Name: quantification of interbacterial competition using single-cell fluorescence imaging
Uploaded: 2021-09-02T15:00:00
Duration: 7 min 34 s
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ए.एन.एस. NIGMS अनुदान R35 GM137886 द्वारा समर्थित था और S.N.S. राष्ट्रीय रक्षा विज्ञान और इंजीनियरिंग स्नातक फैलोशिप कार्यक्रम द्वारा समर्थित था ।

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A., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+exposure+to+symbiosis-competent+bacteria+induces+light+organ+morphogenesis+in+the+host+squid.">A transient exposure to symbiosis-competent bacteria induces light organ morphogenesis in the host squid.</a> The Biological Bulletin. 189 (3), 347-355 (1995).</li><li>Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. 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L., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+parahaemolyticus+type+VI+secretion+system+1+is+activated+in+marine+conditions+to+target+bacteria,+and+is+differentially+regulated+from+system+2.">Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2.</a> PloS One. 8 (4), 61086 (2013).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Typhimurium+utilizes+a+T6SS-mediated+antibacterial+weapon+to+establish+in+the+host+gut.">Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (34), 5044-5051 (2016).</li><li>Bachmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salts+modulate+the+mucin-activated+type+VI+secretion+system+of+pandemic+Vibrio+cholerae.">Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (8), 0004031 (2015).</li><li>Ishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathoadaptive+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 575-584 (2012).</li><li>Johnson, M. 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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल एकल-कोशिका स्तर पर अंतर-व्यवहारिक प्रतिस्पर्धा की मात्रा और विशेषता के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। यह परख, जिसे हमारे क्लिफप्लेट्स 1,2पर हमारे क्लिफू-आधारित प्रतियोगिता परख को संशोधित करके विकसित किया गया था, जिसे वी फिचेरी आइसोले के बीच एकल-सेल प्रतियोगिता के दृश्य के लिए अनुमति दी गई थी और सिस्टम और माइक्रोस्कोपी सेटअप की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए विधि को अनुकूलित करने के लिए सुझाव प्रदान किए जाते हैं। यद्यपि यहां वर्णित विधि को प्रकाश-अंग सहजीवी वी फिचेरीके लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन इसे कई विविध, कृषि योग्य रोगाणुओं को समायोजित करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रतिस्पर्धी तंत्र को तापमान,लवणता और चिपचिपाहट30, 31, 32, 33, 34सहित किसी भी पर्यावरणीय चर द्वारा विनियमित किया जासकताहै। पिछले काम ने पुष्टि की है कि वी फिचेरी एक संपर्क-निर्भर प्रकार VI स्राव प्रणाली का उपयोग करके प्रतिस्पर्धा करता है जो सतहों पर सक्रिय है30,उदाहरण उपभेदों के बीच प्रतिस्पर्धा का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त इस परख में वर्णित शर्तों को बनाता है। बैक्टीरियल प्रतियोगिता की मात्रा बताते समय स्लाइड पर कोशिकाओं के प्रारंभिक घनत्व पर विचार करना भी महत्वपूर्ण है। यह देखते हुए कि लक्ष्य और अवरोधक कोशिकाओं के बीच संपर्क अक्सर हत्या होने के लिए आवश्यक है, मिश्रित संस्कृति इस तरह ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए कि सेल सेल संपर्क अधिकतम है और कोशिकाओं स्लाइड पर एक ही विमान में रहते हैं । सेल संस्कृतियों को एक समान ऑप्टिकल घनत्व (मध्य-लॉग चरण) में उगाया जाना चाहिए और फिर विभिन्न विकास चरणों में कोशिकाओं के शारीरिक परिवर्तनों के कारण उच्च ऑप्टिकल घनत्व के लिए संस्कृतियों को बढ़ाने के बजाय संपर्क को मजबूर करने के लिए केंद्रित किया जाना चाहिए। अन्य प्रणालियों में, संस्कृति की स्थिति और प्रायोगिक सेटअप को यह सुनिश्चित करने के लिए संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है कि प्रतिस्पर्धी तंत्र सक्रिय है और सिक्का की स्थिति में इसका पता लगाया जा सकता है।
इस परख में उपयोग किए जाने वाले एगरेज़ पैड कई लाभ प्रदान करते हैं: वे स्थिरीकरण प्रदान करते हैं ताकि कोशिकाएं स्वतंत्र रूप से घूमें नहीं, और वे संस्कृति को प्रयोग के दौरान सूखने से रोकते हैं। इसके अतिरिक्त, यदि प्रयोग के लिए आइसोप्रोपिल-β-डी-थिओगाल्टोसाइड (आईपीटीजी) जैसे रासायनिक प्रेरकों की आवश्यकता होती है, तो उन्हें आसानी से एग्रिजिंग समाधान में जोड़ा जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एजीआरडब्ल्यू की तैयारी को विभिन्न प्रणालियों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी। ऊपर वर्णित उदाहरण में, एगरेग्डेड पैड को 2% एगरेज (डब्ल्यू/वी) को 20 पीएसयू mPBS में भंग करके तैयार किया गया था, जो वी फिचेरी ग्रोथ मीडियम में इस्तेमाल होने वाला मानक लवणता है । इसके अलावा, कुछ मामलों में एक कार्बन स्रोत को कोशिकाओं को बढ़ने और लंबे प्रयोगों पर प्रतिस्पर्धा करने के लिए एगरेग्मेंट पैड में जोड़ने की आवश्यकता हो सकती है। ऐसे मामले में, एगरॉज पैड्स में एमपीएस को किसी भी विकास माध्यम के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, हालांकि विकास माध्यम में पोषक तत्व अतिरिक्त पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस के ट्रेडऑफ के साथ आ सकते हैं।
मालिकाना छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के बिना, सेल-सेल संपर्क अधिक होने पर व्यक्तिगत सेल काउंट प्राप्त करना बहुत मुश्किल हो सकता है, जैसा कि हम यहां दिखाते हैं कि संपर्क-निर्भर हत्या का निरीक्षण करना आवश्यक है। इस परख को मात्राकरण के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया था जो व्यक्तिगत सेल काउंट पर भरोसा नहीं करता है। इसके बजाय, प्रत्येक फ्लोरेसेंस चैनल के लिए कुल सेल क्षेत्र का उपयोग सिक्का उपभेदों के बीच हत्या की सीमा को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। क्योंकि यह विधि व्यक्तिगत सेल काउंट के बजाय क्षेत्र पर निर्भर करती है, डिफ़ॉल्ट थ्रेसहोल्डिंग सेटिंग्स आमतौर पर कुल सेल क्षेत्र को रेखांकित करने के लिए पर्याप्त होती हैं। थ्रेसिंग की सटीकता को मॉडल जीव के लिए औसत सेल आकार द्वारा एक प्रतिनिधि क्षेत्र के लिए कुल वस्तु क्षेत्र को विभाजित करके और इस अनुमानित सेल नंबर की तुलना एक ही छवि के लिए मैनुअल सेल काउंट से करके सत्यापित किया जा सकता है।
एक अवरोधक और एक लक्ष्य (गैर-हत्यारा) तनाव के बीच कॉइनक्यूबेशन में, अवरोधक के शुद्ध विकास की भविष्यवाणी की जाती है। जैसा कि चित्र 4में देखा गया है, अवरोधक विकास उन उपचारों में काफी अधिक हो सकता है जहां हत्या देखी जाती है, उपचार की तुलना में जहां हत्या नहीं देखी जाती है, शायद इसलिए कि लक्ष्य कोशिकाओं को lysing द्वारा जारी पोषक तत्व अवरोधक तनाव को अधिक तेजी से बढ़ने की अनुमति देते हैं। यहां दिखाए गए उदाहरण में नेट टारगेट डेथ देखी जाती है क्योंकि T6SS-मध्यस्थता प्रतियोगिता के परिणामस्वरूप लक्ष्य सेल लाइसिस होता है जहां लक्ष्य शारीरिक रूप से समाप्त हो जाता है । हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सभी प्रतिस्पर्धी तंत्र ों के परिणामस्वरूप लक्ष्य कोशिकाओं का भौतिक उन्मूलन नहीं होता है। यदि कोई लक्ष्य एक विष से अक्षम है जो विकास अवरोध का कारण बनता है, तो यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप दृश्यमान लक्ष्य जनसंख्या समय के साथ स्थिर रह सकती है क्योंकि लक्ष्य कोशिकाएं अब नहीं बढ़ती हैं लेकिन यह भी नहीं होती हैं । ऐसे मामले में, इस परख के परिणामों की तुलना लक्ष्य सेल व्यवहार्यता के लिए अनुवर्ती परीक्षणों के साथ करना उचित होगा, जैसे कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) के लिए चढ़ाना या प्रोपिडियम आयोडाइड या SYTOX ग्रीन35,36के साथ धुंधला करके लाइव-डेड परख का प्रदर्शन करके।
सिक्का परख की तुलना में जो सीएफयू की गिनती पर भरोसा करते हैं, यह परख समय के साथ लक्षित सेल आकृति विज्ञान में उपभेदों और ट्रैक परिवर्तनों के बीच प्रतिस्पर्धा की स्थानिक संरचना का निरीक्षण और मात्रा निर्धारित करना संभव बनाती है। उदाहरण के लिए, T6SS का उपयोग करके मारने वाली अवरोधक कोशिकाओं को लिस्म-डोमेन प्रोटीन को एन्कोड करने के लिए जाना जाता है जो लक्ष्य सेल दीवार को नीचा दिखाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रारंभिक सेल गोलाई और फिर लाइसिस13होता है, जिसे हमने चित्र 2 एमें दिखाए गए उदाहरण में देखा था। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग बहुत कम समय के तराजू पर उच्च संकल्प पर प्रतिस्पर्धा को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। यहां दिखाए गए उदाहरण में, लक्ष्य क्षेत्र में केवल दो घंटे के बाद एक महत्वपूर्ण कमी देखी जाती है जब कोशिकाओं की भीड़ होती है और सेल-सेल संपर्क उपभेदों(चित्रा 4)के बीच मजबूर होता है। यहां वर्णित छवि विश्लेषण को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके भी किया जा सकता है, जिससे कॉइनक्यूबैटेड उपभेदों के स्थानिक वितरण को बाधित किए बिना वीवो में या जटिल बायोफिल्म्स में बैक्टीरियल प्रतिस्पर्धा का अध्ययन करना संभव होगा।
संक्षेप में, यहां वर्णित परख का उद्देश्य फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकल-कोशिका स्तर पर बैक्टीरियल प्रतियोगिता की कल्पना और मात्रा के लिए एक सुलभ और आसानी से संशोधित दृष्टिकोण प्रदान करना है। इस विधि को विविध बैक्टीरियल आइसोलेट पर लागू किया जा सकता है और इसका उपयोग जटिल वातावरण में भी बैक्टीरियल प्रतिस्पर्धा की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है जैसे कि मेजबान या बायोफिल्म मैट्रिक्स के भीतर।

यह लेख फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकल-कोशिका स्तर पर बैक्टीरियल प्रतिस्पर्धा की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विधि को रेखांकित करता है। माइक्रोबियल समुदायों की संरचना और कार्य को अक्सर रोगाणुओं के बीच प्रतिस्पर्धी बातचीत द्वारा आकार दिया जाता है, और कई मामलों में इन बातचीत की विशेषता के लिए सिक्का1,2, 3,4, 5,6,7, 8में विभिन्न जीवाणु उपभेदों को देखने की आवश्यकता होती है . परंपरागत रूप से, जीवाणु प्रतियोगिता को जनसंख्या स्तर पर अवरोधक की कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की गणना करके निर्धारित किया जाता है और सिक्का संक्रमण अवधि2, 9से पहले और बाद में लक्ष्य उपभेदों का पता लगायाजाताहै। माइक्रोबियल प्रतिस्पर्धा के तंत्र मोटे तौर पर बैक्टीरिया के बीच वितरित किए जाते हैं और लक्षित कोशिकाओं 10 , 11 ,12,13,14 , 15 ,16,17,18 ,19 को बाधित करने के लिए या तो प्रसार या सेल-सेल संपर्क पर निर्भर हो सकते हैं।
यद्यपि जनसंख्या स्तर पर कॉइनक्यूबेशन में बैक्टीरियल उपभेदों को अक्सर देखा जाता है, यह पांडुलिपि बैक्टीरियल प्रतियोगिता के एकल-कोशिका मात्राकरण के लिए एक परख को रेखांकित करती है। इसके अलावा, इस काम में अन्य जीवाणु प्रजातियों के साथ उपयोग के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए सुझाव शामिल हैं। जबकि इस लेख में विशिष्ट तकनीकों का उपयोग सहजीवी जीवाणु विब्रियो फिचेरी20, 21, 22के उपभेदों के बीच संपर्क-निर्भर इंट्रास्पेसिफिक प्रतिस्पर्धा का अध्ययन करने के लिए कियाजाताहै, उन्हें कई जीवों के बीच प्रतिस्पर्धा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह लेख सीधे और उल्टे दोनों माइक्रोस्कोप पर स्लाइड सेटअप के लिए निर्देश प्रदान करता है, और सभी विश्लेषण को ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर फिजी23 का उपयोग करके वर्णित किया गया है ताकि विधि का उपयोग शोधकर्ताओं द्वारा विभिन्न इमेजिंग सेटअप और विश्लेषण कार्यक्रमों तक पहुंच के साथ किया जा सके। दोनों जनसंख्या और एकल सेल स्तर पर माइक्रोबियल प्रतियोगिता का अध्ययन करने के महत्व को देखते हुए, इस विधि शोधकर्ताओं के लिए एक मूल्यवान संसाधन के लिए प्रतिस्पर्धी बातचीत की मात्रा, विशेष रूप से उन है कि मालिकाना विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए उपयोग नहीं है होगा ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 uL single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 uL single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td>Low melting agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellvis 35 mm Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0409658</td>
			<td>#1.5 cover glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0378</td>
			<td>stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 &#956;g /mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>EN62248</td>
			<td>optional (if not using stable plasmids)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI image analysis sofware</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
			<td>open-source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-81P</td>
			<td>#1.5 cover glass; 12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 &#956;g/mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaning Tissue Paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S24530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S65921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro Cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S7563</td>
			<td>optional (if not using stable plasmids)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Gold Seal Plain Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-518-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-050-235</td>
			<td>#1.5 cover glass, 25 mm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion Oil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0297589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright or inverted fluorescence microscope with camera and imaging software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Images in this article were acquired on a Nikon TI-2 inverted fluorescent microscope outfitted with an ORCA-Fusion Digital CMOS camera using NIS-Elements software.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to keep agarose warm prior to pipetting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBS media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris Buffer (pH ~7.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0812-17-9</td>
			<td>15 g (Add only for plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>950 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S640-3</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP97265</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPBS (marine PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Phosphate buffered saline with marine salts added; used for making agarose pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN1960454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS1-160P</td>
			<td>Adjust concentration to appropriate salinity; 20 psu used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Vacuum Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SCGVU01RE</td>
			<td>Used to filter-sterilize mPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to filter-sterilize mPBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of interbacterial competition using single-cell fluorescence imaging

इंटरबैक्टीरियल प्रतियोगिता माइक्रोबायोम की संरचना और कार्य को सीधे प्रभावित कर सकती है। यह काम फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का वर्णन करता है जिसका उपयोग एकल-कोशिका स्तर पर विभिन्न जीवाणु उपभेदों के बीच प्रतिस्पर्धी बातचीत की कल्पना और मात्रा के लिए किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर फिजी का उपयोग करके ईमानदार और उल्टे एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप, लाइव-सेल और समय-चूक इमेजिंग तकनीकों, और मात्रात्मक छवि विश्लेषण दोनों पर स्लाइड तैयारी में उन्नत दृष्टिकोणों के लिए तरीके प्रदान करता है। इस पांडुलिपि में दृष्टिकोण दो कॉइनक्यूबैटेड उपभेदों के लिए समय के साथ क्षेत्र में परिवर्तन को मापने के द्वारा सहजीवी विब्रियो फिचेरी आबादी के बीच प्रतिस्पर्धी बातचीत की मात्रा को रेखांकित करता है जो स्थिर प्लाज्मिड से विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कर रहे हैं। बैक्टीरियल मॉडल सिस्टम में इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए वैकल्पिक तरीकों का वर्णन किया गया है जिसके लिए विभिन्न विकास स्थितियों की आवश्यकता होती है। यद्यपि यहां वर्णित परख वी फिचेरीके लिए अनुकूलित स्थितियों का उपयोग करती है, यह दृष्टिकोण अत्यधिक प्रजनन योग्य है और विविध माइक्रोबायोम से खेती करने योग्य आइसोलिट के बीच प्रतिस्पर्धा का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

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Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

यह पांडुलिपि सहसंस्कृति में बैक्टीरियल प्रतियोगिता की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए एकल-कोशिका फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन करती है।

एकल-सेल फ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके इंटरबैक्टीरियल प्रतियोगिता का मात्राकरण

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

इस विधि को एकल कोशिका स्तर पर बैक्टीरियल उपभेदों के बीच टाइप VI स्राव प्रणाली के माध्यम से संपर्क-निर्भर प्रतिस्पर्धा की मात्रा निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इस तकनीक के बजाय सेल मायने रखता है के बजाय कुल सेल क्षेत्र का उपयोग करता है बैक्टीरिया प्रतियोगिताओं की मात्रा, यह आसान मालिकाना छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग के बिना शोधकर्ताओं के लिए बना रही है । इस विधि को आसानी से विविध कृषि योग्य रोगाणुओं के बीच प्रतिस्पर्धा की मात्रा निर्धारित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।इसके अतिरिक्त, प्रयोगात्मक सेटअप को सीधे या उल्टे माइक्रोस्कोप पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। शुरू करने के लिए, समुद्री पीबीएस में 2% कम पिघल agarose भंग करके agarose पैड समाधान तैयार करते हैं। माइक्रोवेव और भंवर में लगभग 30 सेकंड के लिए समाधान को संक्षेप में गर्म करें जब तक कि एगर उठी पूरी तरह से भंग न हो जाए।इस घोल को 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में तब तक रखें जब तक कि उपयोग के लिए तैयार न हो जाए। इसके बाद, पांच बार एक ग्लास स्लाइड के चारों ओर लैब टेप का एक टुकड़ा लपेटें। एक ही स्लाइड पर टेप के लपेटकर दोहराएं, जैसे कि दो टेप टुकड़ों के बीच की दूरी कवरस्लिप चौड़ाई से थोड़ी छोटी है।एक फ्लैट एगर उठे पैड सतह को सुनिश्चित करने के लिए, टेप के दो टुकड़ों के बीच पिपेट गर्म एगर उठे समाधान और तुरंत शीर्ष पर एक कवरस्लिप डालें जैसे कि कवरस्लिप तरल के साथ संपर्क करता है और एगर उठे समाधान में किसी भी बुलबुले को धक्का देता है। अगेन्ड पैड को कम से कम एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर जमना दें। फिर इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले चार 5 वर्ग मिलीमीटर पैड में रेजर ब्लेड के साथ इस एगर उठे पैड को काट लें।सह इनक्यूबेशन के लिए उपभेदों को तैयार करने के लिए, एलबीएस आगर प्लेटों पर जमे हुए शेयरों से प्रत्येक तनाव बाहर लकीर उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक और 24 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट । अगले दिन, प्रत्येक तनाव से दो उपनिवेशों को चुनें और एंटीबायोटिक पूरक एलबीएस माध्यम में कॉलोनियों को फिर से खर्च करें। इनक्यूबेट ने प्रति मिनट २०० घूर्णन पर मिलाते हुए 24 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कालोनियों को फिर से निलंबित कर दिया ।अगली सुबह, उपसंस्कृति प्रत्येक जैविक एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 1, 000 गुना ताजा एलबीएस माध्यम में एक दोहराने और जब तक कोशिकाओं को ६०० नैनोमीटर पर लगभग १.५ के ऑप्टिकल घनत्व तक पहुंचने । उपाय और सभी नमूनों के लिए 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व रिकॉर्ड। एलबीएस माध्यम के साथ संस्कृति को कमजोर करके प्रत्येक नमूने को एक ऑप्टिकल घनत्व से सामान्य करें।एक लेबल 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक सामान्यीकृत तनाव के 30 माइक्रोलीटर जोड़कर एक समान अनुपात में दो प्रतिस्पर्धी उपभेदों को मिलाएं। भंवर एक से दो सेकंड के लिए मिश्रित तनाव संस्कृति। कुल चार मिश्रित तनाव ट्यूब उत्पन्न करने के लिए प्रत्येक जैविक दोहराने और उपचार के लिए प्रतिस्पर्धी उपभेदों को मिलाएं।सह-इनक्यूबेशन के दौरान संपर्क-निर्भर हत्या के लिए पर्याप्त घने प्रतिस्पर्धी कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा प्रत्येक मिश्रित संस्कृति को तीन गुना केंद्रित करें। सुपरनैंट को त्यागें, एलबीएस माध्यम के 20 माइक्रोलीटर में प्रत्येक गोली को फिर से खर्च करें और प्रत्येक नमूने के लिए एकाग्रता प्रक्रियाएं करें। यदि एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग, एक ३५ मिलीमीटर पेट्री डिश के नंबर १.५ कवरलिप नीचे पर एक मिश्रित संस्कृति के दो माइक्रोलीटर खोलना और सह इनक्यूबेशन स्थान पर agarose पैड जगह से शुरू करते हैं ।एगर उठे पैड के ऊपर 12 मिलीमीटर गोलाकार ग्लास कवरलिप रखें। शेष तीन मिश्रित संस्कृतियों के लिए कवरलिप को दोहराएं और रखें, जिसके परिणामस्वरूप चार व्यंजन इमेज्ड होंगे। आगे बढ़ने से पहले स्लाइड्स में देखें इमेजिंग प्रोसेस के दौरान मूवमेंट से बचने के लिए सेल को आगर पैड पर बसने की इजाजत देने के लिए करीब पांच मिनट तक बेंच टॉप पर बैठते हैं ।फोटोब्लैचिंग प्रभावों को कम करने के लिए डीआईसी का उपयोग करके कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करके शुरू करें। एक एकल जीवाणु कोशिका के औसत आकार के आधार पर, 100X तेल उद्देश्य का उपयोग करें। न्यूनतम पृष्ठभूमि का पता लगाने के साथ प्रत्येक चैनल के लिए एक्सपोजर समय और अधिग्रहण सेटिंग्स को समायोजित करें।कम से कम पांच फ़ील्ड व्यू चुनें और प्रत्येक उपयुक्त चैनल में छवियों को प्राप्त करें. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और विश्लेषण की जाने वाली छवि फ़ाइलों को आयात करें। छवि को ग्रेस्केल में परिवर्तित करें, चैनलों को अलग करें, और पूर्व-प्रसंस्कृत छवि का बाइनरी मास्क बनाकर और तैयार करें।विश्लेषण का चयन करें, फिर ड्रॉपडाउन मेनू से, सेट स्केल का चयन करें और माइक्रोस्कोपी सेटअप के लिए उपयुक्त मान दर्ज करें। इसके बाद, माप निर्धारित करने और क्षेत्र का चयन करने के लिए जाएं। टैब का विश्लेषण करने के तहत, डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करके कणों का विश्लेषण करें।यदि नमूना में मलबा मौजूद है, तो आकार या गोलाकारता को गैर-सेल कणों को फ़िल्टर करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। शो का चयन करें और फिर रूपरेखा ताकि फ़िल्टर आउट विश्लेषण के उत्पादन में विश्लेषण किए गए सभी कणों की एक गिने-चुने रूपरेखा शामिल होंगे। आगे विश्लेषण और रेखांकन के लिए स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में माप निर्यात।प्रत्येक प्रयोगात्मक उपचार के प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस छवियों को दिखाया गया है। स्पॉटिंग से पहले मिश्रित संस्कृति को ध्यान केंद्रित करने के परिणामस्वरूप दो घंटे से अधिक गोल या गायब लक्ष्य कोशिकाएं हुईं, जो सफल अवरोध का संकेत देती हैं। जब मिश्रित संस्कृति केंद्रित नहीं होती है, तो कोशिकाएं स्लाइड पर तितर-बितर रहती हैं।पर्याप्त सेल-टू-सेल संपर्क के बिना, लक्ष्य तनाव घातक तनाव से बाधित नहीं होता है। लक्ष्य कोशिकाओं को न तो गायब हो गया और न ही गोल हो गया जब सह भीड़ या बिखरे हुए परिस्थितियों में एक T6SS उत्परिवर्ती के साथ इनक्यूबेटेड । इस प्रकार, लक्ष्य या तो उपचार में बेहिचक था ।कण विश्लेषण परिणामों को लक्षित तनाव और अवरोधक तनाव दोनों के लिए ग्राफ़ किया गया और विश्लेषण किया गया। अंतिम समय बिंदु पर प्रारंभिक लक्ष्य क्षेत्र के १००% से अधिक लक्ष्य में शुद्ध वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है और प्रारंभिक लक्ष्य क्षेत्र के १००% से कम लक्ष्य में शुद्ध कमी का संकेत दिया । अवरोधक तनाव का शुद्ध विकास सभी उपचारों में देखा गया था।हालांकि, अवरोधक तनाव के लिए प्रारंभिक क्षेत्र का प्रतिशत काफी अधिक था जब एक जंगली प्रकार के अवरोधक को अन्य सभी उपचारों की तुलना में भीड़ की स्थिति में लक्ष्य के साथ सह-इनक्यूबेटेड किया गया था । स्पष्ट छवियों को प्राप्त करने के लिए, एगर उठे पैड को यथासंभव सपाट होने की आवश्यकता है। उन्हें स्लाइड के चारों ओर लपेटने से पहले टेप टुकड़े काट सुनिश्चित करने के लिए वे एक ही लंबाई हैं ।

Research

JoVE Journal

Biology

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