसर भी प्रदान करती है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless केशिका वैद्युतकणसंचलन मास जैविक नमूने मेटाबोलिक रूपरेखा के लिए स्पेक्ट्रोमेट्री

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी isoforms की केशिका वैद्युतकणसंचलन पृथक्करण एक तटस्थ केशिका का उपयोग

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ब्लू मूल निवासी पृष्ठ और प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा द्वारा समानता शुद्ध प्रोटीन परिसरों का समाधान करना

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Formalin की इष्टतम तैयारी के लिए निर्धारित नमूनों पेप्टाइड आधारित मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर Desorption/Ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग वर्कफ़्लोज़

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 आंतरिक विकार का विश्लेषण और धातु आयनों की ओर बाध्यकारी केशिका जेल ट्रो और अपनत्व केशिका ट्रो

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

पत्ती स्प्रे मास स्पेक्ट्रोमेट्री: एक तेजी से परिवेश Ionization तकनीक सीधे संयंत्र के ऊतकों से चयापचयों का आकलन करने के लिए

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide प्रोफ़ेशनल और पहचान एंजियोटेन्सिन द्वितीय द्वारा सचित्र

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा इनोसिटोल फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटाइड इंटरैक्टिंग प्रोटीन की पहचान पश्चिमी ब्लॉट या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए जोड़ा गया

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

जांच इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयारी

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...