Name: bioluminescent optogenetics 2.0: harnessing bioluminescence to activate photosensory proteins in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-08-04T14:30:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Мы благодарим наших коллег за конструкции, в частности, А. Тинга за протеазу Ca-FLARE, транскрипционный фактор и репортер (Addgene # 92214, 92213, 92202), Х. Квона для TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 и NES-CRY2PHR-TevC (Addgene # 89878, 89877), C. Tucker для CRY-GalΔDD (B1013) и CIB-VP64 (B1016) (Addgene # 92035, 92037), М. Уолша для pGL2-GAL4-UAS-Luc (Addgene #33020), К. Гарднера за VP-EL222 и C120-Fluc, а также А. Цетина и Х. Зенга за то, что они сделали iCreV доступным перед публикацией. Эта работа была поддержана грантами NSF (NeuroNex 1707352), NIH (U01NS099709), Фонда W.M. Keck и Шведского исследовательского совета A.B. (2016-06760).

<ol>
	<li>Johnson, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+limits+of+developmental+Erk+signaling.">The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling.</a> Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of Biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+BRET-based+optogenetic+device+for+pulsatile+transgene+expression+enabling+glucose+homeostasis+in+mice.">A synthetic BRET-based optogenetic device for pulsatile transgene expression enabling glucose homeostasis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 615 (2021).</li><li>Berglund, K., Birkner, E., Augustine, G. J., Hochgeschwender, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+channelrhodopsins+for+combined+optogenetic+and+chemical-genetic+control+of+neurons.">Light-emitting channelrhodopsins for combined optogenetic and chemical-genetic control of neurons.</a> PLoS One. 8 (3), 59759 (2013).</li><li>Tung, J. K., Gutekunst, C. -. A., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+luminopsins:+genetically-encoded+bioluminescent+opsins+for+versatile,+scalable,+and+hardware-independent+optogenetic+inhibition.">Inhibitory luminopsins: genetically-encoded bioluminescent opsins for versatile, scalable, and hardware-independent optogenetic inhibition.</a> Scientific Reports. 5, 14366 (2015).</li><li>Berglund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminopsins+integrate+opto-+and+chemogenetics+by+using+physical+and+biological+light+sources+for+opsin+activation.">Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (3), 358-367 (2016).</li><li>Gomez-Ramirez, M., More, A. I., Friedman, N. G., Hochgeschwender, U., Moore, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BioLuminescent-OptoGenetic+in+vivo+response+to+coelenterazine+is+proportional,+sensitive+and+specific+in+neocortex.">The BioLuminescent-OptoGenetic in vivo response to coelenterazine is proportional, sensitive and specific in neocortex.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 471-480 (2020).</li><li>Moore, C. I., Berglund, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BL-OG:+BioLuminescent-OptoGenetics.">BL-OG: BioLuminescent-OptoGenetics.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 469-470 (2020).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+luciferase-opsin+combinations+for+improved+luminopsins.">Novel luciferase-opsin combinations for improved luminopsins.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 410-421 (2020).</li><li>Jaiswal, P. B., Tung, J. K., Gross, R. E., English, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motoneuron+activity+is+required+for+enhancements+in+functional+recovery+after+peripheral+nerve+injury+in+exercised+female+mice.">Motoneuron activity is required for enhancements in functional recovery after peripheral nerve injury in exercised female mice.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 448-457 (2020).</li><li>Zenchak, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence-driven+optogenetic+activation+of+transplanted+neural+precursor+cells+improves+motor+deficits+in+a+Parkinson's+disease+mouse+model.">Bioluminescence-driven optogenetic activation of transplanted neural precursor cells improves motor deficits in a Parkinson's disease mouse model.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 458-468 (2020).</li><li>Tung, J. K., Shiu, F. H., Ding, K., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+activated+luminopsins+allow+optogenetic+inhibition+of+distributed+nodes+in+an+epileptic+network+for+non-invasive+and+multi-site+suppression+of+seizure+activity.">Chemically activated luminopsins allow optogenetic inhibition of distributed nodes in an epileptic network for non-invasive and multi-site suppression of seizure activity.</a> Neurobiology of Disease. 109, 1-10 (2018).</li><li>Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algal+sensory+photoreceptors.">Algal sensory photoreceptors.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 167-189 (2008).</li><li>Losi, A., Gardner, K. H., Moglich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-light+receptors+for+optogenetics.">Blue-light receptors for optogenetics.</a> Chemical Reviews. 118 (21), 10659-10709 (2018).</li><li>Proshkina, G. M., Shramova, E. I., Shilova, O. N., Ryabova, A. V., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+of+flavoprotein+miniSOG+induced+by+bioluminescence+resonance+energy+transfer+in+genetically+encoded+system+NanoLuc-miniSOG+is+comparable+with+its+LED-excited+phototoxicity.">Phototoxicity of flavoprotein miniSOG induced by bioluminescence resonance energy transfer in genetically encoded system NanoLuc-miniSOG is comparable with its LED-excited phototoxicity.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 188, 107-115 (2018).</li><li>Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+Cre-loxP+recombination+system+for+optogenetic+genome+engineering.">A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering.</a> Nature Chemical Biology. 12 (12), 1059-1064 (2016).</li><li>Shramova, E. I., Proshkina, G. M., Chumakov, S. P., Khodarovich, Y. M., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavoprotein+miniSOG+cytotoxisity+can+be+induced+by+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Flavoprotein miniSOG cytotoxisity can be induced by bioluminescence resonance energy transfer.</a> Acta Naturae. 8 (4), 118-123 (2016).</li><li>Naim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence-activated+nucleotide+cyclase+regulates+spatial+and+temporal+cAMP+synthesis.">Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).</li><li>Kim, C. K., Cho, K. F., Kim, M. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase-LOV+BRET+enables+versatile+and+specific+transcriptional+readout+of+cellular+protein-protein+interactions.">Luciferase-LOV BRET enables versatile and specific transcriptional readout of cellular protein-protein interactions.</a> Elife. 8, 43826 (2019).</li><li>Parag-Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+BRET-based+biologic+light+sources+enable+spatiotemporal+control+over+diverse+optogenetic+systems.">Engineered BRET-based biologic light sources enable spatiotemporal control over diverse optogenetic systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 1-9 (2020).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-luminescent+photodynamic+therapy+using+breast+cancer+targeted+proteins.">Self-luminescent photodynamic therapy using breast cancer targeted proteins.</a> Science Advances. 6 (37), (2020).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Molecular+calcium+integrator+reveals+a+striatal+cell+type+driving+aversion.">A Molecular calcium integrator reveals a striatal cell type driving aversion.</a> Cell. 183 (7), 2003-2019 (2020).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-+and+calcium-gated+transcription+factor+for+imaging+and+manipulating+activated+neurons.">A light- and calcium-gated transcription factor for imaging and manipulating activated neurons.</a> Nature Biotechnology. 35 (9), 864-871 (2017).</li><li>Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium-+and+light-gated+switch+to+induce+gene+expression+in+activated+neurons.">A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons.</a> Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).</li><li>Pathak, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+approaches+for+optogenetic+regulation+of+gene+expression+in+mammalian+cells+using+Arabidopsis+cryptochrome+2.">Bidirectional approaches for optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using Arabidopsis cryptochrome 2.</a> Nucleic Acids Research. 45 (20), 167 (2017).</li><li>Nishio, H., Walsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCAAT+displacement+protein/cut+homolog+recruits+G9a+histone+lysine+methyltransferase+to+repress+transcription.">CCAAT displacement protein/cut homolog recruits G9a histone lysine methyltransferase to repress transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11257-11262 (2004).</li><li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics.">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecV+recombinase+system+for+in+vivo+targeted+optogenomic+modifications+of+single+cells+or+cell+populations.">RecV recombinase system for in vivo targeted optogenomic modifications of single cells or cell populations.</a> Nature Methods. 17 (4), 422-429 (2020).</li><li>Love, A. C., Prescher, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+(and+using)+the+light:+Recent+developments+in+bioluminescence+technology.">Seeing (and using) the light: Recent developments in bioluminescence technology.</a> Cell Chemical Biology. 27 (8), 904-920 (2020).</li><li>Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+neural+activity+with+bioluminescence+during+natural+behavior.">Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 513-520 (2010).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Существует ряд люцифераз и люциферинов с длинами волн светового излучения, соответствующими спектрам активации фотосенсорных белков от синего до красного света14,29. Помимо выравнивания длин волн излучения и возбуждения, нет надежного способа определить априори, какое сопряжение будет работать лучше всего. Таким образом, необходимо экспериментально определить, как работают пары люциферин-люцифераза в клетках и организмах при управлении фотосенсорными системами.
Протоколы, изложенные в этой презентации, описывают, как готовить люциферин и как применять его in vitro и in vivo, а также руководящие принципы по созданию комнат, вытяжек для культивирования тканей, инкубаторов и микроскопов для экспериментов с использованием биолюминесценции. В репрезентативных экспериментах использовались различные люциферазы (NanoLuc, Gaussia luciferase) с несколькими фотосенсорными белками (CRY/CIB, EL222, VVD, LOV), демонстрирующие эффекты биолюминесценции по сравнению с физическим светом, котрансфекции по сравнению с белками слияния, сравнения сигнал-шум и различные анализы считывания. Более широкое применение биолюминесцентных активирующих фотосенсорных белков описано в публикациях из нескольких групп, нацеленных на индукцию гибели клеток, синтез цАМФ и движение белка в дополнение к транскрипции (таблица 1).
Простое совместное трансфектирование светоизлучающих и светочувствительных компонентов является хорошим началом. Переменными являются молярные соотношения излучателя и датчика; Неизвестными являются фоновые уровни активности датчиков в темноте, активность датчиков по отношению к интенсивности и продолжительности света, а также эффективность активации датчика при сравнении физического и биологического света. В то время как конструкции синтеза имеют преимущество в том, что они сохраняют молярное соотношение излучателя и датчика на уровне 1:1 и приближают излучатель света к области светочувствительного, в игру вступают другие соображения, такие как где привязать (N- или C-конец) и как связать (длина и состав линкера), не влияя на производительность фотосенсорного привода. 
Для экспериментов как in vitro , так и in vivo существует несколько вариантов настройки биолюминесцентного излучения света, либо путем изменения концентрации люциферина, либо путем изменения времени, в течение которого люциферин становится доступным для соответствующего датчика. Минимальное количество и время определяются наличием или отсутствием эффекта, ожидаемого при световой активации. Напротив, соответствующие максимумы в основном определяются толерантностью клеток к высоким концентрациям люциферина в течение длительного времени. Концентрация CTZ, выбранная в приведенных выше примерах, 100 мкМ, близка к верхнему пределу для различных типов клеток, от клеток HEK293 до нейронов. Цель состоит в том, чтобы использовать как можно более низкую концентрацию в течение кратчайшего времени для достижения активации целевого фотозона. Это будет достигнуто более легко с помощью люцифераз с высоким световым излучением и фоторецепторов с высокой светочувствительностью.
Биолюминесценция для управления фоторецепторами использовалась у грызунов (мышей, крыс) с фотосенсорными белками, экспрессируемыми в печени, мышцах, спинном мозге и головном мозге, а также через фоторецептор-экспрессирующие клетки, пересаженные подкожно или внутрибрюшинно. В принципе, нет никаких ограничений, препятствующих применению этого подхода к различным видам, от нечеловеческих приматов до рыб или мух. В зависимости от проницаемости организма для люциферина, применение может быть таким же простым, как нанесение люциферина в окружающую воду (например, в личинках рыб30). Перед использованием BL-OG в любом новом организме необходимо провести пилотные эксперименты, чтобы убедиться, что люциферин достигает своих целей по выбранному маршруту применения.
Критическими аспектами экспериментального проектирования являются различные элементы управления, которые важны для интерпретации результатов. Клетки, экспрессирующие репортер, управляемый люциферазой, действующей на фотосенсорный белок, следует сравнивать с клетками, в которых отсутствует люцифераза или отсутствует фотосенсорный белок. Кроме того, следует проводить сравнения между клетками, подвергшимися воздействию люциферина, транспортным средством или содержащимися в темноте. Также важно осознать ограничения различных анализов для оценки эффектов активации фоторецепторов, управляемых биолюминесценцией. Например, эффективность биолюминесцентно-активированной транскрипции может быть проверена различными способами, в зависимости от того, является ли ген-репортер ортогональной люциферазой (люминометр, IVIS) или флуоресцентным белком (флуоресцентно-активированная сортировка клеток, анализ изображений микроскопии). Хотя основные эффекты должны быть воспроизводимыми на всех платформах тестирования, количественные аспекты эффектов могут значительно различаться.
До настоящего времени была продемонстрирована активация биолюминесценции фоторецепторов для ограниченного числа люцифераз и фотосенсорных белков, соответственно, как in vitro , так и in vivo. Он может быть распространен на большой класс фоторецепторов для активации многих других биологических процессов. Такому расширению подхода способствует непрерывная разработка новых люцифераз и люциферазно-флуоресцентных белковых пар с гораздо более высоким световым излучением, чем естественные люциферазы, и с кинетическими особенностями, настраиваемыми для различных применений. Эти достижения параллельны генерации новых люциферинов, что еще больше увеличивает яркость и цветовые палитры29. Эта инструментальная платформа предлагает приложения для манипулирования и исследования внутриклеточной динамики и клеточных взаимодействий внутри живых клеток, тканей и организмов.

Фотосенсорные белки могут быть активированы светом либо от физического источника света, либо от фермента люциферазы в присутствии его субстрата, люциферина, для генерации биолюминесценции. Для приложений, требующих милли- или даже фемтосекундных временных шкал и/или одноэлементного пространственного разрешения, физические источники света (лазеры и светодиоды (СВЕТОДИОДы)) являются единственными, настроенными на эти масштабы. Примерами являются пространственное ограничение света, используемое для стимуляции противоположных полюсов в развитии личинок дрозофилы с миллисекундным временным контролем1 или точная стимуляция одиночных субклеточных структур, таких как митохондриальные канальцы2. Однако многие другие приложения для оптических переключателей имеют другие приоритеты, включая расширенное пространственное управление и повторное применение неинвазивно и без повреждения светом, но с определенным временным управлением в минутных временных масштабах и настраиваемых интенсивностях. Здесь использование люцифераз в качестве альтернативного источника света для активации светочувствительных доменов имеет несколько преимуществ. В отличие от активации оптического волокна света, биолюминесценция достигает каждого светочувствительного домена, экспрессируемого в популяции клеток-мишеней, поскольку источник света генетически закодирован. Использование биолюминесценции снимает опасения по поводу повреждения тканей и клеток волоконной оптикой и расширенным физическим воздействием света. Свет включается при нанесении субстрата люциферазы. Начало происходит немедленно in vitro и in vivo в зависимости от пути введения и длится ~15-30 мин; расширенное присутствие или фазовая стимуляция света может быть достигнута с помощью различных люциферинов и при дополнительном или повторном применении субстрата3. Наконец, биолюминесцентное излучение может быть настроено путем изменения концентрации люциферина.
Широко продемонстрировано использование биолюминесценции для активации ионно-движущихся фоторецепторов, т.е. оптогенетических элементов, таких как канальные родопсины или насосы4,5,6,7,8. Этот подход BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) был использован в экспериментах in vivo на мышах и крысах5,6,7,9,10,11,12. Было обнаружено, что активация BL-OG опсинов требует количества биолюминесценции не менее ~33 мкВт/мм2, при этом эффективность активации увеличивается при более высоком световом излучении6,9. Ион-движущиеся сенсорные фоторецепторы представляют собой подгруппу большого контингента сенсорных фоторецепторов, обнаруженных в природе, которые являются неионными движущимися13,14. Распространение биолюминесценции на активацию неионных движущихся фоторецепторов, таких как фотозоны растений или бактерий, поощряется сообщениями15,16 о том, что неионные движущиеся фотодатчики значительно более светочувствительны, чем канальныеродопсины, обеспечивая еще лучший привод датчиков света с биолюминесценцией, чем уже полученные с ионными оптогенетическими элементами. Недавно в нескольких публикациях сообщалось об использовании биолюминесценции в качестве источника света для активации различных фоторецепторов, включая домены, чувствительные к напряжению света (LOV), домены, использующие синий свет (BLUF) и криптохромы (CRYs)3,17,18,19,20,21,22 (Таблица 1 ). Приложения для биолюминесцентной активации оптических переключателей нацелены на внутриклеточные процессы, начиная от гибели клеток, вызванной активными формами кислорода, синтеза цАМФ, рекрутирования и диссоциации белка до геномной рекомбинации и индукции транскрипции.
В этом протоколе излагается общая конструкция оптогенетических инструментов, управляемых биолюминесценцией, и подробно описываются процедуры экспериментального выполнения активации биолюминесценции в клетках и организмах. Он включает в себя описания того, как настроить комнату, вытяжку для культивирования тканей и инкубатор, а также микроскоп для работы с биолюминесценцией, а также этапы от подготовки люциферина до его применения. Этот протокол предоставляет исследователям основные процедуры для проведения биолюминесцентной оптогенетики (BL-OG) in vitro и in vivo. Описанные подходы могут быть дополнительно расширены и индивидуализированы для различных экспериментальных парадигм. Мы ожидаем, что этот протокол облегчит использование биолюминесценции в оптогенетических биологических исследованиях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI 25W Deep Red 660 nm LED Light Bulb</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>to be used with any lamp stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Black Microcentrifuge Tubes, 0.5 mL, Argos Technologies</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL, Argos Technologies</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric (1.5 m x 2.7 m) x 0.12 mm (thick)</td>
			<td>THOR LABS</td>
			<td>BK-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C120-Fluc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>K. Gardner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8106; CAS: 10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca-FLARE protease, transcription factor and reporter</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 92214, 92213, 92202</td>
			<td>A. Ting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIB-VP64 (B1016)</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 92037</td>
			<td>C. Tucker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRY-Gal&#916;DD (B1013)</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 92035</td>
			<td>C. Tucker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTZ</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>303</td>
			<td>formulation for in vitro applications with Gaussia luciferases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTZ (Water soluble native coelenterazine)</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>3031</td>
			<td>formulation for in vivo applications with Gaussia luciferases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270; CAS: 50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCTZ</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>301</td>
			<td>formulation for in vitro applications with Oplophorus luciferases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375; CAS: 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCreV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A. Cetin and H. Zeng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Imaging System (IVIS)</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>Lumina LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405; CAS: 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Array Driver</td>
			<td>Amuza</td>
			<td>LAD-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Array for Multiwell Plates</td>
			<td>Amuza</td>
			<td>LEDA-x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670; CAS: 7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653; CAS: 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFuel Solvent</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>399</td>
			<td>for dissolving CTZ preparations for in vitro use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465; CAS: 1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NES-CRY2PHR-TevC</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 89877</td>
			<td>H. Kwon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11058021</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDL coated coverslips (12 mm, 15 mm, 18 mm)</td>
			<td>Neuvitro Corporation</td>
			<td>GG-12-PDL, GG-15-PDL , GG-18-PDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL2-GAL4-UAS-Luc</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #33020</td>
			<td>M. Walsh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizmatix USB Pulser TTL Generator for Optogenetics</td>
			<td>Goldstone Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16</td>
			<td></td>
			<td>Addgene # 89878</td>
			<td>H. Kwon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vehicle (Water-soluble carrier without CTZ)</td>
			<td>Prolume Inc. (NanoLight)</td>
			<td>3031C</td>
			<td>control for in vivo applications with CTZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VP-EL222</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>K. Gardner</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescent optogenetics 2.0: harnessing bioluminescence to activate photosensory proteins in vitro and in vivo

Биолюминесценция - свет, излучаемый ферментом люциферазы, окисляющим субстрат небольшой молекулы, люциферин - использовался in vitro и in vivo для активации световых ионных каналов и насосов в нейронах. Хотя этот биолюминесцентный подход к оптогенетике (BL-OG) наделяет хемогенетический компонент оптогенетическими инструментами, он не ограничивается использованием в нейробиологии. Скорее, биолюминесценция может быть использована для активации любого фотосенсорного белка, что позволяет манипулировать множеством светоопосредованных функций в клетках. Различные пары люцифераза-люциферин могут быть сопоставлены с фотосенсорными белками, требующими различных длин волн света и интенсивности света.
В зависимости от конкретного применения эффективная доставка света может быть достигнута с помощью белков слияния люциферазы и фоторецепторов или путем простой котрансфекции. Фотосенсорные белки, основанные на светозависимой димеризации или конформационных изменениях, могут быть обусловлены биолюминесценцией для воздействия на клеточные процессы от локализации белка, регуляции внутриклеточных сигнальных путей до транскрипции. В приведенном ниже протоколе подробно описывается экспериментальное выполнение активации биолюминесценции в клетках и организмах и описываются результаты с использованием рекомбиназ, управляемых биолюминесценцией, и факторов транскрипции. Протокол предоставляет исследователям основные процедуры для проведения биолюминесцентной оптогенетики in vitro и in vivo. Описанные подходы могут быть дополнительно расширены и индивидуализированы до множества различных экспериментальных парадигм.

Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Биолюминесценция - свет, излучаемый ферментом люциферазы, окисляющим низкомолекулярный субстрат, люциферин, - может быть использован для активации фотосенсорных белков, тем самым добавляя еще одно измерение к световой стимуляции и позволяя манипулировать множеством светоопосредованных функций в клетках во временном и пространственном масштабах.

Биолюминесцентная оптогенетика 2.0: использование биолюминесценции для активации фотосенсорных белков in vitro и in vivo

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate ...

Биолюминесцентная оптогенетика представляет собой платформенную технологию, в которой генетически закодированные источники света могут визуализировать и контролировать биологические функции и сети внутри и между клетками. Биолюминесценция достигает каждого светочувствительного домена, экспрессируемого в популяции клеток-мишеней, без какого-либо повреждения тканей и клеток волоконной оптикой и длительным физическим воздействием света. Для начала начните подготовку запаса люциферина, растворив пять миллиграммов лиофилизированного CTZ в 250 микролитрах соответствующего растворителя.Обеспечьте растворение CTZ вдоль стен путем пипетки. Защищая флакон от прямого света, подготовьте 50 микролитровых аликвот в 0,5-миллилитровых черных микроцентрифужных трубках и храните аликвоты при минус 80 градусах Цельсия для будущего использования. Выполняйте все дальнейшие манипуляции в светлом тесном помещении в ламинарной вытяжке, освещенной красным светом.Для выполнения одиночной биолюминесцентной световой стимуляции готовят рабочий раствор Люциферина в клеточной культуральной среде, незадолго до добавления в клетки в конечной концентрации 100 микромоляров. Добавьте в клетки среду, содержащую люциферин, и инкубируйте в течение желаемой продолжительности световой стимуляции. Выключите красный индикатор.Подождав несколько секунд, пока глаза не приспособятся к полной темноте, следите за излучением света на глаз. Задокументируйте излучение света, сделав фотографию. Прекратите световую стимуляцию, заменив питательную среду, содержащую люциферин, затем промыть клетки культуральной средой один или два раза, чтобы устранить весь люциферин в зависимости от чувствительности эксперимента.Чтобы избежать потери клеток, наносите клетки на чашки, покрытые PDL, и инкубируйте клетки. Чтобы выполнить повторную биолюминесцентную световую стимуляцию, настройте камеру визуализации живых клеток, создав легкий плотный отсек вокруг микроскопа визуализации живых клеток с помощью коробки и черных листов. Убедитесь, что все источники света присутствуют внутри комнаты.Настройте перфузионную систему с желаемым раствором для впуска и выхода в камеру, ведущую к контейнеру для отходов. В зависимости от количества повторных стимуляций, аликвотируйте подготовленный рабочий раствор для визуализации Люциферина в микроцентрифужные трубки. Поместите в камеру крышку с трансфектированными клетками.Поддерживая работу насоса, снимите впускную трубку насоса с впускного стакана. Быстро погружайте впускную трубку в раствор люциферина, сохраняя короткое время перехода, чтобы избежать пустоты воздуха в трубке. Как только раствор Люциферина будет принят, поместите впускную трубку обратно в всасывающий стакан.Повторяйте удаление и погружение входной трубки в люциферин столько раз, сколько необходимо, с интервалом от нескольких минут до часов в зависимости от физиологического паттерна, которому должны подвергаться клетки. Затем храните клетки в защищенной от света среде в течение 16-24 часов для транскрипции или продолжительности до тех пор, пока не будет оценен эффект световой стимуляции. Чтобы выполнить активацию биолюминесценции in vivo, приготовьте Люциферин, вынув флакон CTZ при минус 80 градусах Цельсия, а затем дайте ему нагреться до комнатной температуры в защищенной от света зоне.К каждому флакону, содержащему 500 мкг КТЗ, добавьте 250 микролитров стерильной воды с помощью пипетки и положите резиновую пробку обратно на флакон. Инкубируйте восстановленный стеклянный флакон на водяной бане, закаленной при 55 градусах Цельсия, в течение нескольких минут, чтобы полностью растворить порошок. Переложите раствор в черную микроцентрифужную трубку и промойте стенки, чтобы извлечь весь CTZ.После удаления необходимого количества раствора храните оставшийся раствор при четырех градусах Цельсия. После подготовки, восстановления и алицитирования транспортного средства аналогичным образом преформируйте биолюминесцентную световую стимуляцию путем удаления объема люциферина или транспортного средства, необходимого для размера животного и выбранного маршрута применения. Введите животному люциферин или транспортное средство, как задумано.Для желаемой активации рекомбиназы во время определенной поведенческой парадигмы вводите животное непосредственно перед поведенческим тестированием. Для фазовой транскрипции вводите животному несколько раз в течение нескольких дней и собирайте данные от животного, стимулируемого биолюминесценцией, как это было задумано. Система экспрессии быстрого света и активности, регулируемая экспрессией, позволила транскрибировать репортерный ген с увеличением внутриклеточных ионов кальция и света.Синий светодиод привел к надежной репортерной флуоресценции, а экспрессия FLuc была определена измерениями люминесценции после добавления люциферина. В системе визуализации in vivo как светодиод, так и CTZ надежно увеличивали экспрессию FLuc, в то время как присутствие одного только компонента транскрипционного фактора приводило к значительному фоновому сигналу, возможно, из-за спонтанного протеолиза. NanoLuc использовался для оптогенной регуляции через димеризацию CRY/CIB и фоточувствительный транскрипционный фактор EL222.Биолюминесценция, индуцированная добавлением hCTZ к клеткам HEK-293 и его удалением через 15 минут, была более эффективной, чем 20 минут воздействия светодиодов для CRY/CIB и EL222. Не наблюдалось существенных различий в эффективности транскрипции между двумя системами при совместном трансфектировании hCTZ, хотя слияния белков CRY/CIB были более эффективными, чем EL222. CRY/CIB показали стабильно более высокие фоновые уровни по сравнению с EL222 независимо от концентрации hCTZ.Была протестирована биолюминесценция фоточувствительной расщепленной рекомбиназы Cre на основе белка VVD LOV iCreV. Результаты применения CTZ показали, что присутствие CTZ надежно увеличивает экспрессию на заднем плане и похоже на применение светодиодов. Использование биолюминесценции для активации не только движущихся фоторецепторов железа, но и любых фотосенсорных доменов добавляет еще одно измерение к световой стимуляции, расширяя манипулирование функциями клеток во временных и пространственных масштабах.Биолюминесцентная оптогенетика была применена в клетках и модельных организмах. Эти протоколы могут быть настроены для проверки широкого спектра направленных гипотез in vitro и in vivo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Обнаружение рН-зависимой активности<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Сопровождающий HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; и<em&gt; В Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Подготовка гидролизат кератина от куриные перья и его применение в косметике

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

На месте Измерение и корреляции плотность клеток и светового излучения биолюминесцентных бактерий

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Изоляция клубочков и в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Как определить долю флуоресцентных белков Photoactivated навалом и в живых клеток

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Сайт Направленный мутагенез для In Vitro и In Vivo экспериментов примером взаимодействия РНК в Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Измерение связывания нуклеотидов с интактными функциональными мембранными белками в режиме реального времени

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Непрерывный флуоресцентный анализ метилирования ДНК на основе эндонуклеазы для скрининга ингибиторов ДНК-метилтрансферазы

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...