Name: absolute quantitation of inositol pyrophosphates by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry
Uploaded: 2021-08-13T13:45:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry at JoVE.com

Этот проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках исследовательской и инновационной программы Европейского союза Horizon 2020 (грантовое соглашение No 864246, HJJ). DQ признает финансовую поддержку со стороны Программы Бригитты-Шлибен-Ланге. AS поддерживается грантом программы MRC MR/T028904/1.

<ol>
	<li>Stephens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection,+purification,+structural+characterization,+and+metabolism+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate(s)+and+bisdiphosphoinositol+tetrakisphosphate(s).">The detection, purification, structural characterization, and metabolism of diphosphoinositol pentakisphosphate(s) and bisdiphosphoinositol tetrakisphosphate(s).</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 4009-4015 (1993).</li><li>Menniti, F. S., Miller, R. N., Putney, J. W., Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+inositol+polyphosphate+pyrophosphates+in+pancreatoma+cells.">Turnover of inositol polyphosphate pyrophosphates in pancreatoma cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 3850-3856 (1993).</li><li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+Why+so+many+phosphates.">Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates.</a> Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).</li><li>Irvine, R. F., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+in+the+water:+the+return+of+the+inositol+phosphates.">Back in the water: the return of the inositol phosphates.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (5), 327-338 (2001).</li><li>Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+inositol+pyrophosphates+on+cellular+energy+dynamics.">Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics.</a> Science. 334 (6057), 802-805 (2011).</li><li>Wild, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+eukaryotic+phosphate+homeostasis+by+inositol+polyphosphate+sensor+domains.">Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains.</a> Science. 352 (6288), 986-990 (2016).</li><li>Chakraborty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+inhibit+Akt+signaling,+thereby+regulating+insulin+sensitivity+and+weight+gain.">Inositol pyrophosphates inhibit Akt signaling, thereby regulating insulin sensitivity and weight gain.</a> Cell. 143 (6), 897-910 (2010).</li><li>Bittner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+caged+inositol+pyrophosphate+InsP8+directly+modulates+intracellular+Ca2++oscillations+and+controls+C2AB+domain+localization.">Photolysis of caged inositol pyrophosphate InsP8 directly modulates intracellular Ca2+ oscillations and controls C2AB domain localization.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (24), (2020).</li><li>Hauke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+cell-permeant+caged+inositol+pyrophosphates+controls+oscillations+of+cytosolic+calcium+in+a+&#946;-cell+line.">Photolysis of cell-permeant caged inositol pyrophosphates controls oscillations of cytosolic calcium in a &#946;-cell line.</a> Chemical Science. 10 (9), 2687-2692 (2019).</li><li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking.">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14206-14211 (2002).</li><li>Koldobskiy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-mediated+apoptosis+requires+inositol+hexakisphosphate+kinase-2.">p53-mediated apoptosis requires inositol hexakisphosphate kinase-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (49), 20947 (2010).</li><li>Rao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+hexakisphosphate+kinase-1+mediates+assembly/disassembly+of+the+CRL4-signalosome+complex+to+regulate+DNA+repair+and+cell+death.">Inositol hexakisphosphate kinase-1 mediates assembly/disassembly of the CRL4-signalosome complex to regulate DNA repair and cell death.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16005 (2014).</li><li>Williams, S. P., Gillaspy, G. E., Perera, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+possible+functions+of+inositol+pyrophosphates+in+plants.">Biosynthesis and possible functions of inositol pyrophosphates in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 67 (2015).</li><li>Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+between+signalling+and+metabolism.">Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism.</a> The Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).</li><li>Harmel, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+13C-labeled+myo-inositol+to+interrogate+inositol+phosphate+messengers+by+NMR.">Harnessing 13C-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR.</a> Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).</li><li>Qiu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+inositol+phosphate+metabolism+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Analysis of inositol phosphate metabolism by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nature Communications. 11 (1), 6035 (2020).</li><li>Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+analysis+of+soluble+inositol+polyphosphates+from+yeast.">Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).</li><li>Wilson, M. S. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+radioactive+labelling+to+elucidate+inositol+polyphosphate+signalling.">Importance of radioactive labelling to elucidate inositol polyphosphate signalling.</a> Phosphate Labeling and Sensing in Chemical Biology. , 67-87 (2017).</li><li>Wilson, M. S. C., Bulley, S. J., Pisani, F., Irvine, R. F., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+purification+of+inositol+phosphates+from+biological+samples+reveals+that+no+phytate+is+present+in+human+plasma+or+urine.">A novel method for the purification of inositol phosphates from biological samples reveals that no phytate is present in human plasma or urine.</a> Open Biology. 5 (3), 150014 (2015).</li><li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity:+analysis+by+gel+electrophoresis.">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PloS One. 4 (5), 5580 (2009).</li><li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphate+InsP8+acts+as+an+intracellular+phosphate+signal+in+arabidopsis.">Inositol pyrophosphate InsP8 acts as an intracellular phosphate signal in arabidopsis.</a> Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).</li><li>Riemer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITPK1+is+an+InsP6/ADP+phosphotransferase+that+controls+systemic+phosphate+homeostasis+in+Arabidopsis.">ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls systemic phosphate homeostasis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Whitfield, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATP-responsive+metabolic+cassette+comprised+of+inositol+tris/tetrakisphosphate+kinase+1+(ITPK1)+and+inositol+pentakisphosphate+2-kinase+(IPK1)+buffers+diphosphosphoinositol+phosphate+levels.">An ATP-responsive metabolic cassette comprised of inositol tris/tetrakisphosphate kinase 1 (ITPK1) and inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPK1) buffers diphosphosphoinositol phosphate levels.</a> The Biochemical Journal. 477 (14), 2621-2638 (2020).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+interaction+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+quantitative+analysis+of+mammalian-derived+inositol+poly/pyrophosphates.">Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates.</a> Journal of chromatography. A. 1573, 87-97 (2018).</li><li>Mantilla, B. S., Amaral, L. D. D., Jessen, H. J., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=the+inositol+pyrophosphate+biosynthetic+pathway+of+Trypanosoma+cruzi.">the inositol pyrophosphate biosynthetic pathway of Trypanosoma cruzi.</a> ACS Chemical Biology. 16 (2), 283-292 (2021).</li><li>Wilson, M. S. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+phosphates+purification+using+titanium+dioxide+beads.">Inositol phosphates purification using titanium dioxide beads.</a> Bio-Protocol. 8 (15), 2959 (2018).</li><li>Puschmann, R., Harmel, R. K., Fiedler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+chemoenzymatic+synthesis+of+inositol+pyrophosphates.">Scalable chemoenzymatic synthesis of inositol pyrophosphates.</a> Biochemistry. 58 (38), 3927-3932 (2019).</li><li>Gu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KO+of+5-InsP7+kinase+activity+transforms+the+HCT116+colon+cancer+cell+line+into+a+hypermetabolic,+growth-inhibited+phenotype.">KO of 5-InsP7 kinase activity transforms the HCT116 colon cancer cell line into a hypermetabolic, growth-inhibited phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 11968-11973 (2017).</li><li>Gu, C., Wilson, M. S. C., Jessen, H. J., Saiardi, A., Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+Pyrophosphate+Profiling+of+Two+HCT116+Cell+Lines+Uncovers+Variation+in+InsP8+Levels.">Inositol Pyrophosphate Profiling of Two HCT116 Cell Lines Uncovers Variation in InsP8 Levels.</a> PloS One. 11 (10), 0165286 (2016).</li></ol>

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Здесь представлен практический и чувствительный метод количественного определения высокозаряженных пирофосфатов инозитола в клетках млекопитающих. Сочетая этот подход к анализу с современной экстракцией InsP с помощью хлорной кислоты с последующим обогащением TiO2, анализ CE-ESI-MS имеет беспрецедентные преимущества. Что касается его пропускной способности, чувствительности, стабильности, абсолютного количественного определения, идентификации изомеров и зависимости от матрицы, этот метод выделяется по сравнению с другими подходами. Этот протокол применим к клеткам млекопитающих, но на самом деле эта стратегия преуспевает во многих различных образцах (например, дрожжи, растения, паразиты, ткани мыши и т. Д.).
Применяемый протокол экстракции полностью восстанавливает PP-InsPs и InsP6 из экстрактов клеток млекопитающих16,19. Он также будет извлекать многие другие анионные метаболиты, особенно фосфатсодержащие виды, например, сахарные фосфаты и нуклеотиды. Оценка восстановления и декомпозиции аналитов пользователя с помощью этого протокола будет необходима.
Как правило, система CE-ESI-MS работает бесперебойно и может вместить около 200 образцов каждую неделю с использованием этого протокола. Однако, в отличие от ВЭЖХ, СЕ долгое время рассматривалась как метод для экспертов и специализированных лиц, что ограничивало ее рынок и ограничивало ее применение. Таким образом, устройство CE-ESI-MS обычно отсутствует на аналитических факультетах. Люди, которые хотят провести анализ CE-ESI-MS, вероятно, не имеют опыта CE и будут тратить больше времени на устранение неполадок. Здесь выделены важнейшие шаги. В первую очередь это качество разреза капилляров. Чувствительность и стабильность спрея ESI в основном зависят от первоклассного капиллярного разреза. Во-вторых, капиллярный выходной конец должен находиться ровно на расстоянии 0,1 мм от наконечника опрыскивателя. Игла опрыскивателя и капилляр СЕ должны находиться в осевом направлении. Качество спрея ESI имеет решающее значение для количественного определения; для оценки повторяемости следует выполнить технические прогоны. 
При описанном протоколе предел количественного определения (LOQ) для PP-InsPs составляет 40 нМ при впрыске при 50 мбар в течение 10 с (10 нЛ). Существует несколько подходов к дальнейшему повышению чувствительности метода. Во-первых, инъекция при 100 мбар в течение 20 с (40 нЛ) все равно приведет к хорошей пиковой форме и достаточному разрешению для региоизомеров 5-PP-InsP5 и 1-PP-InsP5. Во-вторых, экстракты InsP могут быть растворены в меньшем количестве воды. В-третьих, время ожидания может быть увеличено при использовании меньшего количества переходов MRM для количественного определения. Кроме того, источник ионов CE-MS, использующий поток жидкости со сверхнизкой оболочкой, значительно повысит чувствительность.
Работающий буфер CE с pH 9 обеспечивает наилучшее разрешение между InsP 6-InsP8. При повышении pH до 9,7 разрешение среди InsP 3-InsP6 значительно улучшится. Благодаря отличному разрешению для дальнейшего увеличения пропускной способности рекомендуется более короткая длина капилляра 72 см. Кроме того, более высокая температура кассеты CE при 40 °C снижает вязкость водного электрофоретического буфера и ускоряет их движение под EOF. В соответствии с различными исследовательскими требованиями модификации этого метода могут дополнительно облегчить анализ InsPs и PP-InsPs. Таким образом, описанные протоколы CE-ESI-MS могут открыть новые возможности для исследований в этом многогранном семействе сигнальных молекул.

С момента первоначального открытия пирофосфатов мио-инозитола (PP-InsPs) в 1993 году 1,2 был достигнут значительный прогресс в выяснении их биосинтеза, оборота и функций 3. Пирофосфаты инозитола повсеместно встречаются в эукариотических клетках4 и служат метаболическими сигнальными молекулами, критически участвующими, например, в фосфатном гомеостазе 5,6, чувствительности к инсулину7, колебаниях кальция 8,9, везикулярном трафике10, апоптозе11, репарации ДНК12, иммунной сигнализации13 и др. Множество важных процессов под контролем пирофосфатов инозитола требует более глубокого понимания их клеточного изобилия, флуктуации и локализации.
Хотя InsPs и PP-InsPs привлекли внимание во всех дисциплинах, анализ их количества обычно выполняется с использованием метода, разработанного в 80-х годах, состоящего из маркировки клеток тритиированным инозитолом, разрешения извлеченных PP-InsPs с помощью сильной анионообменной хроматографии Sax-HPLC с последующим подсчетом сцинтилляций. Новые методы, основанные на масс-спектрометрии, по-прежнему сталкиваются со значительными проблемами: пирофосфаты инозитола с восемью фосфатными установками содержат эфиры фосфатов и ангидриды, что приводит к значительному отрицательному заряду и потенциальным потерям фосфатов во время ионизации. Существует четыре основных типа PP-InsPs, обнаруженных у млекопитающих (рисунок 1): 1,5-(PP)2-InsP4 (или 1,5-InsP8), 5-PP-InsP5 (или 5-InsP7), 1-PP-InsP5 (или 1-InsP7) и 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 (или 5-PP-InsP4)3,14. Физиологические уровни PP-InsPs обычно находятся в нано- и низкомикромолярном диапазоне, причем 5-PP-InsP5 является наиболее распространенным с клеточными концентрациями 0,5 - 5 мкм. 1,5-(PP)2-InsP 4 и 1-PP-InsP5, как полагают, составляют до 10% пула 5-PP-InsP5 и их трудно отследить во многих клетках15. 5-PP-InsP4 со свободной группой OH еще ниже по количеству и обычно обнаруживается только тогда, когда фосфатные гидролазы ингибируются фторидом натрия (NaF)16.
Высокая плотность заряда PP-InsPs затрудняет их разделение, а появление региоизомеров PP-InsP еще больше усложняет эти усилия. В результате большинство экспериментов опирались на количественное определение метаболической радиоактивной маркировкой клеток с использованием [3H]-инозитола, так как фон из матрицы исключен и высокая чувствительность достигается17,18. Однако этот метод является дорогостоящим, трудоемким и не позволяет правильно различать родственные PP-InsP региоизомеры. Кроме того, маркировка [3H]-инозитола не учитывает эндогенный синтез инозитола из глюкозы. Метод электрофореза на основе полиакриламидного геля (PAGE) является широко применяемой недорогой альтернативой, но ограниченной по своейчувствительности 19,20,21,22. Были опубликованы другие подходы, избегающие радиомаркировки, включая ионную хроматографию, за которой следует постколоночная дериватизация УФ-детектирования23, гидрофильная хроматография взаимодействия (HILIC)24 или слабый анионный обмен (WAX) в сочетании с масс-спектрометрией (MS)25. Однако они (пока) не находятся на одном уровне с классическим протоколом [3H]-инозитол SAX-HPLC.
Недавно капиллярная электрофорезная электрораспылительная масс-спектрометрия с ионизацией (CE-ESI-MS) была введена в качестве преобразующей стратегии для анализа метаболизма InsPs и PP-InsPs, отвечающей всем требованиям, рассмотренным выше16. В сочетании с современной экстракцией InsP хлорной кислотой с последующим обогащением шариками диоксида титана26, CE-ESI-MS преуспел в каждом организме, протестированном до сих пор, от дрожжей до растений и млекопитающих. Было легко достигнуто одновременное профилирование InsPs и PP-InsPs, включая все возможные региоизомеры. Внутренние стандарты со стабильной изотопной маркировкой (SIL) позволили быстро и точно дать абсолютное количественное определение, независимо от матричного воздействия. Поскольку РС может захватывать изотопные различия масс, CE-ESI-MS также может быть применен для изучения компартментированных клеточных путей синтеза InsPs и PP-InsPs, например, путем питания клеток [13C6]-мио-инозитолом или [13C6]-D-глюкозой.
Здесь описан подробный пошаговый протокол для абсолютного количественного определения PP-InsPs и InsPs из клеток млекопитающих CE-ESI-MS. Помимо основного изомера 5-PP-InsP5, в этом исследовании также количественно определены 1,5-(PP)2-InsP4 и 1-PP-InsP5, несмотря на их более низкое содержание. Изучаются две клеточные линии HCT116 из разных лабораторий (NIH, UCL), и подтверждено, что клетки HCT116UCL содержат в 7 раз более высокие уровни 1,5-(PP)2-InsP4, чем в HCT116NIH, в то время как концентрации 5-PP-InsP5 сопоставимы. Кроме того, синтез 1-PP-InsP5 в HCT116UCL достоверно не увеличивается. Также количественно изучается повышение уровня PP-InsP путем блокирования их дефосфорилирования с использованием фторида натрия.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm tissue culture dishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>168381</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>623201</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>260836</td>
			<td>for the DC protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE fused silica capillary</td>
			<td>CS Chromatographie</td>
			<td>105180</td>
			<td>50 &#181;M i.d. 360 &#181;M o.d.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700</td>
			<td>10 mL, 1000 &#181;L, 200 &#181;L, 10 &#181;L pipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94550, 94525, 94010, 94005</td>
			<td>50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6829,0500</td>
			<td>sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1677373</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23209</td>
			<td>albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000116</td>
			<td>DC protein assay reagents package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td>high glucose, pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106, 10500064 (heat inactivated)</td>
			<td>10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.2</td>
			<td>99.95% LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH, 10%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6756.1</td>
			<td>for preparation of 3% NH4OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9216.1</td>
			<td>for preparation of 1 M perchloric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>20760.02</td>
			<td>for preparation of cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 beads</td>
			<td>GL Sciences</td>
			<td>5020-75000</td>
			<td>5 &#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>trypan blue stain (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure (Type 1) water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>ZRQSVP3WW</td>
			<td>model: Direct-Q 3 UV Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30105893</td>
			<td>model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td>model: LUNA-II Automated Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1401</td>
			<td>model: UNIVERSAL 320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge with cooling</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-1647P</td>
			<td>model: Microstar 17R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7100A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE/MS Adapter Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1603A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE/MS Sprayer Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1607A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>LUNA Cell Counting Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5305000304</td>
			<td>model: Concentrator plus complete system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESI source</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>AJS ESI</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0088</td>
			<td>model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice box</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>should provide enough space for samples, dishes, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isocratic LC system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7110B 1260 Iso Pump</td>
			<td>model: Infinity II Quaternary system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G6495C</td>
			<td>triple quadrupole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30086375</td>
			<td>model: SPARK 10 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10072332</td>
			<td>for serological pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>705884, 705880, 705878, 705872, 705870</td>
			<td>various pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>H5500</td>
			<td>model: Mini LabRoller Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shortix capillary column cutter</td>
			<td>SGT</td>
			<td>S0020</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tube shaker (vortex mixer)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HXH6.1</td>
			<td>model: Rotilabo-Mini Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tilt table</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S0600</td>
			<td>model: EDURO MiniMix Nutating Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FSGPD05</td>
			<td>model: Isotemp GPD 05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation Optimizer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Workstation Qualitative Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QQQ Quantitaion Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 10.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantitation of inositol pyrophosphates by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry

Пирофосфаты инозитола (PP-InsPs) являются важной группой внутриклеточных сигнальных молекул. Полученные из инозитолфосфатов (InsPs), эти молекулы характеризуются присутствием по меньшей мере одного энергичного пирофосфатного фрагмента на мио-инозитоловом кольце. Они повсеместно существуют у эукариот и действуют как метаболические мессенджеры, исследующие фосфатный гомеостаз, чувствительность к инсулину и заряд клеточной энергии. Из-за отсутствия хромофора в этих метаболитах, очень высокой плотности заряда и низкой численности, их анализ требует радиоактивного индикатора, а значит, он запутанный и дорогой. Здесь в исследовании представлен подробный протокол для выполнения абсолютного и высокопроизводительного количественного определения пирофосфатов инозитола из клеток млекопитающих с помощью масс-спектрометрии капиллярного электрофореза с электрораспылением ионизации (CE-ESI-MS). Этот метод позволяет проводить чувствительное профилирование всех биологически значимых видов PP-InsPs в клетках млекопитающих, что позволяет проводить базовое разделение региоизомеров. Представлены абсолютные клеточные концентрации PP-InsPs, включая второстепенные изомеры, и мониторинг их временных изменений в клетках HCT116 в нескольких экспериментальных условиях.

Результаты, показанные здесь, призваны проиллюстрировать потенциал анализа CE-ESI-MS. Приведенные цифры описывают технически безупречный запуск CE-ESI-MS. Во-первых, представлена смесь стандартов пирофосфата инозитола (рисунок 1) и экстракта клеток млекопитающих (рисунок 2). Во-вторых, приведено сравнение двух клеточных линий HCT116 (рисунок 3) и клеток HCT116, обработанных NaF (рисунок 4).
Экстрагированные ионные электроферограммы (EEI) инозитоловых (пиро)фосфатных эталонов в концентрации 2 мкМ показаны на фиг.1. Вставлен метаболизм пирофосфатов инозитола у млекопитающих с их упрощенной структурой. Четыре инозитолпирофосфата у млекопитающих, 1,5-(PP)2-InsP4, 5-PP-InsP5, 1-PP-InsP5 и 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 хорошо различаются с использованием описанного способа. Запуск CE-ESI-MS HCT116UCL показан на рисунке 2. С помощью внутренних стандартов, меченных стабильными изотопами (SIL), абсолютное количественное определение может быть легко достигнуто путем сравнения отклика сигнала с шипованным SIL известной концентрации. Показаны интегрированные EEI инозитолфосфата от InsP5 до (PP)2-InsP4 и неинтегрированные EEI их изотопных паттернов. RSD всех аналитов из шести технических повторов находятся в пределах 4%. С измеренной концентрацией и объемом экстрактов можно рассчитать количество аналитов. С количеством клеток и объемом клеток или содержанием белка, абсолютная клеточная концентрация (мкМ) или количество, нормализованное содержанием белка (белок пмоль / мг), обычно являются окончательными результатами такого анализа.
Согласно более раннему исследованию, две партии расходящихся клеток HCT116 имеют вариацию уровней InsP8, клетки HCT116UCL содержат в 6 раз более высокие уровни InsP8, чем HCT116NIH клетки29. С помощью метода CE-MS 1,5-(PP)2-InsP4 в HCT116NIH может быть легко количественно определен (рисунок 3), а клетки HCT116UCL содержат в 7 раз более высокие уровни InsP8, чем в HCT116NIH. Кроме того, значительное накопление 1,5-(PP)2-InsP4 в клетках HCT116UCL сопровождается значительно увеличенным 1-PP-InsP5, что теперь количественно показано на рисунке 3.
Уровни PP-InsPs увеличиваются за счет ингибирования их дефосфорилирования с использованием фторида натрия. Анализ CE-ESI-MS клеток HCT116NIH , обработанных NaF, продемонстрировал повышение -5-PP-InsP5 наряду со снижением InsP6 и появлением 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 (Рисунок 4). Кроме того, заметно повышение уровней InsP8 , в то время как 1-PP-InsP5 в некоторой степени снижается. 1-PP-InsP5 не полностью отсутствует в HCT116NIH, обработанном NaF, но в основном либо под пределом обнаружения, либо количественного определения.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig01.jpg"> Рисунок 1: Типичные экстрагированные ионные электроферограммы (EEI) стандартов инозитол (пиро)фосфатов в анализе CE-ESI-MS с использованием описанного протокола. Концентрация каждого анализируемого вещества составляет 2 мкМ. Объем вводимого образца составляет около 10 нл с инъекцией при 50 мбар в течение 10 с. Вставки показывают метаболизм пирофосфатов инозитола у млекопитающих. IPPK: инозитол пентакисфосфат 2-киназа, IP6K: инозитолгексакисфосфаткиназа, PPIP5K: дифосфоинозитол пентакисфосфаткиназа, DIPP1: дифосфоинозитолполифосфатфосфогидролаза 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig02.jpg"> Рисунок 2: Репрезентативный профиль InsP клеток HCT116UCL. (A) EEI основных инозитоловых (пиро)фосфатов в HCT116NIH и шипованных SIL ISs 2 мкМ [13C6]1,5-(PP)2-InsP4 (1), 4 мкМ [13C6]5-PP-InsP5 (2), 4 мкМ [13C6]1-PP-InsP5 (3), 20 мкМ [13C6]InsP6 (4), и 20 мкМ [13С6]Ins(1,3,4,5,6)P5 (5). Вкладыши показывают шесть технических повторов анализа InsP методом CE-ESI-MS, данные представлены в виде средств ± SD. (B) Клеточная концентрация PP-InsPs и InsPs в клеточных линиях человека HCT116UCL и (C) PP-InsPs и InsPs, нормализованная содержанием белка. Данные являются средствами, ± SEM из трех независимых экспериментов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig03.jpg"> Рисунок 3: Изменение уровней InsP8 между двумя расходящимися ячейками HCT116. (А) EEI инозитолпирофосфата вHCT116UCL и HCT116NIH. InsP8 в HCT116UCL заметно более распространен, чем в HCT116NIH. (B) Отношение пирофосфата инозитола к InsP6 (%) в обеих клетках HCT116. Клетки HCT116UCL содержат в 7 раз более высокие уровни InsP8 по сравнению с HCT116NIH, в то время как уровни 5-PP-InsP5 равны. Данные являются средствами, ± SEM из трех независимых экспериментов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig04.jpg"> Рисунок 4: Уровни инозитол (пиро)фосфатов в клетках HCT116NIH при обработке NaF. (A) EEI инозитол (пиро)фосфата в HCT116NIH с обработкой фторидом натрия (NaF, 10 мМ). Уровни инозитолпирофосфата, включая 1,5-(PP)2-InsP4, 5-PP-InsP5 и 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4, увеличиваются за счет блокирования их дефосфорилирования с помощью NaF. (B) Уровни инозитол(пиро)фосфата (количества нормируются содержанием белка) в необработанных и обработанных NaF клетках HCT116NIH. Данные являются средствами, ± SEM из трех независимых экспериментов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Таблица 1: Настройки параметров CE-ESI-MS. Параметры Source и iFunnel оптимизированы с помощью Source и iFunnel Optimizer. Настройки параметров MSM для инозитоловых (пиро)фосфатов оптимизированы MassHunter Optimizer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/Table1.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Таблица 2: Теоретическое и экспериментальное уравнение регрессии. Концентрация [13C6]5-PP-InsP5 [13C6]InsP6 и [13C6]Ins (1, 3, 4, 5, 6)P5 составляет 4 мкМ, 20 мкМ и 20 мкМ соответственно. Для уравнения регрессии концентрация 5-PP-InsP5 составляет 0,04 мкМ, 0,1 мкМ, 0,2 мкМ, 0,4 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 4 мкМ, 8 мкМ, 16 мкМ, 24 мкМ. InsP6 и Ins (1, 3, 4, 5, 6)P5 концентрация составляет 0,2 мкМ, 0,5 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 20 мкМ, 40 мкМ, 80 мкМ, 120 мкМ. x - концентрация, y - (Площадь InsP)12C/(Область InsP)13C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/Table%202.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry at JoVE.com

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Описана процедура электрораспылительной ионизационной масс-спектрометрии капиллярного электрофореза для абсолютного количественного определения пирофосфатов инозитола из экстрактов клеток млекопитающих.

Абсолютное количественное определение пирофосфатов инозитола методом масс-спектрометрии капиллярного электрофореза Электрораспылительная ионизация масс-спектрометрии

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

Это обеспечивает высококачественные результаты метаболизма инозитолфосфата во всех организмах, которые мы тестировали до сих пор. Это также даст представление о новом клеточном биосинтетическом пути, о котором мы в настоящее время знаем. Анализ метаболизма инозитолфосфата с помощью CE-ESI-MS является более быстрым, высокочувствительным и способным обеспечить структурную информацию для сборок инозитолфосфата.Для начала настройте масс-спектрометрию капиллярного электрофореза electrospray Ionization Mass Spectrometry или CE-ESI-MS, состоящую из коммерческой системы CE и тройного квадрупольного тандемного масс-спектрометра, оснащенного источником Agilent Jet Stream ESI. Затем соедините разветвитель потока оболочки 1:100 и выходное отверстие изократического жидкостного хроматографического насоса и убедитесь, что входной флакон системы CE находится на той же высоте, что и наконечник опрыскивателя анализатора массы. Затем используйте версию MassHunter Workstation или аналогичное программное обеспечение MS для управления всей системой, а также сбора и анализа данных.После подготовки рабочего буфера CE и оболочки жидкости установите жидкость оболочки, продувая со скоростью пять миллилитров в минуту в течение пяти минут. Затем установите расход на один миллилитр в минуту, а давление насоса на 180 бар. Убедитесь, что переработанная трубка подключается обратно к жидкому баллону оболочки для повторного использования растворителя.Далее, используя капиллярный колонкорез с вращающимся алмазным лезвием, правильно вырежьте оба конца капилляра CE-MS с помощью окна обнаружения ультрафиолета. Затем снимите два-три сантиметра полиимидного покрытия с обоих концов зажигалкой, а поверхность капилляров очистите изопропанолом. Чтобы установить капилляр, сопоставьте капилляр с кассетой CE-MS.Затем нажмите кнопку «Изменить кассету» и установите кассету в устройство CE. Чтобы активировать капилляр, сначала промывайте капилляр одним молярным гидроксидом натрия, затем водой в течение 10 минут, а затем СЕ работает буфер в течение 15 минут. Затем вставьте капилляр в распылитель CE-MS.Используя увеличительное стекло и регулировочный шнек в опрыскивателе, точно отрегулируйте капиллярное отверстие, гарантируя, что капиллярный конец выступает примерно на 0,1 миллиметра из наконечника опрыскивателя. Проверьте стабильность опрыскивателя ESI в режиме полной проверки. Флуктуация суммарных ионных электроферограмм должна быть в пределах 5%, после чего выполняют тестовый прогон со стандартами инозитолфосфата.После приготовления внутренней эталонной смеси смешайте 10 микролитров образца с 0,5 микролитрами внутренней эталонной смеси и флаконом образца CE. При использовании системы пополнения нажмите на кнопку Изменить бутылку. Поместите подготовленные 250 миллилитров рабочего буфера CE в бутылку с электролитом.Затем нажмите «Чистые трубки», сохраняя иглу пополнения в флаконе с водой. Задайте параметры ESI и MS. Затем оптимизируйте параметры источника с помощью оптимизатора источника со смесью стандартов инозитолполифосфата и нескольких настроек мониторинга реакций с помощью MassHunter Optimizer со всеми стандартами.Затем выполните пробежку для экстрактов инозитолфосфата и проверьте результаты. Задайте последовательность при наличии большего количества образцов. После измерения пусть MS находится в режиме ожидания и не выключайте жидкостный хроматографический насос.Замените опрыскиватель CE-ESI-MS опрыскивателем LC-ESI-MS при отсутствии подачи жидкости в оболочку. Для анализа данных откройте программное обеспечение количественного анализа и создайте пакет для всех образцов. Затем создайте новый метод из полученных данных мониторинга множественных реакций и установите фосфаты инозитола углерода-13 в качестве внутренних стандартов.Затем проверьте состав для мониторинга нескольких реакций, время удержания, внутренние стандарты, настройку концентрации и квалификатора. Передайте validation и Exit, чтобы применить метод к текущему пакету. Сохраните метод.Затем проверьте, правильно ли интегрирован каждый пик в пакете. В противном случае вручную интегрируйте пик. Экспортируйте результаты в электронную таблицу и количественно оцените пирофосфаты инозитола, сравнив пиковый отклик анолита с соответствующим пиковым откликом стабильного изотопа, помеченного внутренними стандартами с известными концентрациями.Наконец, с измеренной концентрацией в инозитолфосфате, экстракционным раствором и его объемом, рассчитывают абсолютные количества и дополнительно нормализуют количество по количеству клеток или содержанию белка. Рассчитайте клеточную концентрацию на основе количества клеток и среднего объема клеток HCT116. Здесь показаны экстрагированные ионные электроферограммы эталонов инозитолпирофосфата в концентрации двух микромолей.Вставлен метаболизм пирофосфатов инозитола у млекопитающих с их упрощенной структурой. Здесь показан запуск CE-ESI-MS клеток HCT116 из Университетского колледжа Лондона или UCL. CE-MS использовался для количественной оценки вариаций уровней IP8 между клетками HCT116 из UCL и клетками NIH.Клетки HCT116 из UCL содержат в семь раз более высокие уровни IP8, чем у NIH. Значительное накопление 1, 5-IP8 в ячейках HCT116 UCL сопровождается значительным увеличением 1-IP7. Анализ CE-ESI-MS клеток HCT116, обработанных фторидом натрия, из NIH продемонстрировал повышение уровня 5-IP7, а также снижение IP6 и появление 5-PPIP4.Хотя уровни 1-IP7 снизились до некоторой степени, он не полностью отсутствует в клетках, обработанных фторидом натрия, но в основном под пределом обнаружения. Важно сформировать стабильный класс CE-ESI-MS. Мы рекомендуем проверить повторяемость и чувствительность системы перед измерениями.Данная методика позволяет обеспечить метаболизм инозитолфосфата, имплантатов и тканей, а также дает возможность для тщательного изучения биологически значимого инозитолпирофосфата.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Без футляра Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрии для Метаболический Профилирование биологических образцов

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Капиллярный электрофорез Разделение моноклональных антител изоформ с нейтральным капилляра

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Оптимальная подготовка формалин фиксированной образцы для пептида основан матрицу помогает лазерная десорбция/ионизации масс-спектрометрия визуализации рабочих процессов

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Анализ AtHIRD11 внутренние беспорядки и привязки к ионов металлов Капиллярный электрофорез и близость капиллярного электрофореза

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Масс-спектрометрия спрей лист: Быстрое окружающего ионизации техника непосредственно оценить метаболитов из растительных тканей

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Идентификация фосфата инозитола или фосфонинозидных взаимодействующих белков по хроматографии Affinity в сочетании с Западной погреловой или масс-спектрометрией

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...