Name: liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems
Uploaded: 2021-09-23T14:45:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

وقد تم رعاية هذا البحث من قبل برنامج العلوم الجينومية، وزارة الطاقة الأميركية، مكتب العلوم والبيولوجية والبحوث البيئية، كجزء من منطقة التركيز العلمي واجهات الميكروبات النباتية (http://pmi.ornl.gov). يتم إدارة مختبر أوك ريدج الوطني من قبل UT-Battelle، ذ.م.م، لوزارة الطاقة الأمريكية بموجب عقد DE-AC05-00OR22725. وقد تم تأليف هذه المخطوطة من قبل UT-Battelle، ذ م م بموجب العقد DE-AC05-00OR22725 مع وزارة الطاقة الأمريكية. تحتفظ حكومة الولايات المتحدة بالناشر، بقبوله نشر المقال، يقر بأن حكومة الولايات المتحدة تحتفظ بترخيص عالمي غير حصري ومدفوع الأجر وغير قابل للإلغاء لنشر أو إعادة إنتاج الشكل المنشور من هذه المخطوطة، أو السماح للآخرين بذلك، لأغراض حكومة الولايات المتحدة. وستوفر وزارة الطاقة للجمهور إمكانية الوصول إلى هذه النتائج من البحوث التي ترعاها الحكومة الاتحادية وفقا لخطة الوصول العام لوزارة الطاقة (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

<ol>
	<li>Rollin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+hydrogen+production+from+biomass+by+in+vitro+metabolic+engineering:+Mixed+sugars+coutilization+and+kinetic+modeling.">High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).</li><li>Bowie, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biochemistry:+The+bio-inspired+cell-free+approach+to+commodity+chemical+production.">Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production.</a> Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).</li><li>Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+platform+for+cell+free+production+of+monoterpenes+from+glucose.">A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose.</a> Nature Communications. 8, 1-8 (2017).</li><li>Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosynthesis+of+limonene+using+enzyme-enriched+Escherichia+coli+lysates.">Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates.</a> Synthetic Biology. 4 (1), 003 (2019).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+potential+of+crude+cell+extracts+for+producing+pyruvate+from+glucose.">Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose.</a> Synthetic Biology. 3, (2018).</li><li>Kay, J. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysate+of+engineered+Escherichia+coli+supports+high-level+conversion+of+glucose+to+2,3-butanediol.">Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol.</a> Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).</li><li>Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+growth+medium+dropouts+promote+aromatic+compound+synthesis+in+crude+E.+coli+cell-free+systems.">Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysate+proteome+engineering+strategy+for+enhancing+cell-free+metabolite+production.">A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production.</a> Metabolic Engineering Communications. 12, 00162 (2021).</li><li>Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+pathway+prototyping.">Cell-free synthetic biology for pathway prototyping.</a> Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+cell-free+extract+reaction+(CFER)+system+in+Clostridium+thermocellum+to+identify+metabolic+limitations+to+ethanol+production.">Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production.</a> Frontiers in Energy Research. 8, 72 (2020).</li><li>Coskun, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Separation Tecniques: Chromatography. 3, (2016).</li><li>Bernardes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+acids+and+alcohols+quantification+by+HPLC/RID+in+sugarcane+vinasse:+analytical+method+validation+and+matrix+effect+assessment.">Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment.</a> International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computationally+guided+discovery+and+experimental+validation+of+indole-3-acetic+acid+synthesis+pathways.">Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways.</a> ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).</li><li>Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+control+of+cell-free+metabolism+through+pH+modulation.">Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation.</a> Synthetic Biology. 5, (2020).</li><li>Bujara, M., Sch&#252;mperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+cell-free+systems:+Implementation+and+debugging+of+a+system+of+biotransformations.">Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).</li><li>Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+identification+and+quantitation+in+LC-MS/MS-based+metabolomics.">Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics.</a> TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).</li><li>Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-liquid+chromatography.">Nano-liquid chromatography.</a> Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).</li><li>Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+mass+spectrometry-based+metabolomics:+Opportunities+and+challenges.">Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).</li><li>O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+CoA+metabolites+by+SAMDI-MS+to+optimize+the+cell-free+biosynthesis+of+HMG-CoA.">High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA.</a> Science Advances. 5, (2019).</li><li>Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unimod:+Protein+modifications+for+mass+spectrometry.">Unimod: Protein modifications for mass spectrometry.</a> Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).</li><li>Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+mixing+of+Escherichia+coli+crude+extracts+to+prototype+and+rationally+engineer+high-titer+mevalonate+synthesis.">Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).</li><li>Jaishankar, J., Srivastava, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+stationary+phase+survival+and+applications.">Molecular basis of stationary phase survival and applications.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2000 (2017).</li><li>Bartolomeo, M. P., Maisano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+for+quantitative+amino+acid+analysis.">Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).</li><li>Hauck, T., Landmann, C., Br&#252;hlmann, F., Schwab, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone+in+cytosolic+extracts+obtained+from+Zygosaccharomyces+rouxii.">Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).</li><li>Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsoSearch:+An+untargeted+and+unbiased+metabolite+and+lipid+isotopomer+tracing+strategy+from+HR-LC-MS/MS+datasets.">IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets.</a> Methods and Protocols. 3 (3), 54 (2020).</li></ol>

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة معروفة أو أي تضارب آخر في المصالح.

ويمكن استخدام نهج HPLC-RID المبينة لقياس استهلاك ركائز السكر بنجاح والتحويلات اللاحقة إلى الأحماض العضوية الرئيسية ومنتجات الكحول من التمثيل الغذائي المركزي lysate مع مرور الوقت. وعلاوة على ذلك، يستخدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة متساوية التحمل باستخدام مرحلة واحدة متنقلة، ويتطلب الحد الأدنى من إعداد العينة، ويسمح بتحليل بسيط موجه في المصب. يتم تمييز التحليلات التي تقاس بطريقة HPLC-RID فقط بأوقات الاحتفاظ بها ، وبالتالي تفاعلاتها مع راتنج العمود المحدد. تم تصميم عمود HPLC المستخدمة هنا بشكل خاص لفصل الكربوهيدرات والأحماض العضوية والكحول من خلال الجمع بين حجم الاستبعاد وتبادل ليغاند (أي، الكروماتوغرافيا التقسيم الأيونية). الطريقة الموصوفة هي، لذلك، مفيدة لتحليل أكثر استهدافا من ركائز الكربوهيدرات واختيار المنتجات النهائية من مسارات تخمير الجلوكوز التي من المتوقع أن تسهل في المقام الأول وتنشيط التحولات الحيوية القائمة على اليسات8،15،21. ومع ذلك، لا يفسر هذا البروتوكول تنشيط المسارات الأيضية الأخرى في مقتطفات الخلية. يمكن استخدام خطوط الأنابيب التي تستخدم تقنيات فصل الكروماتوغرافيا الأخرى (أي كروماتوغرافيا التفاعل الهيدروفيلي) وطرق التحريج المتدرجة وإعداد العينة الأكثر تعقيدا (أي اشتقاقها) وأجهزة الكشف البصرية المختلفة (مثل الأشعة فوق البنفسجية أو كاشفات تشتت الضوء التبخري) للكشف عن الأيضات الأخرى مثل الأحماض الأمينية وفوسفات السكر23و24 . بدلا من ذلك، يمكن اتباع نهج عالمي لدراسة التمثيل الغذائي ليسات باستخدام LC-MS/MS.
طريقة LC-MS/MS الموصوفة هي سير عمل واحد لقياس وتحديد نطاق أوسع من الأيض. LC-MS/MS هي أداة تحليلية حديثة لتحديد ملامح الأيض بسبب حساسيتها وقدرتها على تمييز الأيض حسب وقت الاحتفاظ ونسب m/z مع دقة عالية16. مع التركيز على مسارات الأيض الكربون المركزية واستقلاب الأحماض الأمينية، تم تنفيذ الوضع السلبي MS / MS للكشف على وجه التحديد الأحماض العضوية القطبية، فوسفات السكر، والأحماض الأمينية. إلى جانب تقنية الكروماتوغرافيا نانو السائل، ويوفر الأسلوب حساسية عالية للكشف عن جزيئات صغيرة في خلفية lysate المعقدة17. من حيث التنميط القائم على استقلاب CFME القائم على الليسات ، ومع ذلك ، فإن الحد من بروتوكول LC-MS / MS الموصوف هو الحد الأدنى للكشف عن 50 م / ض ، مما يحول دون قياس الإيثانول ، وهو منتج رئيسي في استقلاب الجلوكوز في اللحيث ، وكذلك الفورمات ، والتي يتم قياسها بسهولة بطريقة HPLC-RID التفصيلية. بالمقارنة مع LC-MS/MS، يتمتع HPLC-RID بميزة إضافية تتمثل في إمكانية الوصول النسبي من حيث التكلفة والصعوبة. إلى النقطة الأخيرة، استكشاف الأخطاء وإصلاحها طريقة LC-MS/MS الموصوفة هنا قد تتطلب درجة معينة من الخبرة في قياس الطيف الكتلي. ومع ذلك، فإن الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد له تطبيقات جذابة بشكل فريد على RID حيث يمكنه بالإضافة إلى ذلك تمييز النظائر المسماة في الأيض، وهي تقنية ممتازة لفهم حركة الكربون من الركائز التكميلية من خلال شبكة التمثيل الغذائي المعقدة lysate18. تم تطبيق مثل هذا النهج هنا عن طريق استكمال ردود الفعل مع 13C6-الجلوكوز وتحليل قيم وفرة النسبية من المصب 13C-دمج الأيض. سمح التحليل بتعريف المسارات النشطة وغير النشطة ، ودعم الافتراضات المبلغ عنها سابقا وتقديم رؤى جديدة حول التدفق الأيضي في الlysates. ويمكن أيضا إجراء تعديلات في إطار طريقة لإجراء تحليلات محددة. على سبيل المثال، يمكن تحليل الحلول القياسية ل 13 مركبا مستهدفا تحمل علامة C إلى جانب عينات لتحقيق قياسات كميةمطلقة للجزيئات المشتقة من الجلوكوز بمرور الوقت والتوصل إلى استنتاجات حول توزيعات التدفق. يمكن أيضا تمكين الكشف الأفضل عن المركبات المشحونة إيجابيا داخل سير العمل الحالي عن طريق تشغيل التسلسلات مع ملفات .meth التي تم تعديلها للكشف عن الوضع الإيجابي.
22 - وأخذ العينات التحليلية في كلتا الطريقتين الموصوفتين آلي بشكل ملائم، مما يضمن إمكانية استنساخ عالية. وعلاوة على ذلك، يمكن توقع إجراء عمليات تحليل سلسة ما دامت الممارسات السليمة لمعالجة الأجهزة وصيانتها تتم ملاحظتها. وعند استخدام هذه الأدوات لتحليل ردود فعل الCFME، ينبغي وضع اعتبارات أكثر أهمية في المنبع والمصب النهائي لأخذ العينات. أثناء إعداد العينة، من المهم أن تكون عناصر التحكم في الدورة الزمنية ممثلة للوقت صفر. هنا، تم التعجيل البروتينات في اللحوات عن طريق التحمض لوقف ردود الفعل الأيضية. بالنسبة للعينات ذات الوقت صفر، تم دمج المذيب الحمضي مع اليات قبل إضافة مزيج التفاعل الذي يحتوي على الجلوكوز. الحموضة مع حمض ثلاثي الكلور يضمن بشكل فعال أن الجلوكوز لا يتم استقلاب في الوقت صفر، كما هو مبين في بيانات HPLC-RID(الشكل 2). وفي حين تم إجراء إجراء مماثل لإرواء استقلاب الجلوكوز في تحليل LC-MS/MS المبلغ عنه، تم الكشف عن 13مستقلبات تحمل علامة C في عينات صفرية زمنية، وإن كان ذلك بقيم وفرة منخفضة بشكل ملحوظ مقارنة بالعينات المستخرجة في النقاط الزمنية اللاحقة. وعلاوة على ذلك، اقتصرت هذه الملاحظات على وسيطات تحلل الجليكوليسيس. وتشير البيانات إلى أن ردود الفعل تحتفظ بدرجة ما من النشاط الجليكوليك بعد التحمض مع مذيب الاستخراج الذي يتم اكتشافه من خلال هذه الطريقة الحساسة للغاية. غير أنه ينبغي تحديد حجم هذا النشاط كميا. وذكرت دراسة سابقة أن المذيبات استخراج الحمضية قد لا تروي بما فيه الكفاية ردود الفعل الجليكوليك المتوسطة ولكن يمكن أن تتوقف عن استهلاك الجلوكوز كبيرة10. في حين أن هذا لا يزال يتعين مواصلة التحقيق في النظام المستخدم هنا، يمكن تفسير التغيرات الجذرية في قيم الوفرة النسبية بين عينات الوقت صفر ونقطة زمنية لاحقة على أنها اتجاهات في استقلاب الجلوكوز. استكشاف طرق التبريد البديلة، ومع ذلك، ينصح في تطبيقات مماثلة، وتحديدا للحصول على كميات مطلقة من وسيطة الأيض10. وعلاوة على ذلك، ينبغي أيضا مراعاة الممارسات الجيدة أثناء تحليلات البرامجيات في نهاية المرحلة النهائية. الاتساق أمر حتمي عند دمج مناطق الذروة يدويا من إشارات RID للحد من الخطأ البشري. وينبغي أيضا تطبيق التكامل اليدوي على مناطق الذروة من المعايير كلما تستخدم مناطق الذروة المتكاملة يدويا لتحديد تركيزات المستقلب في العينات. في جميع أنحاء تحليل LC-MS/MS المستهدف، يجب التحقق من صحة التعليقات التوضيحية المؤقتة من تحليل MZmine عن طريق التحقق من الذروة اليدوي باستخدام مستعرض جودة MS، ويجب أن تكون ميزات m/z مشروحة فقط عندما تكون الأخطاء الجماعية المحسوبة مقبولة. وفي هذا الهنا، أجريت هذه التحليلات يدويا لمجموعة محدودة من الأهداف نظرا لعدم وضع برامج حاسوبية شاملة وقوية للبحث عن النظائر. ومع ذلك ، فإن مثل هذه الأساليب الآلية للبحث عن 13المستقلبات المسمى C آخذة في الظهور حاليا ومن شأنها تبسيط التحليلات الأكثر تعقيدا أيضا ، مثل تنميط التحلل خارج استقلاب الكربون المركزي25.
الكروماتوغرافيا السائلة المتقدمة هي طريقة قوية وتطبيقها على نطاق واسع لفصل جزيئات صغيرة في خليط الأيضالمعقدة 11. الأساليب الموصوفة زوجين هذه التقنية الفصل مع مؤشر الانكسار أو الكشف الطيفي الشامل لتحليل بنجاح تحويلات المستقلب في ردود الفعل CFME القائمة على التحلل. HPLC-RID و LC-MS/MS هي أدوات قوية بشكل فردي لتحديد التمثيل الغذائي النشط لليسيد، ويمكن الاستفادة من تكاملها لمعالجة القيود المتأصلة في كل تقنية. الأساليب المبلغ عنها تمكين تطبيق وتطوير CFME كما يمكن استخدامها لفهم التمثيل الغذائي lysate, رصد التحسينات في التحويلات المستقلب المستهدفة, وتوضيح التعديلات على تدفق المستقلب عند التلاعب التمثيل الغذائي lysate.

يمكن معالجة القيود المفروضة على الميكروبات الهندسية للإنتاج الكيميائي من خلال تلخيص التفاعلات الكيميائية الحيوية في المختبر حيث تكون وظائف البقاء الخلوية المتنافسة غائبة1. وعلاوة على ذلك، فإن بيئة التفاعل المفتوح (أي عدم وجود غشاء الخلية) أكثر قابلية للتلاعب ويسهل مراقبتها مقارنة بالخلايا الحية. وقد تجلى هذا المفهوم التأسيسي للهندسة الأيضية الخالية من الخلايا (CFME) بأناقة من خلال إعادة تشكيل مسارات التمثيل الغذائي لتجميع المواد الكيميائية القيمة مثل الهيدروجين وmonuterpenes مع مقاييس الإنتاج التي هي أوامر من حجم أعلى مما قدم في مصانع الخلايا الميكروبية حتى الآن1،2،3 . بيد أن طرق تنقية مسارات كاملة مقيدة حاليا بالوقت والتكلفة. بدلا من ذلك، يمكن اشتقاق أنظمة التمثيل الغذائي الخالية من الخلايا من مستخلصات الخلايا الخام من خلال طرق سريعة وغير مكلفة بالنسبة لإعادة تشكيل المسار بأكمله4. الأيض المركزي الذي يتم الاحتفاظ به في مقتطفات الخلية يمكن أن تستكمل مع ركائز الطاقة (على سبيل المثال، الجلوكوز والعوامل الانزيمية) والأملاح في حلول عازلة لتوليد السلائف الأيضية المركزية لأكثر من 24 ساعة5،6. إضافة الإنزيمات الخارجية إلى تفاعل CFME القائم على التحلل يسمح بتحولات بيولوجية أكثر تعقيدا للجلوكوز إلى مواد كيميائية أكثر قيمة في تيترزعالية 4و6و7. على الرغم من أن العائد يميل إلى أن يتعرض للخطر في هذه النظم بسبب تعقيدها الأيضي الشبيه بالخلايا ، إلا أن الطرق الفريدة لتنظيم بروتيوم اليسات لتحويل الغلة الأعلى كانت ويجري تطويرها7و8.
سهولة تنفيذ التحولات الأيضية في أنظمة خالية من الخلايا القائمة على اللذات يجعل هذه المنصات الممتازة إما لنقل التصنيع الكيميائي خارج الخلية تماما أو لنماذج مسارات جديدة مع الإنتاجية العالية قبل بناء واختبار هذه التصاميم في الجسم الحي2،9. بالنسبة لأي من التطبيقين ، فإن أدوات مراقبة التحويلات الأيضية أو مراقبة التعديلات الإجمالية على التدفق الأيضي في الlysates هي جزء لا يتجزأ من تقدم CFME. يمكن استخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) لفصل المكونات الكيميائية لتفاعلات CFME بدقة عالية ويمكن أن تقترن بكاشفات بصرية أو طيفية واسعة لقياس كمية المستقلب5و10. المبدأ الأساسي ل HPLC هو أن التحليلات المذابة في المذيبات (أي مرحلة الجوال) وضخها من خلال عمود تتفاعل مع مواد التعبئة عمود معين (أي المرحلة الثابتة)11. اعتمادا على خصائصها الكيميائية، تظهر هذه التحليلات أوقات استبقاء متفاوتة قبل أن يتم في نهاية المطاف إخراجها من المرحلة الثابتة وحملها من قبل المرحلة المتنقلة إلى كاشف. يفصل هذا التقرير إعداد وتحليل ردود فعل CFME المستندة إلى الإشريكية القولونية من خلال الأساليب المستندة إلى HPLC التي تستفيد من اكتشاف RID وMS/MS.
HPLC مقرونة الكشف عن مؤشر الانكسار (HPLC-RID) هو وسيلة يمكن الوصول إليها عموما لتحديد بسرعة السلائف الأيضية المركزية والمنتجات النهائية. باختصار، يقيس RID كيفية تحليل تغيير انحراف الضوء عن طريق المرحلة المتنقلة12. يمكن بعد ذلك قياس إشارات RID المقابلة لل تحليل الهدف في العينات من خلال المقارنات مع إشارات RID للحلول القياسية. في تطبيقات CFME ، تم استخدام هذا النمط من الكشف الأكثر شيوعا مع أعمدة HPLC التي تفصل المركبات استنادا إلى مزيج من استبعاد الحجم وآليات التبادل ليغاند ، أو الكروماتوغرافيا القسم الأيوني5،6،8،13. وتستخدم هذه التقنية خاصة لتحديد استهلاك ركائز السكر بسرعة مثل الجلوكوز، فضلا عن تشكيل منتجات التخمير مثل succinate, lactate, formate, خلات, والإيثانول في ردود الفعل CFME القائم على اليستات8. تسجيل تغييرات تركيز هذه المركبات عبر HPLC كان مفيدا لتوضيح إمكانات مستخلصات الخلايا الخام لتجميع السلائف الأيضية المركزية وفهم كيفية إعادة توجيه تدفق المسار من خلال مسارات التخمير خلال التحويلات الأيضية المعقدة من الجلوكوز في اللواسير6و8و14. تؤكد دراسات CFME المنوية في مقتطفات خلايا الإشريكية القولونية أن مركبات التخمير تتراكم كمنتجات نهاية لحفز الجلوكوز وتحدث أيضا كمنتجات الثانوية غير المرغوب فيها في اليسات التي تفرط في التعبير عن الإنزيمات الخارجية6،15. ويقترح أن الأيض التخميري يلعب دورا ضروريا في تجديد مكافئات الأكسدة من العوامل المساعدة (أي NAD(P)H و ATP) للحفاظ على ردود الفعل الجليكوليكية8. ومن ثم، فإن طريقة الكشف البصري المستندة إلى HPLC والمصممة لفصل منتجات التخمير هي أداة مفيدة ومطبقة بشكل شائع عند تنفيذ مختلف مهام CFME القائمة على اليسيد.
يمكن تنفيذ CFME لتجميع المنتجات النهائية الأيضية التي ليست الكربوهيدرات والأحماض العضوية، أو الكحول4. قياس الوسيطة التي تستهلك بأسرع ما يتم توليفها قد يكون أيضا مرغوبافيه 10. في حين يمكن الوصول إلى HPLC-RID من حيث التكلفة والصعوبة ، فإن هذه الطريقة مقيدة بقدرتها على التمييز بين المستقلبات فقط استنادا إلى وقت الاحتفاظ. ويمكن تحليل مجموعة أوسع من الأيض عندما يقترن الكروماتوغرافيا السائلة إلى الكشف MS / MS (LC-MS / MS)16. بهذه الطريقة، يتم تأين التحليلات في مرحلة الهاتف المحمول والكشف عنها بشكل تفاضلي استنادا إلى كتلة كل جزيء وخصائص الشحن. معرفة كل من نسبة كتلة إلى تهمة المستقلب (م / ض) ووقت الاحتفاظ على العمود وبالتالي يسهل فصل معظم وسيطة الأيض والمنتجات النهائية مع ارتفاع القرار16. ويمكن أيضا أن يقترن هذا الأسلوب الكشف إلى الكروماتوغرافيا نانو السائل، الذي يوفر معدلات تدفق أقل بكثير وحجم حقن العينة، مما يسمح للكشف أكثر حساسية من جزيئات صغيرة في الخلفية lysate المعقدة17. يمكن إضافة إلى ذلك تطبيق LC-MS/MS مع وضع العلامات النظيرية نظرا لأن التسميات المدمجة تضفي تغييرات على قيم m/z الخاصة بالنواقل18. قياسات Timepoint المستخرجة من رد فعل CFME تكملها 13C6-الجلوكوز الركيزة وبالتالي يمكن تحديد نهاية أو المنتجات الثانوية المستمدة خصيصا من الجلوكوز المكمل. على الرغم من أن هذه الطريقة تتبع النظائر لم تطبق بعد عادة في دراسات CFME، بل هو أداة قوية لفهم التحويلات الأيضية في نظم CFME القائمة على اللستات، وتحديدا منذ مكافحة الملح (أي خلات والغلوتامات) في هذه التفاعلات هي أيضا استقلاب كركائز ثانوية19. وبالتالي فإن الاستفادة من هذه التقنية يمكن أن ترسم صورة شاملة لعملية التمثيل الغذائي للجلوكوز في اليات ، والتي حتى يومنا هذا غير مفهومة تماما. هنا، البروتوكول تفاصيل طريقة للكروماتوغرافيا نانو السائل إلى جانب تأين نانويدروسبراي (نانو ESI) MS / MS التي يمكن استخدامها لاستجواب نموذج ممكن من التمثيل الغذائي الجلوكوز، وتحديدا في lysates القولونية (الشكل 1). ويستند النموذج على تقارير من مسارات التخمير ومسار فوسفات البنتوس يجري نشطة في lysates القولونية المستمدة من سلالات نمت في وسائل الإعلام الغنية5,6,8,14. وتستخدم هذه التقنية بالإضافة إلى ذلك للتحقيق في إنتاج الأحماض الأمينية منذ المعرفة الحالية على استقلاب الأحماض الأمينية من الجلوكوز في اللحامات يقتصر على عدد قليل من الأمثلة مثل تخليق الأحماض الأمينية العطرية7. ونظرا للطبيعة القطبية في الغالب للمنتجات النهائية والمتوسطة في هذه المسارات (أي الأحماض العضوية وفوسفات السكر والأحماض الأمينية)، تم استخدام الكروماتوغرافيا السائلة على مراحل عكسية هنا. هذه التقنية تفصل المركبات القطبية عن طريق الإلتواء من مرحلة ثابتة غير قطبية. ثم تأينت هذه المركبات بواسطة نانو ESI في وضع الأيونات السالبة مما يسمح بالكشف عن التحليلات بشحنة أولية سلبية واحدة على الأقل وبالتالي فهي مفيدة للكشف عن المركبات الحمضية. وتستخدم هذه التقنية هنا لتحليل الجلوكوز المستمدة من 13C-دمج الأيض ويوضح فائدة LC-MS/ MS لفهم استقلاب الجلوكوز في التحلل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m centrifuge tube filters (spin columns)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Binary LC Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1312B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity High Performance Degasser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4225A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Refractive Index Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7162A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Standard Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1329B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374</td>
			<td>CFME reaction mix component (LC-MS/MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.20 &#956;m pore (PES membrane) filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminex HPX 87-H column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1250140</td>
			<td>Chromatography column for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1376</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vial caps (yellow, snap)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-50Y</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W225181</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-dextrose (Glucose)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9230</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8281</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC/MS grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica (internal diameter of 100 &#956;m, external diameter of 375 &#956;m)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>WM22005-ND</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetex 5 &#956;m C18 stationary phase (100 &#197;)</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0632</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanospray Ionization Source</td>
			<td>ThermoFisher Scientific/Proxeon</td>
			<td>ES071 (newest model)</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenLab CDS (Online) Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 2.15.26</td>
			<td>Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 2.7</td>
			<td>Software for tuning the LC-MS/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps (with septa, 9 mm)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29315-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwthread glass vials (2 mL)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29376-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>247596</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71716</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>398055</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>Solvent preparation for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-acetate</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-090-100</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Solvent Rack: SRD-3600</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6500</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 3.0.63</td>
			<td>Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems

يمكن أن تتطلب هندسة التمثيل الغذائي الخلوي لعملية التمثيل الحيوي المستهدفة دورات واسعة النطاق لتصميم وبناء واختبار التعلم (DBTL) حيث يعمل المهندس حول متطلبات بقاء الخلية. بدلا من ذلك، تنفيذ دورات DBTL في بيئات خالية من الخلايا يمكن تسريع هذه العملية وتخفيف المخاوف مع التوافق المضيف. نهج واعد لهندسة التمثيل الغذائي الخالية من الخلايا (CFME) يستفيد من مستخلصات الخلايا الخام النشطة استقلابيا كمنصات للكتلة الحيوية واكتشاف البروتينات المعدلة والمسارات والنماذج الأولية بسرعة. تحقيق هذه القدرات وتحسين أداء CFME يتطلب أساليب لتوصيف المستقلب من منصات خالية من الخلايا القائمة على lysate. أي أن الأدوات التحليلية ضرورية لرصد التحسينات في تحويلات المستقلب المستهدفة وفي توضيح التعديلات على تدفق المستقلب عند التلاعب في عملية التمثيل الغذائي لليسات. هنا، تم تطبيق تحليلات المستقلب باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) إلى جانب الكشف الطيفي البصري أو الكتلي لتوصيف إنتاج المستقلب وتدفقه في lysates E. coli S30. وعلى وجه التحديد، يصف هذا التقرير إعداد عينات من تحللات CFME لتحليلات HPLC باستخدام الكشف عن مؤشر الانكسار (RID) لتحديد توليد وسيطة التمثيل الغذائي المركزية والمنتجات الثانوية في تحويل الركائز منخفضة التكلفة (أي الجلوكوز) إلى مختلف المنتجات ذات القيمة العالية. كما يتم تقديم تحليل تحويل المستقلب في ردود فعل CFME التي تتغذى على 13الجلوكوز C المسمى من خلال الكروماتوغرافيا السائلة عكس المرحلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب (MS / MS)، أداة قوية لوصف غلة المستقلب محددة وتدفق الأيض lysate من مواد البداية. بالإجمال, تطبيق هذه الأساليب التحليلية لSMEME lysate الأيض تمكن من التقدم في هذه النظم كمنصات بديلة لتنفيذ أسرع أو المهام الهندسية الأيضية الجديدة.

Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

تصف البروتوكولات أساليب الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء إلى جانب مؤشر الانكسار أو الكشف الطيفي الكتلي لدراسة التفاعلات الأيضية في الأنظمة المعقدة الخالية من الخلايا القائمة على اليسات.

الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب مؤشر الانكسار أو الكشف الطيفي الكتلي لتنميط المستقلب في الأنظمة الخالية من الخلايا القائمة على Lysate

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

يستخدم هذا البروتوكول الكشف عن مؤشر الانكسار لقياس المنتجات الثانوية لعملية التمثيل الغذائي للكربون التي تتراكم عادة في النظم القائمة على الخلايا القائمة على اليسات. كما أنه يستخدم قياس الطيف الكتلي للكشف عن لوحة أوسع من الأيض المركزي التي يتم إنشاؤها في اليزحات النشطة الأيضية. توفر التقنيتان المستخدمتان في هذا البروتوكول القدرة على وصف التفاعلات الكيميائية التي تحدث في نظام قائم على الخلايا قائم على الليات ، مما يجعل من الممكن اكتشاف مجموعة أوسع من الأيض ، بما في ذلك تلك الموجودة بتركيزات منخفضة في خلفية التسح المعقدة.وسيدلل على هذه الإجراءات خايمي لورنزو دينغلاسان وديفيد ريفز، الباحثان الخريجان من شعبة العلوم البيولوجية. ابدأ بالجمع بين المكونات المختلفة في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر لإعداد ردود الفعل النهائية مع 4.5 ملليغرام لكل ملليلتر من البروتين الكلي لليسات. إعداد الهندسة الأيضية الخالية من الخلايا ، أو CFME ، ردود الفعل مع المجلدات النهائية من 50 ميكرولتر في ثلاثية في كل نقطة زمنية.إنهاء ردود الفعل ثلاثية المستويات في النقاط الزمنية المناسبة على الفور بإضافة حجم متساو من حمض ثلاثي الكلور 5٪ إلى حجم التفاعل النهائي لكل عينة. ثم تمييع كل عينة بإضافة ضعف حجم الماء العقيم إلى كل خليط رد فعل. لتلخيص الوقت صفر، مزيج نفس حجم حمض ثلاثي الكلور 5٪ مثل حجم التفاعل النهائي الكلي مع lysate قبل إضافة بقية مكونات التفاعل.هذه الخطوة التحمض يعجل الانزيمات ليسات قبل أن استقلاب الجلوكوز بشكل كبير. دوامة العينات والطرد المركزي على جهاز الطرد المركزي على مقاعد البدلاء في 11, 600 مرة ز لمدة خمس دقائق, ونقل النافورات التي تحتوي على التحليلات العضوية لتنظيف الأنابيب. تخزين العينات في ناقص 20 درجة مئوية إذا كان تحليل HPLC أن تجرى في وقت لاحق.تأكد من إذابة العينات المخزنة على الجليد قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. تصفية كل supernatant مع مرشح المسام 0.22 ميكرومتر. بعد الطرد المركزي، نقل كل filtrate إلى قارورة زجاجية HPLC نظيفة.قم بتحميل القنينات على درج الطوابع التلقائية لنظام HPLC الذي تم إعداده للتحليل بالفعل. من شريط القوائم، حدد التسلسل، قالب تسلسل جديد. حدد التسلسل.حفظ قالب التسلسل كاسم قالب تسلسل S.Select تسلسل، جدول تسلسل. إلحاق N الصفوف المقابلة لقوارير N. ثم وضع قارورة الإدخال وأسماء العينة تحت اسم القارورة والعينة ، على التوالي ، وفقا لترتيبها على صينية autosampler.حدد الطريقة التي تم إنشاؤها كما هو موضح في المخطوطة من القائمة المنسدلة اسم الأسلوب، وإدخال 50 ميكرولتر كقنين لكل قارورة لكل صف. انقر فوق تطبيق، واحفظ قالب التسلسل بتحديد التسلسل، حفظ قالب التسلسل. تأكد من تحميل قالب التسلسل عن طريق تحديد تسلسل، تحميل قالب تسلسل، تسلسل قالب اسم S.After تحقيق خط أساس مستقر على مؤامرة على الانترنت، انقر بزر الماوس الأيمن على لوحة RID الوحدة، التحكم، إيقاف إعادة تدوير صمام لتوجيه تدفق المذيبات من خلال كاشف RID إلى النفايات.لبدء اكتساب البيانات، حدد التسلسل من شريط القوائم، ثم حدد جدول التسلسل، تشغيل. حدد طريقة عرض تحليل البيانات من القائمة عرض. حدد موقع اسم ملف التسلسل من قائمة الملفات على الجانب الأيسر من الشاشة.على اللوحة المركزية على الشاشة، انتقل إلى تحديد عرض الإشارة، إشارة RID لعرض عينات الكروماتوجرامات. حدد صفا مطابقا لأي من العينات من اللوحة العلوية على الشاشة. سيتم ترتيب القمم المقابلة للناقصة المستهدفة على طول محور وقت الاحتفاظ مثل الجلوكوز ، النجدة ، اللاكتات ، الفورمات ، خلات ، والإيثانول في العينات التي تتواجد فيها جميع هذه الأيضات.تمييز ما إذا كانت القمم من الاهتمام يتم دمجها بشكل جيد من قبل البرنامج. يجب رسم خط أحمر تلقائيا كقاعدة لكل قمة. إذا كان الخط الأحمر هو askew، فشل التكامل التلقائي.ثم حدد الزر التكامل اليدوي من مجموعة أدوات التكامل، وارسم قاعدة الذروة يدويا لدمج منطقة الذروة. حدد أداة Cursor من مجموعة الأدوات المشتركة للنقر على القمم المتكاملة بشكل صحيح. سيتم تمييز منطقة الذروة ووقت رد الفعل المقابل للذروة المحددة كصف جدول على اللوحة السفلية خارج الشاشة.لتصدير مناطق الذروة، حدد ملف، تصدير، نتائج التكامل. قيم منطقة ذروة الرسم مقابل التركيزات المعروفة للعينات في جدول بيانات. انقر بزر الماوس الأيمن فوق البيانات المرسومة، ثم حدد إضافة خط الاتجاه، تنسيق خط الاتجاه، عرض المعادلة على الرسم البياني.في جدول بيانات منفصل، استخدم معادلات خطوط الاتجاه القياسية للمنحنى لتحويل قيم منطقة الذروة إلى تركيزات لكل تحليل من كل عينة. حساب متوسط مناطق الذروة وقيم الخطأ القياسية عبر ثلاث نسخ لتصور البيانات. إعداد ردود الفعل ثلاثية الخطوط لكل نقطة زمنية، باستثناء الوقت صفر، على الجليد كما هو موضح في المخطوطة.بدلا من الجلوكوز، استخدم تركيز نهائي من الجلوكوز 100 ملليمولار-13C6 في ردود الفعل. احتضان ردود الفعل في 37 درجة مئوية لمدة ساعة وسنتين وثلاث ساعات. لتبدأ مع التحليل، ماصة حجم يعادل المذيبات استخراج لكل عينة.إذا تم تجميد العينات، إضافة المذيبات استخراج قبل العينات ذوبان تماما لمنع إعادة تنشيط التمثيل الغذائي الجلوكوز. تنفيذ كافة خطوات معالجة العينة على الجليد. لتلخيص الوقت صفر، ماصة الحجم النهائي للمذيبات استخراج إلى حجم مناسب من ليسات للتركيز النهائي المطلوب من 4.5 ملليغرام لكل ملليلتر في 50 ميكرولتر من حجم رد الفعل.إضافة بقية مكونات رد الفعل كما هو موضح سابقا. هذه الخطوة التحمض يعجل الانزيمات ليسات قبل أن استقلاب الجلوكوز بشكل كبير. احتضان العينات في استخراج المذيبات على الجليد لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز لطيف.ثم طرد العينات في 21، 000 مرة ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية لفصل supernatant من البروتين عجلت. نقل 50 ميكرولتر من supernatant إلى قوارير autosampler، وتحميل قوارير على صينية داخل autosampler أربع درجات مئوية. بعد إعداد الأداة للتحليل، قم بإعداد تسلسل تشغيل باستخدام برنامج الحصول على البيانات والتفسير الخاص بنظام LC-MS/MS.ضمن خريطة الطريق، إعداد التسلسل، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الجدول لإدراج صفوف كثيرة مثل العينات. لكل صف، قم بتعيين حجم الحقن إلى خمسة ميكرولترات والموضع إلى موضع القارورة المعني على صينية الطوابع التلقائية. إدخال أسماء الملفات كأسماء نماذج وتعيين مسار الملف المطلوب لنتائج التشغيل.لبدء التشغيل، قم بتمييز كافة أسماء الملفات في التسلسل. من شريط القوائم، حدد الإجراءات، تشغيل التسلسل. فتح MZmine واستيراد ملفات الإخراج الخام التي تم الحصول عليها مسبقا.من شريط القوائم، حدد أساليب البيانات الخام، استيراد البيانات الخام، وحدد الملفات المقابلة للعينات. اتبع الخطوات الموضحة في المخطوطة لإكمال تحليل MZmine. تصدير مناطق الذروة الخام في نهاية تحليل MZmine كملف CSV.افتح جدول بيانات لحساب كتل الأيض المسمى 13C من استقلاب الجلوكوز للبحث المستهدف. استخدام الجماهير المحسوبة من المستقلبات 13C المسمى للبحث والتعليق على ميزات الشامل إلى تهمة من نتائج MZmine. تحقق يدويا من أطياف التعليقات التوضيحية المفترضة على متصفح الجودة لتأكيد التعليقات التوضيحية.فتح خارطة الطريق، متصفح كوال. من شريط الأدوات، افتح ملفا خاما لاستيراد بيانات MS الأولية لكل عينة. رسم خط تحت النطاق المطلوب من أوقات الاحتفاظ المقابلة للتعليق التوضيحي المفترض على مجموع الكروماتوغرام الأيونية لعرض طيف الكتلة.في تجارب HPLC-RID ، تم استهلاك الجلوكوز في غضون الساعات الثلاث الأولى من التفاعل وتم تخميره بشكل رئيسي إلى اللاكتات. كما حدث تراكم الإيثانول بشكل كبير خلال الساعات الثلاث الأولى من التفاعل وتوقف بعد ذلك. كانت خلات موجودة في البداية في ردود الفعل كعنصر من العازلة S30 وتراكمت فقط بسبب التمثيل الغذائي بعد ست ساعات، عندما تباطأ استهلاك الجلوكوز.وبالتالي يمكن اعتبار اللاكتات والإيثانول كالمنتجات النهائية الرئيسية للتخمير في عملية التمثيل الغذائي للجلوكوز الخالية من الخلايا والقائمة على الليكات. ولوحظ أن كلا من الفورمات والنجدة تم تصنيعها كمنتجات تخمير طفيفة. تم استهلاك الجلوكوز-13C6 بشكل ملحوظ من خلال انحلال الجليكوليسيس، كما يتضح من التقلبات في الوسيطات الجليكوليكية.بما يتفق مع بيانات الكشف عن مؤشر الانكسار HPLC، تراكمت الجلوكوز إلى اللاكتات-13C3 وتم تخميرها أيضا إلى succinate-13C3 في غضون الساعات الثلاث الأولى من رد الفعل. كما لوحظ دمج الكربونات المشتقة من الجلوكوز-13C6 في فوسفات السكر 6-فوسفوجلوكولاتون و6-فوسفوجلوكونات والريبلوز-5-فوسفات وsedoheptulose-7-الفوسفات مما يؤكد مشاركة مسار فوسفات البنتوس في عملية التمثيل الغذائي للجلوكوز ليسات. تم العثور على استقلاب الجلوكوز ليسات لتغذية التيروزين-13C9 التوليف, في حين توفر أيضا مقدمة لإنتاج الهستيدين-13C5.من المهم أن تمثل عينات التحكم الوقت صفر بدقة. لذلك، تأكد من أن البروتينات في اللستات معطلة قبل خلط في الحل الذي يحتوي على مصادر الطاقة. تأكد أيضا من أن التكامل التلقائي للقمم من عينات الاختبار وعينات التحكم والمعايير متسق أيضا ، بحيث تكون مناطق الذروة المستخرجة قابلة للمقارنة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

الخلوية لاستخراج الدهن المستهدفة التخفيف النظائر المستقرة تحليل السائل الطيف اللوني القداس

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

تمكين أكذوبة موسع الأيض التنميط

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

A Coupled Experiment-finite Element Modeling Methodology for Assessing High Strain Rate Mechanical Response of Soft Biomaterials

عنصر النمذجة منهجية الديناميكي تجربة محدودة لتقييم عالية معدل الانفعال الاستجابة الميكانيكية للالحيوية لينة

This study offers a combined experimental and finite element (FE) simulation approach for examining the mechanical behavior of soft biomaterials (e.g. ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

صالحة قابل للغلق غرفة فيمتولتر مجانا خلية علم الأحياء

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

توليف حيويا الكريستال السائل المرنة كسوات كما السقالات الخليوي لزراعات الخلايا 3D المكانية

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

توليف "باكتيريوفاجيس المعدية" في كولاي-استناداً إلى "نظام التعبير" الخلية الحرة

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

الكشف عن الأحماض النووية متعددة في صفيف شعرية البصرية

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

منصة ميكروفلويدريك متعددة الطبقات لتوصيل التعبير الجيني الخالي من الخلايا لفترات طويلة

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

الكشف عن سرطان المبيض باستخدام الضوئية تدفق الصوتية الخلوية

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

القياس الكمي المتزامن لـ Kynurenines المختارة التي تم تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة- القياس الطيفي الكتلي في المتوسط الذي تم جمعه من ثقافات الخلايا السرطانية

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...