Name: absolute quantitation of inositol pyrophosphates by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry
Uploaded: 2021-08-13T13:45:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry at JoVE.com

Dette prosjektet har mottatt finansiering fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horisont 2020 (tilskuddsavtale nr. 864246, til HJJ). DQ anerkjenner den økonomiske støtten fra Brigitte-Schlieben-Lange-Programm. AS er støttet av MRC-programstipendet MR/T028904/1.

1. Sette opp CE-ESI-MS-systemet
<ol><li>Sett opp et CE-ESI-MS-system som består av et kommersielt CE-system - og et trippel quadrupole tandemmassespektrometer, utstyrt med en Agilent Jet Stream (AJS) elektrosprayionisering (ESI) kilde. Et CE-ESI-MS sprøytesett og en isokratisk LC-pumpe (væskekromatografi) er nødvendig.</li>
	<li>Koble kappestrømmen 1:100 splitter (inkludert i CE-MS sprøytesettet) og det isokratiske LC-pumpeuttaket.</li>
	<li>Forsikre deg om at CE-systemets innløpshetteglass er i samme høyde som sprøytespissen på masseanalysatoren.</li>
	<li>Bruk MassHunter Workstation (versjon 10.1) eller tilsvarende MS-programvare for å kontrollere hele systemet, og for datainnsamling og analyse.</li>
</ol>2. Forbereder buffer-, kapillær- og CE-MS-system
<ol><li>Forbered CE løpebuffer: Juster pH på 40 mM ammoniumacetat til 9,0 med ammoniumhydroksid. En 250 ml volumetrisk kolbe anbefales. Filtrer bufferen på 250 ml med 0,2 μm membranfiltre i porestørrelse. Sørg for å bruke bare ultrarent avionisert vann og MS-grade reagenser. MERK: Denne bufferen kan oppbevares ved romtemperatur i 2-3 uker eller i flere måneder i kjøleskap.</li>
	<li>Forbered kappevæske: Bland 100 ml ultrarent vann og 100 ml LC-MS-klasse isopropanol i en 250 ml flaske. Bytt kappevæske minst en gang i uken. Legg massereferanse i kappevæsken når du bruker et høyoppløselig massespektrometer.</li>
	<li>Installer kappevæske: Tøm ved 5 ml / min i 5 minutter og sett strømningshastigheten til 1 ml / min (10 μL / min i CE-MS-sprøyten). Pumpetrykket vil være på ca. 180 bar. Forsikre deg om at resirkuleringsslangen kobles tilbake til kappevæskeflasken for å gjenbruke løsningsmidlet.</li>
	<li>Forbered kapillær: Kjøp en CE-MS kapillær (50 μm i.d. og 365 μM o.d. med en lengde på 125 cm) med et UV-deteksjonsvindu. Brukeren kan også få mye billigere bar-smeltet silika kapillærer fra spesialiserte distributører. Klipp en kapillær med en lengde på 100 cm. Klipp begge kapillærendene riktig med en kapillærsøyleskjærer med et roterende diamantblad og fjern 2-3 cm polyimidbelegg i begge ender med en lighter. Rengjør kapillæroverflaten med isopropanol.</li>
	<li>Monter kapillær: Match kapillæren i CE-MS-kassetten. Klikk på Endre kassett-knappen og installer kassetten i CE-enheten. Innløpsenden av kapillæren er rundt 2 mm lavere enn elektroden. Sørg for at innløpsenden er lavere enn prøvens overflate under injeksjonsprosessen.</li>
	<li>Aktiver kapillær: Før første gangs bruk, skyll kapillæren med 1 M NaOH, etterfulgt av vann i 10 minutter, og CE løpende buffer i 15 minutter.</li>
	<li>Sett kapillærenden inn i CE-MS-sprøyten: Sett kapillæren forsiktig inn i CE-MS-sprøyten og sørg for at kapillærenden stikker ca. 0,1 mm ut av sprøytespissen. Sørg for å foreta nøyaktig justering av kapillærutløpsenden med et forstørrelsesglass og justeringsskruen i sprøyten. Sett sprøyten tilbake i ionekilden og unngå å berøre justeringsskruen. MS er i standby-modus når du utfører denne operasjonen.</li>
	<li>Kontroller ESI-spray: Kontroller stabiliteten til ESI-sprøyten i full skannemodus. Svingningen av totale ionelektroferogrammer må være innenfor 5%.</li>
	<li>Utfør en testkjøring med InsP-standarder: Bruk en blanding av 2 μM InsP3-InsP 8-standarder (justert med kvantitativ 31P NMR 15,27) for testkjøringer med en injeksjon på 50 mbar for 10 s (10 nL). Angi detaljerte ESI- og MS-parametere som vist i tabell 1. CE-strømmen er ca. 26 μA. Toppbredden er rundt 0,4-0,5 min. Sørg for at signal-til-støy-forholdet når minst 400.</li>
</ol>3. Ekstraksjon av løselige inositolfosfater fra pattedyrceller
MERK: HCT116NIH-celler var en snill gave fra Stephen Shears28. HCT116UCL-celler var fra Saiardis Lab26.
<ol><li>Såing av celler<ol><li>Kultur HCT116NIH - eller HCT116UCL-celler i T75-kolber ved 37 ° C i en 5% høy luftfuktighet CO2-atmosfære (videre referert til som standardforhold) i Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS).</li>
		<li>Vask HCT116NIH - og HCT116UCL-stamkulturene med fosfatbufret saltvann (PBS) (5 ml) og inkuber cellene med trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (3 ml, 0,25 %) under standardbetingelser til de er helt løsrevet. Slukk trypsinaktivitet ved å tilsette medium (7 ml), samle cellene i et sentrifugerør og sentrifuge (200 x g, 3 min).</li>
		<li>Fjern supernatanten og resuspend cellene i medium (10 ml). Tell cellene og bestem levedyktigheten via trypanblå eksklusjon.</li>
		<li>Frø cellene (6 millioner HCT116-celler per analyse) i en 150 mm tallerken og juster totalt 20 ml cellekulturmedium. Premix mediet og cellene i et sentrifugerrør før sådd for å oppnå en lik fordeling av cellene i parabolen. Forbered en parallell tallerken når normalisering etter cellenummer er nødvendig.</li>
		<li>Dyrk cellene under standardforhold i 72 timer. Cellene vil nå ca 80% -90% sammenløp.</li>
	</ol></li>
	<li>Modulering av inositolfosfatnivåer med NaF og cellehøsting<ol><li>NaF-behandling: Tilsett NaF (10 mM) 1 time før høsting i mediet. Bland mediet ved å virvle platen/pipetteringen og inkuber cellene i 60 minutter under standardbetingelser.</li>
		<li>Etter NaF-behandlingen, fjern mediet fra cellene og legg cellene på is.</li>
		<li>Vask cellene to ganger med PBS (5 ml, 4 °C) og fjern PBS helt fra fatet.</li>
		<li>Tilsett perklorsyre (PA) (1 ml, 1 M, 4 °C). Sørg for å dekke hele overflaten med PA (cellene blir hvite når proteiner faller ut). Inkuber cellene i 10 minutter på et vippebord ved 4 °C.</li>
		<li>Samle PA i et sentrifugerør og fjern forurensende rusk ved sentrifugering (17 000 x g, 5 min, 4 °C). Legg supernatanten til de forberedte TiO2-perlene for nedtrekking av InsPs.</li>
		<li>Vask parabolen etter ekstraksjon to ganger med PBS (5 ml, r.t.) for deacidification; fjern PBS helt fra parabolen.</li>
		<li>Solubiliser proteinene på platen via tilsetning av cellelysebuffer (1,5 ml, r.t.; 0,1% natriumdodecylsulfat [SDS] i 0,1 M NaOH). Inkuber retten i 15 minutter på et vippebord på r.t. Overfør cellelysatet til et sentrifugerør og sentrifuge (17 000 x g, 5 min, 4 °C). Oppbevar supernatanten ved -80 °C til proteinkonsentrasjonen bestemmes via DC-proteinanalysen ved bruk av bovint serumalbumin som kalibreringsstandard (vanligvis inneholder en 150 mm tallerken rundt 10 mg proteiner).</li>
		<li>Bestemmelse av celletall fra parallelle retter: Høst cellene i parallellskålen via trypsin som beskrevet i trinn 3.1.2 (bruk 5 ml trypsin-EDTA for 150 mm parabolen) og fjern mediet. Resuspend cellepelleten i PBS (5 ml), bland riktig og tell cellene. Utfør dette trinnet rett før høsting via direkte slukking for å oppnå representative celletall. I tillegg måler du volumet av cellene med en passende metode (f.eks. med en multisizer-maskin).</li>
	</ol></li>
	<li>TiO2 anrikning av inositolfosfater MERK: For å unngå sur nedbrytning av fosforylerte forbindelser, utfør alle anrikningstrinnene til eluering på is, og avkjøl alle reagenser til 4 ° C. Hold tiden for utvinningen til et minimum (1,5-2 timer). Utfør alle ekstraksjonstrinnene med 1 M PA.<ol><li>Tilberedning av perler: Vask TiO 2 perler (5 mg per prøve) med ddH2O (1 ml) og sentrifuge (3 500 x g, 1 min, 4 °C). Fjern ddH2O og vask perlene med PA (1 ml). Fjern PA ved sentrifugering (3 500 x g, 1 min, 4 °C). Resuspend perlene i PA (50 μL per prøve).</li>
		<li>Tilsett supernatant som inneholder fosforylerte forbindelser (sammenlign pkt. 3.2, trinn 3.2.5) til perlesuspensjonen, virvelen, og roter deretter prøven i 20 minutter ved 4 °C.</li>
		<li>Sentrifuger prøven (3 500 x g, 1 min, 4 °C) og kast supernatanten. Vask perlene med PA (500 μL) og sentrifuge (3 500 x g, 1 min, 4 °C). Kast supernatanten og gjenta vasketrinnet.</li>
		<li>Tilsett NH4OH (200 μL, 3%) til perlene og resuspend. Roter prøven i 5 minutter ved r.t.</li>
		<li>Sentrifuger prøven (3,500 x g, 1 min) og overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør.</li>
		<li>Gjenta elueringstrinnene 3.3.4 og 3.3.5 og kombiner eluentene. Kast perlene.</li>
		<li>Sentrifuger de kombinerte eluentene (17 000 x g, 1 min, 4 °C) for å fjerne eventuelle uoppløselige rester.</li>
		<li>Tørk supernatanten helt under vakuumfordampning (70 min, 60 °C, V-AQ). Tilsett ddH2O (50 μL) i de tørkede ekstraktene som inneholder InsPs. Vortex for å blande prøven til den er helt oppløst. Oppbevar prøven ved -20 °C til CE-ESI-MS-analyse.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Utføre CE-ESI-MS-løpene
<ol><li>Forbered en blanding av interne standarder som inneholder 40 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 80 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 80 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 400 μM [13 C 6]InsP 6 og 400 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5. Bestem konsentrasjonene av SIL IS-løsninger ved kvantitativ 31P og 1H NMR, ved hjelp av en sertifisert referansestandard, dvs. fosfoeddiksyre. MERK: Alle ovennevnte SIL interne standarder (IS) med renheter høyere enn 96% ble syntetisert og levert av Fiedler gruppe15,27. På samme måte som med nukleotider, kan disse IS bære mange krystallvannmolekyler og forskjellige motioner. I stedet for å veie stoffet og beregne konsentrasjonen, anbefales konsentrasjonsbestemmelse av 13C6 standardløsninger ved kvantitativ 31P NMR.</li>
	<li>Bland 10 μL av prøven med 0,5 μL intern standardblanding i et CE-prøvehetteglass. 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 20 μM [13 C 6]InsP 6 og 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 er de endelige konsentrasjonene inne i prøvene.</li>
	<li>Når du bruker påfyllingssystemet, klikker du på Bytt flaske-knappen , legger den forberedte 250 ml CE-løpebufferen i elektrolyttflasken og klikker på Rengjør rør. Oppbevar påfyllingsnålen i et vannglass.</li>
	<li>Angi ESI- og MS-parametere som vist i tabell 1. Optimaliser kildeparametrene ved hjelp av en Source Optimizer med en blanding av inositolpolyfosfatstandarder. Få innstillingene for flere reaksjonsovervåking (MRM) ved hjelp av Masshunter Optimizer med alle standarder. Juster ESI- og MS/MS/MS-innstillingene for ulike instrumenter.</li>
	<li>Utfør en kjøring for InsP-ekstraktene og kontroller resultatet (figur 2). Angi en sekvens når det er flere eksempler.</li>
	<li>La MS være i standby-modus etter målinger. Ikke slå av LC-pumpen. Strømmen av kappevæske beskytter sprøytenålen. Bytt ut CE-ESI-MS Sprayer med en LC-ESI-MS Sprayer når det ikke er tilførsel av kappevæske.</li>
</ol>5. Analyse av data
<ol><li>Open Quantitative Analysis (for QQQ) programvare, lage en batch for alle prøver.</li>
	<li>Opprett en ny metode fra de innsamlede MRM-dataene. Sett [13C6]InsPs som interne standarder - (ISTD). Kontroller oppsett av MRM-forbindelse, oppsett av oppbevaringstid, ISTD-oppsett, konsentrasjonsoppsett og kvalifiseringsoppsett. Send valideringen og avslutt for å bruke metoden på gjeldende bunke. Lagre metoden.</li>
	<li>Sjekk om hver topp i batchen er riktig integrert; Ellers integrerer du toppen manuelt.</li>
	<li>Eksporter resultatene til et regneark. Utføre kvantifiseringen av inositol (pyro)fosfater ved å sammenligne analyttens topprespons med den respektive toppresponsen til SIL IS med kjente konsentrasjoner. Teoretiske og eksperimentelle kalibreringskurver er vist i tabell 2 for 5-PP-InsP 5, InsP 6 og Ins(1,3,4,5,6)P 5 med det lineære området. MERK: Forutsetningen for å anvende teoretisk kalibreringskurve er bruken av et isotopmønster av høy kvalitet av målrettede analytter og med troverdig konsentrasjon. Evaluer det lineære området. En kalibreringskurve er avgjørende for absolutt kvantifisering når hele oppkjøpet av de ovennevnte isotopstandardene er upraktisk.</li>
	<li>Med den målte konsentrasjonen i InsP-ekstraktløsningen og dens volum, beregne de absolutte mengdene. Videre normaliserer du mengden ved celletall eller proteininnhold. Beregn cellekonsentrasjonen basert på celletall og gjennomsnittlig cellevolum av HCT116 (1,68 fL).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stephens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection,+purification,+structural+characterization,+and+metabolism+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate(s)+and+bisdiphosphoinositol+tetrakisphosphate(s).">The detection, purification, structural characterization, and metabolism of diphosphoinositol pentakisphosphate(s) and bisdiphosphoinositol tetrakisphosphate(s).</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 4009-4015 (1993).</li><li>Menniti, F. S., Miller, R. N., Putney, J. W., Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+inositol+polyphosphate+pyrophosphates+in+pancreatoma+cells.">Turnover of inositol polyphosphate pyrophosphates in pancreatoma cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 3850-3856 (1993).</li><li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+Why+so+many+phosphates.">Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates.</a> Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).</li><li>Irvine, R. F., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+in+the+water:+the+return+of+the+inositol+phosphates.">Back in the water: the return of the inositol phosphates.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (5), 327-338 (2001).</li><li>Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+inositol+pyrophosphates+on+cellular+energy+dynamics.">Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics.</a> Science. 334 (6057), 802-805 (2011).</li><li>Wild, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+eukaryotic+phosphate+homeostasis+by+inositol+polyphosphate+sensor+domains.">Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains.</a> Science. 352 (6288), 986-990 (2016).</li><li>Chakraborty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+inhibit+Akt+signaling,+thereby+regulating+insulin+sensitivity+and+weight+gain.">Inositol pyrophosphates inhibit Akt signaling, thereby regulating insulin sensitivity and weight gain.</a> Cell. 143 (6), 897-910 (2010).</li><li>Bittner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+caged+inositol+pyrophosphate+InsP8+directly+modulates+intracellular+Ca2++oscillations+and+controls+C2AB+domain+localization.">Photolysis of caged inositol pyrophosphate InsP8 directly modulates intracellular Ca2+ oscillations and controls C2AB domain localization.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (24), (2020).</li><li>Hauke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+cell-permeant+caged+inositol+pyrophosphates+controls+oscillations+of+cytosolic+calcium+in+a+&#946;-cell+line.">Photolysis of cell-permeant caged inositol pyrophosphates controls oscillations of cytosolic calcium in a &#946;-cell line.</a> Chemical Science. 10 (9), 2687-2692 (2019).</li><li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking.">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14206-14211 (2002).</li><li>Koldobskiy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-mediated+apoptosis+requires+inositol+hexakisphosphate+kinase-2.">p53-mediated apoptosis requires inositol hexakisphosphate kinase-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (49), 20947 (2010).</li><li>Rao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+hexakisphosphate+kinase-1+mediates+assembly/disassembly+of+the+CRL4-signalosome+complex+to+regulate+DNA+repair+and+cell+death.">Inositol hexakisphosphate kinase-1 mediates assembly/disassembly of the CRL4-signalosome complex to regulate DNA repair and cell death.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16005 (2014).</li><li>Williams, S. P., Gillaspy, G. E., Perera, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+possible+functions+of+inositol+pyrophosphates+in+plants.">Biosynthesis and possible functions of inositol pyrophosphates in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 67 (2015).</li><li>Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+between+signalling+and+metabolism.">Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism.</a> The Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).</li><li>Harmel, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+13C-labeled+myo-inositol+to+interrogate+inositol+phosphate+messengers+by+NMR.">Harnessing 13C-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR.</a> Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).</li><li>Qiu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+inositol+phosphate+metabolism+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Analysis of inositol phosphate metabolism by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nature Communications. 11 (1), 6035 (2020).</li><li>Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+analysis+of+soluble+inositol+polyphosphates+from+yeast.">Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).</li><li>Wilson, M. S. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+radioactive+labelling+to+elucidate+inositol+polyphosphate+signalling.">Importance of radioactive labelling to elucidate inositol polyphosphate signalling.</a> Phosphate Labeling and Sensing in Chemical Biology. , 67-87 (2017).</li><li>Wilson, M. S. C., Bulley, S. J., Pisani, F., Irvine, R. F., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+purification+of+inositol+phosphates+from+biological+samples+reveals+that+no+phytate+is+present+in+human+plasma+or+urine.">A novel method for the purification of inositol phosphates from biological samples reveals that no phytate is present in human plasma or urine.</a> Open Biology. 5 (3), 150014 (2015).</li><li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity:+analysis+by+gel+electrophoresis.">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PloS One. 4 (5), 5580 (2009).</li><li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphate+InsP8+acts+as+an+intracellular+phosphate+signal+in+arabidopsis.">Inositol pyrophosphate InsP8 acts as an intracellular phosphate signal in arabidopsis.</a> Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).</li><li>Riemer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITPK1+is+an+InsP6/ADP+phosphotransferase+that+controls+systemic+phosphate+homeostasis+in+Arabidopsis.">ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls systemic phosphate homeostasis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Whitfield, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATP-responsive+metabolic+cassette+comprised+of+inositol+tris/tetrakisphosphate+kinase+1+(ITPK1)+and+inositol+pentakisphosphate+2-kinase+(IPK1)+buffers+diphosphosphoinositol+phosphate+levels.">An ATP-responsive metabolic cassette comprised of inositol tris/tetrakisphosphate kinase 1 (ITPK1) and inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPK1) buffers diphosphosphoinositol phosphate levels.</a> The Biochemical Journal. 477 (14), 2621-2638 (2020).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+interaction+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+quantitative+analysis+of+mammalian-derived+inositol+poly/pyrophosphates.">Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates.</a> Journal of chromatography. A. 1573, 87-97 (2018).</li><li>Mantilla, B. S., Amaral, L. D. D., Jessen, H. J., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=the+inositol+pyrophosphate+biosynthetic+pathway+of+Trypanosoma+cruzi.">the inositol pyrophosphate biosynthetic pathway of Trypanosoma cruzi.</a> ACS Chemical Biology. 16 (2), 283-292 (2021).</li><li>Wilson, M. S. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+phosphates+purification+using+titanium+dioxide+beads.">Inositol phosphates purification using titanium dioxide beads.</a> Bio-Protocol. 8 (15), 2959 (2018).</li><li>Puschmann, R., Harmel, R. K., Fiedler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+chemoenzymatic+synthesis+of+inositol+pyrophosphates.">Scalable chemoenzymatic synthesis of inositol pyrophosphates.</a> Biochemistry. 58 (38), 3927-3932 (2019).</li><li>Gu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KO+of+5-InsP7+kinase+activity+transforms+the+HCT116+colon+cancer+cell+line+into+a+hypermetabolic,+growth-inhibited+phenotype.">KO of 5-InsP7 kinase activity transforms the HCT116 colon cancer cell line into a hypermetabolic, growth-inhibited phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 11968-11973 (2017).</li><li>Gu, C., Wilson, M. S. C., Jessen, H. J., Saiardi, A., Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+Pyrophosphate+Profiling+of+Two+HCT116+Cell+Lines+Uncovers+Variation+in+InsP8+Levels.">Inositol Pyrophosphate Profiling of Two HCT116 Cell Lines Uncovers Variation in InsP8 Levels.</a> PloS One. 11 (10), 0165286 (2016).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Presentert her er en praktisk og sensitiv metode for kvantifisering av høyt ladede inositolpyrofosfater i pattedyrceller. Ved å kombinere denne analysetilnærmingen med dagens toppmoderne InsP-ekstraksjon med perklorsyre etterfulgt av anrikning med TiO2, har CE-ESI-MS-analyse enestående fordeler. Med hensyn til gjennomstrømning, følsomhet, stabilitet, absolutt kvantifisering, isomeridentifikasjon og matrise-in-avhengighet, skiller denne metoden seg ut sammenlignet med andre tilnærminger. Denne protokollen gjelder for pattedyrceller, men faktisk lykkes denne strategien i mange forskjellige prøver (f.eks. Gjær, planter, parasitter, musevev, etc.).
Den anvendte ekstraksjonsprotokollen gjenoppretter fullt ut PP-InsPs og InsP6 fra pattedyrcelleekstrakter16,19. Det vil også trekke ut mange andre anioniske metabolitter, spesielt fosfatholdige arter, for eksempel sukkerfosfater og nukleotider. Evaluering av gjenoppretting og nedbrytning for brukerens analytter med denne protokollen vil være nødvendig.
Vanligvis kjører CE-ESI-MS-systemet jevnt og kan romme rundt 200 prøver hver uke ved hjelp av denne protokollen. I motsetning til HPLC har CE blitt ansett som en metode for eksperter og spesialiserte personer i lang tid, noe som begrenset markedet og begrenset anvendelsen. Dermed er en CE-ESI-MS-enhet vanligvis fraværende i analytiske fakulteter. Folk som ønsker å utføre CE-ESI-MS-analyse, mangler sannsynligvis CE-erfaring og vil bruke mer tid på feilsøking. Her fremheves de kritiske trinnene. Først og fremst er kvaliteten på kapillærkuttet. Følsomheten og stabiliteten til ESI-spray er for det meste avhengig av et førsteklasses kapillærkutt. For det andre skal kapillærutløpsenden være nøyaktig 0,1 mm ut av sprøytespissen. Sprøytekanylen og CE-kapillæren skal være i aksial retning. Kvaliteten på ESI-sprayen er kritisk for kvantifisering; Tekniske kjøringer bør utføres for å evaluere repeterbarheten. 
Med den beskrevne protokollen er kvantifiseringsgrensen (LOQ) for PP-InsPs 40 nM med en injeksjon ved 50 mbar for 10 s (10 nL). Det er flere tilnærminger for å øke metodefølsomheten ytterligere. For det første vil en injeksjon på 100 mbar i 20 s (40 nL) fortsatt resultere i en god toppform og tilstrekkelig oppløsning for regioisomerer 5-PP-InsP 5 og 1-PP-InsP5. For det andre kan InsP-ekstrakter oppløses i en mindre mengde vann. For det tredje kan oppholdstiden økes ved bruk av mindre MRM-overganger for kvantifisering. I tillegg vil en CE-MS-ionkilde ved bruk av ultralav kappevæskestrøm øke følsomheten betydelig.
CE-kjørebufferen med pH 9 gir den beste oppløsningen mellom InsP 6-InsP 8. Når du øker pH til 9,7, vil oppløsningen blant InsP3-InsP 6 forbedres betydelig. På grunn av den utmerkede oppløsningen anbefales en kortere kapillær lengde på 72 cm for å øke gjennomstrømningen ytterligere. Dessuten reduserer en høyere CE-kassetttemperatur ved 40 ° C viskositeten til den vandige elektroforetiske bufferen og akseler bevegelsen under EOF. I henhold til ulike forskningskrav kan modifikasjoner av denne metoden ytterligere lette InsPs- og PP-InsPs-analyse. Derfor har de beskrevne CE-ESI-MS-protokollene potensialet til å åpne nye forskningsveier i denne mangefasetterte familien av signalmolekyler.

Siden den første oppdagelsen av myo-inositolpyrofosfater (PP-InsPs) i 19931,2, har det blitt gjort betydelige fremskritt for å belyse deres biosyntese, omsetningog funksjoner. Inositolpyrofosfater forekommer allestedsnærværende i eukaryote celler4 og fungerer som metabolske signalmolekyler som er kritisk involvert i f.eks. fosfathomeostase5,6, insulinfølsomhet7, kalsiumoscillasjoner8,9, vesikulær handel 10, apoptose 11, DNA-reparasjon 12, immunsignalering 13 , og andre. Mengden av viktige prosesser under kontroll av inositolpyrofosfater krever en dypere forståelse av deres cellulære overflod, svingninger og lokalisering.
Selv om InsPs og PP-InsPs vakte oppmerksomhet på tvers av disipliner, utføres analysen av deres overflod rutinemessig ved hjelp av en metode utviklet i løpet av 80-tallet, bestående av merking av celler med tritiert inositol, oppløsning av ekstraherte PP-InsPs ved sterk anionutvekslingskromatografi Sax-HPLC med påfølgende scintillasjonstelling. Nyere metoder basert på massespektrometri står fortsatt overfor betydelige utfordringer: inositolpyrofosfater med opptil åtte fosfatenheter har fosfatestere og anhydrider, noe som fører til en betydelig negativ ladning og potensielt fosfattap under ionisering. Det finnes fire hovedtyper av PP-InsPs hos pattedyr (figur 1): 1,5-(PP)2-InsP 4 (eller 1,5-InsP8), 5-PP-InsP 5 (eller 5-InsP 7), 1-PP-InsP 5 (eller 1-InsP7) og 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (eller5-PP-InsP 4)3,14. De fysiologiske nivåene av PP-InsPs er vanligvis i nano- til lavmikromolært område, med 5-PP-InsP 5 som den mest tallrike med cellulære konsentrasjoner på 0,5 - 5 μM. 1,5- (PP) 2-InsP4 og 1-PP-InsP 5 antas å være opptil rundt 10% av 5-PP-InsP 5-bassenget og forblir vanskelig å spore i mange celler15. 5-PP-InsP4 med en fri OH-gruppe er enda lavere i overflod og blir vanligvis bare påviselig når fosfathydrolaser hemmes med natriumfluorid (NaF)16.
Den høye ladningstettheten til PP-InsPs gjør separasjonen vanskelig, og forekomsten av PP-InsP-regioisomerer kompliserer disse anstrengelsene ytterligere. Som et resultat var de fleste eksperimenter avhengig av kvantifisering ved metabolsk radioaktiv merking av celler ved bruk av [3H] -inositol, da bakgrunn fra matrisen er utelukket og høy følsomhet oppnås17,18. Denne metoden er imidlertid kostbar, tidkrevende og tillater ikke å skille relaterte PP-InsP-regioisomerer riktig. Videre tar [3H] -inositol-merking ikke hensyn til endogen inositolsyntese fra glukose. En polyakrylamidgelelektroforese (PAGE)-basert metode er et mye brukt billig alternativ, men begrenset i sin følsomhet 19,20,21,22. Andre tilnærminger som unngår radiomerking er publisert, inkludert ionekromatografi etterfulgt av UV-deteksjon23 etter kolonnederivatisering, hydrofil interaksjonskromatografi (HILIC)24 eller svak anionutveksling (WAX) kombinert med massespektrometri (MS)25. Imidlertid er de ikke (ennå) på nivå med den klassiske [3H] -inositol SAX-HPLC-protokollen.
Nylig ble kapillærelektroforeseelektrosprayioniseringsmassespektrometri (CE-ESI-MS) introdusert som en transformativ strategi for analyse av InsPs og PP-InsPs metabolisme, og oppfyller alle kravene diskutert ovenfor16. Kombinert med dagens state-of-the-art InsP-ekstraksjon av perklorsyre etterfulgt av anrikning med titandioksidperler26, lyktes CE-ESI-MS i hver organisme som er testet så langt, fra gjær til planter og pattedyr. Samtidig profilering av InsPs og PP-InsPs, inkludert alle mulige regioisomerer, ble enkelt oppnådd. Stabile isotopmerkede (SIL) interne standarder muliggjorde en rask og presis absolutt kvantifisering, uavhengig av matriseeffekter. Fordi MS kan fange isotopiske masseforskjeller, kan CE-ESI-MS også brukes til å studere compartmentalized cellulære synteseveier av InsPs og PP-InsPs, for eksempel ved å mate celler med [13 C 6] -myo-inositol eller [13C6] -D-glukose.
Beskrevet her er en detaljert trinnvis protokoll for absolutt kvantifisering av PP-InsPs og InsPs fra pattedyrceller av CE-ESI-MS. Bortsett fra den store 5-PP-InsP 5-isomeren, er 1,5-(PP)2-InsP 4 og 1-PP-InsP5 også kvantifisert i denne studien, til tross for deres lavere overflod. To HCT116-cellelinjer fra forskjellige laboratorier (NIH, UCL) studeres, og det er validert at HCT116UCL-celler inneholder 7 ganger høyere nivåer av 1,5-(PP)2-InsP 4 enn funnet i HCT116NIH, mens 5-PP-InsP5-konsentrasjoner er sammenlignbare. I tillegg er 1-PP-InsP5-syntese i HCT116UCL ikke signifikant økt. Også økningen av PP-InsP-nivåer ved å blokkere deres defosforylering ved bruk av natriumfluorid studeres kvantitativt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm tissue culture dishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>168381</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>623201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>260836</td>
			<td>for the DC protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE fused silica capillary</td>
			<td>CS Chromatographie</td>
			<td>105180</td>
			<td>50 &#181;M i.d. 360 &#181;M o.d.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700</td>
			<td>10 mL, 1000 &#181;L, 200 &#181;L, 10 &#181;L pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94550, 94525, 94010, 94005</td>
			<td>50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6829,0500</td>
			<td>sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1677373</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23209</td>
			<td>albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000116</td>
			<td>DC protein assay reagents package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td>high glucose, pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106, 10500064 (heat inactivated)</td>
			<td>10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.2</td>
			<td>99.95% LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH, 10%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6756.1</td>
			<td>for preparation of 3% NH4OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9216.1</td>
			<td>for preparation of 1 M perchloric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>20760.02</td>
			<td>for preparation of cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 beads</td>
			<td>GL Sciences</td>
			<td>5020-75000</td>
			<td>5 &#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>trypan blue stain (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure (Type 1) water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>ZRQSVP3WW</td>
			<td>model: Direct-Q 3 UV Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30105893</td>
			<td>model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td>model: LUNA-II Automated Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1401</td>
			<td>model: UNIVERSAL 320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge with cooling</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-1647P</td>
			<td>model: Microstar 17R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7100A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE/MS Adapter Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1603A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE/MS Sprayer Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1607A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>LUNA Cell Counting Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5305000304</td>
			<td>model: Concentrator plus complete system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESI source</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>AJS ESI</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0088</td>
			<td>model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice box</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>should provide enough space for samples, dishes, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isocratic LC system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7110B 1260 Iso Pump</td>
			<td>model: Infinity II Quaternary system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G6495C</td>
			<td>triple quadrupole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30086375</td>
			<td>model: SPARK 10 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10072332</td>
			<td>for serological pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705884, 705880, 705878, 705872, 705870</td>
			<td>various pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>H5500</td>
			<td>model: Mini LabRoller Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortix capillary column cutter</td>
			<td>SGT</td>
			<td>S0020</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube shaker (vortex mixer)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HXH6.1</td>
			<td>model: Rotilabo-Mini Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tilt table</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S0600</td>
			<td>model: EDURO MiniMix Nutating Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FSGPD05</td>
			<td>model: Isotemp GPD 05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation Optimizer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation Qualitative Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QQQ Quantitaion Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantitation of inositol pyrophosphates by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry

Inositolpyrofosfater (PP-InsPs) er en viktig gruppe intracellulære signalmolekyler. Avledet fra inositolfosfater (InsPs), har disse molekylene tilstedeværelsen av minst en energisk pyrofosfatdel på myo-inositol-ringen. De eksisterer allestedsnærværende i eukaryoter og fungerer som metabolske budbringere som kartlegger fosfathomeostase, insulinfølsomhet og cellulær energiladning. På grunn av fraværet av en kromofor i disse metabolittene, en meget høy ladningstetthet og lav overflod, krever analysen radioaktivt sporstoff, og dermed er det innviklet og dyrt. Her presenterer studien en detaljert protokoll for å utføre absolutt og høy gjennomstrømningskvantitasjon av inositolpyrofosfater fra pattedyrceller ved kapillærelektroforese elektrosprayioniseringsmassespektrometri (CE-ESI-MS). Denne metoden muliggjør sensitiv profilering av alle biologisk relevante PP-InsPs-arter i pattedyrceller, noe som muliggjør baseline separasjon av regioisomerer. Absolutte cellulære konsentrasjoner av PP-InsPs, inkludert mindre isomerer, og overvåking av deres tidsmessige endringer i HCT116-celler under flere eksperimentelle forhold presenteres.

Resultatene som vises her tar sikte på å illustrere potensialet i CE-ESI-MS-analyse. De rapporterte tallene er beskrivende for et teknisk feilfritt CE-ESI-MS-løp. For det første presenteres en blanding av inositolpyrofosfatstandarder (figur 1) og et pattedyrcelleekstrakt (figur 2). For det andre er det gitt en sammenligning av to HCT116-cellelinjer (figur 3) og NaF-behandlede HCT116-celler (figur 4).
Ekstraherte ionelektroferogrammer (EIEs) av inositol (pyro)fosfatstandarder i en konsentrasjon på 2 μM er vist i figur 1. Metabolisme av inositolpyrofosfater hos pattedyr med deres forenklede strukturer er satt inn. De fire inositolpyrofosfatene i pattedyr, 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, 1-PP-InsP 5 og5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 skilles godt ut ved hjelp av den beskrevne metoden. En CE-ESI-MS-kjøring av HCT116UCL er avbildet i figur 2. Ved hjelp av stabile isotopmerkede (SIL) interne standarder kan en absolutt kvantifisering lett oppnås ved å sammenligne signalresponsen med den piggede SIL av kjent konsentrasjon. De integrerte EIEene av inositolfosfatet fra InsP5 til (PP) 2-InsP 4 og ikke-integrerte EIEer av deres isotopiske mønstre vises. RSD-er av alle analytter fra seks tekniske repetisjoner er innenfor 4%. Med den målte konsentrasjonen og volumet av ekstrakter kan mengden analytter beregnes. Med celletall og cellevolum, eller proteininnhold, er absolutt cellulær konsentrasjon (μM) eller mengde normalisert av proteininnhold (pmol / mg protein) vanligvis de endelige resultatene av en slik analyse.
Ifølge en tidligere studie har to grupper av divergerte HCT116-celler en variasjon av InsP 8-nivåer, HCT116UCL-celler inneholder 6 ganger høyere nivåer av InsP8 enn HCT116NIH-celler 29. Med CE-MS-metoden kan 1,5-(PP)2-InsP 4 i HCT116 NIH lett kvantifiseres (figur 3), og HCT116UCL-celler inneholder 7 ganger høyere nivåer av InsP8 enn i HCT116NIH. I tillegg er signifikant akkumulering av 1,5-(PP)2-InsP 4 i HCT116UCL-celler parallelt med en signifikant økt 1-PP-InsP5, som nå kvantitativt er vist i figur 3.
PP-InsPs nivåer øker ved å hemme deres defosforylering ved hjelp av natriumfluorid. CE-ESI-MS-analyse av NaF-behandlede HCT116NIH-celler viste -5-PP-InsP 5-høyden sammen med en reduksjon i InsP6 og et utseende på 5-PP-Ins (1,3,4,6) P 4 (figur 4). Dessuten er høyden på InsP8-nivåene merkbar, mens 1-PP-InsP5 reduseres til en viss grad. 1-PP-InsP5 er ikke helt fraværende i NaF-behandlet HCT116NIH, men stort sett enten under grensen for påvisning eller kvantifisering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig01.jpg"> Figur 1: Typiske ekstraherte ionelektroferogrammer (EIE) av inositol (pyro)fosfatstandarder i CE-ESI-MS-analyse ved bruk av den beskrevne protokollen. Konsentrasjonen av hver analytt er 2 μM. Injisert prøvevolum er ca. 10 nL med en injeksjon på 50 mbar i 10 s. Innsatser viser metabolismen av inositolpyrofosfater hos pattedyr. IPPK: inositol pentakisfosfat 2-kinase, IP6K: inositolheksakisfosfatkinase, PPIP5K: difosfoinositol pentakisfosfatkinase, DIPP1: difosfoinositolpolyfosfatfosfohydrolase 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig02.jpg"> Figur 2: Representativ InsP-profil for HCT116UCL-celler. (A) EIEs av de viktigste inositol (pyro)fosfatene i HCT116NIH og pigget SIL ISs 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4 (1), 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5 (2), 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP5 (3), 20 μM [13C 6]InsP 6 (4), og 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 (5). Innsatser viser seks tekniske gjentakelser av InsP-analyse av CE-ESI-MS, data presenteres som midler ± SD. (B) Cellulær konsentrasjon av PP-InsPs og InsPs i humane cellelinjer HCT116UCL og (C) PP-InsPs og InsPs mengde normalisert av proteininnhold. Data er midler ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig03.jpg"> Figur 3: Variasjon i InsP8-nivåer mellom to divergerte HCT116-celler. (A) EIEs av inositolpyrofosfat i HCT116 UCL og HCT116NIH. InsP8 i HCT116UCL er markant mer rikelig enn i HCT116NIH. (B) Forholdet mellom inositolpyrofosfat og InsP6 (%) i begge HCT116-cellene. HCT116UCL-celler inneholder 7 ganger høyere nivåer av InsP8 sammenlignet med i HCT116NIH, mens 5-PP-InsP5-nivåene er like. Data er midler ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig04.jpg"> Figur 4: Inositol (pyro)fosfatnivåer i HCT116NIH-celler, med NaF-behandling. (A) EIE av inositol (pyro)fosfat i HCT116NIH med natriumfluoridbehandling (NaF, 10 mM). Nivåene av inositolpyrofosfat inkludert 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5 og5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 øker ved å blokkere dephosphoryleringen ved bruk av NaF. (B) Inositol (pyro)fosfatnivåer (mengder normaliseres ved proteininnhold) i ubehandlede og NaF-behandlede HCT116NIH-celler. Data er midler ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1: CE-ESI-MS parameterinnstillinger. Kildeparameter- og iFunnel-parametere optimaliseres av Source og iFunnel Optimizer. MSM-parameterinnstillinger for inositol (pyro)fosfater optimaliseres av MassHunter Optimizer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/Table1.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 2: Teoretisk og eksperimentell regresjonsligning. Konsentrasjon av [13 C 6]5-PP-InsP 5 [13 C 6]InsP 6, og [13C 6]Ins (1, 3, 4, 5, 6)P5 er henholdsvis 4 μM, 20 μM og 20 μM. For regresjonsligning er 5-PP-InsP 5 konsentrasjon ved 0,04 μM, 0,1 μM, 0,2 μM, 0,4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM. InsP 6 og Ins (1, 3, 4, 5,6)P 5 konsentrasjonen er ved 0,2 μM, 0,5 μM, 1 μM, 2 μM,5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 120 μM. x er konsentrasjon, y er (Areal InsP)12C/(Area InsP)13C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/Table%202.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry at JoVE.com

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

En prosedyre for kapillærelektroforese elektrosprayionisering massespektrometri for absolutt kvantifisering av inositolpyrofosfater fra pattedyrcelleekstrakter er beskrevet.

Absolutt kvantifisering av inositolpyrofosfater ved kapillærelektroforese Elektrospray ionisering massespektrometri

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

Dette gir resultater av høy kvalitet for inositolfosfatmetabolismen i alle organismer vi har testet så langt. Det vil også gi innsikt i nye cellulære biosyntetiske veier som vi for tiden er klar over. Analyse av inositolfosfatmetabolismen ved CE-ESI-MS er raskere, svært følsom og i stand til å gi strukturinformasjon for inositolfosfatsamlinger.For å begynne, sett opp et kapillærelektroforese elektrosprayioniseringsmassespektrometri eller CE-ESI-MS-system som består av et kommersielt CE-system, og et trippel quadrupole tandem massespektrometer, utstyrt med en Agilent Jet Stream ESI-kilde. Deretter kobler du kappestrømmen 1:100-splitteren og det isokratiske væskekromatografipumpeutløpet, og sørger for at CE-systemets innløpshetteglass er i samme høyde som sprøytespissen på masseanalysatoren. Deretter bruker du MassHunter Workstation-versjonen eller lignende MS-programvare for å kontrollere hele systemet og datainnsamling og analyse.Etter å ha forberedt CE-løpebufferen og kappevæsken, installer kappevæsken ved å rense ved fem milliliter per minutt i fem minutter. Sett deretter strømningshastigheten til en milliliter per minutt og pumpetrykket til 180 bar. Forsikre deg om at det resirkulerte slangen kobles tilbake til kappevæskeflasken for å gjenbruke løsningsmidlet.Deretter kuttes begge ender av en CE-MS-kapillær med et roterende diamantblad med et UV-deteksjonsvindu ved hjelp av en kapillærsøyle med et UV-deteksjonsvindu. Fjern deretter to til tre centimeter polyimidbelegg i begge ender med en lighter, og rengjør kapillæroverflaten med isopropanol. For å installere kapillæren, match kapillæren i CE-MS-kassetten.Klikk deretter på Endre kassett knappen og installer kassetten i CE-enheten. For å aktivere kapillæren, skyll først kapillæren med ett molært natriumhydroksyd, etterfulgt av vann i 10 minutter, og deretter CE-løpende buffer i 15 minutter. Sett deretter kapillæren inn i CE-MS-sprøyten.Bruk et forstørrelsesglass og justeringsskruen i sprøyten til å justere kapillærutløpet nøyaktig, slik at kapillærenden stikker omtrent 0,1 millimeter ut av sprøytespissen. Kontroller stabiliteten til ESI-sprøyten under Full Scan-modus. Svingningen av totale ionelektroferogrammer bør være innenfor 5%Utfør deretter en testkjøring med inositolfosfatstandarder.Etter å ha forberedt den interne standardblandingen, bland 10 mikroliter av prøven med 0,5 mikroliter av den interne standardblandingen og et CE-prøvehetteglass. Når du bruker påfyllingssystemet, klikker du på Endre flaske-knappen. Sett den forberedte 250 milliliter CE-løpebufferen i elektrolyttflasken.Klikk deretter på Rengjør rør som holder påfyllingsnålen i et vannflaske. Angi ESI- og MS-parametrene. Optimaliser deretter kildeparametrene ved hjelp av en kildeoptimerer med en blanding av inositolpolyfosfatstandarder, og flere reaksjonsovervåkingsinnstillinger ved hjelp av MassHunter Optimizer med alle standarder.Deretter utfører du et løp for inositolfosfatekstraktene og kontrollerer resultatene. Angi en sekvens når det er flere eksempler. Etter måling, la MS være i standby-modus og ikke slå av væskekromatografipumpen.Bytt ut CE-ESI-MS sprayer med en LC-ESI-MS sprøyte når det ikke er noen skjedevæsketilførsel. For dataanalyse, åpne kvantitativ analyseprogramvare og lag en batch for alle prøver. Deretter oppretter du en ny metode fra de oppkjøpte dataene for overvåking av flere reaksjoner, og setter Carbon-13 inositolfosfater som interne standarder.Kontroller deretter oppsettet Multiple Reaction Monitoring Compound, Retention Time, interne standarder, Konsentrasjon og Qualifier. Send validering og avslutning for å bruke metoden på gjeldende bunke. Lagre metoden.Kontroller deretter om hver topp i batchen er riktig integrert. Ellers integrerer du toppen manuelt. Eksporter resultatene til et regneark, og kvantifiser inositolpyrofosfatene ved å sammenligne anolytttoppresponsen med den respektive toppresponsen til den stabile isotopen merket interne standarder med kjente konsentrasjoner.Til slutt, med den målte konsentrasjonen i inositolfosfat, ekstraktløsningen og dens volum, beregne de absolutte mengdene og ytterligere normalisere mengden ved celletall eller proteininnhold. Beregn cellekonsentrasjonen basert på celletall og gjennomsnittlig cellevolum av HCT116-celler. De ekstraherte ionelektroferogrammene av inositolpyrofosfatstandarder ved en konsentrasjon av to mikromol er vist her.Metabolisme av inositolpyrofosfater hos pattedyr med deres forenklede strukturer er satt inn. En CE-ESI-MS-kjøring av HCT116-celler fra University College London eller UCL er vist her. CE-MS ble brukt til å kvantifisere variasjon i IP8-nivåer mellom HCT116-celler fra UCL og de fra NIH.HCT116-cellene fra UCL inneholder syv ganger høyere nivåer av IP8 enn de fra NIH. Signifikant akkumulering av 1, 5-IP8 i HCT116 UCL-cellene er parallell med en betydelig økning i 1-IP7. CE-ESI-MS-analyse av natriumfluoridbehandlede HCT116-celler fra NIH viste en økning på 5-IP7, sammen med en reduksjon i IP6 og et utseende på 5-PPIP4.Selv om nivåene av 1-IP7 ble redusert til en viss grad, er det ikke helt fraværende i natriumfluoridbehandlede celler, men for det meste under deteksjonsgrensen. Det er viktig å danne en stabil CE-ESI-MS-klasse. Vi anbefaler å sjekke repeterbarheten og følsomheten til systemet før målinger.Denne teknikken gjør det mulig å gi inositolfosfatmetabolisme, implantater og vev, og gir også mulighet for nøye å studere det biologisk relevante inositolpyrofosfatet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Kapillær elektroforese-massespektrometri for Metabolsk profilering av biologiske prøver

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Kapillær elektroforese Separasjon av monoklonalt antistoff isoformer Ved hjelp av en nøytral kapillær

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal utarbeidelse av Formalin fast prøver for peptid basert Matrix assistert Laser desorpsjon/ionisering massespektrometri Imaging arbeidsflyter

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse av AtHIRD11 iboende forstyrrelse og bindende mot metall ioner av kapillær Gel gelelektroforese og affinitet kapillært geleelektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massespektrometri: En rask Ambient ionisering teknikk å vurdere direkte metabolitter fra anlegget vev

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifisering av Inositol fosfat eller Fosfoinositid samspill proteiner av affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller Mass massespektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...