Name: liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems
Uploaded: 2021-09-23T14:45:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Denne forskning blev sponsoreret af Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, som en del af Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory administreres af UT-Battelle, LLC, for det amerikanske energiministerium på kontrakt DE-AC05-00OR22725. Dette manuskript er blevet forfattet af UT-Battelle, LLC i henhold til kontrakt DE-AC05-00OR22725 med det amerikanske energiministerium. Den amerikanske regering bevarer og udgiveren, ved at acceptere artiklen til offentliggørelse, anerkender, at den amerikanske regering bevarer en ikke-klam, betalt, uigenkaldelig, verdensomspændende licens til at offentliggøre eller gengive den offentliggjorte form af dette manuskript, eller tillade andre at gøre det, for usa's regering formål. Department of Energy vil give offentligheden adgang til disse resultater af føderalt sponsoreret forskning i overensstemmelse med DOE Public Access Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

<ol>
	<li>Rollin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+hydrogen+production+from+biomass+by+in+vitro+metabolic+engineering:+Mixed+sugars+coutilization+and+kinetic+modeling.">High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).</li><li>Bowie, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biochemistry:+The+bio-inspired+cell-free+approach+to+commodity+chemical+production.">Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production.</a> Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).</li><li>Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+platform+for+cell+free+production+of+monoterpenes+from+glucose.">A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose.</a> Nature Communications. 8, 1-8 (2017).</li><li>Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosynthesis+of+limonene+using+enzyme-enriched+Escherichia+coli+lysates.">Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates.</a> Synthetic Biology. 4 (1), 003 (2019).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+potential+of+crude+cell+extracts+for+producing+pyruvate+from+glucose.">Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose.</a> Synthetic Biology. 3, (2018).</li><li>Kay, J. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysate+of+engineered+Escherichia+coli+supports+high-level+conversion+of+glucose+to+2,3-butanediol.">Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol.</a> Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).</li><li>Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+growth+medium+dropouts+promote+aromatic+compound+synthesis+in+crude+E.+coli+cell-free+systems.">Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysate+proteome+engineering+strategy+for+enhancing+cell-free+metabolite+production.">A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production.</a> Metabolic Engineering Communications. 12, 00162 (2021).</li><li>Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+pathway+prototyping.">Cell-free synthetic biology for pathway prototyping.</a> Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+cell-free+extract+reaction+(CFER)+system+in+Clostridium+thermocellum+to+identify+metabolic+limitations+to+ethanol+production.">Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production.</a> Frontiers in Energy Research. 8, 72 (2020).</li><li>Coskun, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Separation Tecniques: Chromatography. 3, (2016).</li><li>Bernardes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+acids+and+alcohols+quantification+by+HPLC/RID+in+sugarcane+vinasse:+analytical+method+validation+and+matrix+effect+assessment.">Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment.</a> International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computationally+guided+discovery+and+experimental+validation+of+indole-3-acetic+acid+synthesis+pathways.">Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways.</a> ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).</li><li>Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+control+of+cell-free+metabolism+through+pH+modulation.">Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation.</a> Synthetic Biology. 5, (2020).</li><li>Bujara, M., Sch&#252;mperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+cell-free+systems:+Implementation+and+debugging+of+a+system+of+biotransformations.">Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).</li><li>Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+identification+and+quantitation+in+LC-MS/MS-based+metabolomics.">Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics.</a> TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).</li><li>Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-liquid+chromatography.">Nano-liquid chromatography.</a> Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).</li><li>Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+mass+spectrometry-based+metabolomics:+Opportunities+and+challenges.">Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).</li><li>O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+CoA+metabolites+by+SAMDI-MS+to+optimize+the+cell-free+biosynthesis+of+HMG-CoA.">High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA.</a> Science Advances. 5, (2019).</li><li>Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unimod:+Protein+modifications+for+mass+spectrometry.">Unimod: Protein modifications for mass spectrometry.</a> Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).</li><li>Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+mixing+of+Escherichia+coli+crude+extracts+to+prototype+and+rationally+engineer+high-titer+mevalonate+synthesis.">Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).</li><li>Jaishankar, J., Srivastava, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+stationary+phase+survival+and+applications.">Molecular basis of stationary phase survival and applications.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2000 (2017).</li><li>Bartolomeo, M. P., Maisano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+for+quantitative+amino+acid+analysis.">Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).</li><li>Hauck, T., Landmann, C., Br&#252;hlmann, F., Schwab, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone+in+cytosolic+extracts+obtained+from+Zygosaccharomyces+rouxii.">Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).</li><li>Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsoSearch:+An+untargeted+and+unbiased+metabolite+and+lipid+isotopomer+tracing+strategy+from+HR-LC-MS/MS+datasets.">IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets.</a> Methods and Protocols. 3 (3), 54 (2020).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen kendte konkurrerende finansielle interesser eller andre interessekonflikter.

Den skitserede HPLC-RID-tilgang kan bruges til at kvantificere forbruget af sukkersubstrat og efterfølgende konverteringer til større organiske syre- og alkoholprodukter af lysatcentral metabolisme over tid. Desuden anvender denne protokol en simpel isokratisk metode ved hjælp af en enkelt mobil fase, kræver minimal prøveforberedelse og giver mulighed for en simpel målrettet downstream-analyse. Analytter målt ved HPLC-RID-metoden skelnes udelukkende af deres opbevaringstider og dermed deres interaktioner med den valgte kolonneharpiks. HPLC kolonne anvendes her var specielt designet til at adskille kulhydrater, organiske syrer, og alkoholer ved at kombinere størrelse-udelukkelse og ligand udveksling (dvs. ion-modereret partition kromatografi). Den beskrevne metode er derfor nyttig til mere målrettet analyse af kulhydratsubstrater og udvalgte slutprodukter af glukosefermenteringsveje, som primært forventes at lette og energize lysatebaserede biotransformationer8,15,21. Men, denne protokol ikke tegner sig for aktivering af andre metaboliske veje i celle ekstrakter. Rørledninger, der anvender andre kromatografiske separationsteknikker (dvs. hydrofil interaktionskromatografi), gradient elution metoder, mere kompliceret prøve forberedelse (dvs. derivatisering), og forskellige optiske detektorer (f.eks ultraviolet lys eller fordampningslys spredning detektorer) kunne anvendes til at opdage andre metabolitter såsom aminosyrer og sukker fosfater23,24 . Alternativt kan en global tilgang til undersøgelse af lysatmetabolisme tages ved hjælp af LC-MS/MS.
Den beskrevne LC-MS/MS-metode er en enkelt arbejdsgang til måling og identifikation af en bredere vifte af metabolitter. LC-MS/MS er et topmoderne analyseværktøj til metabolomprofilering på grund af dets følsomhed og evne til at skelne metabolitter efter retentionstid og m/z-nøgletal med høj opløsning16. Med fokus på centrale kulstof metaboliske veje og aminosyre anabolisme, negativ tilstand MS / MS blev gennemført for specifikt at opdage polære organiske syrer, sukker fosfater, og aminosyrer. Kombineret med en nano-flydende kromatografi teknik, metoden giver høj følsomhed til påvisning af små molekyler i den komplekse lysat baggrund17. Med hensyn til profilering af lysatbaseret CFME-metabolisme er en begrænsning af den beskrevne LC-MS/MS-protokol imidlertid dens nedre detektionsgrænse på 50 m/z, hvilket udelukker måling af ethanol, et vigtigt produkt i lysat glucosemetabolisme, samt format, som begge ellers let kvantificeres efter den detaljerede HPLC-RID-metode. Sammenlignet med LC-MS/MS har HPLC-RID den ekstra fordel, at den relative tilgængelighed med hensyn til omkostninger og vanskeligheder. Til sidstnævnte punkt kan fejlfinding af den LC-MS/MS-metode, der er beskrevet her, kræve en vis grad af ekspertise inden for massespektrometri. Ikke desto mindre har MS-detektion unikt tiltalende applikationer over RID, da det desuden kan skelne mærkede isotoper i metabolomer, en fremragende teknik til at forstå kulstofbevægelse fra supplerede substrater gennem det komplekse lysat metaboliske netværk18. En sådan tilgang blev anvendt her ved at supplere reaktioner med 13C6-glukose og analysere de relative overflodsværdier af downstream 13C-inkorporerende metabolitter. Analysen gjorde det muligt at definere aktive og inaktive veje, støtte tidligere rapporterede antagelser og give ny indsigt om metabolisk flux i lysater. Der kan også foretages ændringer inden for metoden til specifikke analyser. For eksempel kan standardopløsninger af 13C-mærkede målforbindelser analyseres sammen med prøver for at opnå absolutte kvantitative målinger af glukose-afledte molekyler over tid og drage konklusioner om fluxfordelinger. Bedre registrering af positivt ladede forbindelser kan også aktiveres i den aktuelle arbejdsproces ved at køre sekvenser med .meth-filer justeret til registrering af positiv tilstand.
Analytisk prøveudtagning i begge beskrevne metoder er bekvemt automatiseret, hvilket sikrer høj reproducerbarhed. Desuden kan der forventes glatte analytiske kørsler, så længe der overholdes korrekt instrumenthåndteringspraksis og vedligeholdelse. Ved brug af disse værktøjer til at analysere CFME-reaktioner bør der tages mere kritiske overvejelser opstrøms og nedstrøms af prøveudtagning. Under prøveforberedelse er det vigtigt, at tidskurskontroller er repræsentative for time-zero. Her blev proteiner udfældet i lysater ved forsuring for at stoppe metaboliske reaktioner. Til tid-nul prøver blev syreopløsningsmidlet kombineret med lysat, før reaktionsmikset indeholdt glukose. Forsuring med trichloreddikesyre sikrede effektivt, at glukose ikke metaboliseres på tid-nul, som vist i HPLC-RID-dataene (Figur 2). Mens en lignende procedure for at slukke glukosemetabolisme blev udført i den rapporterede LC-MS/MS-analyse, blev der påvist 13C-mærkede metabolitter i time-zero-prøver, om end ved betydeligt lave overflodsværdier i forhold til prøver, der blev udvundet på senere tidspunkt. Desuden var disse observationer begrænset til parprodukter af glykolyse. Dataene tyder på, at reaktionerne bevarer en vis grad af glykolytisk aktivitet efter forsuring med ekstraktionsopløsningsmidlet, der detekteres ved denne meget følsomme metode. Omfanget af denne aktivitet bør dog kvantificeres. En tidligere undersøgelse rapporterede , at sure ekstraktionsmidler ikke i tilstrækkelig grad må slukke mellemliggende glykolytiske reaktioner, men kan stoppe et betydeligt glukoseforbrug10. Mens dette stadig skal undersøges yderligere i det system, der anvendes her, drastiske ændringer i relative overflod værdier mellem tid-nul og senere timepoint prøver kan fortolkes som tendenser i glukose metabolisme. Undersøgelse af alternative slukningsmetoder anbefales dog i lignende applikationer, specielt til opnåelse af absolutte mængder metaboliske mellemprodukter10. Desuden bør der også overholdes god praksis i forbindelse med downstream-softwareanalyser. Konsistens er afgørende, når du manuelt integrerer spidsområder fra RID-signaler for at reducere menneskelige fejl. Manuel integration bør også anvendes på spidsbelastningsområder af standarder, når der anvendes manuelt integrerede spidsområder til at kvantificere metabolitkoncentrationer i prøver. I hele den målrettede LC-MS/MS-analyse bør foreløbige anmærkninger fra MZmine-analyse valideres ved manuel topkontrol ved hjælp af en MS-kvalitetsbrowser, og m/z-funktioner bør kun kommenteres, når beregnede massefejl er acceptable. Her blev disse analyser udført manuelt for et begrænset sæt mål, da omfattende og robust software til isotopsøgning endnu ikke er etableret. Men sådanne automatiserede metoder til søgning 13C mærket metabolitter er i øjeblikket ved at opstå og ville strømline mere komplicerede analyser samt, ligesom profilering lysater ud central kulstof metabolisme25.
Avanceret flydende kromatografi er en robust og bredt anvendt metode til adskillelse af små molekyler i komplekse metaboliske blandinger11. De beskrevne metoder parerer denne separationsteknik med brydningsindekset eller massespektrometrisk detektion for at kunne analysere metabolitkonverteringer i lysatbaserede CFME-reaktioner. HPLC-RID og LC-MS/MS er individuelt effektive værktøjer til profilering af aktiv lysatmetabolisme, og deres komplementaritet kan yderligere udnyttes til at håndtere hver tekniks iboende begrænsninger. De rapporterede metoder gør det muligt at anvende og udvikle CFME, da de kan udnyttes til at forstå lysatmetabolisme, overvåge forbedringer i målrettede metabolitkonverteringer og belyse ændringer til metabolitstrøm, når de manipulerer lysatmetabolisme.

Begrænsninger i tekniske mikrober til kemisk produktion kan løses ved at generobre biokemiske reaktioner in vitro, hvor konkurrerende cellulære overlevelsesfunktioner er fraværende1. Desuden er det åbne reaktionsmiljø (dvs. fravær af en cellemembran) mere modtageligt for manipulation og er lettere at overvåge sammenlignet med levende celler. Dette grundlæggende koncept for cellefri metabolisk teknik (CFME) er elegant blevet demonstreret ved rekonstitution af metaboliske veje til at syntetisere værdifulde kemikalier som brint og monoterpener med produktionsmålinger, der er størrelsesordener højere end præsenteret i mikrobielle cellefabrikker hidtil1,2,3 . Metoder til rensning af hele veje er imidlertid i øjeblikket begrænset af tid og omkostninger. Alternativt kan cellefrie metaboliske systemer udledes af råcelleekstrakter gennem hurtige og billige metoder i forhold til hele vejen rekonstitution4. Det centrale stofskifte, der opbevares i celleekstrakter, kan suppleres med energisubstrater (f.eks. glukose og enzymatiske cofaktorer) og salte i bufferede opløsninger til at generere centrale metaboliske prækursorer i over 24 timer5,6. Tilsætning af udefrakommende enzymer til den lysatbaserede CFME-reaktion giver mulighed for mere komplekse biotransformationer af glukose til mere værdifulde kemikalier ved høje titere4,6,7. Selvom udbyttet har tendens til at blive kompromitteret i disse systemer på grund af deres cellelignende metaboliske kompleksitet, er der og er ved at blive udviklet unikke metoder til at kuratere lysatproetomer til højere udbyttekonvertering7,8.
Den nemme at udføre metaboliske transformationer i lysatbaserede cellefrie systemer gør disse fremragende platforme til enten at flytte kemisk produktion uden for cellen helt eller til prototype af nye veje med høj gennemløb, før de bygger og tester disse designs in vivo2,9. For enten anvendelse, værktøjer til overvågning metaboliske konverteringer eller observere generelle ændringer til metabolisk flux i lysater er en integreret del af udviklingen af CFME. Højtydende flydende kromatografi (HPLC) kan anvendes til at adskille de kemiske bestanddele af CFME-reaktioner med høj opløsning og kan kobles til optiske eller massespektrometrære detektorer til metabolitkvantificering5,10. Det grundlæggende princip i HPLC er, at analytter opløst i et opløsningsmiddel (dvs. mobil fase) og pumpes gennem en kolonne vil interagere med den specifikke kolonne emballage materiale (dvs. stationær fase)11. Afhængigt af deres kemiske egenskaber udviser disse analytter varierende retentionstider, før de til sidst eluteres fra den stationære fase og bæres af den mobile fase til en detektor. Denne rapport beskriver udarbejdelsen og analysen af E. coli lysate-baserede CFME-reaktioner gennem HPLC-baserede metoder, der udnytter RID og MS/MS-detektion.
HPLC koblet til brydningsindeksdetektering (HPLC-RID) er en generelt tilgængelig metode til hurtigt at identificere centrale metaboliske prækursorer og slutprodukter. Kort sagt måler RID, hvordan analytter ændrer lysafbøjningen i den mobile fase12. RID-signaler svarende til målanaytter i prøver kan derefter kvantificeres ved sammenligninger med RID-signaler fra standardopløsninger. I CFME-programmer har denne detektionsmåde oftest været anvendt med HPLC-kolonner, der adskiller forbindelser baseret på en kombination af størrelsesudelukkelses- og ligandudvekslingsmekanismer eller ion-modereret partitionskromatografi5,6,8,13. Denne særlige teknik bruges til hurtigt at kvantificere forbruget af sukkersubstrater som glukose samt dannelsen af fermenteringsprodukter som succinate, laktat, format, acetat og ethanol i lysatbaserede CFME-reaktioner8. Registrering af koncentrationsændringerne af disse forbindelser via HPLC har været nyttig til både at belyse potentialet i råcelleekstrakter til at samle centrale metaboliske prækursorer og forstå, hvordan vejstrøm omdirigeres gennem fermentative veje under komplekse metaboliske konverteringer fra glukose i lysater6,8,14. Skelsættende CFME-undersøgelser i E. coli-celleekstrakter bekræfter, at fermenteringsforbindelser ophobes som slutprodukter af glukosekatabolisme og også forekommer som uønskede biprodukter i lysater, der overekspresserer eksogene enzymer6,15. Det foreslås, at fermentativ metabolisme spiller en nødvendig rolle i regenerering af redox ækvivalenter af cofaktorer (dvs. NAD (P)H og ATP) til at opretholde glykolytiske reaktioner8. Derfor er en HPLC-baseret optisk detektionsmetode designet til at adskille fermenteringsprodukter et nyttigt og almindeligt anvendt værktøj, når der udføres forskellige lysatbaserede CFME-opgaver.
CFME kan implementeres for at akkumulere metaboliske slutprodukter, der ikke er kulhydrater, organiske syrer eller alkoholer4. Måling af mellemprodukter, der forbruges så hurtigt som de syntetiseres, kan også være ønskeligt10. Mens HPLC-RID er tilgængelig med hensyn til omkostninger og vanskeligheder, er denne metode begrænset af dens evne til kun at skelne metabolitter baseret på opbevaringstid. En bredere vifte af metabolitter kan analyseres, når flydende kromatografi kobles til MS/MS detection (LC-MS/MS)16. Ved denne metode er analytter i den mobile fase ioniseret og differentieret detekteret baseret på hvert molekyles masse- og opladningsegenskaber. Kendskab til både metabolitens masse-til-opladningsforhold (m/z) og opbevaringstid på kolonnen letter således adskillelsen af de fleste metaboliske mellemprodukter og slutprodukter med høj opløsning16. Denne detektionsteknik kan også kobles til nano-flydende kromatografi, som giver meget lavere strømningshastigheder og prøveindsprøjtningsmængder, hvilket giver mulighed for mere følsom påvisning af små molekyler i den komplekse lysatbaggrund17. LC-MS/MS kan desuden anvendes med isotopmærkning, da indbygget etiketter giver ændringer i analytes m/z-værdier18. Timepointmålinger udvundet af en CFME-reaktion suppleret med et 13C6-glukosesubstrat kan således bestemme de slut- eller biprodukter, der er afledt specifikt af suppleret glukose. Selvom denne isotopsporingsmetode endnu ikke anvendes almindeligt i CFME-undersøgelser, er det et effektivt værktøj til at forstå metaboliske konverteringer i lysatbaserede CFME-systemer, specifikt da salttællere (dvs. acetat og glutamat) i disse reaktioner også kataboliseres som sekundære substrater19. Udnyttelse af denne teknik kan således tegne et omfattende billede af glukosemetabolisme i lysater, som den dag i dag ikke er helt forstået. Her beskriver protokollen en metode til nano-flydende kromatografi koblet til nanoelektrosprayionisering (nano ESI) MS/MS, der kan bruges til at afhøre en mulig model for glukosemetabolisme, specielt i E. coli lysater (Figur 1). Modellen er baseret på rapporter om fermentative veje, og pentosephosphatvejen er aktiv i E. coli lysater, der stammer fra stammer, der dyrkes i rige medier5,6,8,14. Teknikken bruges desuden til at undersøge aminosyreproduktion, da den nuværende viden om aminosyre anabolisme fra glukose i lysater er begrænset til et par eksempler såsom syntesen af aromatiske aminosyrer7. I betragtning af den mest polære karakter af slutprodukter og mellemprodukter i disse veje (dvs. organiske syrer, sukkerphosphater og aminosyrer), blev omvendt faset flydende kromatografi udnyttet her. Denne teknik adskiller polarforbindelser ved elution fra en ikkepolær stationær fase. Disse forbindelser blev derefter ioniseret af nano ESI i negativ ion-tilstand, som gør det muligt at detektere analytter med mindst én negativ elementarladning og er derfor nyttig til påvisning af sure forbindelser. Denne teknik anvendes her til at analysere glukose-afledte 13C-indarbejde metabolitter og demonstrerer nytten af LC-MS / MS til forståelse af glukosemetabolisme i lysater.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m centrifuge tube filters (spin columns)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Binary LC Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1312B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity High Performance Degasser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4225A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Refractive Index Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7162A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Standard Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1329B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374</td>
			<td>CFME reaction mix component (LC-MS/MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.20 &#956;m pore (PES membrane) filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminex HPX 87-H column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1250140</td>
			<td>Chromatography column for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1376</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vial caps (yellow, snap)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-50Y</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W225181</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-dextrose (Glucose)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9230</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8281</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC/MS grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica (internal diameter of 100 &#956;m, external diameter of 375 &#956;m)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>WM22005-ND</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetex 5 &#956;m C18 stationary phase (100 &#197;)</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0632</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanospray Ionization Source</td>
			<td>ThermoFisher Scientific/Proxeon</td>
			<td>ES071 (newest model)</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenLab CDS (Online) Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 2.15.26</td>
			<td>Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 2.7</td>
			<td>Software for tuning the LC-MS/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps (with septa, 9 mm)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29315-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwthread glass vials (2 mL)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29376-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>247596</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71716</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>398055</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>Solvent preparation for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-acetate</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-090-100</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Solvent Rack: SRD-3600</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6500</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 3.0.63</td>
			<td>Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems

Engineering cellulære metabolisme til målrettet biosyntese kan kræve omfattende design-build-test-learn (DBTL) cykler som ingeniør arbejder omkring cellens overlevelse krav. Alternativt kan udførelse af DBTL-cyklusser i cellefrie miljøer fremskynde denne proces og afhjælpe bekymringer med værtskompatibilitet. En lovende tilgang til cellefri metabolisk teknik (CFME) udnytter metabolisk aktive råcelleekstrakter som platforme for biofremstilling og til hurtigt at opdage og prototyping modificerede proteiner og veje. Realisering af disse funktioner og optimering af CFME-ydeevne kræver metoder til at karakterisere metabolomet af lysatbaserede cellefrie platforme. Det vil sige, at analytiske værktøjer er nødvendige for at overvåge forbedringer i målrettede metabolitkonverteringer og til at belyse ændringer af metabolitstrøm, når man manipulerer lysatmetabolisme. Her blev metabolitanalyser ved hjælp af højtydende flydende kromatografi (HPLC) kombineret med enten optisk eller massespektrometrisk detektion anvendt til at karakterisere metabolitproduktion og flux i E. coli S30-lysater. Konkret beskriver denne rapport forberedelsen af prøver fra CFME-lysater til HPLC-analyser ved hjælp af brydningsindeksdetektering (RID) for at kvantificere produktionen af centrale metaboliske mellemprodukter og biprodukter i omdannelsen af billige substrater (dvs. glukose) til forskellige produkter af høj værdi. Analysen af metabolitkonvertering i CFME-reaktioner fodret med 13C-mærket glukose gennem omvendt fase flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri (MS / MS), et kraftfuldt værktøj til at karakterisere specifikke metabolit udbytter og lysat metabolisk flux fra udgangsmaterialer, er også præsenteret. Alt i alt gør anvendelsen af disse analysemetoder til CFME lysatmetabolisme det muligt at fremme disse systemer som alternative platforme til udførelse af hurtigere eller nye metaboliske tekniske opgaver.

For at kvantificere den lysatbaserede cellefri syntese af almindelige fermenteringsprodukter fra glukose blev lysater fremstillet af stammer, der blev dyrket i 2xYPTG-medier, fodret med 100 μM glukose som primær kulstofkilde8. Reaktionerne blev stoppet over et 24 timers tidsforløb ved proteinforsuring. Filtrerede supernatanter, der indeholder pyruvat, succinate, laktat, format, acetat og ethanol fremstillet af glukosekafi, blev indlæst på autosamplermodulet i et HPLC-system udstyret med et RID-modul. Hætteglas med filtrerede blandinger af fermentative slutprodukter og glukose ved 1,17 μM, 2,34 μM, 4,69 μM, 9,38 μM, 18,75 μM, 37,50 μM, 75 μM og 150 μM koncentrationer i S30 buffer blev læsset på instrumentet som standard. Analytter blev udvundet isocratically fra en HPLC kolonne til RID. Toppe for glukose, succinate, laktat, format, acetat og ethanol inden for 1 til 150 μM-området kunne løses ved HJÆLP. Spidsbelastningsområder for glukose blev afledt af manuel integration fra RID-dataene for tidskurs- og standardkurveprøver. Udvundne spidsområder for succinate, laktat, format, acetat og ethanol blev taget fra automatisk integrerede signaler. Alle standardkurver (spidsareal vs. kendt koncentration) havde R2-værdier >0,99 og var lineære i hele det koncentrationsområde, der anvendes her.
Molarkoncentrationer for alle målanaytter blev beregnet ud fra deres respektive standardkurver. Glukose blev indtaget inden for de første 3 timer af reaktionen og hovedsagelig fermenteret til laktat (Figur 2A, B). Ethanolakkumuleringen forekom også signifikant inden for de første 3 timer af reaktionen og stoppede derefter (Figur 2C). Observationen af en betydelig produktion af laktat og ethanol med et betydeligt glukoseforbrug efter 3 timer var ikke uden fortilfælde, da laktat- og ethanolproduktionsveje gør det muligt at regenerere 1 netto mol NAD+ fra glykolytisk NADH, der kræves til fortsat glukoseforbrug gennem glykolyse (figur 1). Laktat og ethanol kan således betragtes som de vigtigste fermenteringsprodukter i lysatbaseret cellefri glukosemetabolisme. Acetat var oprindeligt til stede i reaktionerne som en del af S30-bufferen og uventet kun akkumuleret på grund af stofskiftet efter 6 timer, når glukoseforbruget var bremset (Figur 2D). Dette resultat tyder på, at acetatgæring ikke nødvendigvis muliggør hurtig glykolytisk flux i tidligere tidspunkter. I mellemtiden blev format og succinate syntetiseret som mindre fermenteringsprodukter (Figur 2E, F). Alt i alt muliggjorde metoden den absolutte kvantificering af sukkersubstratudtømning og fermentativ produktdannelse i E. coli S30 lysater.
MS detektion til profil lysat glukose metabolisme specifikt blev anvendt her. Lysater afledt af stammer dyrket i 2xYPTG medier blev fodret 13C6-glukose som en kulstofkilde. CFME-reaktioner blev kørt i tredotel i 0 timer, 1 time, 2 timer og 3 timer. Prøver fra hvert timepoint blev indlæst på et LC-system udstyret med en omvendt fase kolonne og koblet til Fourier transformering og ion fælde massespektrometre. Negative ion mode spektre blev opnået og behandlet til at analysere organiske syrer, sukker fosfater, og aminosyrer. Beregnede teoretiske masser af 13C-mærkede arter, der tilhører central carbon metabolisme blev søgt for at identificere specifikt glukose-afledte forbindelser. Baseret på de udnyttede kildestamme dyrkningsforhold og tidligere rapporter om aktive veje i E. coli CFME, antages det her, at lysat proteomet omfatter et metabolisk netværk, der føder glukose i glykolytisk gæring, pentosephosphat vej, og muligvis aminosyre anabolisme5,6,7,8,14 ( Figur1). Derfor blev søgningen indsnævret til medlemmer af disse veje, hvoraf 16 metabolitter, der inkorporerer glukose-afledte 13C-etiketter, utvetydigt blev kommenteret (supplerende tabel 1).
13 C6- glukose blev observerbart forbrugt gennem glykolyse, som det fremgår af udsvingene i glykolytiske mellemliggende overfloder (Figur 3A-E). I overensstemmelse med HPLC-RID-dataene akkumulerede glukose til 13C3-laktat og blev også fermenteret til 13C3-succinate inden for de første 3 timer af reaktionen (figur 4A, B). Dannelsen af 13C3-succinate isotopolog understøtter den foreslåede model for lysat glukosemetabolisme (Figur 1), hvor succinate sandsynligvis vil blive genereret af carboxylation af 3-carbon fosfoenolpyruvat (PEP) molekyle og ikke fra indgangen af et 2-carbon acetyl-CoA-molekyle til TCA-cyklussen. Aktivering af TCA-cyklussen er blevet antaget i tidligere CFME-undersøgelser , men andre 13C-mærkede mellemprodukter af TCA blev ikke påvist her8,19,21. 13 C3-aspartatsyntese forekom dog inden for første h og blev forbrugt, hvilket forstærkede ideen om, at PEP omdannes direkte til oxaloacetat (figur 1, figur 6C). Dataene afspejler et lysat proteom fra kildestammer høstet under fermentativ vækst på glukoserige medier (2xYPTG). Dette ville endvidere indebære, at resten af TCA-enzymerne, der ikke deltager i succinateproduktionen, udgør en oxidativ TCA-gren (figur 1). Ingen af metabolitterne i denne vej blev imidlertid opdaget, muligvis fordi høje koncentrationer af glutamat tilsat CFME-reaktionen som en salttællerion forhindrer udviklingen af denne gren. 
HPLC-RID-dataene suppleres desuden af manglen på 13C2-acetatdetektering inden for 3 timers reaktionstidsramme, hvilket tyder på, at der ikke opbygges et acetat fra glukose op til 3 timer (figur 2B). Imidlertid akkumuleres den direkte forløber for acetatat, acetylphosphat (acetyl-P), hvilket tyder på, at Pta-AckA-stien til acetatasyntese fra acetyl-CoA er aktiv (Figur 4C, D). AckA katalyseret dephorylation af 13C2-acetyl-P til 13C2-acetat forekommer sandsynligvis ikke inden for denne tidsramme, fordi acetat er en vigtig del af den S30-buffer, der anvendes i reaktionerne (Figur 1, Figur 2B).
Inkorporeringen af 13C6-glucose-afledte kulstof i sukkerphosphater 6-fosfogluconolaktone (6PGL), 6-fosfogluconat (6PG), ribulose-5-fosfat (Ru5P) og sedoheptulose-7-fosfat (S7P) blev også observeret (figur 5). Disse resultater bekræfter deltagelsen af pentosephosphatvejen i lysatglukosemetabolisme og giver sandsynligvis 13C9-tyrosinsyntese, som tidligere er blevet foreslået af en proteomisk undersøgelse, samtidig med at den giver en forløber for 13C5-histidinproduktion (Figur 6A, B)7. Mærket phenylalanin og tryptofan blev ikke observeret her, og heller ikke var de fleste af de essentielle aminosyrer. Dette er dog ikke helt overraskende, da aminosyreanabolisme sandsynligvis vil blive beriget med lysater afledt af celler dyrket i næringsrige forhold eller i den stationære fase7,22. Desuden tyder de hidtidige data på, at mellemprodukter af glykolyse og gæring kanaliseres mod cofaktorregenererende slutreaktioner, hvilket må udelukke syntese af mange aminosyrer, der stammer fra glyceraldehyd-3-fosfat, pyruvat og acetyl-CoA (dvs. glycin, cystein, serin, alanin, valin, leucin og lysin) (figur 1). Som nævnt blev der produceret 13C3-aspartat inden for den første time, mens aspartat afledte 13C-inkorporerede aminosyrer (dvs. threonine, isoleucin, methionin og asparagine) ikke blev observeret muligvis fordi glukose-afledt aspartat deltager i gæring (figur 1, figur 6C). Endelig kan flux mod mærkede glutamat- og aminosyrer, der stammer fra glutamat, være blevet hæmmet af høje niveauer af glutamat i reaktionsmiljøet (figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig01.jpg"> Figur 1: En putativ metabolisk model af lysater afledt af E. coli BL21DE3-Star vokser eksponentielt i høje glukosekoncentrationer. Mellemprodukter og slutprodukter af glykolyse (grøn), pentosephosphatvejen (mørk orange) og fermentative veje (blå) fra acetyl-CoA er blevet rapporteret i lysatbaseret CFME. Tilstedeværelsen af succinate gæring indebærer aktivering af den oxidative TCA gren (grå). Aminosyre anabolisme (guld) i lysater er ikke veldefineret og undersøges her. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig02.jpg"> Figur 2: HPLC-RID-data til glukoseforbrug og fermentativ syntese af slutproduktet i CFME-reaktioner tilberedt med E. coli-råekstrakter. (A) Glukoseforbrug og (B) laktat, (C) ethanol, (D) acetat, (E)format og (F) succinateproduktion i CFME-reaktioner blev overvåget over 24 timer. Gennemsnitlige mM-koncentrationer og fejllinjer (SE) kvantificeret med standardkurver præsenteres (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig03.jpg"> Figur 3: Tidsforløbstendenser på 13C6- glucose og 13C-mærkede glykolytiske mellemprodukter i E. coli lysate CFME. Relativ forekomst af (A) 13C6-glucose, (B) 13C6-glucose-6-fosfat/fructose-6-fosfat, (C) 13C6-fructose-1,6-bisphosphat, (D) 13C3-glyceraldehyd-3-fosfat/dioxyhydracetonephosphat, og (E) 13C6 -pyruvat i CFME-reaktioner over 3 timer. Rå spidsområder udvundet af mzMINE-software blev brugt til at beregne gennemsnit og fejllinjer (SE) for positive anmærkninger (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig04.jpg"> Figur 4: Tidskurstendenser for mellemprodukter og slutprodukter i 13C6- glukosegæring i E. coli lysate CFME. Relativ forekomst af (A) 13C3-laktat, (B) 13C3-succinate, (C) 13C2-acetyl-fosfat og (D) 13C2-acetyl-CoA i CFME reaktioner over 3 timer. Rå spidsområder udvundet af mzMINE-software blev brugt til at beregne gennemsnit og fejllinjer (SE) for positive anmærkninger (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig05.jpg"> Figur 5: Tidsforløbstendenser på 13C6- glukose afledt pentosephosphat pathway mellemprodukter i E. coli lysate CFME. Relativ forekomst af (A) 13C6-6-fosfogluconolactone, (B) 13C6-6-fosfogluconat, (C) 13C5-ribulose-5-fosfat og (D) 13C7-sedoheptulose-7-fosfat over 3 timer. Rå spidsområder udvundet af mzMINE-software blev brugt til at beregne gennemsnit og fejllinjer (SE) for positive anmærkninger (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig06.jpg"> Figur 6: Tidskurstendenser for påviste 13C6-glucose afledte aminosyrer i E. coli lysate CFME. Relative overfloder af (A) 13C9-tyrosin, (B) 13C5-histidin, og (C) 13C3-aspartate over 3 timer. Rå spidsområder udvundet af mzMINE-software blev brugt til at beregne gennemsnit og fejllinjer (SE) for positive anmærkninger (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende figur 1: Repræsentativt HPLC-RID kromatogram, der viser toppe for større fermentative produkter i en CFME-reaktion inkuberet ved 37 °C i 24 timer. Glukose, succinate, laktat, format, acetat og ethanoltoppe kan i tilstrækkelig grad skelnes fra deres retentionstider på en HPLC-kolonne under isokratisk elution med 5 mM svovlsyreopløsningsmiddel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-Suppfig1.eps" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 2: Repræsentativt massespektre for 13C-mærkede metabolitter, specifikt (A) laktat,(B) glukose og (C) 6-fosfogluconat (6PG) i en CFME-reaktion inkuberet ved 37 °C i 1 time. Klik her for <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-SuppFig2.eps" target="_blank">at downloade denne fil.</a>
Supplerende tabel 1: Liste over fundne 13C-mærkede metabolitter, retentionstider (justeret på tværs af prøver ved hjælp af MZmine), teoretisk fuldt 13C-mærket negativ tilstand m /z værdier, m / z værdier af registrerede funktioner, og beregnede massefejl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/Supplemental%20Table%201.docx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Protokollerne beskriver højtydende flydende kromatografi metoder koblet til brydningsindeks eller massespektrometrisk detektion til undersøgelse af metaboliske reaktioner i komplekse lysat-baserede celle-fri systemer.

Flydende kromatografi koblet til brydningsindeks eller massespektrometrisk detektion til metabolitprofilering i lysatbaserede cellefrie systemer

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

Denne protokol bruger brydningsindeksdetektering til at måle biprodukter af kulstofmetabolisme, der almindeligvis akkumuleres i lysatbaserede, cellefrie systemer. Det gør også brug af massespektrometri til at opdage et endnu bredere panel af centrale metabolitter, der genereres i metabolisk aktive lysater. De to teknikker, der anvendes i denne protokol, giver mulighed for kvantitativt at beskrive de kemiske reaktioner, der forekommer i et lysatbaseret, cellefrit system, hvilket gør det muligt at opdage en bredere vifte af metabolitter, herunder dem, der er til stede ved lave koncentrationer i den komplekse lysatbaggrund.Demonstrere procedurerne vil være Jaime Lorenzo Dinglasan og David Reeves, kandidat forskere fra Biosciences Division. Begynd med at kombinere de forskellige komponenter i 1,5-milliliter mikrocentrifugerør for at forberede endelige reaktioner med 4,5 milligram pr. milliliter af totalt lysatprotein. Forbered cellefri metabolisk teknik, eller CFME, reaktioner med endelige mængder af 50 mikroliter i tredobling pr. gang.Afslut trepartsreaktionerne på det rette tidspunkt med det samme ved at tilsætte et tilsvarende volumen på 5 % trichloreddikesyre til hver prøves endelige reaktionsvolumen. Fortynd derefter hver prøve ved at tilsætte to gange mængden af sterilt vand til hver reaktionsblanding. For at generobre tid nul skal du blande det samme volumen af 5% trichloreddikesyre som det samlede endelige reaktionsvolumen med lysatet, før resten af reaktionskomponenterne tilsættes.Dette forsuringstrin udfælder lysatenzymer, før de væsentligt metaboliserer glukose. Hvirvle prøverne og centrifuge på en bordplade mikrocentrifuge på 11,600 gange g i fem minutter, og overføre supernatants indeholder de organiske analytter til at rense rør. Gem prøverne ved minus 20 grader Celsius, hvis HPLC-analyser skal udføres senere.Sørg for at optø de lagrede prøver på is, før du går videre til næste trin. Filtrer hver supernatant med et 0,22-mikrometer porefilter. Efter centrifuge overføres hver filtrat til et rent HPLC-glasglasglas.Læg hætteglasset på autosamplerbakken på det HPLC-system, der allerede er konfigureret til analyse. Vælg Sekvens, Ny sekvensskabelon på menulinjen. Vælg Sekvens.Gem sekvensskabelon som sekvensskabelonnavn S.Select Sequence, Sekvenstabel. Tilføj N-rækker svarende til N-hætteglas. Derefter input hætteglas positioner og prøve navne under Hætteglas og Sample Navn, henholdsvis i henhold til deres arrangement på autosampler bakke.Vælg den metode, der genereres som beskrevet i manuskriptet, i rullemenuen Metodenavn, og indtast 50 mikroliter som injektion pr. hætteglas for hver række. Klik på Anvend, og gem sekvensskabelonen ved at vælge Sekvens og derefter på Gem sekvensskabelon. Sørg for, at sekvensskabelonen indlæses ved at vælge Sekvens, Load Sequence Template, sekvensskabelonnavn S.Når du har opnået en stabil baseline på onlineplottet, skal du højreklikke på panelet RID Module, Control, Off Recycling Valve for at lede opløsningsmiddelstrømmen gennem RID-detektoren til affald.Hvis du vil starte dataindsamlingen, skal du vælge Sekvens på menulinjen og derefter vælge Sekvenstabel, Kør. Vælg dataanalyse i menuen Vis. Find sekvensfilnavnet på fillisten i venstre side af skærmen.Gå til Signalvisningsmarkeringen i det midterste panel på skærmen, RID-signal for at få vist eksempelkromamatogrammet. Vælg en række, der svarer til et af prøverne, fra det øverste panel på skærmen. Toppe svarende til målet analytter vil blive arrangeret langs retention tid akse som glukose, succinate, laktat, format, acetat, og ethanol i prøver, hvor alle disse metabolitter er til stede.Skelne, om toppe af interesse er godt integreret af softwaren. En rød linje skal automatisk tegnes som bunden af hver top. Hvis den røde linje er skæv, er den automatiske integration mislykkedes.Vælg derefter knappen Manuel integration i integrationsværktøjssættet, og tegn manuelt en topbase for at integrere spidsområdet. Vælg værktøjet Cursor i det fælles værktøjssæt for at klikke på korrekt integrerede toppe. Spidsområdet og den tilsvarende reaktionstid for den valgte top fremhæves som en tabelrække på det nederste panel uden for skærmen.Hvis du vil eksportere spidsbelastningsområder, skal du vælge Filer, Eksportér, Integrationsresultater. Afbilde topområdeværdier i forhold til kendte koncentrationer af prøver i et regneark. Højreklik på de afbildede data, og vælg derefter Tilføj tendenslinje, Formatér tendenslinje, Visningsligning i diagram.I et separat regneark skal du bruge ligninger af standardkurvetendenslinjer til at konvertere topområdeværdier til koncentrationer for hver analysand fra hver prøve. Beregn de gennemsnitlige spidsbelastningsområder og standardfejlværdier på tværs af tredoliceringer til datavisualisering. Opsætning af tredelt reaktioner pr. tidspunkt, undtagen tid nul, på is som beskrevet i manuskriptet.I stedet for glukose skal du bruge en endelig koncentration på 100 millimolar glukose-13C6 i reaktionerne. Inkubere reaktionerne ved 37 grader Celsius i en, to og tre timer. Til at begynde med analysen pipettes en tilsvarende mængde ekstraktionsmiddel til hver prøve.Hvis prøverne blev frosset, tilsættes ekstraktionsmiddel, før prøverne helt optøs for at forhindre reaktivering af glukosemetabolisme. Udfør alle prøvebehandlingstrin på is. For at generobre tid nul skal pipette det endelige volumen af ekstraktionsmiddel til et passende lysatvolumen for den ønskede endelige koncentration på 4,5 milligram pr. milliliter i 50 mikroliter reaktionsvolumen.Tilsæt resten af reaktionskomponenterne som beskrevet tidligere. Dette forsuringstrin udfælder lysatenzymer, før de væsentligt metaboliserer glukose. Inkuber prøverne i ekstraktionsmiddel på is i 30 minutter med blid rystelse.Derefter centrifugere prøverne på 21.000 gange g i 15 minutter ved fire grader Celsius at adskille supernatant fra udfældet protein. Overfør 50 mikroliter af supernatanten til autosamplerglass, og læg hætteglassene på bakken inden for de fire grader Celsius autosampler. Når du har forberedt analyseinstrumentet, skal du konfigurere en køresekvens ved hjælp af LC-MS/MS-systemets software til dataindsamling og fortolkning.Højreklik på tabellen i Roadmap, Sequence Setup, for at indsætte lige så mange rækker som eksempler. For hver række skal injektionsvolumenet indstilles til fem mikroliter og positionen til hætteglasets respektive position på autosamplerbakken. Input filnavne som eksempelnavne, og angiv den ønskede filsti til kørselsresultater.Hvis du vil starte kørslen, skal du markere alle filnavne i sekvensen. Vælg Handlinger, Kør sekvens på menulinjen. Åbn MZmine, og importer de rå outputfiler, der er hentet tidligere.Vælg Rå datametoder, Rå dataimport, på menulinjen, og vælg de filer, der svarer til eksemplerne. Følg de trin, der er beskrevet i manuskriptet for at fuldføre MZmine-analysen. Eksporter de rå spidsområder i slutningen af MZmine-analysen som en CSV-fil.Åbn et regneark for at beregne masserne af 13C-mærkede metabolitter fra glukosemetabolisme til den målrettede søgning. Brug beregnede masser af 13C-mærkede metabolitter til at søge og anmærke masse-til-opladning funktioner fra MZmine resultater. Kontroller manuelt spektret af de putative anmærkninger i en kvalitetsbrowser for at bekræfte anmærkningerne.Åbn køreplan, Qual Browser. Åbn rå fil fra værktøjslinjen for at importere rå MS-data for hvert eksempel. Tegn en linje under det ønskede interval af opbevaringstider svarende til den putative anmærkning på det samlede ionkromatogram for at se et massespektrum.I HPLC-RID-eksperimenter blev glukose indtaget inden for de første tre timer efter reaktionen og hovedsagelig fermenteret til laktat. Ethanolakkumuleringen forekom også signifikant inden for de første tre timer efter reaktionen og stoppede derefter. Acetat var oprindeligt til stede i reaktionerne som en del af S30-bufferen og akkumulerede først på grund af stofskiftet efter seks timer, da glukoseforbruget var bremset.Laktat og ethanol kan således betragtes som de vigtigste fermenteringsafslutningsprodukter i lysatbaseret, cellefri glukosemetabolisme. Det blev bemærket, at både format og succinate blev syntetiseret som mindre fermenteringsprodukter. Glukose-13C6 blev observerbart forbruges gennem glykolyse, som det fremgår af udsvingene i glykolytiske mellemprodukter.I overensstemmelse med HPLC-brydningsindeksdetekteringsdata akkumulerede glukose til laktat-13C3 og blev også fermenteret for at succinate-13C3 inden for de første tre timer efter reaktionen. Inkorporeringen af glukose-13C6-afledte kulstof i sukkerphosphater 6-fosfogluconolactone, 6-fosfogluconat, ribulose-5-fosfat og sedoheptulose-7-fosfat blev også observeret, hvilket bekræfter deltagelsen af pentosephosphatvejen i lysatglukosemetabolisme. Lysat glukosemetabolismen viste sig at fodre tyrosin-13C9 syntese, samtidig med at den gav en forløber for histidin-13C5 produktion.Det er vigtigt, at kontrolprøverne præcist repræsenterer tid nul. Sørg derfor for, at proteinerne i lysatet inaktiveres, inden de blandes i opløsningen, der indeholder energikilder. Sørg også for, at den automatiske integration af toppe fra testprøver, kontrolprøver og standarder også er konsistente, således at udvundne spidsområder er sammenlignelige.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Ekstraktion for målrettet stabile isotoper Fortynding Liquid Chromatography-massespektrometri Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS-aktiverede Noninvasiv stofskifteprofil

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

A Coupled Experiment-finite Element Modeling Methodology for Assessing High Strain Rate Mechanical Response of Soft Biomaterials

En Koblet Eksperiment-Finite Element Modeling metode til vurdering af High Strain Rate Mekanisk Reaktion af Soft Biomaterials

This study offers a combined experimental and finite element (FE) simulation approach for examining the mechanical behavior of soft biomaterials (e.g. ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Forsegles Femtoliter Chamber Arrays for celle-fri Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Syntese af Biokompatible Liquid Crystal Elastomer Skum som Cell Stilladser til 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntese af smitsomme Bakteriofager i en E. coli -baseret celle-gratis Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Visuel genkendelse af flere nukleinsyrer i en kapillær Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En Mikrofluidic-platform med flere lag til overledning af forlænget celle frit genekspression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Påvisning af kræft i æggestokkene ved hjælp af foto akustisk flow cytometri

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Samtidig kvantificering af udvalgte kynureniner analyseret af flydende kromatografi-massespektrometri i medium indsamlet fra kræftcellekulturer

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...