Name: bioluminescent optogenetics 2.0: harnessing bioluminescence to activate photosensory proteins in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-08-04T14:30:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo at JoVE.com

نشكر زملائنا على الإنشاءات ، وتحديدا A. Ting ل Ca-FLARE protease ، وعامل النسخ والمراسل (Addgene # 92214 ، 92213 ، 92202) ، H. Kwon ل TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 و NES-CRY2PHR-TevC (Addgene # 89878 ، 89877) ، C. Tucker ل CRY-GalΔDD (B1013) و CIB-VP64 (B1016) (Addgene # 92035 ، 92037) ، M. Walsh ل pGL2-GAL4-UAS-Luc (Addgene # 33020) ، K. Gardner ل VP-EL222 و C120-Fluc ، و A. Cetin و H. Zeng لجعل iCreV متاحا قبل النشر. تم دعم هذا العمل من خلال منح من NSF (NeuroNex 1707352) ، و NIH (U01NS099709) ، ومؤسسة W.M. Keck ، ومجلس البحوث السويدي إلى A.B. (2016-06760).

تم تنفيذ جميع الإجراءات في الدراسة الحالية باستخدام بروتوكولات معتمدة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) للتعامل مع الحيوانات في جامعة ميشيغان المركزية ، ميشيغان.
1. تنشيط التلألؤ الحيوي للبروتينات الحسية الضوئية في المختبر
<ol><li>نيات<ol>
<li>حدد تسلسل لوسيفيراز أو تسلسل اندماج بروتين لوسيفيراز فلورسنت الذي سيؤدي إلى التعبير عن باعث ضوء ينتج ضوءا بطول موجي يطابق المستقبل الضوئي المراد تنشيطه. ملاحظة: على سبيل المثال، يمكن إقران اللوسيفيراز الباعث للضوء الأزرق، مثل متغيرات غاوسيا لوسيفيراز أو نانولوك، بمستقبلات ضوئية مستشعرة للضوء الأزرق مثل CRY/Ca2+- وبروتين إنتغرين المرتبط (CIB) أو لوف أو فيفيد (VVD).</li>
		<li>إذا لم تكن متاحة بالفعل من باحثين آخرين أو رواسب البلازميد ، فاستخدم تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية لاستنساخ الحمض النووي إلى بلازميد تعبير الثدييات. ملاحظة: إن اختيار المروجين تمليه الحاجة إلى توفير تعبير قوي وتأسيسي عن الوحدة الباعثة للضوء، مثل تلك التي يقدمها مروجو CAG وCMV.</li>
		<li>بالنسبة للدراسات الأولية ، استخدم بلازميدات منفصلة للنقل المشترك لباعث الضوء ومستشعر الضوء. توليد بروتينات الانصهار من اثنين من moieties حسب الحاجة وللدراسات اللاحقة.</li>
		<li>احصل على الحمض النووي البلازميد عالي الجودة باستخدام مجموعات صغيرة أو متوسطة أو ماكسيبريب وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.</li>
	</ol></li>
	<li>زراعة الخلايا ونقلها ملاحظة: يتم استخدام خلايا HeLa وخلايا HEK293 كأمثلة في هذا البروتوكول.<ol>
<li>خلايا اللوحة في أشكال وأرقام وفقا للاستخدام النهائي المطلوب. ملاحظة: ترد أمثلة محددة في الجدول 2. ستحدد كثافة الخلايا في وقت الطلاء متى يمكن نقل الخلايا.<ol>
<li>لتقييم النسخ المنشط بالتلألؤ الحيوي بواسطة المجهر الفلوري ، قم بلوحة خلايا HEK293 على أغطية 12 مم مغلفة بالبولي دي ليسين (PDL) موضوعة في 24 طبقا جيدا.</li>
			<li>لتقييم النسخ المنشط بالتلألؤ الحيوي عن طريق قياس انبعاث الضوء من مراسل متعامد luciferase في مقياس اللمعان ، قم بلوحة خلايا HeLa في البداية في أطباق 6 أو 12 بئرا للنقل ولكن أعد طبقها بعد النقل (انظر الخطوة 4).</li>
			<li>إذا تم إجراء تحفيز التلألؤ الحيوي المتكرر في غرف تصوير الخلايا الحية ، فحدد أغطية من الحجم المناسب وضعها في ألواح متعددة الآبار ذات الحجم المناسب (لوحات 24 بئرا لأغطية 12 مم ؛ لوحات 12 بئر ل 15 مم و 18 مم). زرع الخلايا الموجودة أعلى الأغطية باستخدام أرقام الخلايا المحددة في الجدول 2. إذا كان نوع الخلية المحدد لا يلتصق جيدا بسطح المزرعة ، فقم بلوحة الخلايا على أطباق مغلفة ب PDL.</li>
		</ol>
</li>
		<li>قم بإجراء النقل عن طريق lipofection وفقا لتوصية الشركة المصنعة أو استخدم أي طريقة نقل مناسبة لنوع الخلية المحدد. ملاحظة: يفصل الجدول 3 تجارب النقل لمستقبلين ضوئيين مختلفين، هما EL222 وCRY2/CIB، والبلازميدات المراسلة الخاصة بكل منهما، بالإضافة إلى البروتينات المختلفة الباعثة للضوء. تعمل نسب البلازميدات المختلفة بشكل جيد مع الأمثلة المختارة ولكن يجب تحسينها لكل زوج من مستشعرات باعث الضوء / الضوء.</li>
		<li>بعد النقل ، ضع الخلايا في حاضنة محكمة الإغلاق تماما (الشكل 1).</li>
		<li>اعتمادا على الاستخدام النهائي المطلوب ، استخدم الخلايا لتحفيز التلألؤ الحيوي في اليوم التالي في آبارها / أطباقها الأصلية ، أو أعد طبقها بعد 3-4 ساعات من التفتيت الدهني. لقراءة نسخ جين مراسل لوسيفيراز اليراع في مقياس اللمعان، أعد طلاء الخلايا في صفائح بيضاء من 96 بئرا. ملاحظة: نفذ جميع عمليات التلاعب في غرفة محكمة الإغلاق في غطاء محرك أقراص مضاء بالضوء الأحمر (الشكل 2).<ol>
<li>اغسل الخلايا المنقولة مرة واحدة باستخدام وسيط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) أو الملح المخزن بالفوسفات (PBS).</li>
			<li>أضف الحد الأدنى لحجم كاشف التربسينات إلى الآبار (24 بئرا: 100 ميكرولتر ؛ 12 بئرا: 150 ميكرولتر ؛ 6 بئر: 300 ميكرولتر) واحتضن الخلايا لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.</li>
			<li>أضف وسط الاستزراع لتحقيق تركيز الخلية الذي سيؤدي إلى كثافة الخلية المناسبة لخطوة الطلاء التالية (على سبيل المثال ، إعادة تعليق الخلايا في 24 بئرا في حجم نهائي يبلغ 1.2 مل للطلاء في 10 آبار من صفيحة 96 بئرا ؛ إعادة تعليق الخلايا في 12 بئرا في حجم نهائي من 2.4 مل للطلاء في 20 بئرا من صفيحة 96 بئرا). تجميع الخلايا المنقولة من عدة آبار اعتمادا على عدد الآبار اللازمة في النهاية.</li>
			<li>قم بلوحة الخلايا المنقولة في شكلها النهائي وأعد الألواح إلى الحاضنة المحمية بالضوء.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>تنشيط التلألؤ الحيوي in vitro
	<ol><li>تحضير الركيزة luciferase (luciferin).<ol>
<li>تحضير مخزون 50 mM عن طريق إذابة 5 ملغ من coelenterazine المجفف بالتجميد (CTZ) في 250 ميكرولتر من المذيب المحدد. تأكد من إذابة جميع CTZ على طول جدران القارورة عن طريق السحب أو الدوامة. حماية القارورة من الضوء المباشر.</li>
			<li>قم بإعداد 50 ميكرولتر من الأليكوت في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة السوداء سعة 0.5 مل وتخزينها عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. ملاحظة: CTZ المذاب في المذيب لا يتجمد عند -80 درجة مئوية. يمكن إزالة Aliquots من الفريزر وإعادته إليه عدة مرات لصنع حلول العمل طالما تم الحفاظ على التعرض للضوء ودرجة حرارة الغرفة إلى الحد الأدنى.</li>
		</ol></li>
		<li>تحفيز ضوء التلألؤ الحيوي الفردي ملاحظة: يتم تنفيذ جميع عمليات التلاعب في غرفة محكمة الإغلاق في غطاء محرك أقراص مضاء بالضوء الأحمر (الشكل 2).<ol>
<li>إعداد حل عملي من لوسيفيرين في وسط زراعة الخلايا (DMEM أو NeuroBasal). اضبط تركيز اللوسيفيرين بحيث يكون التركيز النهائي 100 ميكرومتر. قم بإعداد جميع تخفيفات CTZ في الوسط قبل وقت قصير من إضافتها إلى الخلايا ، حيث يتأكسد CTZ بمرور الوقت. ملاحظة: إذا تم استبدال الحجم الكامل للوسيط ، فسيكون حل العمل 100 ميكرومتر. إذا تمت إضافة وسط يحتوي على لوسيفيرين إلى الخلايا ، فسيكون التركيز أعلى بواسطة عامل التخفيف (على سبيل المثال ، إضافة 50 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على 300 ميكرومتر لوسيفيرين إلى 100 ميكرولتر من الوسط في البئر سيؤدي إلى تخفيف 1: 3 وبالتالي إلى تركيز نهائي 100 ميكرومتر من لوسيفيرين).</li>
			<li>أضف وسطا يحتوي على لوسيفيرين إلى الخلايا واحتضنه طوال المدة المطلوبة من التحفيز الخفيف. ملاحظة: يمكن أن يكون هذا قصيرا مثل 1 دقيقة أو طويلا يصل إلى 15 دقيقة وقد يكون أقصر أو أطول. يعتمد طول الوقت اللازم لترك الوسط المحتوي على لوسيفيرين على الخلايا على عمر النصف والحركية لمجموعة لوسيفيراز - لوسيفيرين المختارة.</li>
			<li>مراقبة انبعاث الضوء عند تركيز لوسيفيرين النهائي 100 ميكرومتر بالعين بعد إيقاف تشغيل الضوء الأحمر ؛ انتظر لبضع ثوان حتى تتكيف العيون مع الظلام الدامس. قم بتوثيق انبعاث الضوء عن طريق التقاط صورة فوتوغرافية (حتى باستخدام الهاتف الخلوي).</li>
			<li>إنهاء التحفيز الضوئي عن طريق إزالة الوسط المحتوي على لوسيفيرين واستبداله بوسط الثقافة. اعتمادا على حساسية التجارب ، اغسل الخلايا بوسط الثقافة مرة أو مرتين بعد إزالة الوسط المحتوي على لوسيفيرين للقضاء على جميع لوسيفيرين. إذا لم تلتصق الخلايا جيدا بسطح المزرعة ، فقم بوضعها على أطباق مغلفة ب PDL لتجنب فقدان الخلايا أثناء الغسيل.</li>
			<li>أعد الخلايا إلى الحاضنة المحمية بالضوء لمدة 16-24 ساعة.</li>
		</ol></li>
		<li>التحفيز المتكرر لضوء التلألؤ الحيوي ملاحظة: يتم تنفيذ جميع عمليات التلاعب في غرفة يمكن جعلها محكمة الإغلاق ومضاءة بالضوء الأحمر.<ol>
<li>قم بإعداد غرفة تصوير الخلايا الحية. قم بإنشاء حجرة محكمة الإغلاق حول مجهر تصوير الخلايا الحية باستخدام صندوق وصفائح بلاستيكية سوداء أو ستائر سوداء (الشكل 3). قم بتغطية جميع مصادر الضوء الموجودة داخل المقصورة الضيقة للضوء والغرفة (على سبيل المثال ، مؤشرات LED على المجهر أو الأدوات).</li>
			<li>قم بإعداد نظام التروية مع الحل المطلوب للسحب والمنفذ الخارجي للغرفة مما يؤدي إلى حاوية نفايات. ملاحظة: على سبيل المثال ، يمكن أن يكون محلول التصوير هو محلول Tyrode (كلوريد الصوديوم (124 mM) ، كلوريد البوتاسيوم (3 mM) ، HEPES (10 mM) ، ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (2 mM) ، سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم (1 mM) ، D-glucose (20 mM)).</li>
			<li>إعداد حل عملي من luciferin في محلول التصوير. Aliquot في العديد من أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة مثل عدد المحفزات المتكررة. اضبط تركيز لوسيفيرين بحيث يكون التركيز النهائي في غرفة التصوير 100 ميكرومتر.</li>
			<li>ضع غطاء مع خلايا منقولة في الغرفة.</li>
			<li>أثناء الحفاظ على تشغيل المضخة ، قم بإزالة أنبوب مدخل المضخة من كوب السحب واغمره بسرعة في محلول luciferin ، مع الحفاظ على وقت الانتقال قصيرا قدر الإمكان لتجنب أي فراغ هوائي في الأنابيب.</li>
			<li>بمجرد تناول محلول luciferin ، ضع أنبوب المدخل مرة أخرى في كوب السحب. كرر هذه العملية عدة مرات حسب الحاجة وعلى فترات من عدة دقائق إلى ساعات ، اعتمادا على النمط الفسيولوجي الذي من المفترض أن تتعرض له الخلايا.</li>
			<li>أعد الخلايا إلى الحاضنة المحمية بالضوء لمدة 16-24 ساعة للنسخ ، أو لطول الفترة الزمنية التي يتم فيها تقييم تأثير التحفيز الضوئي.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. تنشيط التلألؤ الحيوي للبروتينات الحسية الضوئية في الجسم الحي
<ol><li>نيات<ol>
<li>حدد تسلسل لوسيفيراز أو تسلسل اندماج بروتين لوسيفيراز فلورسنت الذي سيؤدي إلى التعبير عن باعث ضوء ينتج ضوءا بطول موجي يطابق المستقبل الضوئي المراد تنشيطه.</li>
		<li>استخدم تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية لاستنساخ الحمض النووي إلى بلازميد pAAV ، إن لم يكن متاحا بالفعل من باحثين آخرين أو رواسب البلازميد.</li>
		<li>اختر المروجين الأقوياء للتعبير عن الوحدات الباعثة للضوء، مثل CAG أو CMV.</li>
		<li>استخدام النهج القياسية لإعداد المخزونات الفيروسية عالية العيار6 أو إعداد النواقل الفيروسية تجاريا.</li>
		<li>بالنسبة للدراسات الأولية ، استخدم ناقلات فيروسية منفصلة للنقل المشترك لباعث الضوء ومستشعر الضوء للسماح بتعديل نسب المكونات المختلفة إذا لزم الأمر.</li>
	</ol>
</li>
	<li>نقل AAV<ol>
<li>حقن العضو المستهدف لحيوان التجارب بناقلات فيروسية لباعث الضوء ومستشعر الضوء والمراسل مماثلة لنسب التركيز المستخدمة في عمليات النقل في المختبر (الجدول 3).</li>
		<li>إعادة الحيوانات إلى أقفاصها المنزلية لمدة 2 أسابيع على الأقل للسماح بالتعبير الأقصى لجميع المكونات. ملاحظة: إذا كان العضو المستهدف داخل الجسم ومحميا من الضوء المحيط ، فيمكن إيواء الحيوانات في ظروف الإضاءة العادية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تنشيط التلألؤ الحيوي في الجسم الحي
	<ol>
<li>تحضير الركيزة luciferase (luciferin).<ol>
<li>أخرج قارورة من CTZ القابلة للذوبان في الماء من الفريزر -80 درجة مئوية واتركها دافئة إلى درجة حرارة الغرفة. احتفظ به محميا من الضوء.</li>
			<li>لكل قارورة 500 ميكروغرام ، أضف 250 ميكرولتر من الماء المعقم ، إما باستخدام حقنة أو عن طريق فتح القارورة وإضافة الماء باستخدام ماصة ، ثم وضع السدادة المطاطية مرة أخرى على القارورة الزجاجية.</li>
			<li>احتضن القارورة الزجاجية المعاد تشكيلها في حمام مائي 55 درجة مئوية لبضع دقائق لإذابة المسحوق تماما.</li>
			<li>انقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي أسود أسود. شطف جدران القارورة الزجاجية لاسترداد جميع CTZ.</li>
			<li>قم بإزالة كمية المحلول اللازمة لهذا اليوم. قم بتخزين المحلول المتبقي على درجة حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام في اليوم التالي. لا تجمد!</li>
			<li>نفذ نفس الخطوات (2.3.1.1.-2.3.1.5) لقارورة السيارة.</li>
		</ol>
</li>
		<li>تحفيز ضوء التلألؤ الحيوي<ol>
<li>إزالة حجم لوسيفيرين / السيارة اللازمة لحجم الحيوان ومسار التطبيق المختار (الجدول 4).</li>
			<li>حقن الحيوانات مع لوسيفيرين أو السيارة. كرر تحفيز ضوء التلألؤ الحيوي وفقا للتصميم التجريبي. على سبيل المثال ، إذا كان تنشيط recombinase مطلوبا خلال نموذج سلوكي معين ، فقم بحقن الحيوانات قبل الاختبار السلوكي مباشرة. إذا كان النسخ التدريجي للجزيء هو الهدف ، فقم بحقن الحيوانات مرارا وتكرارا على مدار أيام.</li>
			<li>جمع البيانات من الحيوانات التي تحفز التلألؤ الحيوي كما هو مصمم.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+limits+of+developmental+Erk+signaling.">The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling.</a> Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of Biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+BRET-based+optogenetic+device+for+pulsatile+transgene+expression+enabling+glucose+homeostasis+in+mice.">A synthetic BRET-based optogenetic device for pulsatile transgene expression enabling glucose homeostasis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 615 (2021).</li><li>Berglund, K., Birkner, E., Augustine, G. J., Hochgeschwender, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+channelrhodopsins+for+combined+optogenetic+and+chemical-genetic+control+of+neurons.">Light-emitting channelrhodopsins for combined optogenetic and chemical-genetic control of neurons.</a> PLoS One. 8 (3), 59759 (2013).</li><li>Tung, J. K., Gutekunst, C. -. A., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+luminopsins:+genetically-encoded+bioluminescent+opsins+for+versatile,+scalable,+and+hardware-independent+optogenetic+inhibition.">Inhibitory luminopsins: genetically-encoded bioluminescent opsins for versatile, scalable, and hardware-independent optogenetic inhibition.</a> Scientific Reports. 5, 14366 (2015).</li><li>Berglund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminopsins+integrate+opto-+and+chemogenetics+by+using+physical+and+biological+light+sources+for+opsin+activation.">Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (3), 358-367 (2016).</li><li>Gomez-Ramirez, M., More, A. I., Friedman, N. G., Hochgeschwender, U., Moore, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BioLuminescent-OptoGenetic+in+vivo+response+to+coelenterazine+is+proportional,+sensitive+and+specific+in+neocortex.">The BioLuminescent-OptoGenetic in vivo response to coelenterazine is proportional, sensitive and specific in neocortex.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 471-480 (2020).</li><li>Moore, C. I., Berglund, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BL-OG:+BioLuminescent-OptoGenetics.">BL-OG: BioLuminescent-OptoGenetics.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 469-470 (2020).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+luciferase-opsin+combinations+for+improved+luminopsins.">Novel luciferase-opsin combinations for improved luminopsins.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 410-421 (2020).</li><li>Jaiswal, P. B., Tung, J. K., Gross, R. E., English, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motoneuron+activity+is+required+for+enhancements+in+functional+recovery+after+peripheral+nerve+injury+in+exercised+female+mice.">Motoneuron activity is required for enhancements in functional recovery after peripheral nerve injury in exercised female mice.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 448-457 (2020).</li><li>Zenchak, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence-driven+optogenetic+activation+of+transplanted+neural+precursor+cells+improves+motor+deficits+in+a+Parkinson's+disease+mouse+model.">Bioluminescence-driven optogenetic activation of transplanted neural precursor cells improves motor deficits in a Parkinson's disease mouse model.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 458-468 (2020).</li><li>Tung, J. K., Shiu, F. H., Ding, K., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+activated+luminopsins+allow+optogenetic+inhibition+of+distributed+nodes+in+an+epileptic+network+for+non-invasive+and+multi-site+suppression+of+seizure+activity.">Chemically activated luminopsins allow optogenetic inhibition of distributed nodes in an epileptic network for non-invasive and multi-site suppression of seizure activity.</a> Neurobiology of Disease. 109, 1-10 (2018).</li><li>Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algal+sensory+photoreceptors.">Algal sensory photoreceptors.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 167-189 (2008).</li><li>Losi, A., Gardner, K. H., Moglich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-light+receptors+for+optogenetics.">Blue-light receptors for optogenetics.</a> Chemical Reviews. 118 (21), 10659-10709 (2018).</li><li>Proshkina, G. M., Shramova, E. I., Shilova, O. N., Ryabova, A. V., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+of+flavoprotein+miniSOG+induced+by+bioluminescence+resonance+energy+transfer+in+genetically+encoded+system+NanoLuc-miniSOG+is+comparable+with+its+LED-excited+phototoxicity.">Phototoxicity of flavoprotein miniSOG induced by bioluminescence resonance energy transfer in genetically encoded system NanoLuc-miniSOG is comparable with its LED-excited phototoxicity.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 188, 107-115 (2018).</li><li>Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+Cre-loxP+recombination+system+for+optogenetic+genome+engineering.">A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering.</a> Nature Chemical Biology. 12 (12), 1059-1064 (2016).</li><li>Shramova, E. I., Proshkina, G. M., Chumakov, S. P., Khodarovich, Y. M., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavoprotein+miniSOG+cytotoxisity+can+be+induced+by+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Flavoprotein miniSOG cytotoxisity can be induced by bioluminescence resonance energy transfer.</a> Acta Naturae. 8 (4), 118-123 (2016).</li><li>Naim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence-activated+nucleotide+cyclase+regulates+spatial+and+temporal+cAMP+synthesis.">Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).</li><li>Kim, C. K., Cho, K. F., Kim, M. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase-LOV+BRET+enables+versatile+and+specific+transcriptional+readout+of+cellular+protein-protein+interactions.">Luciferase-LOV BRET enables versatile and specific transcriptional readout of cellular protein-protein interactions.</a> Elife. 8, 43826 (2019).</li><li>Parag-Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+BRET-based+biologic+light+sources+enable+spatiotemporal+control+over+diverse+optogenetic+systems.">Engineered BRET-based biologic light sources enable spatiotemporal control over diverse optogenetic systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 1-9 (2020).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-luminescent+photodynamic+therapy+using+breast+cancer+targeted+proteins.">Self-luminescent photodynamic therapy using breast cancer targeted proteins.</a> Science Advances. 6 (37), (2020).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Molecular+calcium+integrator+reveals+a+striatal+cell+type+driving+aversion.">A Molecular calcium integrator reveals a striatal cell type driving aversion.</a> Cell. 183 (7), 2003-2019 (2020).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-+and+calcium-gated+transcription+factor+for+imaging+and+manipulating+activated+neurons.">A light- and calcium-gated transcription factor for imaging and manipulating activated neurons.</a> Nature Biotechnology. 35 (9), 864-871 (2017).</li><li>Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium-+and+light-gated+switch+to+induce+gene+expression+in+activated+neurons.">A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons.</a> Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).</li><li>Pathak, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+approaches+for+optogenetic+regulation+of+gene+expression+in+mammalian+cells+using+Arabidopsis+cryptochrome+2.">Bidirectional approaches for optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using Arabidopsis cryptochrome 2.</a> Nucleic Acids Research. 45 (20), 167 (2017).</li><li>Nishio, H., Walsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCAAT+displacement+protein/cut+homolog+recruits+G9a+histone+lysine+methyltransferase+to+repress+transcription.">CCAAT displacement protein/cut homolog recruits G9a histone lysine methyltransferase to repress transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11257-11262 (2004).</li><li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics.">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecV+recombinase+system+for+in+vivo+targeted+optogenomic+modifications+of+single+cells+or+cell+populations.">RecV recombinase system for in vivo targeted optogenomic modifications of single cells or cell populations.</a> Nature Methods. 17 (4), 422-429 (2020).</li><li>Love, A. C., Prescher, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+(and+using)+the+light:+Recent+developments+in+bioluminescence+technology.">Seeing (and using) the light: Recent developments in bioluminescence technology.</a> Cell Chemical Biology. 27 (8), 904-920 (2020).</li><li>Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+neural+activity+with+bioluminescence+during+natural+behavior.">Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 513-520 (2010).</li></ol>

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

هناك مجموعة من luciferases و luciferins مع أطوال موجية لانبعاثات الضوء تتطابق مع أطياف تنشيط البروتينات الحسية الضوئية من الضوء الأزرق إلى الضوء الأحمر14,29. بصرف النظر عن محاذاة الأطوال الموجية للانبعاثات والإثارة ، لا توجد طريقة موثوقة لتحديد الاقتران الذي سيعمل بشكل أفضل مسبقا. وبالتالي ، فإن الحاجة إلى تحديد تجريبي لكيفية عمل أزواج luciferin-luciferase في الخلايا والكائنات الحية في قيادة الأنظمة الحسية الضوئية.
تصف البروتوكولات الموضحة في هذا العرض التقديمي كيفية تحضير لوسيفيرين وكيفية تطبيقه في المختبر وفي الجسم الحي ، إلى جانب إرشادات حول إعداد الغرف وأغطية زراعة الأنسجة والحاضنات والمجاهر للتجارب التي تستخدم التلألؤ الحيوي. في التجارب التمثيلية ، تم استخدام لوسيفيراز مختلفة (نانولوك ، غاوسيا لوسيفيراز) مع العديد من البروتينات الحسية الضوئية (CRI / CIB ، EL222 ، VVD ، LOV) ، مما يدل على آثار التلألؤ الحيوي مقابل الضوء المادي ، والنقل المشترك مقابل بروتينات الاندماج ، ومقارنات الإشارة إلى الضوضاء ، ومقايسات القراءة المختلفة. يتم وصف المزيد من تطبيقات التلألؤ الحيوي الذي ينشط البروتينات الحسية الضوئية في منشورات من عدة مجموعات ، تستهدف تحريض موت الخلايا ، وتخليق cAMP ، وحركة البروتين بالإضافة إلى النسخ (الجدول 1).
ببساطة المشاركة في نقل المكونات الباعثة للضوء واستشعار الضوء هي بداية جيدة. المتغيرات هي النسب المولية للباعث والمستشعر. المجهولات هي مستويات الخلفية لنشاط المستشعر في الظلام ، ونشاط المستشعر فيما يتعلق بكثافة الضوء ومدته ، وكفاءة تنشيط المستشعر مقارنة الضوء الفيزيائي والبيولوجي. في حين أن تركيبات الاندماج لها ميزة الحفاظ على النسبة المولية للباعث والمستشعر عند 1: 1 وجعل باعث الضوء قريبا من مجال استشعار الضوء ، فإن اعتبارات أخرى تدخل حيز التنفيذ ، مثل مكان الربط (N- أو C-terminus) وكيفية الربط (طول الرابط وتكوينه) دون التأثير على أداء المحرك الحسي الضوئي. 
بالنسبة للتجارب في المختبر وفي الجسم الحي على حد سواء ، هناك خيارات متعددة لضبط انبعاث الضوء الحيوي ، إما عن طريق تغيير تركيز لوسيفيرين ، و / أو عن طريق تغيير الوقت الذي يتم فيه توفير لوسيفيرين للمستشعر المعني. يتم تحديد الحد الأدنى للمبلغ والوقت من خلال وجود أو عدم وجود التأثير المتوقع مع تنشيط الضوء. في المقابل ، يتم تحديد الحد الأقصى المعني بشكل رئيسي من خلال تحمل الخلايا لتركيزات عالية من luciferin على مدى فترات طويلة. تركيز CTZ المختار في الأمثلة المذكورة أعلاه ، 100 ميكرومتر ، قريب من الحد الأعلى لأنواع الخلايا المختلفة ، من خلايا HEK293 إلى الخلايا العصبية. الهدف هو استخدام تركيز منخفض قدر الإمكان لأقصر وقت لتحقيق تنشيط مجال التصوير المستهدف. وسيتم تحقيق ذلك بسهولة أكبر باستخدام luciferases مع انبعاث الضوء العالي والمستقبلات الضوئية مع حساسية عالية للضوء.
تم استخدام التلألؤ الحيوي لقيادة المستقبلات الضوئية في القوارض (الفئران والجرذان) مع بروتينات التصوير الضوئي المعبر عنها في الكبد والعضلات والحبل الشوكي والدماغ وكذلك عبر الخلايا المعبرة عن المستقبلات الضوئية المزروعة تحت الجلد أو داخل الصفاق. من حيث المبدأ ، لا توجد حدود تمنع تطبيق النهج على الأنواع المختلفة ، من الرئيسيات غير البشرية إلى الأسماك أو الذباب. اعتمادا على نفاذية الكائن الحي لللوسيفيرين ، قد يكون التطبيق سهلا مثل تطبيق لوسيفيرين على المياه المحيطة (على سبيل المثال ، في يرقات الأسماك 30). قبل استخدام BL-OG في أي كائن حي جديد ، يجب إجراء تجارب تجريبية لضمان وصول لوسيفيرين إلى أهدافه عبر طريق التطبيق المختار.
الجوانب الحرجة للتصميم التجريبي هي الضوابط المختلفة المهمة لتفسير النتائج. يجب مقارنة الخلايا التي تعبر عن مراسل مدفوع بواسطة luciferase يعمل على بروتين حسي ضوئي بالخلايا التي تفتقر إلى luciferase أو تفتقر إلى البروتين الحسي الضوئي. علاوة على ذلك ، يجب إجراء مقارنات بين الخلايا المعرضة للوسيفيرين أو السيارة أو الاحتفاظ بها في الظلام. من المهم أيضا إدراك قيود الفحوصات المختلفة لتقييم آثار تنشيط المستقبلات الضوئية التي يحركها التلألؤ الحيوي. على سبيل المثال ، يمكن اختبار فعالية النسخ المنشط بالتلألؤ الحيوي بطرق مختلفة ، اعتمادا على ما إذا كان الجين المراسل عبارة عن لوسيفيراز متعامد (مقياس اللمعان ، IVIS) ، أو بروتين فلورسنت (فرز الخلايا المنشط بالفلور ، تحليل الصور بالفحص المجهري). في حين أن الآثار الأساسية يجب أن تكون قابلة للتكرار عبر منصات الاختبار ، فإن الجوانب الكمية للتأثيرات قد تختلف اختلافا كبيرا.
وقد ثبت حتى الآن تنشيط التلألؤ الحيوي للمستقبلات الضوئية لعدد محدود من اللوسيفيراز والبروتينات الحسية الضوئية، على التوالي، سواء في المختبر أو في الجسم الحي. يمكن توسيعه إلى فئة كبيرة من المستقبلات الضوئية لتنشيط العديد من العمليات البيولوجية. ومما يعزز هذا التوسع في هذا النهج التطوير المستمر لأزواج جديدة من اللوسيفيراز وبروتين لوسيفيراز الفلوري مع انبعاث ضوء أعلى بكثير من اللوسيفيراز التي تحدث بشكل طبيعي ومع ميزات حركية قابلة للضبط لتطبيقات مختلفة. ويواكب هذا التقدم جيل اللوسيفيرين الجديد، مما يزيد من زيادة السطوع ولوحات الألوان29. تقدم منصة الأدوات هذه تطبيقات لمعالجة والتحقيق في الديناميكيات داخل الخلايا والتفاعلات الخلوية داخل الخلايا الحية والأنسجة والكائنات الحية.

يمكن تنشيط البروتينات الحسية الضوئية عن طريق الضوء إما من مصدر الضوء المادي أو من إنزيم luciferase في وجود ركيزته ، luciferin ، لتوليد التلألؤ الحيوي. بالنسبة للتطبيقات التي تتطلب جداول زمنية بالمللي أو حتى الفيمتو ثانية و / أو دقة مكانية أحادية الخلية ، فإن مصادر الضوء المادية (الليزر والثنائيات الباعثة للضوء (LEDs)) هي الوحيدة التي يمكن ضبطها على هذه المقاييس. ومن الأمثلة على ذلك التقييد المكاني للضوء المستخدم لتحفيز الأقطاب المتقابلة في تطوير يرقات ذبابة الفاكهة مع التحكم الزمني بالمللي ثانية1 أو التحفيز الدقيق للهياكل دون الخلوية المفردة مثل أنابيب الميتوكوندريا2. ومع ذلك، فإن العديد من التطبيقات الأخرى للمفاتيح الضوئية لها أولويات مختلفة، بما في ذلك التحكم المكاني الموسع والتطبيق المتكرر بشكل غير جراحي ودون تلف خفيف ولكن مع تحكم زمني محدد في جداول زمنية دقيقة وكثافة قابلة للضبط. هنا ، فإن استخدام luciferases كمصدر بديل للضوء لتنشيط مجالات استشعار الضوء له العديد من المزايا. على النقيض من تنشيط ضوء الألياف البصرية ، يصل التلألؤ الحيوي إلى كل مجال استشعار الضوء المعبر عنه في مجموعة الخلايا المستهدفة حيث يتم تشفير مصدر الضوء وراثيا. استخدام التلألؤ الحيوي يخفف من المخاوف بشأن تلف الأنسجة والخلايا بواسطة الألياف البصرية والتعرض المادي الممتد للضوء. يتم تشغيل الضوء مع تطبيق الركيزة luciferase. البداية فورية في المختبر وفي الجسم الحي اعتمادا على مسار الإدارة وتستمر لمدة ~ 15-30 دقيقة ؛ يمكن تحقيق الوجود الموسع أو التحفيز التدريجي للضوء باستخدام لوسيفيرين مختلفة ومع تطبيقات إضافية أو متكررة للركيزة3. وأخيرا ، يمكن ضبط انبعاث التلألؤ الحيوي عن طريق تغيير تركيز لوسيفيرين.
وقد تم إثبات استخدام التلألؤ الحيوي لتنشيط المستقبلات الضوئية المتحركة للأيونات ، أي العناصر البصرية الوراثية ، مثل القنوات أو المضخات ، على نطاق واسع4،5،6،7،8. تم استخدام نهج BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) هذا في تجارب الجسم الحي على الفئران والجرذان5،6،7،9،10،11،12. وجد أن تنشيط BL-OG للأوبسينات يتطلب كمية من التلألؤ الحيوي لا تقل عن 33 ميكروواط / مم 2 ، مع زيادة كفاءة التنشيط مع ارتفاع انبعاثات الضوء6,9. المستقبلات الضوئية الحسية المتحركة للأيونات هي مجموعة فرعية من الوحدة الكبيرة من المستقبلات الضوئية الحسية الموجودة في الطبيعة والتي لا تتحرك أيونات13,14. إن توسيع نطاق التلألؤ الحيوي لتنشيط المستقبلات الضوئية المتحركة غير الأيونية ، مثل مجالات التصوير الضوئي من النباتات أو البكتيريا ، تشجعه التقارير 15,16 التي تفيد بأن أجهزة الاستشعار الضوئية غير المتحركة غير الأيونية أكثر حساسية للضوء من channelrhodopsins ، مما يضمن قيادة أفضل لمستشعرات الضوء مع التلألؤ الحيوي مما تم الحصول عليه بالفعل مع العناصر البصرية الوراثية المتحركة للأيونات. في الآونة الأخيرة ، أبلغت العديد من المنشورات عن استخدام التلألؤ الحيوي كمصدر للضوء لتنشيط مجموعة متنوعة من المستقبلات الضوئية ، بما في ذلك مجالات استشعار الضوء والأكسجين والجهد (LOV) ، ومجالات الفلافين التي تستخدم الضوء الأزرق (BLUF) ، و cryptochromes (CRYs) 3،17،18،19،20،21،22 (الجدول 1 ). استهدفت تطبيقات التنشيط المدفوع بالتلألؤ الحيوي للمفاتيح الضوئية العمليات داخل الخلايا التي تتراوح بين موت الخلايا الناجم عن أنواع الأكسجين التفاعلية ، وتخليق cAMP ، وتوظيف البروتين وتفكيكه إلى إعادة التركيب الجينومي وتحريض النسخ.
يحدد هذا البروتوكول التصميم العام للأدوات البصرية الجينية التي تعتمد على التلألؤ الحيوي ويفصل إجراءات التنفيذ التجريبي لتنشيط التلألؤ الحيوي في الخلايا والكائنات الحية. ويشمل وصفا حول كيفية إعداد غرفة ، وغطاء وحاضنة لزراعة الأنسجة ، ومجهر للعمل مع التلألؤ الحيوي ، بالإضافة إلى الخطوات من إعداد luciferin إلى تطبيقه. يوفر هذا البروتوكول للمحققين الإجراءات الأساسية لتنفيذ BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) في المختبر وفي الجسم الحي. يمكن توسيع النهج الموصوفة وتخصيصها لتشمل نماذج تجريبية مختلفة. نتوقع أن يسهل هذا البروتوكول اعتماد استخدام التلألؤ الحيوي في الدراسات البيولوجية البصرية الوراثية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI 25W Deep Red 660 nm LED Light Bulb</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>to be used with any lamp stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Black Microcentrifuge Tubes, 0.5 mL, Argos Technologies</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL, Argos Technologies</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric (1.5 m x 2.7 m) x 0.12 mm (thick)</td>
			<td>THOR LABS</td>
			<td>BK-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C120-Fluc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>K. Gardner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8106; CAS: 10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca-FLARE protease, transcription factor and reporter</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 92214, 92213, 92202</td>
			<td>A. Ting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIB-VP64 (B1016)</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 92037</td>
			<td>C. Tucker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRY-Gal&#916;DD (B1013)</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 92035</td>
			<td>C. Tucker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTZ</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>303</td>
			<td>formulation for in vitro applications with Gaussia luciferases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTZ (Water soluble native coelenterazine)</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>3031</td>
			<td>formulation for in vivo applications with Gaussia luciferases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270; CAS: 50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCTZ</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>301</td>
			<td>formulation for in vitro applications with Oplophorus luciferases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375; CAS: 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCreV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A. Cetin and H. Zeng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Imaging System (IVIS)</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>Lumina LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405; CAS: 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Array Driver</td>
			<td>Amuza</td>
			<td>LAD-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Array for Multiwell Plates</td>
			<td>Amuza</td>
			<td>LEDA-x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670; CAS: 7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653; CAS: 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFuel Solvent</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>399</td>
			<td>for dissolving CTZ preparations for in vitro use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465; CAS: 1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NES-CRY2PHR-TevC</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 89877</td>
			<td>H. Kwon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11058021</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDL coated coverslips (12 mm, 15 mm, 18 mm)</td>
			<td>Neuvitro Corporation</td>
			<td>GG-12-PDL, GG-15-PDL , GG-18-PDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL2-GAL4-UAS-Luc</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #33020</td>
			<td>M. Walsh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizmatix USB Pulser TTL Generator for Optogenetics</td>
			<td>Goldstone Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 89878</td>
			<td>H. Kwon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vehicle (Water-soluble carrier without CTZ)</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>3031C</td>
			<td>control for in vivo applications with CTZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VP-EL222</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>K. Gardner</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescent optogenetics 2.0: harnessing bioluminescence to activate photosensory proteins in vitro and in vivo

تم استخدام التلألؤ الحيوي - الضوء المنبعث من إنزيم luciferase المؤكسد ركيزة جزيء صغير ، luciferin - في المختبر وفي الجسم الحي لتنشيط القنوات الأيونية ذات بوابات الضوء والمضخات في الخلايا العصبية. في حين أن هذا النهج البصري الوراثي الحيوي (BL-OG) يمنح مكونا كيميائيا وراثيا للأدوات البصرية الجينية ، إلا أنه لا يقتصر على استخدامه في علم الأعصاب. بدلا من ذلك ، يمكن تسخير التلألؤ الحيوي لتنشيط أي بروتين حسي ضوئي ، وبالتالي تمكين التلاعب بالعديد من الوظائف بوساطة الضوء في الخلايا. يمكن مطابقة مجموعة متنوعة من أزواج luciferase-luciferin مع البروتينات الحسية الضوئية التي تتطلب أطوال موجية مختلفة من الضوء وشدة الضوء.
اعتمادا على التطبيق المحدد ، يمكن تحقيق توصيل الضوء الفعال باستخدام بروتينات اندماج المستقبلات الضوئية luciferase أو عن طريق النقل المشترك البسيط. يمكن أن تكون البروتينات الحسية الضوئية القائمة على الانحراف المعتمد على الضوء أو التغيرات التوافقية مدفوعة بالتلألؤ الحيوي للتأثير على العمليات الخلوية من توطين البروتين ، وتنظيم مسارات الإشارات داخل الخلايا إلى النسخ. يفصل البروتوكول أدناه التنفيذ التجريبي لتنشيط التلألؤ الحيوي في الخلايا والكائنات الحية ويصف النتائج باستخدام عمليات إعادة التلألؤ الحيوي وعوامل النسخ. يوفر البروتوكول للمحققين الإجراءات الأساسية لإجراء علم البصريات الحيوي الوراثي في المختبر وفي الجسم الحي. يمكن توسيع النهج الموصوفة وتخصيصها إلى العديد من النماذج التجريبية المختلفة.

هناك العديد من الأحداث داخل الخلايا التي يمكن التلاعب بها باستخدام المحركات التي تستجيب للضوء ، والتي تكون قابلة للتنشيط ثنائي النمط مع مصادر الضوء الفيزيائية والبيولوجية. فيما يلي أمثلة تستخدم أداة دمج الكالسيوم الضوئي (Ca2 +) ، ونقل البروتين الناجم عن الضوء ، وعامل النسخ المستحث للضوء ، والمؤتلف الحساس للضوء. توضح الأمثلة جدوى استخدام التلألؤ الحيوي لتنشيط أنواع مختلفة من المستقبلات الضوئية. لم يتم تحسين التجارب المقدمة على وجه التحديد فيما يتعلق بتطبيق الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) ، أو اختيار luciferase ، أو فيما يتعلق بتركيزات وتوقيت تطبيق luciferin.
التعبير السريع المنظم للضوء والنشاط (FLARE) هو نظام بصري وراثي يسمح بنسخ جين مراسل مع تزامن زيادة Ca2+ داخل الخلايا و light23 (الشكل 4A). مطلوب وجود Ca2 + لجعل البروتياز بالقرب من موقع انقسام البروتياز لا يمكن الوصول إليه إلا من خلال التحفيز الضوئي ، مما يؤدي إلى إطلاق عامل النسخ. تم نقل خلايا HEK293 بشكل مشترك مع مكونات FLARE الأصلية ، وبناء مراسل Firefly (FLuc) - dTomato المزدوج ، ومتغير Gaussia luciferase المثبتة على الغشاء sbGLuc6. في وجود زيادة داخل الخلايا Ca2 + من خلال تعرض الخلايا ل 2 ميكرومتر من الأيونومايسين و 5 مللي متر من كلوريد الكالسيوم (CaCl2) ، أدى تطبيق LED الأزرق إلى تعبير قوي عن مراسل التألق مقارنة بالخلايا المتبقية في الظلام ، وكذلك إلى التعبير عن FLuc الذي يتم تحديده عن طريق قياس التلألؤ عند إضافة ركيزة FLuc ، د-لوسيفيرين. تم تحقيق مستويات مماثلة من التعبير FLuc مع التلألؤ الحيوي المنبعث من sbGLuc عند تطبيق الركيزة sbGLuc (CTZ) جنبا إلى جنب مع ionomycin و CaCl2. لاحظ أن اللوسيفيراز المستخدمة لتنشيط الضوء (sbGLuc) وللإبلاغ عن تأثير التنشيط الضوئي (نسخ FLuc) تنتج الضوء فقط مع لوسيفيرين الخاصة بها (CTZ مقابل D-luciferin) ولا تتفاعل بشكل متقاطع.
تم الجمع بين مكونات مختلفة لإنشاء نظام نسخ مستحث بالضوء يعتمد على عدم تغاير cryptochromes23,24 (الشكل 4B). تم دمج CRY2 في البروتياز بينما تم دمج CIB المرتبط بالغشاء في موقع انقسام البروتياز وعامل النسخ. أطلق نقل البروتين الناجم عن الضوء عامل النسخ ، مما أدى إلى التعبير عن FLuc و dTomato، كما هو موضح في الشكل 4A. في حين أن وجود مكون عامل النسخ وحده أدى إلى إشارة خلفية كبيرة ربما بسبب التحلل البروتيني التلقائي ، فإن كل من الضوء المادي (LED) والتلألؤ الحيوي (CTZ) زاد بقوة من التعبير عن FLuc كما تم قياسه في نظام التصوير في الجسم الحي (IVIS).
في مجموعة أخرى من التجارب ، تم استخدام NanoLuc (luciferin: furimazine أو hCTZ) للتنظيم البصري الوراثي للنسخ من خلال تعتيم CRI / CIB وعامل النسخ الحساس للضوء ، EL22225,26,27. ويبين الشكل 5A,B مخططات المكونات المختلفة في الحالتين المظلمة والضوئية ولوسيفيراز التي تم نقلها أو دمجها في مستشعر الضوء. وترد مقارنات مختلفة في الشكل 5 جيم. كان التلألؤ الحيوي ، الناجم عن إضافة hCTZ إلى خلايا HEK293 التي تعبر عن التركيبات وإزالتها بعد 15 دقيقة ، أكثر كفاءة في قيادة نسخ المراسل من 20 دقيقة من التعرض لضوء LED لكل من CRI / CIB و EL222. بالنسبة ل CRI / CIB ، كانت ساعة من التعرض LED كافية للوصول إلى مستوى من النسخ يضاهي 15 دقيقة من التلألؤ الحيوي. في المقابل ، بالنسبة ل EL222 ، حتى 60 دقيقة من LED كانت بالكاد نصف فعالية التعرض القصير للتلألؤ الحيوي. لم تكن هناك اختلافات كبيرة في فعالية النسخ بين النظامين عند النقل المشترك ، على الرغم من أن بروتينات الاندماج في CRI / CIB كانت أكثر كفاءة من تلك الموجودة في EL222. بالنسبة لكلا النظامين ، أدت بروتينات الاندماج إلى مستويات نسخ أعلى بكثير من المكونات المنقولة بشكل مشترك. أظهر CRY/CIB مستويات خلفية أعلى باستمرار مع تطبيق السيارة مقارنة ب EL222 ، الذي كان يحتوي على نسخ خلفية لا يكاد يذكر. زيادة تركيزات hCTZ وحدها لم يكن لها أي تأثير على نسخ جين المراسل.
توفر عمليات إعادة التجميع القابلة للتنشيط الضوئي أداة متعددة الاستخدامات للتلاعبات البصرية. اختبرنا تنشيط التلألؤ الحيوي لكري كري المقسم الحساس للضوء على أساس بروتين لوف النابض بالحياة، iCreV28. يوضح الشكل 6A مخططا للمكونات المختلفة ، sbGLuc و iCreV ومراسل التألق lox-stop-lox (tdTomato) قبل وبعد تطبيق CTZ. تظهر النتائج من تطبيق CTZ بالنسبة إلى عناصر التحكم (لا CTZ أو LED) في الشكل 6B. هناك بعض التعبير في الخلفية حتى في الظلام (لا CTZ) ؛ ومع ذلك ، في وجود CTZ ، يتم زيادة التعبير بقوة على الخلفية وعلى غرار ذلك الناجم عن تطبيق LED.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig01.jpg"> الشكل 1: حاضنة مختومة بالضوء. رفرف صندوق من الورق المقوى يغطي الضوء من لوحة التحكم المضيئة (السهم العلوي). غطاء غير منفذ للضوء فوق الباب الزجاجي للحاضنة (السهم السفلي) لحماية الخلايا من التعرض للضوء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig02.jpg"> الشكل 2: غطاء محرك السيارة ذو التدفق الرقائقي المضاء بالضوء الأحمر. إعداد يعرض غطاء محرك أنسجة تدفق صفحي قياسي يتم إضاءته بالضوء الأحمر. يشير السهم إلى مصباح سطح مكتب قياسي مع مصباح أحمر. يتم تنفيذ جميع عمليات التلاعب تحت الضوء الأحمر في غرفة مظلمة ضيقة الضوء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig03.jpg"> الشكل 3: مقصورات محكمة الإغلاق حول مجاهر تصوير الخلايا الحية. مثالان على إعدادات مجهر تصوير الخلايا الحية التي تظهر استخدام إما صندوق صلب مع ستائر بلاستيكية فقط على الجانب الأمامي (الألواح اليسرى: أعلى وأسفل) أو ستائر سوداء في جميع أنحاء إعداد التصوير (الألواح اليمنى: أعلى وأسفل). تظل الجوانب الأمامية في كلا المثالين مفتوحة وملفوفة عندما لا تكون قيد الاستخدام (اللوحات العلوية: اليسار واليمين). يتم لف الستائر السوداء الأمامية لأسفل لمنع أي ضوء في الغرفة (على سبيل المثال ، شاشات الكمبيوتر) من دخول منطقة التصوير عند إجراء تحفيز التلألؤ الحيوي للخلايا الحية و / أو التصوير (الألواح السفلية: اليسار واليمين). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig04.jpg"> الشكل 4: التلألؤ الحيوي لدمج أحداث الإشارات داخل الخلايا. (أ) مخططات مكونات التوهج التي يتم نقلها بالاشتراك مع sbGLuc. في وجود Ca2+ والقرب الناتج من البروتياز إلى موقع انقسام البروتياز ، سيؤدي التلألؤ الحيوي أو LED إلى تكشف LOV ، والتعرض لموقع الانقسام ، وإطلاق عامل النسخ. تعرضت الخلايا ل LED (دورة العمل 33٪ ، 2 ثانية على / 4 ثانية إيقاف لمدة 40 دقيقة ؛ 3.5 ميغاواط من الضوء ، 4.72 ميغاواط / سم 2 من الإشعاع) أو للتلألؤ الحيوي (التركيز النهائي 100 ميكرومتر CTZ لمدة 15 دقيقة) أو تركت في الظلام. صور مجهرية لخلايا HEK293 تعبر عن المكونات المذكورة أعلاه بعد العلاج لزيادة مستويات Ca2+ والتعرض ل LED (يسار). FLuc اللمعان الذي يقاس في مقياس لمعان يقارن التعرض بمصابيح LED أو التلألؤ الحيوي (CTZ) أو اليسار في الظلام (يمين). (ب) مخططات نظام نسخ غير معتمد على Ca2+ مشترك مع sbGLuc. تم نقل خلايا HEK293 في لوحات 4 آبار مع أربعة ترتيبات مختلفة من المكونات كما هو موضح في المخطط. تعرضت الألواح إما لمؤشر LED (دورة التشغيل 33٪ ، 2 ثانية على / 4 ثانية إيقاف لمدة 40 دقيقة ؛ طاقة ضوئية 3.5 ميجاوات ، إشعاع 4.72 ميجاوات / سم 2 ) أو تلألؤ حيوي (تركيز نهائي 100 ميكرومتر CTZ) عن طريق إضافة CTZ وتركه قيد التشغيل لمدة 15 دقيقة ؛ تركت لوحات التحكم في الظلام. تم قياس نسخ مراسل FLuc في IVIS. يتم عرض صور IVIS للأطباق التمثيلية على اليسار ؛ تظهر قياسات الإشراق من عدة نسخ متماثلة مبطنة إلى عناصر التحكم المظلمة على اليمين. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: FLARE = التعبير السريع المنظم للضوء والنشاط ؛ LOV = استشعار الضوء والأكسجين والجهد ؛ LED = الصمام الثنائي الباعث للضوء. CTZ = كولينترازين; FLuc = لوسيفيراز اليراعة; dTom = dTomato; CRY2 = كريبتوكروم 2; CRY2PHR = منطقة التماثل الضوئي CRY2 ؛ CIB1 = Ca2 + - والبروتين المرتبط ب integrin 1 ؛ CIBN = N-terminus of CIB1; IVIS = في نظام التصوير في الجسم الحي . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig05.jpg"> الشكل 5: التلألؤ الحيوي للنسخ أثناء القيادة . (أ) مخططات لنظامين للنسخ قابلين للتنشيط الضوئي في حالتيهما المظلمة والفاتحة. (ب) تم نقل نانولوك إما بشكل مشترك أو دمجه في الجزيئات المستشعرة للضوء على النحو المبين (N-NanoLuc-CRY-GalDD-C; N-نانولوك-VP16-EL222-C). (ج) المقارنات باستخدام كلا النظامين فيما يتعلق بمصادر الضوء وتصميم البناء والإشارة إلى الضوضاء. تعرضت الخلايا ل LED (دورة العمل 33٪ ، 2 ثانية على / 4 ثانية إيقاف لمدة 40 دقيقة ؛ طاقة ضوئية 3.5 ميجاوات ، إشعاع 4.72 ميجاوات / سم 2 ) أو للتلألؤ الحيوي لمدة 15 دقيقة (التركيز النهائي 100 ميكرومتر hCTZ ؛ باستثناء الحالات التي لوحظت فيها تركيزات مختلفة). في الظلام ، تركت الألواح دون مساس في الحاضنة بين التحول الأولي للبلازميدات وقياس FLuc ؛ VEH ، تم التعامل مع اللوحات نفسها مثل تلك التي تتلقى hCTZ ، ولكن تلقت السيارة بدلا من ذلك. الاختلافات في مستويات النسخ: hCTZ ، CRY المنقولة بشكل مشترك مقابل EL222 - ليست كبيرة ؛ hCTZ ، luciferase - اندماج البروتين الضوئي CRY مقابل EL222 - ص < 0.005 ؛ hCTZ ، CRY النقل المشترك مقابل الانصهار - p < 0.005 ؛ hCTZ ، EL222 النقل المشترك مقابل الانصهار - ص < 0.01 ؛ السيارة ، CRY مقابل EL222 - ص < 0.05. الاختصارات: UAS = تسلسل تنشيط المنبع. LED = الصمام الثنائي الباعث للضوء. CTZ = كولينترازين; FLuc = لوسيفيراز اليراعة; CRY = كريبتوكروم; CIB = Ca2 + - والبروتين المرتبط بالإنتغرين ؛ VEH = مركبة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig06.jpg"> الشكل 6: التلألؤ الحيوي للتلاعب البصري. (أ) مخططات التلاعب البصري المدفوع بالتلألؤ الحيوي باستخدام sbGLuc ، ومكونات iCreV المنقسمة ، وكاسيت مراسل LSL ، قبل وبعد تطبيق الضوء. (ب) تم شفط خلايا HEK293 بالبلازميدات ، ثم تم الاحتفاظ بها في الظلام. بعد أربع وعشرين ساعة ، تمت معالجة الخلايا لمدة 30 دقيقة مع متوسط فقط (بدون CTZ) أو مع CTZ (تركيز نهائي 100 ميكرومتر) أو مع LED (دورة العمل 25٪ ، 5 ثانية على / 15 ثانية قبالة لمدة 5 دقائق ؛ 14.81 ميغاواط من الطاقة الخفيفة ، 20 ميغاواط / سم 2 إشعاع) كعنصر تحكم إيجابي. صور مجهرية لتألق الطماطم باستخدام الظروف كما هو موضح. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: LSL = lox-stop-lox; CTZ = كولينترازين; LED = الصمام الثنائي الباعث للضوء. VVD = حية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: تنشيط التلألؤ الحيوي للمستقبلات الضوئية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%201_revised.xlsx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 2: مبادئ توجيهية لطلاء ونقل الخلايا بأشكال مختلفة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%202_revised.xlsx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 3: نسب البلازميدات المختلفة للنقل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%203.xlsx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 4: طرق الحقن وأحجامه وتركيزات لوسيفيرين للتطبيقات في الجسم الحي (25 جم ماوس). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%204.xlsx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

يمكن تسخير الضوء الحيوي المنبعث من إنزيم لوسيفيراز المؤكسد لركيزة جزيء صغير ، لوسيفيرين - لتنشيط البروتينات الحسية الضوئية ، وبالتالي إضافة بعد آخر إلى تحفيز الضوء وتمكين التلاعب بالعديد من الوظائف بوساطة الضوء في الخلايا عبر المقاييس الزمنية والمكانية.

علم البصريات الحيوي 2.0: تسخير التلألؤ الحيوي لتنشيط البروتينات الحسية الضوئية في المختبر وفي الجسم الحي

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate ...

1 (نغمات إلكترونية) علم البصريات Bioluminescent هو تقنية منصة يمكن من خلالها لمصادر الضوء المشفرة وراثيا تصور الوظائف والشبكات البيولوجية والتحكم فيها داخل الخلايا وفيما بينها. يصل التلألؤ الحيوي إلى كل مجال استشعار للضوء يتم التعبير عنه في مجموعة الخلايا المستهدفة دون أي تلف في الأنسجة والخلايا بواسطة الألياف البصرية والتعرض المادي المطول للضوء. للبدء ، ابدأ في إعداد مخزون Luciferin عن طريق إذابة خمسة ملليغرام من CTZ المجفف بالتجميد في 250 ميكرولتر من المذيب المعني.ضمان حل CTZ على طول الجدران عن طريق السحب. أثناء حماية القارورة من الضوء المباشر ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من الأليكوت في أنابيب أجهزة طرد مركزي سوداء 0.5 ملليلتر وتخزين الأليكوت عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للاستخدام في المستقبل. قم بإجراء جميع عمليات التلاعب الإضافية في غرفة ضيقة خفيفة في غطاء محرك أقراص مضاء بالضوء الأحمر.لإجراء تحفيز ضوء التلألؤ الحيوي الفردي ، قم بإعداد محلول عمل من Luciferin في وسط زراعة الخلايا ، قبل وقت قصير من إضافته إلى الخلايا بتركيز نهائي من 100 ميكرومولار. أضف الوسط المحتوي على اللوسيفيرين إلى الخلايا واحتضنه طوال المدة المطلوبة من التحفيز الخفيف. أطفئ الضوء الأحمر.بعد الانتظار لبضع ثوان حتى تتكيف العيون مع الظلام الدامس ، راقب انبعاث الضوء بالعين. قم بتوثيق انبعاث الضوء عن طريق التقاط صورة. قم بإنهاء التحفيز الضوئي عن طريق استبدال الوسط المحتوي على لوسيفيرين بوسط الزرع ، ثم اغسل الخلايا بوسط الزرع مرة أو مرتين للقضاء على كل لوسيفيرين اعتمادا على حساسية التجربة.لتجنب فقدان الخلايا ، قم بطبق الخلايا على أطباق مغلفة ب PDL واحتضن الخلايا. لإجراء التحفيز المتكرر لضوء التلألؤ الحيوي ، قم بإعداد غرفة تصوير الخلايا الحية عن طريق إنشاء حجرة ضيقة للضوء حول مجهر تصوير الخلايا الحية باستخدام صندوق وأوراق سوداء. تأكد من تغطية جميع مصادر الإضاءة الموجودة داخل الغرفة.قم بإعداد نظام التروية مع الحل المطلوب للسحب وإخراج الغرفة مما يؤدي إلى حاوية نفايات. اعتمادا على عدد المحفزات المتكررة ، قم بتوصيل محلول تصوير Luciferin العامل المعد في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. ضع غطاء مع خلايا منقولة في الغرفة.أثناء الحفاظ على تشغيل المضخة، قم بإزالة أنبوب مدخل المضخة من وعاء السحب. اغمر أنبوب المدخل بسرعة في محلول Luciferin ، مع الحفاظ على وقت الانتقال قصيرا لتجنب أي فراغ هوائي في الأنابيب. بمجرد تناول محلول Luciferin ، ضع أنبوب المدخل مرة أخرى في كوب السحب.كرر إزالة وغمر أنبوب المدخل في Luciferin عدة مرات حسب الحاجة على فترات من عدة دقائق إلى ساعات اعتمادا على النمط الفسيولوجي الذي من المفترض أن تتعرض له الخلايا. ثم احتفظ بالخلايا في بيئة محمية من الضوء لمدة 16 إلى 24 ساعة للنسخ أو المدة حتى يتم تقييم تأثير التحفيز الضوئي. لإجراء تنشيط التلألؤ الحيوي في الجسم الحي ، قم بإعداد Luciferin عن طريق إخراج قارورة CTZ من 80 درجة مئوية تحت الصفر ، ثم اتركها دافئة إلى درجة حرارة الغرفة في المنطقة المحمية من الضوء.لكل قارورة تحتوي على 500 ميكروغرام من CTZ ، أضف 250 ميكرولتر من الماء المعقم باستخدام ماصة وضع السدادة المطاطية مرة أخرى على القارورة. احتضن القارورة الزجاجية المعاد تشكيلها في حمام مائي خفف من درجة حرارة 55 درجة مئوية لبضع دقائق لإذابة المسحوق تماما. انقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي أسود وشطف الجدران لاسترداد جميع CTZ.بعد إزالة كمية المحلول اللازمة ، قم بتخزين المحلول المتبقي عند أربع درجات مئوية. بعد إعداد السيارة وإعادة تشكيلها واقتباسها بطريقة مماثلة ، قم بتشكيل تحفيز ضوء التلألؤ الحيوي عن طريق إزالة حجم Luciferin أو السيارة اللازمة لحجم الحيوان ومسار التطبيق المختار. حقن الحيوان مع Luciferin أو السيارة كما هو مصمم.لتنشيط المؤتلف المطلوب خلال نموذج سلوكي معين ، قم بحقن الحيوان قبل الاختبار السلوكي مباشرة. للنسخ المرحلي ، حقن الحيوان مرارا وتكرارا على مدار أيام وجمع البيانات من الحيوان المحفز للتلألؤ الحيوي كما هو مصمم. سمح نظام التعبير السريع المنظم للضوء والنشاط بنسخ جين المراسل مع زيادة أيونات الكالسيوم داخل الخلايا والضوء.أدى مؤشر LED الأزرق إلى تألق قوي للمراسل وتم تحديد تعبير FLuc من خلال قياسات التلألؤ بعد إضافة Luciferin. في نظام التصوير في الجسم الحي ، زاد كل من LED و CTZ بقوة من تعبير FLuc ، في حين أن وجود مكون عامل النسخ وحده أدى إلى إشارة خلفية كبيرة ، ربما بسبب التحلل البروتيني التلقائي. تم استخدام NanoLuc للتنظيم البصري من خلال DIMERIZATION CRI / CIB وعامل النسخ الحساس للضوء EL222.كان التلألؤ الحيوي الناجم عن إضافة hCTZ إلى خلايا HEK-293 وإزالته بعد 15 دقيقة أكثر كفاءة من 20 دقيقة من التعرض LED ل CRI / CIB و EL222. لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في فعالية النسخ بين النظامين عند نقلها المشترك مع hCTZ ، على الرغم من أن بروتينات الاندماج في CRI / CIB كانت أكثر كفاءة من EL222. أظهر CRY/CIB مستويات خلفية أعلى باستمرار مقارنة ب EL222 بغض النظر عن تركيز hCTZ.تم اختبار التلألؤ الحيوي لكري كري المقسم الحساس للضوء على أساس بروتين VVD LOV iCreV. كشفت النتائج من تطبيق CTZ أن وجود CTZ زاد بقوة من التعبير على الخلفية ويشبه تطبيق LED. إن استخدام التلألؤ الحيوي لتنشيط ليس فقط المستقبلات الضوئية المتحركة للحديد ، ولكن أي مجالات حسية ضوئية تضيف بعدا آخر لتحفيز الضوء الذي يوسع التلاعب بوظائف الخلايا عبر المقاييس الزمنية والمكانية.تم تطبيق علم البصريات الحيوي الوراثي في الخلايا والكائنات الحية النموذجية. يمكن تخصيص هذه البروتوكولات لاختبار مجموعة واسعة من الفرضيات الموجهة في المختبر وفي الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من<em&gt; كولاي</em&gt; الوصيفة HdeB<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

إعداد هيدروليساتي الكيراتين من ريش الدجاج وتطبيقه في مستحضرات التجميل

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

في الموقع القياس والعلاقة بين كثافة الخلية وانبعاث الضوء من البكتيريا طرحه

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

عزل جلوميرولي و في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

كيفية تحديد جزء صغير البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتيد بكميات كبيرة وفي الخلايا الحية

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

الطفرات موقع الموجه لفي المختبر وفي فيفو التجارب المتمثلة بالتفاعلات الحمض النووي الريبي في الإشريكيّة القولونية

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

قياس ارتباط النوكليوتيدات ببروتينات الغشاء الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بالنوكلياز الداخلي القائمة على التألق المستمر لفحص مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...