Name: bioluminescent optogenetics 2.0: harnessing bioluminescence to activate photosensory proteins in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-08-04T14:30:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo at JoVE.com

我们感谢我们的同事的构建，特别是A. Ting的Ca-FLARE蛋白酶，转录因子和报告者（Addgene # 92214，92213，92202），H. Kwon的TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16和NES-CRY2PHR-TevC（Addgene # 89878，89877），C. Tucker的CRY-GalΔDD（B1013）和CIB-VP64（B1016）（Addgene # 92035，92037），M. Walsh的pGL2-GAL4-UAS-Luc（Addgene #33020），K. Gardner的VP-EL222和C120-Fluc，以及A. Cetin和H. Zeng在发布前使iCreV可用。这项工作得到了NSF（NeuroNex 1707352），NIH（U01NS099709），W.M. Keck基金会和瑞典研究委员会对A.B.（2016-06760）的资助。

本研究中的所有程序均使用机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的中密歇根大学动物处理方案进行。
1. 体外光敏蛋白的生物发光激活
<ol><li>构建<ol>
<li>选择荧光素酶序列或荧光素酶-荧光蛋白融合序列，这将导致光发射器的表达产生与要激活的光感受器相匹配的波长的光。 注意：例如，蓝光发光荧光素酶（如 高斯 荧光素酶变体或 NanoLuc）可与蓝光感应光感受器（如 CRY/Ca2+- 和整合素结合蛋白 （CIB）、LOV 或 Vivid （VVD））配对。</li>
		<li>如果其他研究人员或质粒沉积物尚不可用，请使用标准分子生物学技术将DNA克隆到哺乳动物表达质粒中。 注意：启动子的选择取决于需要提供发光模块的强和组成表达，例如CAG和CMV启动子提供的表达。</li>
		<li>对于初始研究，使用单独的质粒对光发射器和光传感器进行共转染。根据需要生成两个部分的融合蛋白，并用于后续研究。</li>
		<li>根据制造商的协议，使用迷你、中型或大型质粒试剂盒获得高质量的质粒DNA。</li>
	</ol></li>
	<li>细胞培养和转染 注意：HeLa细胞和HEK293细胞在此方案中用作示例。<ol>
<li>根据所需的最终用途以格式和数量平板细胞。 注：具体示例见 表2。接种时的细胞密度将决定细胞可以转染的速度。<ol>
<li>为了通过荧光显微镜评估生物发光激活的转录，将聚-D-赖氨酸（PDL）包被的12mm盖玻片上的板HEK293细胞置于24孔培养皿中。</li>
			<li>为了通过在光度计中测量正交报告荧光素酶的光发射来评估生物发光激活的转录，首先在6孔或12孔培养皿中将HeLa细胞用于转染，但在转染后重新接种（参见步骤4）。</li>
			<li>如果要在活细胞成像室中进行重复的生物发光刺激，请选择适当尺寸的盖玻片并将其放入适当大小的多孔板中（12 mm盖玻片为24孔板;15 mm和18 mm盖玻片为12孔板）。使用 表 2 中指定的单元格编号在盖玻片顶部设定单元格的种子。如果选择的细胞类型不能很好地粘附在培养表面上，则将细胞接种在PDL包被的培养皿上。</li>
		</ol>
</li>
		<li>根据制造商的建议通过脂质进行转染，或使用适合所选细胞类型的任何转染方法。 注： 表3 详细介绍了两种不同光感受器EL222和CRY2/CIB及其各自的报告质粒以及不同发光蛋白的转染实验。各种质粒的比率适用于所选示例，但必须针对每个光发射器/光传感器对进行优化。</li>
		<li>转染后，将细胞置于完全光密封的培养箱中（图1）。</li>
		<li>根据所需的最终用途，第二天在原始孔/培养皿中使用细胞进行生物发光刺激，或在脂肪注射后3-4小时重新接种。为了在荧光仪中读取萤火虫荧光素酶报告基因的转录，将细胞重新接种在白色96孔板中。 注：在红灯照亮的层流罩中，在光线密闭的房间里执行所有操作（图2）。<ol>
<li>用Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤转染的细胞一次。</li>
			<li>将胰蛋白酶消化试剂的最小体积加入孔中（24孔：100μL;12孔：150μL;6孔：300μL），并在37°C下孵育细胞3分钟。</li>
			<li>加入培养基以达到细胞浓度，该浓度将为下一个接种步骤产生适当的细胞密度（例如，将细胞重悬于24孔中，最终体积为1.2 mL，用于在96孔板的10孔中接种;将细胞重悬于12孔中，最终体积为2.4 mL，用于在96孔板的20孔中接种）。根据最终需要的孔数，从几个孔中池出转染的细胞。</li>
			<li>以最终形式平板转染细胞，并将平板返回到光保护培养箱中。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>生物发光激活 in vitro
	<ol><li>准备荧光素酶底物（荧光素）。<ol>
<li>通过将5mg冻干的腔肠拉嗪（CTZ）溶解在250μL其特定溶剂中来制备50mM储备。确保沿小瓶壁的所有CTZ通过移液或涡旋溶解。保护小瓶免受直射光。</li>
			<li>在0.5mL黑色微量离心管中准备50μL等分试样，并储存在-80°C以备将来使用。 注意：溶解在溶剂中的CTZ在-80°C时不会冻结。 等分试样可以从冰箱中取出并多次返回冰箱，以制作工作溶液，只要暴露在光照和室温下保持在最低限度。</li>
		</ol></li>
		<li>单一生物发光光刺激 注：所有操作均在红灯照亮的层流罩中的严光室中进行（图2）。<ol>
<li>在细胞培养基（DMEM或NeuroBasal）中制备荧光素的工作溶液。调整荧光素的浓度，使最终浓度为100μM.在加入细胞之前不久在培养基中准备所有CTZ稀释液，因为CTZ会随着时间的推移而氧化。 注：如果更换整个体积的介质，则工作溶液将为100μM。如果将含荧光素的培养基添加到细胞中，则稀释因子的浓度将更高（例如，将50μL含有300μM荧光素的培养基加入孔中的100μL培养基将导致1：3稀释，从而产生100μM荧光素的最终浓度）。</li>
			<li>将含荧光素的培养基加入细胞中，并孵育所需的光刺激持续时间。 注意：这可以短至1分钟，也可以长至15分钟，甚至可能更短或更长。将含荧光素的培养基留在细胞上的时间长度取决于所选荧光素酶 - 荧光素组合的半衰期和动力学。</li>
			<li>关红灯后，用眼睛监测100μM最终荧光素浓度的光发射;等待几秒钟，直到眼睛完全变黑。通过拍照（即使使用手机）记录光发射。</li>
			<li>通过除去含荧光素的培养基并用培养基代替它来终止光刺激。根据实验的灵敏度，在除去含荧光素的培养基后，用培养基洗涤细胞一次或两次，以消除所有荧光素。如果细胞不能很好地粘附在培养表面，请将它们接种在PDL包被的培养皿上，以避免在洗涤过程中丢失细胞。</li>
			<li>将细胞返回光保护培养箱16-24小时。</li>
		</ol></li>
		<li>重复生物发光光刺激 注意：所有操作都在一个可以变得严密并被红灯照亮的房间内进行。<ol>
<li>设置活细胞成像室。使用盒子和黑色塑料片或黑色窗帘在活细胞成像显微镜周围创建一个隔间（图3）。覆盖密闭隔间和室内存在的所有光源（例如，显微镜或仪器上的 LED 指示灯）。</li>
			<li>使用所需的溶液建立灌注系统，用于进气和通往废物容器的腔室出口。 注意：例如，成像溶液可以是Tyrode溶液（氯化钠（124mM），氯化钾（3 mM），HEPES（10 mM），氯化钙二水合物（2 mM），六水合氯化镁（1 mM），D-葡萄糖（20 mM））。</li>
			<li>在成像溶液中制备荧光素的工作溶液。等分到尽可能多的微量离心管中重复刺激的次数。调节荧光素的浓度，使成像室中的最终浓度为100μM。</li>
			<li>将装有转染细胞的盖玻片放在腔室中。</li>
			<li>在保持泵运行的同时，从进气杯中取出泵的入口管，并迅速将其浸入荧光素溶液中，使过渡时间尽可能短，以避免管路中的任何空气空隙。</li>
			<li>一旦荧光素溶液被吸收，将入口管放回进气杯中。根据需要多次重复此过程，间隔几分钟到几小时，具体取决于细胞应该暴露的生理模式。</li>
			<li>将细胞返回受光保护的培养箱16-24小时进行转录，或者在一段时间内评估光刺激的效果。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. 体内光敏蛋白的生物发光激活
<ol><li>构建<ol>
<li>选择荧光素酶序列或荧光素酶-荧光蛋白融合序列，这将导致光发射器的表达产生与要激活的光感受器相匹配的波长的光。</li>
		<li>使用标准的分子生物学技术将DNA克隆到pAAV质粒中，如果其他研究人员或质粒沉积物尚不可用。</li>
		<li>选择强启动子用于发光模块的表达，例如CAG或CMV。</li>
		<li>使用标准方法制备高滴度病毒储液6 或商业化制备病毒载体。</li>
		<li>对于初始研究，使用单独的病毒载体共转导光发射器和光传感器，以便在需要时调整不同组分的比例。</li>
	</ol>
</li>
	<li>自动转导<ol>
<li>向实验动物的靶器官注射光发射器，光传感器和报告者的病毒载体，类似于体 外 转染的浓度比（表3）。</li>
		<li>将动物放回家笼至少2周，以使所有成分得到最大程度的表达。 注意：如果靶器官在体内并受到环境光照的保护，则可以在正常光照条件下饲养动物。</li>
	</ol>
</li>
	<li>体内生物发光活化
	<ol>
<li>准备荧光素酶底物（荧光素）。<ol>
<li>从-80°C冰箱中取出一小瓶水溶性CTZ，使其升温至室温。保护它免受光线照射。</li>
			<li>每500μg小瓶，加入250μL无菌水，使用注射器或打开小瓶并用移液管加水，然后将橡胶塞放回玻璃瓶上。</li>
			<li>将重构的玻璃小瓶在55°C水浴中孵育几分钟以完全溶解粉末。</li>
			<li>将溶液转移到黑色微量离心管中。冲洗玻璃小瓶的壁以取回所有CTZ。</li>
			<li>除去当天所需的溶液量。将剩余的溶液储存在4°C以备次日使用。不要冻结！</li>
			<li>对一小瓶车辆执行相同的步骤（2.3.1.1.-2.3.1.5）。</li>
		</ol>
</li>
		<li>生物发光光刺激<ol>
<li>除去所选动物大小和应用途径所需的荧光素/载体的体积（表4）。</li>
			<li>给动物注射荧光素或载体。根据实验设计重复生物发光光刺激。例如，如果在特定行为范式期间需要激活重组酶，请在行为测试之前注射动物。如果分子的相位转录是目标，则在几天内反复注射动物。</li>
			<li>按照设计从生物发光刺激的动物中收集数据。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+limits+of+developmental+Erk+signaling.">The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling.</a> Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of Biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+BRET-based+optogenetic+device+for+pulsatile+transgene+expression+enabling+glucose+homeostasis+in+mice.">A synthetic BRET-based optogenetic device for pulsatile transgene expression enabling glucose homeostasis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 615 (2021).</li><li>Berglund, K., Birkner, E., Augustine, G. J., Hochgeschwender, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+channelrhodopsins+for+combined+optogenetic+and+chemical-genetic+control+of+neurons.">Light-emitting channelrhodopsins for combined optogenetic and chemical-genetic control of neurons.</a> PLoS One. 8 (3), 59759 (2013).</li><li>Tung, J. K., Gutekunst, C. -. A., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+luminopsins:+genetically-encoded+bioluminescent+opsins+for+versatile,+scalable,+and+hardware-independent+optogenetic+inhibition.">Inhibitory luminopsins: genetically-encoded bioluminescent opsins for versatile, scalable, and hardware-independent optogenetic inhibition.</a> Scientific Reports. 5, 14366 (2015).</li><li>Berglund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminopsins+integrate+opto-+and+chemogenetics+by+using+physical+and+biological+light+sources+for+opsin+activation.">Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (3), 358-367 (2016).</li><li>Gomez-Ramirez, M., More, A. I., Friedman, N. G., Hochgeschwender, U., Moore, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BioLuminescent-OptoGenetic+in+vivo+response+to+coelenterazine+is+proportional,+sensitive+and+specific+in+neocortex.">The BioLuminescent-OptoGenetic in vivo response to coelenterazine is proportional, sensitive and specific in neocortex.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 471-480 (2020).</li><li>Moore, C. I., Berglund, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BL-OG:+BioLuminescent-OptoGenetics.">BL-OG: BioLuminescent-OptoGenetics.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 469-470 (2020).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+luciferase-opsin+combinations+for+improved+luminopsins.">Novel luciferase-opsin combinations for improved luminopsins.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 410-421 (2020).</li><li>Jaiswal, P. B., Tung, J. K., Gross, R. E., English, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motoneuron+activity+is+required+for+enhancements+in+functional+recovery+after+peripheral+nerve+injury+in+exercised+female+mice.">Motoneuron activity is required for enhancements in functional recovery after peripheral nerve injury in exercised female mice.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 448-457 (2020).</li><li>Zenchak, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence-driven+optogenetic+activation+of+transplanted+neural+precursor+cells+improves+motor+deficits+in+a+Parkinson's+disease+mouse+model.">Bioluminescence-driven optogenetic activation of transplanted neural precursor cells improves motor deficits in a Parkinson's disease mouse model.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 458-468 (2020).</li><li>Tung, J. K., Shiu, F. H., Ding, K., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+activated+luminopsins+allow+optogenetic+inhibition+of+distributed+nodes+in+an+epileptic+network+for+non-invasive+and+multi-site+suppression+of+seizure+activity.">Chemically activated luminopsins allow optogenetic inhibition of distributed nodes in an epileptic network for non-invasive and multi-site suppression of seizure activity.</a> Neurobiology of Disease. 109, 1-10 (2018).</li><li>Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algal+sensory+photoreceptors.">Algal sensory photoreceptors.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 167-189 (2008).</li><li>Losi, A., Gardner, K. H., Moglich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-light+receptors+for+optogenetics.">Blue-light receptors for optogenetics.</a> Chemical Reviews. 118 (21), 10659-10709 (2018).</li><li>Proshkina, G. M., Shramova, E. I., Shilova, O. N., Ryabova, A. V., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+of+flavoprotein+miniSOG+induced+by+bioluminescence+resonance+energy+transfer+in+genetically+encoded+system+NanoLuc-miniSOG+is+comparable+with+its+LED-excited+phototoxicity.">Phototoxicity of flavoprotein miniSOG induced by bioluminescence resonance energy transfer in genetically encoded system NanoLuc-miniSOG is comparable with its LED-excited phototoxicity.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 188, 107-115 (2018).</li><li>Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+Cre-loxP+recombination+system+for+optogenetic+genome+engineering.">A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering.</a> Nature Chemical Biology. 12 (12), 1059-1064 (2016).</li><li>Shramova, E. I., Proshkina, G. M., Chumakov, S. P., Khodarovich, Y. M., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavoprotein+miniSOG+cytotoxisity+can+be+induced+by+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Flavoprotein miniSOG cytotoxisity can be induced by bioluminescence resonance energy transfer.</a> Acta Naturae. 8 (4), 118-123 (2016).</li><li>Naim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence-activated+nucleotide+cyclase+regulates+spatial+and+temporal+cAMP+synthesis.">Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).</li><li>Kim, C. K., Cho, K. F., Kim, M. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase-LOV+BRET+enables+versatile+and+specific+transcriptional+readout+of+cellular+protein-protein+interactions.">Luciferase-LOV BRET enables versatile and specific transcriptional readout of cellular protein-protein interactions.</a> Elife. 8, 43826 (2019).</li><li>Parag-Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+BRET-based+biologic+light+sources+enable+spatiotemporal+control+over+diverse+optogenetic+systems.">Engineered BRET-based biologic light sources enable spatiotemporal control over diverse optogenetic systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 1-9 (2020).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-luminescent+photodynamic+therapy+using+breast+cancer+targeted+proteins.">Self-luminescent photodynamic therapy using breast cancer targeted proteins.</a> Science Advances. 6 (37), (2020).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Molecular+calcium+integrator+reveals+a+striatal+cell+type+driving+aversion.">A Molecular calcium integrator reveals a striatal cell type driving aversion.</a> Cell. 183 (7), 2003-2019 (2020).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-+and+calcium-gated+transcription+factor+for+imaging+and+manipulating+activated+neurons.">A light- and calcium-gated transcription factor for imaging and manipulating activated neurons.</a> Nature Biotechnology. 35 (9), 864-871 (2017).</li><li>Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium-+and+light-gated+switch+to+induce+gene+expression+in+activated+neurons.">A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons.</a> Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).</li><li>Pathak, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+approaches+for+optogenetic+regulation+of+gene+expression+in+mammalian+cells+using+Arabidopsis+cryptochrome+2.">Bidirectional approaches for optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using Arabidopsis cryptochrome 2.</a> Nucleic Acids Research. 45 (20), 167 (2017).</li><li>Nishio, H., Walsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCAAT+displacement+protein/cut+homolog+recruits+G9a+histone+lysine+methyltransferase+to+repress+transcription.">CCAAT displacement protein/cut homolog recruits G9a histone lysine methyltransferase to repress transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11257-11262 (2004).</li><li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics.">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecV+recombinase+system+for+in+vivo+targeted+optogenomic+modifications+of+single+cells+or+cell+populations.">RecV recombinase system for in vivo targeted optogenomic modifications of single cells or cell populations.</a> Nature Methods. 17 (4), 422-429 (2020).</li><li>Love, A. C., Prescher, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+(and+using)+the+light:+Recent+developments+in+bioluminescence+technology.">Seeing (and using) the light: Recent developments in bioluminescence technology.</a> Cell Chemical Biology. 27 (8), 904-920 (2020).</li><li>Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+neural+activity+with+bioluminescence+during+natural+behavior.">Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 513-520 (2010).</li></ol>

作者没有利益冲突需要披露。

有一系列荧光素酶和荧光素，其发光波长与光敏蛋白的活化光谱相匹配，从蓝光到红光14，29。除了对齐发射和激发波长之外，没有可靠的方法来 先验 地确定哪种配对效果最好。因此，需要通过实验确定荧光素 - 荧光素酶对如何在驱动光感觉系统的细胞和生物体中起作用。
本演示中概述的方案描述了如何制备荧光素以及如何 在体外 和 体内应用它，以及关于设置房间，组织培养罩，培养箱和显微镜的指南，用于利用生物发光进行实验。在代表性实验中，使用具有几种光敏蛋白（CRY / CIB，EL222，VVD，LOV）的不同荧光素酶（NanoLuc， Gaussia 荧光素酶），证明了生物发光与物理光，共转染与融合蛋白，信噪比和不同读数测定的影响。生物发光激活光敏蛋白的更多应用在几个小组的出版物中进行了描述，除了转录之外，还靶向诱导细胞死亡，cAMP合成和蛋白质运动（表1）。
简单地共同转染发光和光传感组件是一个良好的开端。变量是发射器和传感器的摩尔比;未知因素包括黑暗中传感器活动的背景水平、传感器活动与光强度和持续时间的关系，以及传感器激活效率与物理光和生物光的比较。虽然融合结构的优点是将发射器和传感器的摩尔比保持在1：1，并使光发射器靠近光传感域，但其他考虑因素也起作用，例如在哪里系绳（N端或C端）以及如何在不影响光敏致动器性能的情况下链接（连接器长度和组成）。 
对于 体外 和 体内的实验，有多种选择可以通过改变荧光素的浓度和/或改变荧光素提供给相应传感器的时间来调整生物发光发光。最小量和时间取决于光激活时预期效果的存在与否。相反，各自的最大值主要由细胞在长时间内对高浓度荧光素的耐受性决定。在上面的例子中选择的CTZ浓度为100μM，接近从HEK293细胞到神经元的各种细胞类型的上限。目标是在最短的时间内使用尽可能低的浓度来实现目标光感域的激活。使用具有高光发射的荧光素酶和具有高光灵敏度的光感受器将更容易实现。
用于驱动光感受器的生物发光已用于啮齿动物（小鼠，大鼠），其光敏蛋白在肝脏，肌肉，脊髓和大脑中表达，以及通过皮下或腹膜内移植的表达光感受器的细胞。原则上，没有限制阻止该方法应用于不同的物种，从非人类灵长类动物到鱼类或苍蝇。根据生物体对荧光素的渗透性，应用可能像将荧光素施用于周围水域（例如，在鱼幼虫中30）一样简单。在任何新生物体中使用BL-OG之前，必须进行中试实验，以确保荧光素通过所选的应用途径到达其靶标。
实验设计的关键方面是各种对结果解释很重要的控制。应将作用于光敏蛋白的荧光素酶驱动的表达报告细胞与缺乏荧光素酶或缺乏光敏蛋白的细胞进行比较。此外，应在暴露于荧光素，载体或保持在黑暗中的细胞之间进行比较。认识到不同测定的局限性对于评估生物发光驱动的光感受器激活的影响也很重要。例如，生物发光激活转录的功效可以用不同的方式进行测试，这取决于报告基因是正交荧光素酶（发光计，IVIS）还是荧光蛋白（荧光激活细胞分选，显微镜图像分析）。虽然基本效果应该在测试平台上可重复，但效果的定量方面可能会有很大差异。
到目前为止，光感受器的生物发光激活已被证明分别用于体 外 和 体内有限数量的荧光素酶和光敏蛋白。它可以扩展到大类光感受器，以激活更多的生物过程。通过不断开发新型荧光素酶和荧光素酶 -荧光蛋白对，其光发射率远高于天然存在的荧光素酶，并且具有不同应用无法调节的动力学特征，进一步推动了该方法的扩展。这些进步与新型荧光素的产生并行，进一步增加了亮度和调色板29。该工具平台提供了用于操作和研究活细胞，组织和生物体内部的细胞内动力学和细胞相互作用的应用程序。

光敏蛋白可以被来自物理光源或荧光素酶在其底物荧光素存在下的光激活，以产生生物发光。对于需要毫秒甚至飞秒时间尺度和/或单单元空间分辨率的应用，物理光源（激光器和发光二极管（LED））是唯一可以调到这些尺度的光源。例如，用于以毫秒级时间控制刺激发育中的 果蝇 幼虫中对立两极的光的空间限制1 或对线粒体小管等单个亚细胞结构的精确刺激2。然而，光开关的许多其他应用具有不同的优先级，包括扩展的空间控制和重复应用，非侵入性且无光损伤，但在分钟时间尺度和可调强度下具有定义的时间控制。在这里，使用荧光素酶作为替代光源来激活光传感域有几个优点。与光纤光激活相反，生物发光到达目标细胞群中表达的每个光传感域，因为光源是遗传编码的。使用生物发光可以减轻对光纤和延长物理光照射对组织和细胞损伤的担忧。使用荧光素酶底物打开灯。根据给药途径，发病 立即在体外 和 体内 ，持续约15-30分钟;光的扩展存在或相位刺激可以通过不同的荧光素和基质的附加或重复应用来实现3。最后，生物发光发射可以通过改变荧光素的浓度来调节。
使用生物发光来激活离子运动的光感受器，即光遗传学元件，如通道视紫红质或泵，已被广泛证明4，5，6，7，8。这种生物发光光遗传学（BL-OG）方法已被用于小鼠和大鼠的体内实验5，6，7，9，10，11，12。发现视蛋白的BL-OG激活需要至少约33μW / mm2的生物发光量，激活效率随着光发射的增加而增加6，9。离子运动的感觉光感受器是自然界中发现的非离子移动的大量感觉光感受器的一个亚组13，14。报告15，16鼓励生物发光扩展到激活非离子运动的光感受器，例如来自植物或细菌的光敏域，非离子运动光敏电阻比通道视紫红质更感光，确保具有生物发光的光传感器比离子运动光遗传学元件已经获得的光传感器更好。最近，一些出版物报道了使用生物发光作为激活各种光感受器的光源，包括光氧电压传感（LOV）结构域，蓝光使用黄素（BLUF）结构域和隐色素（CRYs）3，17，18，19，20，21，22（表1).生物发光驱动的光开关激活的应用靶向细胞内过程，从活性氧诱导的细胞死亡、cAMP合成、蛋白质募集和解离到基因组重组和转录诱导。
该协议概述了生物发光驱动光遗传学工具的一般设计，并详细介绍了在细胞和生物体中实验执行生物发光激活的程序。它包括有关如何设置房间，组织培养罩和培养箱，以及用于生物发光工作的显微镜的描述，以及从制备荧光素到应用荧光素的步骤。该协议为研究人员提供了在 体外 和 体内进行生物发光光遗传学（BL-OG）的基本程序。所描述的方法可以进一步扩展和个性化到不同的实验范式。我们预计该协议将促进在光遗传学生物学研究中采用生物发光。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI 25W Deep Red 660 nm LED Light Bulb</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>to be used with any lamp stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Black Microcentrifuge Tubes, 0.5 mL, Argos Technologies</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL, Argos Technologies</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric (1.5 m x 2.7 m) x 0.12 mm (thick)</td>
			<td>THOR LABS</td>
			<td>BK-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C120-Fluc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>K. Gardner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8106; CAS: 10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca-FLARE protease, transcription factor and reporter</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 92214, 92213, 92202</td>
			<td>A. Ting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIB-VP64 (B1016)</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 92037</td>
			<td>C. Tucker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRY-Gal&#916;DD (B1013)</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 92035</td>
			<td>C. Tucker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTZ</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>303</td>
			<td>formulation for in vitro applications with Gaussia luciferases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTZ (Water soluble native coelenterazine)</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>3031</td>
			<td>formulation for in vivo applications with Gaussia luciferases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270; CAS: 50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCTZ</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>301</td>
			<td>formulation for in vitro applications with Oplophorus luciferases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375; CAS: 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCreV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A. Cetin and H. Zeng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Imaging System (IVIS)</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>Lumina LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405; CAS: 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Array Driver</td>
			<td>Amuza</td>
			<td>LAD-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Array for Multiwell Plates</td>
			<td>Amuza</td>
			<td>LEDA-x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670; CAS: 7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653; CAS: 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFuel Solvent</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>399</td>
			<td>for dissolving CTZ preparations for in vitro use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465; CAS: 1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NES-CRY2PHR-TevC</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 89877</td>
			<td>H. Kwon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11058021</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDL coated coverslips (12 mm, 15 mm, 18 mm)</td>
			<td>Neuvitro Corporation</td>
			<td>GG-12-PDL, GG-15-PDL , GG-18-PDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL2-GAL4-UAS-Luc</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #33020</td>
			<td>M. Walsh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizmatix USB Pulser TTL Generator for Optogenetics</td>
			<td>Goldstone Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 89878</td>
			<td>H. Kwon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vehicle (Water-soluble carrier without CTZ)</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>3031C</td>
			<td>control for in vivo applications with CTZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VP-EL222</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>K. Gardner</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescent optogenetics 2.0: harnessing bioluminescence to activate photosensory proteins in vitro and in vivo

生物发光 - 由氧化小分子底物荧光素的荧光素酶发出的光 - 已 在体外 和 体内 用于激活神经元中的光门控离子通道和泵。虽然这种生物发光光遗传学（BL-OG）方法为光遗传学工具赋予化学遗传学成分，但它不仅限于神经科学的使用。相反，可以利用生物发光来激活任何光敏蛋白，从而能够操纵细胞中多种光介导的功能。各种荧光素酶 - 荧光素对可以与需要不同波长的光敏蛋白和光强度相匹配。
根据具体应用，通过使用荧光素酶-光感受器融合蛋白或通过简单的共转染可以实现有效的光传递。基于光依赖性二聚化或构象变化的光敏蛋白可以由生物发光驱动，以影响从蛋白质定位，调节细胞内信号通路到转录的细胞过程。下面的方案详细介绍了细胞和生物体中生物发光激活的实验执行，并使用生物发光驱动的重组酶和转录因子描述了结果。该协议为研究人员提供了在 体外 和 体内进行生物发光光遗传学的基本程序。所描述的方法可以进一步扩展和个性化到许多不同的实验范式。

有许多细胞内事件可以通过对光做出反应的致动器来操纵，并且可以通过物理和生物光源进行双峰激活。以下是采用光敏钙（Ca2 +）积分器，光诱导蛋白质易位，光敏转录因子和光敏重组酶的示例。这些例子说明了使用生物发光来激活各种光感受器的可行性。所提出的实验没有针对发光二极管（LED）应用，选择的荧光素酶或荧光素应用的浓度和时间进行专门优化。
快速光和活性调节表达（FLARE）是一种光遗传学系统，允许转录报告基因，同时增加细胞内Ca2 +和light23（图4A）。需要Ca2 +的存在才能使蛋白酶靠近蛋白酶切割位点，只能通过光刺激进入，从而导致转录因子的释放。HEK293细胞与原始的FLARE组分，双萤火虫（FLuc）-dTomato报告构建体和膜锚定高西娅荧光素酶变体sbGLuc6共同转染。在通过将细胞暴露于2μM离子霉素和5mM氯化钙（CaCl2）而增加的细胞内Ca2 +的情况下，与留在黑暗中的细胞相比，蓝色LED的应用导致荧光报告器的稳定表达，以及通过在添加FLuc底物时测量发光来确定FLuc的表达， D-荧光素。在将sbGLuc底物（CTZ）与离子霉素和CaCl2一起施用sbGLuc底物（CTZ）时，sbGLuc发出的生物发光实现了相似水平的FLuc表达。请注意，用于光激活（sbGLuc）和用于报告光激活作用（FLuc转录）的荧光素酶仅与其各自的荧光素（CTZ与D-荧光素）产生光，并且不交叉反应。
将不同的组分组合在一起，基于隐色素的异源二聚化生成光诱导转录系统23，24 （图4B）。将CRY2融合到蛋白酶上，而膜结合的CIB融合到蛋白酶裂解位点和转录因子。光诱导的蛋白质易位释放了转录因子，导致FLuc和dTomato的表达，如图 4A所示。虽然转录因子成分的存在单独导致相当大的背景信号可能是由于自发蛋白水解，但物理光（LED）和生物发光（CTZ）都稳健地增加了 在体内 成像系统（IVIS）中测量的FLuc的表达。
在另一组实验中，使用NanoLuc（荧光素：呋喃嗪或hCTZ）通过CRY / CIB和光敏转录因子EL22225，26，27的二聚化来调节转录的光遗传学调控。图5A、B显示了不同元件在暗、亮状态下以及荧光素酶共转染或融合到光传感器的示意图。各种比较如图5C所示。通过将hCTZ添加到表达结构并在15分钟后将其去除的HEK293细胞来诱导生物发光，对于CRY / CIB和EL222，在驱动报告转录方面比20分钟的LED光照射更有效。对于CRY / CIB，一个小时的LED曝光足以达到与15分钟的生物发光相当的转录水平。相比之下，对于EL222，即使是60分钟的LED也只有短暂暴露于生物发光的一半。共转染时，两个系统的转录功效无显著差异，但CRY/CIB的融合蛋白比EL222的融合蛋白更有效。对于这两种系统，融合蛋白导致转录水平明显高于共转染组分。与EL222相比，CRY / CIB在车辆应用中显示出更高的背景水平，EL222的背景转录可以忽略不计。单独增加hCTZ浓度对报告基因的转录没有影响。
光活性重组酶为视神经操作提供了一种多功能工具。我们测试了基于Vivid LOV蛋白iCreV28的光敏分裂Cre重组酶的生物发光激活。 图6A 显示了在CTZ应用之前和之后的不同组件，sbGLuc，iCreV和lox-stop-lox荧光报告器（tdTomato）的示意图。CTZ应用相对于控制（无CTZ或LED）的结果如图 6B所示。即使在黑暗中也有一些背景表达（没有CTZ）;然而，在CTZ存在的情况下，表达在背景上强劲地增加，类似于LED应用引起的表达。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig01.jpg"> 图1：轻度密封培养箱。 纸板箱翻盖覆盖了发光控制面板的光线（顶部箭头）。培养箱玻璃门（底部箭头）上的防光盖，以保护细胞免受光照。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig02.jpg"> 图2：红灯照亮的层流罩。 装置显示由红灯照亮的标准层流组织培养罩。箭头表示带有红色灯泡的标准台灯。在红灯下的所有操作都是在黑暗的密闭室中进行的。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig03.jpg"> 图3：活细胞成像显微镜周围的密光隔室。 活细胞成像显微镜设置的两个示例显示了使用仅在正面（左侧面板：顶部和底部）带有塑料窗帘的实心盒，或者在成像设置周围使用黑色窗帘（右侧面板：顶部和底部）。两个示例中的正面在不使用时保持打开和卷起（顶部面板：左侧和右侧）。在执行活细胞生物发光刺激和/或成像（底部面板：左侧和右侧）时，将前部的黑色窗帘向下滚动，以防止房间中的任何光线（例如计算机屏幕）进入成像区域。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig04.jpg"> 图4：用于整合细胞内信号传导事件的生物发光。 （A） 与 sbGLuc 共转染的 FLARE 组件的示意图。在Ca2 + 的存在以及由此产生的蛋白酶与蛋白酶裂解位点的接近下，生物发光或LED都将导致LOV的展开，裂解位点的暴露和转录因子的释放。将细胞暴露于LED（占空比33%，2 s开/4 s关40分钟;3.5mW光功率，4.72 mW / cm2 辐照度）或生物发光（100μM CTZ终浓度15分钟）或留在黑暗中。HEK293细胞的显微图像在处理后表达上述成分，以增加Ca2 + 水平并暴露于LED（左）。在发光计中测量的FLuc发光，比较与LED，生物发光（CTZ）或黑暗中的曝光（右）。（B）与sbGLuc共转染的非Ca2 +依赖性转录系统的示意图。如图示意图所示，转染4孔板中的HEK293细胞具有四种不同的组分排列。将板暴露在LED（占空比33%，2 s开/4 s关下40分钟;3.5 mW光功率，4.72 mW / cm2 辐照度）或生物发光（100μM CTZ终浓度）下，加入CTZ并将其保持打开15分钟;控制板被留在黑暗中。在IVIS中测量了FLuc报告员的转录。IVIS代表性菜肴的图像显示在左侧;右侧显示了从基线到深色控件的多个仿行的辐射度测量值。比例尺 = 100 μm。缩写：FLARE = 快速光和活性调节表达;LOV = 光氧电压检测;发光二极管 = 发光二极管;CTZ = 腔肠拉嗪;FLuc = 萤火虫荧光素酶;dTom = dTomato;CRY2 = 隐色素 2;CRY2PHR = CRY2光解酶同源区;CIB1 = Ca2 +-和整合素结合蛋白1;CIBN = CIB1 的 N 端;IVIS = 体内 成像系统。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig05.jpg"> 图5：用于驱动转录的生物发光。 （A）两种光活性转录系统在黑暗和浅色状态下的示意图。（B）纳米Luc要么共转染，要么融合到所描述的光感部分（N-NanoLuc-CRY-GalDD-C;N-纳米卢克-VP16-EL222-C）。（C）使用两种系统在光源，结构设计和信噪比方面的比较。将细胞暴露于LED（占空比33%，2 s on / 4 s关闭40分钟;3.5mW光功率，4.72 mW / cm2 辐照度）或生物发光15分钟（100μM hCTZ终浓度;除非注意到不同的浓度）。在质粒的初始转化和FLuc测量之间，在培养箱中保持黑暗，板保持不变;VEH，车牌的处理方式与接收hCTZ的车牌相同，但接收车辆。转录水平的差异：hCTZ，共转染的CRY与EL222 - 不显着;hCTZ，荧光素酶 - 光蛋白融合CRY与EL222 - p <0.005;hCTZ， CRY 共转染 vs. 融合 - p < 0.005;hCTZ， EL222 共转染 vs. 融合 - p < 0.01;车辆， CRY vs. EL222 - p < 0.05.缩写：UAS = 上游激活序列;发光二极管 = 发光二极管;CTZ = 腔肠拉嗪;FLuc = 萤火虫荧光素酶;CRY = 隐色素;CIB = Ca2 +-和整合素结合蛋白;VEH = 车辆。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig06.jpg"> 图6：用于光学操作的生物发光。 （A）在光照射之前和之后使用sbGLuc，分裂的iCreV组件和LSL报告盒进行生物发光驱动的光学操作的示意图。（B）HEK293细胞用质粒进行脂质感染，然后保持在黑暗中。24小时后，将细胞仅用培养基（无CTZ）或CTZ（100μM终浓度）或LED（占空比25%，5 s开/15 s关5分钟;14.81mW光功率，20 mW / cm2 辐照度）作为阳性对照处理细胞30分钟。使用所示条件的tdTomato荧光的显微图像。比例尺 = 100 μm。缩写： LSL = lox-stop-lox;CTZ = 腔肠拉嗪;发光二极管 = 发光二极管;VVD = 生动。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
表1：光感受器的生物发光激活。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%201_revised.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>
表2：不同格式的电镀和转染细胞指南。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%202_revised.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>
表3：用于转染的各种质粒的比率。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%203.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>
表4：用于体内应用的荧光素的注射途径，体积和浓度 （25g小鼠） 。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%204.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

由氧化小分子底物的荧光素酶发出的生物发光 - 荧光素 - 可以用来激活光敏蛋白，从而为光刺激增加另一个维度，并能够在时间和空间尺度上操纵细胞中多种光介导的功能。

生物发光光遗传学2.0：利用生物发光在体外和体内激活光敏蛋白

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate ...

1（电子色调）生物发光光遗传学是一种平台技术，其中遗传编码的光源可以可视化和控制细胞内和细胞之间的生物功能和网络。生物发光到达目标细胞群中表达的每个光传感域，而不会受到光纤和延长物理光照射的任何组织和细胞损伤。首先，通过将5毫克冻干CTZ溶解在250微升的相应溶剂中来开始制备荧光素储备。通过移液确保沿壁的CTZ溶解。在保护小瓶免受直射光的同时，在0.5毫升黑色微量离心管中制备50微升等分试样，并将等分试样储存在零下80摄氏度以备将来使用。在由红灯照亮的层流罩中，在光线紧凑的房间里执行所有进一步的操作。为了进行单次生物发光光刺激，在细胞培养基中制备荧光素的工作溶液，然后以100微摩尔的终浓度加入细胞。将含有荧光素的培养基加入细胞中，并孵育所需的光刺激持续时间。关掉红灯。等待几秒钟，直到眼睛完全变黑，然后监测眼睛的光发射。通过拍照记录光发射。通过用培养基替换含有荧光素的培养基来终止光刺激，然后用培养基洗涤细胞一次或两次，以根据实验灵敏度消除所有荧光素。为避免细胞损失，将细胞接种在PDL包被的培养皿上并孵育细胞。为了进行重复的生物发光光刺激，通过使用盒子和黑色片在活细胞成像显微镜周围创建一个光密隔室来设置活细胞成像室。确保覆盖房间内存在的所有光源。使用所需的进气溶液和导致废物容器的腔室输出设置灌注系统。根据重复刺激的次数，将制备的工作荧光素成像溶液等分到微量离心管中。将装有转染细胞的盖玻片放在腔室中。在保持泵运行的同时，从进气杯中取出泵的进气管。快速将入口管浸入荧光素溶液中，保持较短的过渡时间，以避免管子中的任何空气空隙。一旦荧光素溶液被吸收，将入口管放回进气杯中。根据需要多次重复取出并将入口管浸入荧光素中，间隔几分钟至数小时，具体取决于细胞应该暴露的生理模式。然后将细胞保持在光保护环境中16至24小时进行转录或持续时间，直到评估光刺激的效果。为了在体内进行生物发光激活，通过从零下80摄氏度取出CTZ小瓶来制备荧光素，然后在光保护区域将其加热至室温。对于每个含有500微克CTZ的小瓶，使用移液管加入250微升无菌水，然后将橡胶塞放回小瓶上。将重构的玻璃小瓶在55摄氏度的水浴中孵育几分钟，以完全溶解粉末。将溶液转移到黑色微量离心管中，并冲洗墙壁以取回所有CTZ。除去所需溶液量后，将剩余的溶液储存在四摄氏度。在以类似方式制备、重构和等分载体之后，通过除去所需的体积的荧光素或载体的大小和所选择的应用路线来预制生物发光光刺激。按照设计向动物注射荧光素或车辆。对于特定行为范式期间所需的重组酶激活，请在行为测试之前注射动物。对于相位转录，在几天内反复注射动物，并按照设计从生物发光刺激的动物中收集数据。快速光和活性调节表达系统允许转录具有增加的细胞内钙离子和光的报告基因。蓝色LED导致强大的报告荧光，并且在添加荧光素后通过发光测量确定FLuc表达。在体内成像系统中，LED和CTZ都稳健地增加了FLuc表达，而转录因子成分的存在单独导致相当大的背景信号，可能是由于自发蛋白水解。NanoLuc通过CRY / CIB二聚化和光敏转录因子EL222用于光原调节。对于CRY/CIB和EL222，向HEK-293细胞添加hCTZ并在15分钟后将其去除所诱导的生物发光比LED曝光20分钟更有效。当与hCTZ共转染时，两个系统之间的转录功效没有显着差异，尽管CRY / CIB的融合蛋白比EL222更有效。与EL222相比，CRY / CIB显示出与hCTZ浓度无关的更高背景水平。测试了基于VVD LOV蛋白iCreV的光敏分裂Cre重组酶的生物发光。CTZ应用的结果表明，CTZ的存在在背景上稳健地增加了表达，并且类似于LED应用。使用生物发光不仅激活铁移动的光感受器，而且激活任何光感受域都为光刺激增加了另一个维度，扩展了跨时间和空间尺度的细胞功能的操纵。生物发光光遗传学已应用于细胞和模式生物。这些方案可以定制，以在体外和体内测试广泛的定向假设。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

的pH依赖性活性的检测<em&gt;大肠杆菌</em&gt;陪护HdeB<em&gt;体外</em&gt;和<em&gt;在体内</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

科研

生物化学

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

热稳定，表达，纯化，和人类血清素转运蛋白结晶绑定到<em&gt;取值</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

鸡羽毛角蛋白水解物的制备及其在化妆品中的应用

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

就地生物发光细菌细胞密度与光发射的测量与相关性研究

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

肾小球的分离及肾小球细胞表面蛋白的活体标记

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

如何定量光活化荧光蛋白在大容量和活细胞中的分数

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

体外和体内实验的位定向诱变-以大肠杆菌rna相互作用为例

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

实时测量核苷酸与完整功能性膜蛋白的结合

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

成熟水稻的横向切片（米 苜蓿L.）使用移液器吸头作为固定支架的扫描电子显微镜成像的内核

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

基于荧光的连续核酸内切酶偶联DNA甲基化测定，用于筛选DNA甲基转移酶抑制剂

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...