Name: bioluminescent optogenetics 2.0: harnessing bioluminescence to activate photosensory proteins in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-08-04T14:30:00
Duration: 7 min 19 s
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Agradecemos aos nossos colegas pelas construções, especificamente A. Ting para o Ca-FLARE protease, fator de transcrição e repórter (Addgene # 92214, 92213, 92202), H. Kwon para TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 e NES-CRY2PHR-TevC (Addgene # 89878, 89877), C. Tucker para CRY-GalΔDD (B1013) e CIB-VP64 (B1016) (Addgene # 92035, 92037), M. Walsh para pGL2-GAL4-UAS-Luc (Addgene #33020), K. Gardner para VP-EL222 e C120-Fluc, e A. Cetin e H. Zeng para disponibilizar iCreV antes da publicação. Este trabalho foi apoiado por subsídios da NSF (NeuroNex 1707352), NIH (U01NS099709), da Fundação W.M. Keck e do Conselho Sueco de Pesquisa para A.B. (2016-06760).

Todos os procedimentos do presente estudo foram realizados utilizando protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) para manejo de animais na Universidade Central de Michigan, MI.
1. Ativação de bioluminescência de proteínas fotosensory in vitro
<ol><li>Constrói<ol>
<li>Selecione uma sequência de luciferase ou uma sequência de fusão de proteínas fluorescentes de luciferase que resultará na expressão de um emissor de luz produzindo luz de um comprimento de onda que corresponde ao fotoreceptor a ser ativado. NOTA: Por exemplo, as luciferases emissoras de luz azul, como variantes de luciferase gaussia ou NanoLuc, podem ser emparelhadas com fotorreceptores de sensor de luz azul, como CRY/Ca2+- e proteína de ligação de integrin (CIB), LOV ou Vivid (VVD).</li>
		<li>Se ainda não estiver disponível de outros investigadores ou depósitos de plasmídeos, use técnicas padrão de biologia molecular para clonar o DNA em uma expressão de mamífero plasmídeo. NOTA: A escolha dos promotores é ditada pela necessidade de proporcionar uma expressão forte e constitutiva do módulo emissor de luz, como o fornecido pelos promotores do CAG e CMV.</li>
		<li>Para estudos iniciais, use plasmídeos separados para a co-transfecção do emissor de luz e do sensor de luz. Gerar proteínas de fusão dos dois moieties conforme necessário e para estudos subsequentes.</li>
		<li>Obtenha DNAs plasmídeos de alta qualidade usando kits mini-, midi-ou maxiprep de acordo com os protocolos do fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura celular e transfecção NOTA: As células HeLa e HEK293 são usadas como exemplos neste protocolo.<ol>
<li>Células de placa em formatos e números de acordo com o uso final desejado. NOTA: Exemplos específicos são dados na Tabela 2. A densidade celular no momento do revestimento determinará em quanto tempo as células podem ser transfeccionadas.<ol>
<li>Para avaliar a transcrição ativada pela bioluminescência por microscopia de fluorescência, as células hek293 da placa hek293 em poli-D-lysina (PDL) revestidas de 12 mm de tampas colocadas em pratos de 24 poços.</li>
			<li>Para avaliar a transcrição ativada pela bioluminescência medindo a emissão de luz de uma luciferase de repórter ortogonal em um luminômetro, as células de placa HeLa inicialmente em pratos de 6 ou 12 poços para transfecção, mas re-emplacam-nas após a transfecção (ver passo 4).</li>
			<li>Se a estimulação repetida de bioluminescência for realizada em câmaras de imagem de células vivas, selecione clipes de cobertura do tamanho apropriado e coloque-os em placas multi-poço do tamanho apropriado (placas de 24 poços para tampas de 12 mm; placas de 12 poços para tampas de 15 mm e 18 mm). Semear as células em cima das tampas usando os números de células especificados na Tabela 2. Se o tipo de célula selecionada não aderir bem à superfície da cultura, emplaque as células em pratos revestidos de PDL.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realizar a transfecção por lipofecção de acordo com a recomendação do fabricante ou utilizar qualquer método de transfecção apropriado para o tipo de célula selecionada. NOTA: A Tabela 3 detalha experimentos de transfecção para dois fotorreceptores diferentes, EL222 e CRY2/CIB, e seus respectivos plasmídeos repórteres, além de diferentes proteínas emissoras de luz. As proporções dos vários plasmídeos funcionam bem para os exemplos selecionados, mas terão que ser otimizadas para cada par de sensores de luz/luz.</li>
		<li>Após a transfecção, coloque as células em uma incubadora completamente selada (Figura 1).</li>
		<li>Dependendo do uso final desejado, use as células para estimulação de bioluminescência no dia seguinte em seus poços/pratos originais, ou reemplaque-os 3-4 h após a lipofecção. Para ler a transcrição de um gene repórter de luciferase vagalume em um luminômetro, re-emplaque as células em placas brancas de 96 poços. NOTA: Realize todas as manipulações em uma sala leve em um capô de fluxo laminar iluminado pela luz vermelha (Figura 2).<ol>
<li>Lave as células transfeminadas uma vez com o meio eagle modificado (DMEM) modificado de Dulbecco ou soro fisco tamponado (PBS).</li>
			<li>Adicione o volume mínimo de um reagente trypsinizador aos poços (24-well: 100 μL; 12-well: 150 μL; 6-well: 300 μL) e incubar as células por 3 min a 37 °C.</li>
			<li>Adicione meio de cultura para alcançar uma concentração celular que irá produzir a densidade celular apropriada para o próximo passo de chapeamento (por exemplo, resuspend células em um 24-well em um volume final de 1,2 mL para chapeamento em 10 poços de uma placa de 96 poços; células resuspend em um 12-well em um volume final de 2,4 mL para chapeamento em 20 poços de uma placa de 96 poços). Acumule as células transfectadas de vários poços, dependendo do número de poços necessários no final.</li>
			<li>Aplaque as células transfeinadas em seu formato final e devolva as placas à incubadora protegida pela luz.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Ativação da bioluminescência in vitro
	<ol><li>Prepare o substrato de luciferase (luciferina).<ol>
<li>Prepare 50 mM de estoque dissolvendo 5 mg de coelenterazina liofilizada (CTZ) em 250 μL de seu solvente específico. Certifique-se de que todo o CTZ ao longo das paredes do frasco seja dissolvido por pipetação ou vórtice. Proteja o frasco da luz direta.</li>
			<li>Prepare 50 alíquotas de μL em tubos de microcentrifusagem preto de 0,5 mL e armazene a -80 °C para uso futuro. NOTA: CTZ dissolvido em solvente não congela a -80 °C. As alíquotas podem ser removidas e devolvidas ao congelador várias vezes para fazer soluções de trabalho, desde que a exposição à luz e à temperatura ambiente seja mantida ao mínimo.</li>
		</ol></li>
		<li>Estimulação da luz de bioluminescência única NOTA: Todas as manipulações são realizadas em uma sala leve em um capô de fluxo laminar iluminado pela luz vermelha (Figura 2).<ol>
<li>Prepare uma solução de trabalho de luciferina no meio de cultura celular (DMEM ou NeuroBasal). Ajuste a concentração da luciferina de tal forma que a concentração final seja de 100 μM. Prepare todas as diluições de CTZ em médio pouco antes de adicionar às células, pois o CTZ oxida ao longo do tempo. NOTA: Se todo o volume do meio for substituído, a solução de trabalho será de 100 μM. Se o meio contendo luciferina for adicionado às células, a concentração será maior pelo fator de diluição (por exemplo, adicionando 50 μL de meio contendo luciferina de 300 μM a 100 μL de média no poço resultará em uma diluição de 1:3 e, portanto, em uma concentração final de 100 μM de luciferina).</li>
			<li>Adicione o meio contendo luciferina às células e incubar para a duração desejada da estimulação da luz. NOTA: Pode ser tão curto quanto 1 min ou até 15 min e pode ser ainda mais curto ou mais longo. O tempo para deixar o meio contendo luciferina nas células depende da meia-vida e cinética da combinação luciferase-luciferina selecionada.</li>
			<li>Monitore a emissão de luz a 100 μM de concentração final de luciferina olho após desligar a luz vermelha; esperar por alguns segundos até que os olhos se ajustem para a escuridão completa. Documente a emissão de luz tirando uma foto (mesmo com um celular).</li>
			<li>Termine a estimulação da luz removendo o meio contendo luciferina e substituindo-o por meio de cultura. Dependendo da sensibilidade dos experimentos, lave as células com meio de cultura uma ou duas vezes após a remoção do meio contendo luciferina para eliminar toda a luciferina. Se as células não aderirem bem à superfície da cultura, emplaque-as em pratos revestidos de PDL para evitar perder as células durante as lavagens.</li>
			<li>Devolva as células à incubadora protegida pela luz por 16-24 h.</li>
		</ol></li>
		<li>Estimulação repetida da luz da bioluminescência NOTA: Todas as manipulações são realizadas em uma sala que pode ser feita levemente apertada e ser iluminada pela luz vermelha.<ol>
<li>Configure a câmara de imagens de células vivas. Crie um compartimento leve ao redor do microscópio de imagem de células vivas usando uma caixa e folhas de plástico pretas ou cortinas pretas (Figura 3). Cubra todas as fontes de luz presentes dentro do compartimento de luz e da sala (por exemplo, indicadores LED no microscópio ou instrumentos).</li>
			<li>Configure o sistema de perfusão com a solução desejada para a entrada e o porto de câmara levando a um recipiente de resíduos. NOTA: Por exemplo, a solução de imagem pode ser a Solução de Tyrode (cloreto de sódio (124 mM), cloreto de potássio (3 mM), HEPES (10 mM), dihidrato de cloreto de cálcio (2 mM), hexahidrato de cloreto de magnésio (1 mM), D-glicose (20 mM)).</li>
			<li>Prepare uma solução de trabalho de luciferina na solução de imagem. Alíquotar em tantos tubos de microcentrifuuuagem quanto o número de estimulações repetidas. Ajuste a concentração da luciferina de tal forma que a concentração final na câmara de imagem seja de 100 μM.</li>
			<li>Coloque uma mancha de cobertura com células transfeinadas na câmara.</li>
			<li>Mantendo a bomba funcionando, remova o tubo de entrada da bomba do béquer de entrada e mergulhe-o rapidamente na solução de luciferina, mantendo o tempo de transição o mais curto possível para evitar qualquer vazio de ar na tubulação.</li>
			<li>Assim que a solução de luciferina for retomada, coloque o tubo de entrada de volta no béquer de entrada. Repita esse processo quantas vezes for necessário e em intervalos de vários minutos a horas, dependendo do padrão fisiológico ao qual as células devem ser expostas.</li>
			<li>Devolva as células à incubadora protegida pela luz por 16-24 h para transcrição, ou pelo tempo o efeito da estimulação da luz deve ser avaliado.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Ativação de bioluminescência de proteínas fotossensoriais in vivo
<ol><li>Constrói<ol>
<li>Selecione uma sequência de luciferase ou uma sequência de fusão de proteínas fluorescentes de luciferase que resultará na expressão de um emissor de luz produzindo luz de um comprimento de onda que corresponde ao fotoreceptor a ser ativado.</li>
		<li>Use técnicas padrão de biologia molecular para clonar o DNA em um plasmídeo pAAV, se ainda não estiver disponível de outros investigadores ou depósitos plasmídeos.</li>
		<li>Escolha promotores fortes para a expressão dos módulos emissores de luz, como CAG ou CMV.</li>
		<li>Use abordagens padrão para preparar estoques virais de alta titer6 ou ter vetores virais preparados comercialmente.</li>
		<li>Para estudos iniciais, utilize vetores virais separados para a co-transdução do emissor de luz e do sensor de luz para permitir o ajuste das proporções dos diferentes componentes, se necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transdução AAV<ol>
<li>Injete o órgão alvo do animal experimental com vetores virais do emissor de luz, sensor de luz e repórter análogo às razões de concentração utilizadas para as transfecções in vitro (Tabela 3).</li>
		<li>Devolva os animais para suas gaiolas por pelo menos 2 semanas para permitir a expressão máxima de todos os componentes. NOTA: Se o órgão alvo estiver dentro do corpo e protegido da luz ambiente, os animais podem ser alojados em condições normais de luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ativação de bioluminescência in vivo
	<ol>
<li>Prepare o substrato de luciferase (luciferina).<ol>
<li>Retire um frasco de CTZ solúvel em água do congelador -80 °C e deixe aquecido até a temperatura ambiente. Mantenha-o protegido da luz.</li>
			<li>Por frasco de 500 μg, adicione 250 μL de água estéril, usando uma seringa ou abrindo o frasco e adicionando água com uma pipeta, em seguida, colocando a rolha de borracha de volta no frasco de vidro.</li>
			<li>Incubar o frasco de vidro reconstituído em um banho de água de 55 °C por alguns minutos para dissolver completamente o pó.</li>
			<li>Transfira a solução para um tubo de microcentrifuuagem preto. Enxágüe as paredes do frasco de vidro para recuperar toda a CTZ.</li>
			<li>Remova a quantidade de solução necessária para o dia. Armazene a solução restante a 4 °C para uso no dia seguinte. Não congele!</li>
			<li>Realizar as mesmas etapas (2.3.1.1.-2.3.1.5) para um frasco de veículo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Estimulação da luz da bioluminescência<ol>
<li>Remova o volume de luciferina/veículo necessário para o tamanho da rota animal e de aplicação escolhida (Tabela 4).</li>
			<li>Injete os animais com luciferina ou veículo. Repita a estimulação da luz da bioluminescência de acordo com o desenho experimental. Por exemplo, se a ativação de uma recombinase for desejada durante um paradigma comportamental específico, injete os animais pouco antes do teste comportamental. Se a transcrição afásica de uma molécula é o objetivo, injete os animais repetidamente ao longo dos dias.</li>
			<li>Coletar dados dos animais estimulados pela bioluminescência conforme projetado.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+limits+of+developmental+Erk+signaling.">The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling.</a> Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of Biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+BRET-based+optogenetic+device+for+pulsatile+transgene+expression+enabling+glucose+homeostasis+in+mice.">A synthetic BRET-based optogenetic device for pulsatile transgene expression enabling glucose homeostasis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 615 (2021).</li><li>Berglund, K., Birkner, E., Augustine, G. J., Hochgeschwender, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+channelrhodopsins+for+combined+optogenetic+and+chemical-genetic+control+of+neurons.">Light-emitting channelrhodopsins for combined optogenetic and chemical-genetic control of neurons.</a> PLoS One. 8 (3), 59759 (2013).</li><li>Tung, J. K., Gutekunst, C. -. A., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+luminopsins:+genetically-encoded+bioluminescent+opsins+for+versatile,+scalable,+and+hardware-independent+optogenetic+inhibition.">Inhibitory luminopsins: genetically-encoded bioluminescent opsins for versatile, scalable, and hardware-independent optogenetic inhibition.</a> Scientific Reports. 5, 14366 (2015).</li><li>Berglund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminopsins+integrate+opto-+and+chemogenetics+by+using+physical+and+biological+light+sources+for+opsin+activation.">Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (3), 358-367 (2016).</li><li>Gomez-Ramirez, M., More, A. I., Friedman, N. G., Hochgeschwender, U., Moore, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BioLuminescent-OptoGenetic+in+vivo+response+to+coelenterazine+is+proportional,+sensitive+and+specific+in+neocortex.">The BioLuminescent-OptoGenetic in vivo response to coelenterazine is proportional, sensitive and specific in neocortex.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 471-480 (2020).</li><li>Moore, C. I., Berglund, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BL-OG:+BioLuminescent-OptoGenetics.">BL-OG: BioLuminescent-OptoGenetics.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 469-470 (2020).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+luciferase-opsin+combinations+for+improved+luminopsins.">Novel luciferase-opsin combinations for improved luminopsins.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 410-421 (2020).</li><li>Jaiswal, P. B., Tung, J. K., Gross, R. E., English, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motoneuron+activity+is+required+for+enhancements+in+functional+recovery+after+peripheral+nerve+injury+in+exercised+female+mice.">Motoneuron activity is required for enhancements in functional recovery after peripheral nerve injury in exercised female mice.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 448-457 (2020).</li><li>Zenchak, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence-driven+optogenetic+activation+of+transplanted+neural+precursor+cells+improves+motor+deficits+in+a+Parkinson's+disease+mouse+model.">Bioluminescence-driven optogenetic activation of transplanted neural precursor cells improves motor deficits in a Parkinson's disease mouse model.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 458-468 (2020).</li><li>Tung, J. K., Shiu, F. H., Ding, K., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+activated+luminopsins+allow+optogenetic+inhibition+of+distributed+nodes+in+an+epileptic+network+for+non-invasive+and+multi-site+suppression+of+seizure+activity.">Chemically activated luminopsins allow optogenetic inhibition of distributed nodes in an epileptic network for non-invasive and multi-site suppression of seizure activity.</a> Neurobiology of Disease. 109, 1-10 (2018).</li><li>Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algal+sensory+photoreceptors.">Algal sensory photoreceptors.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 167-189 (2008).</li><li>Losi, A., Gardner, K. H., Moglich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-light+receptors+for+optogenetics.">Blue-light receptors for optogenetics.</a> Chemical Reviews. 118 (21), 10659-10709 (2018).</li><li>Proshkina, G. M., Shramova, E. I., Shilova, O. N., Ryabova, A. V., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+of+flavoprotein+miniSOG+induced+by+bioluminescence+resonance+energy+transfer+in+genetically+encoded+system+NanoLuc-miniSOG+is+comparable+with+its+LED-excited+phototoxicity.">Phototoxicity of flavoprotein miniSOG induced by bioluminescence resonance energy transfer in genetically encoded system NanoLuc-miniSOG is comparable with its LED-excited phototoxicity.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 188, 107-115 (2018).</li><li>Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+Cre-loxP+recombination+system+for+optogenetic+genome+engineering.">A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering.</a> Nature Chemical Biology. 12 (12), 1059-1064 (2016).</li><li>Shramova, E. I., Proshkina, G. M., Chumakov, S. P., Khodarovich, Y. M., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavoprotein+miniSOG+cytotoxisity+can+be+induced+by+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Flavoprotein miniSOG cytotoxisity can be induced by bioluminescence resonance energy transfer.</a> Acta Naturae. 8 (4), 118-123 (2016).</li><li>Naim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence-activated+nucleotide+cyclase+regulates+spatial+and+temporal+cAMP+synthesis.">Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).</li><li>Kim, C. K., Cho, K. F., Kim, M. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase-LOV+BRET+enables+versatile+and+specific+transcriptional+readout+of+cellular+protein-protein+interactions.">Luciferase-LOV BRET enables versatile and specific transcriptional readout of cellular protein-protein interactions.</a> Elife. 8, 43826 (2019).</li><li>Parag-Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+BRET-based+biologic+light+sources+enable+spatiotemporal+control+over+diverse+optogenetic+systems.">Engineered BRET-based biologic light sources enable spatiotemporal control over diverse optogenetic systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 1-9 (2020).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-luminescent+photodynamic+therapy+using+breast+cancer+targeted+proteins.">Self-luminescent photodynamic therapy using breast cancer targeted proteins.</a> Science Advances. 6 (37), (2020).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Molecular+calcium+integrator+reveals+a+striatal+cell+type+driving+aversion.">A Molecular calcium integrator reveals a striatal cell type driving aversion.</a> Cell. 183 (7), 2003-2019 (2020).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-+and+calcium-gated+transcription+factor+for+imaging+and+manipulating+activated+neurons.">A light- and calcium-gated transcription factor for imaging and manipulating activated neurons.</a> Nature Biotechnology. 35 (9), 864-871 (2017).</li><li>Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium-+and+light-gated+switch+to+induce+gene+expression+in+activated+neurons.">A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons.</a> Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).</li><li>Pathak, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+approaches+for+optogenetic+regulation+of+gene+expression+in+mammalian+cells+using+Arabidopsis+cryptochrome+2.">Bidirectional approaches for optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using Arabidopsis cryptochrome 2.</a> Nucleic Acids Research. 45 (20), 167 (2017).</li><li>Nishio, H., Walsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCAAT+displacement+protein/cut+homolog+recruits+G9a+histone+lysine+methyltransferase+to+repress+transcription.">CCAAT displacement protein/cut homolog recruits G9a histone lysine methyltransferase to repress transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11257-11262 (2004).</li><li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics.">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecV+recombinase+system+for+in+vivo+targeted+optogenomic+modifications+of+single+cells+or+cell+populations.">RecV recombinase system for in vivo targeted optogenomic modifications of single cells or cell populations.</a> Nature Methods. 17 (4), 422-429 (2020).</li><li>Love, A. C., Prescher, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+(and+using)+the+light:+Recent+developments+in+bioluminescence+technology.">Seeing (and using) the light: Recent developments in bioluminescence technology.</a> Cell Chemical Biology. 27 (8), 904-920 (2020).</li><li>Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+neural+activity+with+bioluminescence+during+natural+behavior.">Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 513-520 (2010).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Há uma gama de luciferases e luciferinas com comprimentos de onda de emissão de luz que correspondem aos espectros de ativação de proteínas fotosensory de azul a luz vermelha14,29. Além de alinhar comprimentos de onda de emissão e excitação, não há uma maneira confiável de determinar a priori qual emparelhamento funcionará melhor. Assim, a necessidade de determinar experimentalmente como os pares luciferina-luciferase funcionam em células e organismos na condução de sistemas fotosensórios.
Os protocolos descritos nesta apresentação descrevem como preparar a luciferina e como aplicá-la in vitro e in vivo, juntamente com orientações sobre a instalação de salas, capas de cultura tecidual, incubadoras e microscópios para experimentos que utilizam a bioluminescência. Nos experimentos representativos, foram utilizadas diferentes luciferases (NanoLuc, Gaussia luciferase) com diversas proteínas fotosensory (CRY/CIB, EL222, VVD, LOV) demonstrando os efeitos da bioluminescência versus luz física, co-transfecção versus proteínas de fusão, comparações sinal-ruído e diferentes ensaios de leitura. Mais aplicações de bioluminescência ativando proteínas fotosensory são descritas em publicações de vários grupos, visando a indução de morte celular, síntese de cAMP e movimento proteico, além de transcrição (Tabela 1).
Simplesmente co-transfecionar componentes emissores de luz e detecção de luz é um bom começo. As variáveis são as relações molares do emissor e do sensor; desconhecidos são níveis de fundo de atividade do sensor no escuro, atividade do sensor em relação à intensidade e duração da luz, e a eficiência da ativação do sensor comparando a luz física e biológica. Enquanto os construtos de fusão têm a vantagem de manter a relação molar de emissor e sensor em 1:1 e trazer o emissor de luz perto do domínio de sensor de luz, outras considerações entram em jogo, como onde amarrar (N ou C-terminus) e como ligar (comprimento e composição do linker) sem impactar o desempenho do atuador fotosensório. 
Para experimentos in vitro e in vivo, existem múltiplas opções para afinar a emissão de luz bioluminescente, seja variando a concentração da luciferina, e/ou variando o tempo em que a luciferina é disponibilizada para o respectivo sensor. O valor e o tempo mínimos são determinados pela presença ou ausência do efeito esperado com a ativação da luz. Em contraste, as respectivas máximas são determinadas principalmente pela tolerância das células às altas concentrações de luciferina em tempos prolongados. A concentração de CTZ escolhida nos exemplos acima, de 100 μM, é próxima do limite superior para vários tipos de células, de células HEK293 a neurônios. O objetivo é usar o menor nível possível de concentração para conseguir a ativação do domínio de fotosensão direcionado. Isso será conseguido mais facilmente usando luciferases com alta emissão de luz e fotorreceptores com alta sensibilidade à luz.
A bioluminescência para fotorreceptores de condução tem sido usada em roedores (ratos, ratos) com proteínas de fotosensão expressas no fígado, músculo, medula espinhal e cérebro, bem como através de células expressas por fotoreceptores transplantadas subcutânea ou intraperitonel. Em princípio, não há limites que impeçam que a abordagem seja aplicada a diferentes espécies, desde primatas não humanos até peixes ou moscas. Dependendo da permeabilidade do organismo para a luciferina, a aplicação pode ser tão fácil quanto aplicar a luciferina na água circundante (por exemplo, em larvas de peixe30). Antes de usar o BL-OG em qualquer novo organismo, os experimentos piloto devem ser realizados para garantir que a luciferina atinja seus alvos através da rota de aplicação escolhida.
Aspectos críticos do desenho experimental são os diversos controles que são importantes para a interpretação dos resultados. As células que expressam um repórter impulsionado por uma luciferase agindo em uma proteína fotossensorial devem ser comparadas com células que não têm a luciferase ou não têm a proteína fotossensorial. Além disso, devem ser feitas comparações entre células expostas à luciferina, veículo ou mantidas no escuro. Também é importante perceber as limitações de diferentes ensaios para avaliar os efeitos da ativação do fotorreceptor orientado pela bioluminescência. Por exemplo, a eficácia da transcrição ativada pela bioluminescência pode ser testada de diferentes maneiras, dependendo se o gene repórter é uma luciferase ortogonal (luminômetro, IVIS), ou uma proteína fluorescente (classificação celular ativada por fluorescência, análise de imagem de microscopia). Embora os efeitos básicos devam ser reprodutíveis entre as plataformas de teste, os aspectos quantitativos dos efeitos podem variar consideravelmente.
A ativação da bioluminescência de fotorreceptores tem sido demonstrada até agora para um número limitado de luciferases e proteínas fotosensory, respectivamente, tanto in vitro quanto in vivo. Pode ser estendido à grande classe de fotorreceptores para ativar muitos outros processos biológicos. Tal expansão da abordagem é ainda mais promovida pelo desenvolvimento contínuo de novos pares de proteínas luciferase-fluorescência com emissão de luz muito maior do que as luciferases de ocorrência natural e com características cinéticas incapazes de diferentes aplicações. Esses avanços são paralelos pela geração de novas luciferinas, aumentando ainda mais o brilho e as paletas de cores29. Esta plataforma de ferramentas oferece aplicativos para manipular e investigar dinâmicas intracelulares e interações celulares dentro de células vivas, tecidos e organismos.

Proteínas fotossensoriais podem ser ativadas pela luz de uma fonte de luz física ou de uma enzima luciferase na presença de seu substrato, a luciferina, para gerar bioluminescência. Para aplicações que requerem escalas de tempo mili ou mesmo femtosegundos e/ou resolução espacial unicelular, as fontes de luz física (lasers e diodos emissores de luz (LEDs)) são as únicas incapazes dessas escalas. Exemplos são a restrição espacial da luz usada para estimular polos opostos no desenvolvimento de larvas de Drosophila com controle temporal milissegundo1 ou a estimulação precisa de estruturas subcelulares únicas, como túbulos mitocondriais2. No entanto, muitas outras aplicações para switches ópticos têm prioridades diferentes, incluindo controle espacial estendido e aplicação repetida não invasiva e sem dano à luz, mas com controle temporal definido em escalas de tempo minúsculas e intensidades tunable. Aqui, usar as luciferases como fonte de luz alternativa para ativar domínios de sensor de luz tem várias vantagens. Em contraste com a ativação da luz de fibra óptica, a bioluminescência atinge todos os domínios de sensoriamento de luz expressos na população celular-alvo à medida que a fonte de luz é geneticamente codificada. O uso da bioluminescência alivia as preocupações com os danos teciduais e celulares por fibra óptica e exposição prolongada à luz física. A luz é acesa com a aplicação do substrato luciferase. O início é imediato in vitro e in vivo dependendo da rota da administração e dura ~15-30 min; presença estendida ou estimulação afásica de luz pode ser alcançada com diferentes luciferinas e com aplicações adicionais ou repetidas de substrato3. Por fim, a emissão de bioluminescência pode ser ajustada variando a concentração de luciferina.
O uso de bioluminescência para ativar fotorreceptores em movimento de íons, ou seja, elementos optogenéticos, como channelrhodopsins ou bombas, tem sido amplamente demonstrado4,5,6,7,8. Esta abordagem BioLuminescente OptoGenetics (BL-OG) tem sido empregada em experimentos in vivo em camundongos e ratos5,6,7,9,10,11,12. A ativação bl-OG de opsinas exigiu uma quantidade de bioluminescência de pelo menos ~33 μW/mm2, com a eficiência da ativação aumentando com maior emissão de luz6,9. Fotorreceptores sensoriais em movimento de íons são um subgrupo do grande contingente de fotorreceptores sensoriais encontrados na natureza que não são ion movendo13,14. A extensão da bioluminescência para ativar fotorreceptores móveis não-íons, como o fotosensing de domínios de plantas ou bactérias, é incentivada por relatórios15,16 de que fotosensores móveis não-íons são significativamente mais sensíveis à luz do que os canalrhodopsinas, garantindo um impulso ainda melhor de sensores de luz com bioluminescência do que já obtidos com elementos optogenéticos em movimento de íons. Recentemente, várias publicações relataram o uso da bioluminescência como fonte de luz para a ativação de uma variedade de fotorreceptores, incluindo domínios de sensoriamento de temporais de luz-oxigênio (LOV), domínios de blue-light-using-flavin (BLUF) e criptocromos (CRYs)3,17,18,19,20,21,22 (Tabela 1 ). Aplicações para ativação orientada à bioluminescência de switches ópticos direcionadas a processos intracelulares que vão desde morte celular induzida por espécies de oxigênio reativo, síntese cAMP, recrutamento e dissociação de proteínas até recombinação genômica e indução da transcrição.
Este protocolo descreve o desenho geral de ferramentas optogenéticas orientadas à bioluminescência e detalha os procedimentos para a execução experimental da ativação da bioluminescência em células e organismos. Inclui descrições sobre como montar uma sala, uma capa de cultura de tecido e incubadora, e um microscópio para trabalhar com bioluminescência, bem como os passos de preparar a luciferina para aplicá-la. Este protocolo fornece aos pesquisadores os procedimentos básicos para a realização de BioLuminescente OptoGenetics (BL-OG) in vitro e in vivo. As abordagens descritas podem ser ainda mais estendidas e individualizadas a diferentes paradigmas experimentais. Antecipamos esse protocolo para facilitar a adoção do uso da bioluminescência em estudos biológicos optogenéticos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI 25W Deep Red 660 nm LED Light Bulb</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>to be used with any lamp stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Black Microcentrifuge Tubes, 0.5 mL, Argos Technologies</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL, Argos Technologies</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric (1.5 m x 2.7 m) x 0.12 mm (thick)</td>
			<td>THOR LABS</td>
			<td>BK-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C120-Fluc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>K. Gardner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8106; CAS: 10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca-FLARE protease, transcription factor and reporter</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 92214, 92213, 92202</td>
			<td>A. Ting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIB-VP64 (B1016)</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 92037</td>
			<td>C. Tucker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRY-Gal&#916;DD (B1013)</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 92035</td>
			<td>C. Tucker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTZ</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>303</td>
			<td>formulation for in vitro applications with Gaussia luciferases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTZ (Water soluble native coelenterazine)</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>3031</td>
			<td>formulation for in vivo applications with Gaussia luciferases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270; CAS: 50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCTZ</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>301</td>
			<td>formulation for in vitro applications with Oplophorus luciferases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375; CAS: 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCreV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A. Cetin and H. Zeng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Imaging System (IVIS)</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>Lumina LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405; CAS: 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Array Driver</td>
			<td>Amuza</td>
			<td>LAD-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Array for Multiwell Plates</td>
			<td>Amuza</td>
			<td>LEDA-x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670; CAS: 7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653; CAS: 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFuel Solvent</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>399</td>
			<td>for dissolving CTZ preparations for in vitro use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465; CAS: 1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NES-CRY2PHR-TevC</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 89877</td>
			<td>H. Kwon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11058021</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDL coated coverslips (12 mm, 15 mm, 18 mm)</td>
			<td>Neuvitro Corporation</td>
			<td>GG-12-PDL, GG-15-PDL , GG-18-PDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL2-GAL4-UAS-Luc</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #33020</td>
			<td>M. Walsh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizmatix USB Pulser TTL Generator for Optogenetics</td>
			<td>Goldstone Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 89878</td>
			<td>H. Kwon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vehicle (Water-soluble carrier without CTZ)</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>3031C</td>
			<td>control for in vivo applications with CTZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VP-EL222</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>K. Gardner</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescent optogenetics 2.0: harnessing bioluminescence to activate photosensory proteins in vitro and in vivo

A bioluminescência - luz emitida por uma enzima luciferase oxidando um substrato de molécula pequena, uma luciferina - tem sido usada in vitro e in vivo para ativar canais de íons e bombas de íons com entrada de luz em neurônios. Embora essa abordagem bioluminescente optogenética (BL-OG) confere um componente quimigenético às ferramentas optogenéticas, não se limita ao uso na neurociência. Em vez disso, a bioluminescência pode ser aproveitada para ativar qualquer proteína fotossensorial, permitindo assim a manipulação de uma infinidade de funções mediadas pela luz nas células. Uma variedade de pares de luciferase-luciferina pode ser combinada com proteínas fotossensoriais que requerem diferentes comprimentos de onda de intensidades de luz e luz.
Dependendo da aplicação específica, a entrega de luz eficiente pode ser alcançada usando proteínas de fusão de fotorreceptores de luciferase ou por co-transfecção simples. Proteínas fotossoriais baseadas em dimerização dependente da luz ou alterações conformais podem ser impulsionadas pela bioluminescência para efetivar processos celulares desde a localização de proteínas, regulação de vias de sinalização intracelulares até a transcrição. O protocolo abaixo detalha a execução experimental da ativação da bioluminescência em células e organismos e descreve os resultados usando recombinases orientadas por bioluminescência e fatores de transcrição. O protocolo fornece aos investigadores os procedimentos básicos para a realização de optogenética bioluminescente in vitro e in vivo. As abordagens descritas podem ser ainda mais estendidas e individualizadas para uma infinidade de diferentes paradigmas experimentais.

Existem inúmeros eventos intracelulares que podem ser manipulados com atuadores respondendo à luz, e que são favoráveis à ativação de bimodais com fontes de luz físicas e biológicas. Abaixo estão exemplos que empregam um integrador de cálcio fotoensiva (Ca2+), translocação de proteína induzida pela luz, um fator de transcrição de detecção de luz e uma recombinase fotossensitiva. Os exemplos ilustram a viabilidade do uso da bioluminescência para ativar vários tipos de fotorreceptores. Os experimentos apresentados não foram especificamente otimizados no que diz respeito à aplicação de diodo emissor de luz (LED), à luciferase escolhida ou com relação às concentrações e tempo de aplicação da luciferina.
A expressão rápida regulada por luz e atividade (FLARE) é um sistema optogenético que permite a transcrição de um gene repórter com a co-incidência de ca2+ intracelular aumentado e light23 (Figura 4A). A presença do Ca2+ é necessária para trazer a protease nas proximidades do local de decote protease acessível apenas com estimulação de luz, resultando na liberação do fator de transcrição. As células HEK293 foram co-transfeinadas com os componentes FLARE originais, uma construção de repórter firefly duplo (FLuc)-dTomato, e uma variante de luciferase gaussia ancorada em membrana sbGLuc6. Na presença de ca2+ intracelular aumentado através da exposição de células a 2 μM de ionomicina e cloreto de cálcio de 5 mM (CaCl2), a aplicação de LED azul levou à expressão robusta do repórter de fluorescência em comparação com as células deixadas no escuro, bem como à expressão de FLuc determinada pela medição da luminescência ao adicionar o substrato FLuc, D-luciferina. Níveis semelhantes de expressão FLuc foram alcançados com bioluminescência emitida pelo sbGLuc após a aplicação do substrato sbGLuc (CTZ) juntamente com ionomicina e CaCl2. Note que as luciferases utilizadas para ativação de luz (sbGLuc) e para relatar o efeito da ativação da luz (transcrição de FLuc) só produzem luz com suas respectivas luciferinas (CTZ vs. D-luciferina) e não reagem cruzadamente.
Diferentes componentes foram combinados para gerar um sistema de transcrição induzido pela luz com base na heterodimerização dos criptocromatos23,24 (Figura 4B). Cry2 foi fundido a uma protease enquanto o CIB ligado à membrana foi fundido ao local de decote protease e ao fator de transcrição. A translocação de proteína induzida pela luz liberou o fator de transcrição, levando à expressão de FLuc e dTomato, como mostrado na Figura 4A. Enquanto a presença do componente do fator de transcrição por si só resultou em um considerável sinal de fundo possivelmente devido à proteólise espontânea, tanto a luz física (LED) quanto a bioluminescência (CTZ) aumentaram robustamente a expressão do FLuc medida em um sistema de imagem in vivo (IVIS).
Em outro conjunto de experimentos, nanoluc (luciferina: furimazine ou hCTZ) foi empregado para a regulação optogenética da transcrição através da dimerização do CRY/CIB e do fator de transcrição fotossensível, EL22225,26,27. Figura 5A,B mostram os esquemas dos diferentes componentes nos estados escuros e claros e a luciferase co-transfilvada ou fundida ao sensor de luz. Várias comparações são mostradas na Figura 5C. A bioluminescência, induzida pela adição de hCTZ às células HEK293 expressando os construtos e removendo-os após 15 minutos, foi mais eficiente na transcrição do repórter de condução do que 20 minutos de exposição à luz LED tanto para CRY/CIB quanto para EL222. Para o CRY/CIB, uma hora de exposição ao LED foi suficiente para atingir um nível de transcrição comparável a 15 min de bioluminescência. Em contraste, para el222, mesmo 60 min de LED eram apenas metade tão eficaz quanto uma breve exposição à bioluminescência. Não houve diferenças significativas na eficácia da transcrição entre os dois sistemas quando co-transfeinados, embora as proteínas de fusão do CRY/CIB fossem mais eficientes do que as de EL222. Para ambos os sistemas, as proteínas de fusão levaram a níveis de transcrição significativamente mais elevados do que os componentes co-transfectados. O CRY/CIB mostrou níveis de fundo consistentemente mais elevados com a aplicação do veículo em comparação com o EL222, que tinha transcrição de fundo insignificante. O aumento das concentrações de hCTZ por si só não teve efeito na transcrição do gene repórter.
As recombinases fotoativas fornecem uma ferramenta versátil para manipulações optogenomicas. Testamos a ativação da bioluminescência de uma recombinase de cre dividida fotosensível baseada na proteína Vivid LOV, iCreV28. A Figura 6A mostra um esquema dos diferentes componentes, sbGLuc, iCreV e um repórter de fluorescência lox-stop-lox (tdTomato) antes e depois da aplicação do CTZ. Os resultados da aplicação CTZ relativa aos controles (sem CTZ ou LED) são mostrados na Figura 6B. Há alguma expressão de fundo mesmo no escuro (sem CTZ); no entanto, na presença de CTZ, a expressão é robustamente aumentada em segundo plano e semelhante à induzida com aplicação LED.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig01.jpg"> Figura 1: Incubadora selada à luz. Retalho de caixa de papelão cobrindo a luz do painel de controle iluminado (seta superior). Tampa impermeável à luz sobre a porta de vidro da incubadora (seta inferior) para proteger as células da exposição à luz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig02.jpg"> Figura 2: Capô de fluxo laminar iluminado pela luz vermelha. Configuração mostrando um capô padrão de cultura de tecido de fluxo laminar sendo iluminado pela luz vermelha. A seta indica uma lâmpada de desktop padrão com uma lâmpada vermelha. Todas as manipulações sob a luz vermelha são realizadas em uma sala de outra forma escura e clara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig03.jpg"> Figura 3: Compartimentos leves ao redor de microscópios de imagem de células vivas. Dois exemplos de configurações de microscópio de imagem de células vivas mostrando o uso de uma caixa sólida com cortinas de plástico apenas na parte frontal (painéis esquerdos: superior e inferior) ou cortinas pretas ao redor da configuração de imagem (painéis direito: superior e inferior). As laterais dianteiras em ambos os exemplos permanecem abertas e enroladas quando não estão em uso (painéis superiores: esquerda e direita). As cortinas pretas dianteiras são enroladas para evitar que qualquer luz na sala (por exemplo, telas de computador) entre na área de imagem ao realizar estimulação de bioluminescência de células vivas e/ou imagem (painéis inferiores: esquerdo e direito). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig04.jpg"> Figura 4: Bioluminescência para integração de eventos de sinalização intracelular. (A) Esquemas dos componentes FLARE co-transfeinados com sbGLuc. Na presença do Ca2+ e na consequente proximidade da protease ao local do decote protease, seja bioluminescência ou LED levará ao desdobramento do LOV, exposição do local do decote e liberação do fator de transcrição. As células foram expostas ao LED (ciclo de serviço 33%, 2 s on/4 s off por 40 min; 3,5 mW de potência leve, irradiação de 4,72 mW/cm2 ) ou à bioluminescência (concentração final de CTZ de 100 μM por 15 min) ou deixada no escuro. Imagens microscópicas de células HEK293 expressando os componentes acima após o tratamento para aumentar os níveis de Ca2+ e exposição ao LED (esquerda). Luminescência FLuc medida em um luminômetro comparando exposição a LED, bioluminescência (CTZ) ou esquerda no escuro (direita). (B) Esquemas de um sistema de transcrição não-Ca2+dependente co-transinfetado com sbGLuc. As células HEK293 em placas de 4 poços foram transfeinadas com quatro arranjos diferentes de componentes, como descrito no esquema. As placas foram expostas a LED (ciclo de serviço 33%, 2 s on/4 s off por 40 min; 3,5 mW de potência leve, irradiação de 4,72 mW/cm2 ) ou bioluminescência (concentração final de CTZ de 100 μM) adicionando CTZ e deixando-a acesa por 15 min; placas de controle foram deixados no escuro. A transcrição do repórter da FLuc foi medida em um IVIS. Imagens IVIS de pratos representativos são mostradas à esquerda; medições de brilho de várias réplicas baseadas nos controles escuros são mostradas à direita. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: FLARE = Expressão rápida regulada pela luz e atividade; LOV = detecção de luz-oxigênio-tensão; LED = diodo emissor de luz; CTZ = coelenterazina; FLuc = luciferase de vagalume; dTom = dTomato; CRY2 = criptocromo 2; CRY2PHR = região de folologia fotolyase CRY2; CIB1 = Ca2+- e proteína de ligação de integrin 1; CIBN = N-terminus de CIB1; IVIS = sistema de imagem in vivo . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig05.jpg"> Figura 5: Bioluminescência para transcrição de condução. (A) Esquemas de dois sistemas de transcrição fotoativatáveis em seus estados escuros e claros. (B) NanoLuc foi co-transfectado ou fundido às moieties de detecção de luz como retratado (N-NanoLuc-CRY-GalDD-C; N-NanoLuc-VP16-EL222-C). (C) Comparações utilizando ambos os sistemas em relação a fontes de luz, projeto de construção e sinal ao ruído. As células foram expostas ao LED (ciclo de serviço 33%, 2 s on/4 s off por 40 min; 3,5 mW de potência luminosa, irradiação de 4,72 mW/cm2 ) ou à bioluminescência por 15 min (concentração final de 100 μM hCTZ; exceto quando diferentes concentrações são observadas). Escuras, as placas foram deixadas intocadas na incubadora entre a transformação inicial de plasmídeos e a medição do FLuc; VEH, as placas eram manuseadas da mesma forma que as que recebiam hCTZ, mas recebiam o veículo. Diferenças nos níveis de transcrição: hCTZ, CRY co-transfectado vs. EL222 - não significativas; hCTZ, luciferase - fusão de fotoproteína CRY vs. EL222 - p < 0,005; hCTZ, CO-transfecção CRY vs. fusão - p < 0,005; hCTZ, co-transfecção EL222 vs. fusão - p < 0,01; veículo, CRY vs. EL222 - p < 0,05. Abreviaturas: UAS = sequência de ativação a montante; LED = diodo emissor de luz; CTZ = coelenterazina; FLuc = luciferase de vagalume; CRY = criptocromo; CIB = Ca2+- e proteína de ligação de integrin; VEH = veículo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig06.jpg"> Figura 6: Bioluminescência para manipulação optogenomic. (A) Esquemas de manipulação optogenomic orientada à bioluminescência usando sbGLuc, os componentes de iCreV divididos e um repórter LSL, antes e depois da aplicação da luz. (B) As células HEK293 foram lipofectadas com plasmídeos, depois mantidas no escuro. Vinte e quatro horas depois, as células foram tratadas por 30 minutos com apenas médio (sem CTZ) ou com CTZ (concentração final de 100 μM) ou com LED (ciclo de serviço 25%, 5 s on/15 s off por 5 min; 14,81 mW de energia leve, irradiação de 20 mW/cm2 ) como controle positivo. Imagens microscópicas da fluorescência tdTomato usando condições conforme indicado. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: LSL = lox-stop-lox; CTZ = coelenterazina; LED = diodo emissor de luz; VVD = Vívido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Ativação bioluminescência de fotorreceptores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%201_revised.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 2: Diretrizes para emplacamento e transfeminação de células em diferentes formatos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%202_revised.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 3: Proporções de vários plasmídeos para transfecção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%203.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 4: Rotas de injeção, volumes e concentrações de luciferina para aplicações in vivo (mouse de 25 g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%204.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

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Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

A luz de bioluminescência emitida por uma enzima luciferase oxidando um substrato de molécula pequena, uma luciferina pode ser aproveitada para ativar proteínas fotosensoriais, adicionando assim outra dimensão à estimulação da luz e permitindo a manipulação de uma infinidade de funções mediadas pela luz em células através de escalas temporais e espaciais.

Bioluminescente Optogenética 2.0: Aproveitamento da Bioluminescência para Ativar Proteínas Fotosensory In Vitro e In Vivo

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate ...

1 (tons eletrônicos)A bioluminescente optogenética é uma tecnologia de plataforma na qual fontes de luz geneticamente codificadas podem visualizar e controlar funções biológicas e redes dentro e entre células. A bioluminescência atinge todos os domínios de sensoriamento de luz expressos na população celular-alvo sem qualquer dano tecidual e celular por fibra óptica e exposição prolongada à luz física. Para começar, comece a preparar o estoque de Luciferina dissolvendo cinco miligramas de CTZ liofilizado em 250 microliters de seu respectivo solvente.Certifique-se de dissolução de CTZ ao longo das paredes por pipetação. Enquanto protege o frasco da luz direta, prepare 50 alíquotas de microliter em tubos de microcentrifusagem preto de 0,5 mililitro e armazene as alíquotas a menos 80 graus Celsius para uso futuro. Realize todas as outras manipulações em uma sala apertada em um capô de fluxo laminar iluminado pela luz vermelha.Para realizar uma estimulação de luz de bioluminescência única, prepare uma solução de trabalho da Luciferina em um meio de cultura celular, pouco antes de adicionar às células em uma concentração final de 100 micromolar. Adicione o meio contendo luciferina às células e incubar para a duração desejada da estimulação da luz. Desligue a luz vermelha.Depois de esperar alguns segundos até que os olhos se ajustem para completar a escuridão, monitore a emissão de luz olho a olho. Documente a emissão de luz tirando uma foto. Termine a estimulação da luz substituindo o meio contendo luciferina pelo meio de cultura, depois lave as células com o meio de cultura uma ou duas vezes para eliminar toda a Luciferina, dependendo da sensibilidade do experimento.Para evitar a perda de células, coloque as células em pratos revestidos de PDL e incuba as células. Para realizar repetidas estimulações de luz de bioluminescência, configure a câmara de imagem celular viva criando um compartimento leve e apertado ao redor do microscópio de imagem celular ao vivo usando uma caixa e folhas pretas. Certifique-se de cobrir todas as fontes de luz presentes dentro da sala.Configure o sistema de perfusão com a solução desejada para a entrada e a saída da câmara levando a um recipiente de resíduos. Dependendo do número de estimulações repetidas, aliquot a solução de imagem lúciferina preparada nos tubos de microcentrifuge. Coloque uma mancha de cobertura com células transfeinadas na câmara.Enquanto a bomba estiver funcionando, remova o tubo de entrada da bomba do béquer de entrada. Imerque rapidamente o tubo de entrada na solução de Luciferina, mantendo o tempo de transição curto para evitar qualquer vazio de ar na tubulação. Assim que a solução de Luciferina for retomada, coloque o tubo de entrada de volta no béquer de entrada.Repita a remoção e imersão do tubo de entrada em Luciferina quantas vezes for necessário nos intervalos de vários minutos a horas, dependendo do padrão fisiológico ao qual as células devem ser expostas. Em seguida, mantenha as células em um ambiente protegido pela luz por 16 a 24 horas para transcrição ou duração até que o efeito da estimulação da luz seja avaliado. Para realizar a ativação da bioluminescência in vivo, prepare a Luciferin tirando um frasco de CTZ a menos 80 graus Celsius, depois deixe-o aquecido à temperatura ambiente na área protegida pela luz.Para cada frasco contendo 500 microgramas de CTZ, adicione 250 microliters de água estéril usando uma pipeta e coloque a rolha de borracha de volta no frasco. Incubar o frasco de vidro reconstituído em um banho de água temperado a 55 graus Celsius por alguns minutos para dissolver completamente o pó. Transfira a solução para um tubo de microcentrifuuagem preto e enxágue as paredes para recuperar todo o CTZ.Depois de remover a quantidade de solução necessária, armazene a solução restante a quatro graus Celsius. Após a preparação, reconstituição e aliquotação do veículo de forma semelhante, preforme a estimulação da luz de bioluminescência removendo o volume de Luciferina ou veículo necessário para o tamanho do animal e rota de aplicação escolhida. Injete o animal com Lúciferina ou veículo conforme projetado.Para a ativação recombina desejada durante um paradigma comportamental específico, injete o animal pouco antes do teste comportamental. Para transcrição afásica, injete o animal repetidamente ao longo dos dias e colete os dados da bioluminescência estimulada animal conforme projetado. O sistema de expressão regulado por luz rápida e atividade permitiu a transcrição do gene repórter com íons de cálcio intracelulares aumentados e luz.O LED azul levou a uma forte fluorescência de repórteres e a expressão FLuc foi determinada por medidas de luminescência após a adição de Luciferina. Em um sistema de imagem in vivo, tanto led quanto CTZ aumentaram robustamente a expressão FLuc, enquanto a presença do componente fator de transcrição sozinho resultou em um sinal de fundo considerável, possivelmente devido à proteólise espontânea. A NanoLuc foi empregada para regulação optogênica através do fator de dimerização cry/CIB e transcrição fotossensível EL222.A bioluminescência induzida pela adição de hCTZ às células HEK-293 e sua remoção após 15 minutos foi mais eficiente do que 20 minutos de exposição led para CRY/CIB e EL222. Não foram observadas diferenças significativas na eficácia da transcrição entre os dois sistemas quando co-transfeinadas com hCTZ, embora as proteínas de fusão de CRY/CIB fossem mais eficientes que el222. O CRY/CIB apresentou níveis de fundo consistentemente mais elevados em comparação com o EL222 independente da concentração de hCTZ.A bioluminescência de uma recombinase de cre dividido fotoensiva baseada na proteína VVD LOV iCreV foi testada. Os resultados do aplicativo CTZ revelaram que a presença de CTZ aumentou robustamente a expressão em segundo plano e é semelhante à aplicação LED. O uso da bioluminescência para ativar não apenas fotorreceptores móveis de ferro, mas qualquer domínio fotosensor adiciona outra dimensão à estimulação da luz expandindo a manipulação das funções celulares através de escalas temporais e espaciais.A optogenética bioluminescente tem sido aplicada em células e organismos modelo. Esses protocolos podem ser personalizados para testar uma ampla gama de hipóteses direcionadas in vitro e in vivo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Bioquímica

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Preparação de hidrolisado de queratina de penas de galinha e sua aplicação em cosméticos

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

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In Situ Medição e correlação da densidade celular e emissão de luz de bactérias bioluminescentes

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolamento de glomérulos e In Vivo de rotulagem das proteínas de superfície celular Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Como quantificar a fração de proteínas fluorescentes fotoativo a granel e em células vivas

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutagenesis local-dirigido para In Vitro e In Vivo experimentos exemplificados com interações de RNA em Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Secção Transversa de Arroz Maduro (Oryza sativa L.) Kernels para digitalização de imagens de microscopia eletrônica usando dicas de pipeta como suporte à imobilização

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...