Name: liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems
Uploaded: 2021-09-23T14:45:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Dit onderzoek werd gesponsord door het Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, als onderdeel van het Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory wordt beheerd door UT-Battelle, LLC, voor het Amerikaanse ministerie van Energie onder contract DE-AC05-00OR22725. Dit manuscript is geschreven door UT-Battelle, LLC onder contract DE-AC05- 00OR22725 met het Amerikaanse ministerie van Energie. De regering van de Verenigde Staten behoudt en de uitgever erkent, door het artikel voor publicatie te accepteren, dat de regering van de Verenigde Staten een niet-exclusieve, betaalde, onherroepelijke, wereldwijde licentie behoudt om de gepubliceerde vorm van dit manuscript te publiceren of te reproduceren, of anderen toe te staan dit te doen, voor doeleinden van de Regering van de Verenigde Staten. Het ministerie van Energie zal openbare toegang bieden tot deze resultaten van federaal gesponsord onderzoek in overeenstemming met het DOE Public Access Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

<ol>
	<li>Rollin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+hydrogen+production+from+biomass+by+in+vitro+metabolic+engineering:+Mixed+sugars+coutilization+and+kinetic+modeling.">High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).</li><li>Bowie, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biochemistry:+The+bio-inspired+cell-free+approach+to+commodity+chemical+production.">Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production.</a> Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).</li><li>Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+platform+for+cell+free+production+of+monoterpenes+from+glucose.">A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose.</a> Nature Communications. 8, 1-8 (2017).</li><li>Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosynthesis+of+limonene+using+enzyme-enriched+Escherichia+coli+lysates.">Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates.</a> Synthetic Biology. 4 (1), 003 (2019).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+potential+of+crude+cell+extracts+for+producing+pyruvate+from+glucose.">Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose.</a> Synthetic Biology. 3, (2018).</li><li>Kay, J. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysate+of+engineered+Escherichia+coli+supports+high-level+conversion+of+glucose+to+2,3-butanediol.">Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol.</a> Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).</li><li>Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+growth+medium+dropouts+promote+aromatic+compound+synthesis+in+crude+E.+coli+cell-free+systems.">Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysate+proteome+engineering+strategy+for+enhancing+cell-free+metabolite+production.">A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production.</a> Metabolic Engineering Communications. 12, 00162 (2021).</li><li>Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+pathway+prototyping.">Cell-free synthetic biology for pathway prototyping.</a> Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+cell-free+extract+reaction+(CFER)+system+in+Clostridium+thermocellum+to+identify+metabolic+limitations+to+ethanol+production.">Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production.</a> Frontiers in Energy Research. 8, 72 (2020).</li><li>Coskun, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Separation Tecniques: Chromatography. 3, (2016).</li><li>Bernardes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+acids+and+alcohols+quantification+by+HPLC/RID+in+sugarcane+vinasse:+analytical+method+validation+and+matrix+effect+assessment.">Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment.</a> International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computationally+guided+discovery+and+experimental+validation+of+indole-3-acetic+acid+synthesis+pathways.">Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways.</a> ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).</li><li>Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+control+of+cell-free+metabolism+through+pH+modulation.">Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation.</a> Synthetic Biology. 5, (2020).</li><li>Bujara, M., Sch&#252;mperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+cell-free+systems:+Implementation+and+debugging+of+a+system+of+biotransformations.">Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).</li><li>Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+identification+and+quantitation+in+LC-MS/MS-based+metabolomics.">Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics.</a> TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).</li><li>Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-liquid+chromatography.">Nano-liquid chromatography.</a> Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).</li><li>Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+mass+spectrometry-based+metabolomics:+Opportunities+and+challenges.">Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).</li><li>O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+CoA+metabolites+by+SAMDI-MS+to+optimize+the+cell-free+biosynthesis+of+HMG-CoA.">High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA.</a> Science Advances. 5, (2019).</li><li>Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unimod:+Protein+modifications+for+mass+spectrometry.">Unimod: Protein modifications for mass spectrometry.</a> Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).</li><li>Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+mixing+of+Escherichia+coli+crude+extracts+to+prototype+and+rationally+engineer+high-titer+mevalonate+synthesis.">Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).</li><li>Jaishankar, J., Srivastava, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+stationary+phase+survival+and+applications.">Molecular basis of stationary phase survival and applications.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2000 (2017).</li><li>Bartolomeo, M. P., Maisano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+for+quantitative+amino+acid+analysis.">Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).</li><li>Hauck, T., Landmann, C., Br&#252;hlmann, F., Schwab, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone+in+cytosolic+extracts+obtained+from+Zygosaccharomyces+rouxii.">Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).</li><li>Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsoSearch:+An+untargeted+and+unbiased+metabolite+and+lipid+isotopomer+tracing+strategy+from+HR-LC-MS/MS+datasets.">IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets.</a> Methods and Protocols. 3 (3), 54 (2020).</li></ol>

De auteurs verklaren dat zij geen bekende concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten hebben.

De geschetste HPLC-RID-aanpak kan worden gebruikt om de consumptie van suikersubstraat en daaropvolgende conversies naar belangrijke organische zuur- en alcoholproducten van het centrale metabolisme van lysaat in de loop van de tijd met succes te kwantificeren. Bovendien maakt dit protocol gebruik van een eenvoudige isocratische methode met behulp van een enkele mobiele fase, vereist minimale monstervoorbereiding en maakt een eenvoudige gerichte downstream-analyse mogelijk. Analyten gemeten met de HPLC-RID-methode onderscheiden zich uitsluitend door hun retentietijden en dus hun interacties met de geselecteerde kolomhars. De HPLC-kolom die hier wordt gebruikt, is met name ontworpen om koolhydraten, organische zuren en alcoholen te scheiden door grootte-uitsluiting en liganduitwisseling te combineren (d.w.z. ion-gemodereerde partitiechromatografie). De beschreven methode is daarom nuttig voor een meer gerichte analyse van koolhydraatsubstraten en geselecteerde eindproducten van glucosefermentatieroutes die naar verwachting voornamelijk op lysaat gebaseerde biotransformaties8,15,21zullen vergemakkelijken en stimuleren. Dit protocol houdt echter geen rekening met de activering van andere metabole routes in celextracten. Pijpleidingen met andere chromatografische scheidingstechnieken (d.w.z. hydrofiele interactiechromatografie), gradiëntelutiemethoden, meer gecompliceerde monstervoorbereiding (d.w.z. derivatisatie) en verschillende optische detectoren (bijv. ultraviolet licht of verdampingslichtverstrooiingsdetectoren) kunnen worden gebruikt om andere metabolieten zoals aminozuren en suikerfosfaten te detecteren23,24 . Als alternatief kan een globale benadering voor het bestuderen van het lysaatmetabolisme worden gevolgd met behulp van LC-MS / MS.
De beschreven LC-MS/MS-methode is een enkele workflow voor het meten en identificeren van een breder scala aan metabolieten. LC-MS/MS is een state-of-the-art analytisch instrument voor metaboloomprofilering vanwege de gevoeligheid en het vermogen om metabolieten te onderscheiden door retentietijd en m/z-verhoudingen met hoge resolutie16. Met een focus op centrale koolstof metabole routes en aminozuuranabolisme, werd de negatieve modus MS / MS geïmplementeerd om specifiek polaire organische zuren, suikerfosfaten en aminozuren te detecteren. In combinatie met een nano-vloeistofchromatografietechniek biedt de methode een hoge gevoeligheid voor het detecteren van kleine moleculen in de complexe lysaatachtergrond17. In termen van profilering van het op lysaat gebaseerde CFME-metabolisme is een beperking van het beschreven LC-MS / MS-protocol echter de onderste detectiegrens van 50 m / z, die de meting van ethanol, een belangrijk product in het lysaatglucosemetabolisme, evenals formate, die beide anders gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd door de gedetailleerde HPLC-RID-methode, uitsluit. In vergelijking met LC-MS/MS heeft HPLC-RID het extra voordeel van relatieve toegankelijkheid in termen van kosten en moeilijkheidsgraad. Tot op dit laatste punt kan het oplossen van problemen met de hier beschreven LC-MS/MS-methode enige mate van expertise in massaspectrometrie vereisen. Niettemin heeft MS-detectie uniek aantrekkelijke toepassingen ten opzichte van RID, omdat het bovendien gelabelde isotopen in metabolomen kan onderscheiden, een uitstekende techniek voor het begrijpen van koolstofbewegingen van aangevulde substraten via het complexe lysaatmetabool netwerk18. Een dergelijke benadering werd hier toegepast door reacties aan te vullen met 13C6-glucose en de relatieve abundantiewaarden van stroomafwaarts 13C-opnemende metabolieten te analyseren. De analyse maakte de definitie van actieve en inactieve routes mogelijk, ondersteunde eerder gerapporteerde aannames en leverde nieuwe inzichten op over metabole flux in lysaten. Ook voor specifieke analyses kunnen binnen de methode wijzigingen worden aangebracht. Standaardoplossingen van 13C-gelabelde doelverbindingen kunnen bijvoorbeeld samen met monsters worden geanalyseerd om absolute kwantitatieve metingen van glucose-afgeleide moleculen in de loop van de tijd te bereiken en conclusies te trekken over fluxverdelingen. Betere detectie van positief geladen verbindingen kan ook worden ingeschakeld binnen de huidige workflow door reeksen uit te voeren met .meth-bestanden die zijn aangepast voor detectie in de positieve modus.
Analytische bemonstering in beide beschreven methoden is handig geautomatiseerd, waardoor een hoge reproduceerbaarheid wordt gegarandeerd. Bovendien kunnen soepele analytische runs worden verwacht zolang de juiste instrumentbehandelingspraktijken en onderhoud in acht worden genomen. Bij het gebruik van deze instrumenten om CFME-reacties te analyseren, moeten meer kritische overwegingen worden gemaakt vóór en na de bemonstering. Tijdens de monstervoorbereiding is het belangrijk dat tijdsverloopcontroles representatief zijn voor tijd nul. Hier werden eiwitten in lysaten neergeslagen door verzuring om metabole reacties te stoppen. Voor tijd-nulmonsters werd het zure oplosmiddel gecombineerd met lysaat voordat het reactiemengsel met glucose werd toegevoegd. Verzuring met trichloorazijnzuur zorgde er effectief voor dat glucose niet op tijd nul wordt gemetaboliseerd, zoals blijkt uit de HPLC-RID-gegevens (figuur 2). Terwijl een vergelijkbare procedure om het glucosemetabolisme te dempen werd uitgevoerd in de gerapporteerde LC-MS / MS-analyse, werden 13C-gelabelde metabolieten gedetecteerd in tijd-nulmonsters, zij het bij significant lage abundantiewaarden ten opzichte van monsters geëxtraheerd op latere tijdstippen. Bovendien waren deze waarnemingen beperkt tot tussenproducten van glycolyse. De gegevens suggereren dat de reacties een zekere mate van glycolytische activiteit behouden na verzuring met het extractiemiddel dat wordt gedetecteerd door deze zeer gevoelige methode. De omvang van deze activiteit moet echter worden gekwantificeerd. Een eerdere studie meldde dat zure extractiemiddelen intermediaire glycolytische reacties mogelijk niet voldoende doven, maar een significant glucoseverbruik kunnen stoppen10. Hoewel dit nog verder moet worden onderzocht in het hier gebruikte systeem, kunnen drastische veranderingen in relatieve abundantiewaarden tussen tijd nul en latere tijdpuntmonsters worden geïnterpreteerd als trends in het glucosemetabolisme. Het verkennen van alternatieve blusmethoden wordt echter aanbevolen in vergelijkbare toepassingen, met name voor het verkrijgen van absolute hoeveelheden metabole tussenproducten10. Bovendien moeten ook goede praktijken tijdens downstream-softwareanalyses in acht worden genomen. Consistentie is noodzakelijk bij het handmatig integreren van piekgebieden van RID-signalen om menselijke fouten te verminderen. Handmatige integratie moet ook worden toegepast op piekgebieden van normen wanneer handmatig geïntegreerde piekgebieden worden gebruikt om metabolietconcentraties in monsters te kwantificeren. Gedurende de gerichte LC-MS/MS-analyse moeten voorlopige annotaties van MZmine-analyse worden gevalideerd door handmatige piekcontrole met behulp van een MS-kwaliteitsbrowser, en m/z-functies mogen alleen worden geannoteerd wanneer berekende massafouten aanvaardbaar zijn. Hier werden deze analyses handmatig uitgevoerd voor een beperkte reeks doelen, omdat uitgebreide en robuuste software voor het zoeken naar isotopen nog niet is vastgesteld. Dergelijke geautomatiseerde methoden voor het doorzoeken van 13C-gelabelde metabolieten zijn momenteel echter in opkomst en zouden ook meer gecompliceerde analyses stroomlijnen, zoals profileringslysaten voorbij het centrale koolstofmetabolisme25.
Geavanceerde vloeistofchromatografie is een robuuste en veel toegepaste methode voor het scheiden van kleine moleculen in complexe metabole mengsels11. De beschreven methoden koppelen deze scheidingstechniek aan de refractieve index of massaspectrometrische detectie om met succes metabolietconversies in op lysaat gebaseerde CFME-reacties te analyseren. HPLC-RID en LC-MS/MS zijn individueel krachtige hulpmiddelen voor het profileren van het actieve lysaatmetabolisme, en hun complementariteit kan verder worden gebruikt om de inherente beperkingen van elke techniek aan te pakken. De gerapporteerde methoden maken de toepassing en ontwikkeling van CFME mogelijk, omdat ze kunnen worden gebruikt om het lysaatmetabolisme te begrijpen, verbeteringen in gerichte metabolietconversies te volgen en veranderingen in de metabolietflux op te helderen bij het manipuleren van het lysaatmetabolisme.

Beperkingen in het ontwikkelen van microben voor chemische productie kunnen worden aangepakt door biochemische reacties in vitro samen te vatten waarbij concurrerende cellulaire overlevingsfuncties afwezig zijn1. Bovendien is de open reactieomgeving (d.w.z. afwezigheid van een celmembraan) vatbaarder voor manipulatie en is deze gemakkelijker te controleren in vergelijking met levende cellen. Dit fundamentele concept van celvrije metabole engineering (CFME) is elegant aangetoond door de reconstructie van metabole routes om waardevolle chemicaliën zoals waterstof en monoterpenen te synthetiseren met productiestatistieken die ordes van grootte hoger zijn dan gepresenteerd in microbiële celfabrieken tot nu toe1,2,3 . Methoden voor het zuiveren van hele paden worden momenteel echter beperkt door tijd en kosten. Als alternatief kunnen celvrije metabole systemen worden afgeleid van ruwe celextracten door middel van snelle en goedkope methoden ten opzichte van de reconstructie van de hele route4. Het centrale metabolisme dat wordt vastgehouden in celextracten kan worden aangevuld met energiesubstraten (bijv. Glucose en enzymatische cofactoren) en zouten in gebufferde oplossingen om centrale metabole precursoren te genereren gedurende meer dan 24 uur5,6. Het toevoegen van exogene enzymen aan de op lysaat gebaseerde CFME-reactie maakt complexere biotransformaties van glucose in waardevollere chemicaliën bij hoge titers4,6,7mogelijk. Hoewel de opbrengst in deze systemen meestal wordt aangetast vanwege hun celachtige metabole complexiteit, zijn en worden unieke methoden ontwikkeld om lysaatproteomen te cureren voor conversie met een hogere opbrengst7,8.
Het gemak van het uitvoeren van metabole transformaties in op lysaat gebaseerde celvrije systemen maakt deze uitstekende platforms voor het verplaatsen van chemische productie buiten de cel of voor het prototypen van nieuwe routes met een hoge doorvoer voordat deze ontwerpen in vivoworden gebouwd en getest2,9. Voor beide toepassingen zijn hulpmiddelen voor het monitoren van metabole conversies of het observeren van algemene veranderingen in metabole flux in lysaten een integraal onderdeel van de vooruitgang van CFME. High-performance vloeistofchromatografie (HPLC) kan worden gebruikt om de chemische bestanddelen van CFME-reacties met hoge resolutie te scheiden en kan worden gekoppeld aan optische of massaspectrometrische detectoren voor metabolietkwantificering5,10. Het onderliggende principe van HPLC is dat analyten opgelost in een oplosmiddel (d.w.z. mobiele fase) en door een kolom worden gepompt, interageren met het specifieke kolomverpakkingsmateriaal (d.w.z. stationaire fase)11. Afhankelijk van hun chemische eigenschappen vertonen deze analyten verschillende retentietijden voordat ze uiteindelijk uit de stationaire fase worden geëloteerd en door de mobiele fase naar een detector worden gedragen. Dit rapport beschrijft de voorbereiding en analyse van op E. coli lysaat gebaseerde CFME-reacties door middel van HPLC-gebaseerde methoden die gebruikmaken van RID- en MS/MS-detectie.
HPLC gekoppeld aan brekingsindexdetectie (HPLC-RID) is een algemeen toegankelijke methode voor het snel identificeren van centrale metabole precursoren en eindproducten. In het kort meet RID hoe analyten de afbuiging van licht veranderen door de mobiele fase12. RID-signalen die overeenkomen met doelanalyten in monsters kunnen vervolgens worden gekwantificeerd door vergelijkingen met RID-signalen van standaardoplossingen. In CFME-toepassingen is deze detectiemodus het meest gebruikt met HPLC-kolommen die verbindingen scheiden op basis van een combinatie van grootte-uitsluiting en liganduitwisselingsmechanismen, of ion-gemodereerde partitiechromatografie5,6,8,13. Deze specifieke techniek wordt gebruikt om snel de consumptie van suikersubstraten zoals glucose te kwantificeren, evenals de vorming van fermentatieproducten zoals succinaat, lactaat, formate, acetaat en ethanol in op lysaat gebaseerde CFME-reacties8. Het registreren van de concentratieveranderingen van deze verbindingen via HPLC is nuttig geweest voor zowel het ophelderen van het potentieel van ruwe celextracten om centrale metabole precursoren te bundelen als voor het begrijpen hoe pathway flux wordt omgeleid via fermentatieve routes tijdens complexe metabole conversies van glucose in lysaten6,8,14. Baanbrekende CFME-studies in E. coli-celextracten bevestigen dat fermentatieverbindingen zich ophopen als eindproducten van glucosekatabolisme en ook voorkomen als ongewenste bijproducten in lysaten die exogene enzymen overexpressie6,15. Er wordt gesuggereerd dat fermentatief metabolisme een noodzakelijke rol speelt bij het regenereren van redoxequivalenten van cofactoren (d.w.z. NAD (P) H en ATP) om glycolytische reacties te ondersteunen8. Daarom is een op HPLC gebaseerde optische detectiemethode die is ontworpen om fermentatieproducten te scheiden een nuttig en vaak toegepast hulpmiddel bij het uitvoeren van verschillende op lysaat gebaseerde CFME-taken.
CFME kan worden geïmplementeerd om metabole eindproducten te accumuleren die geen koolhydraten, organische zuren of alcoholen zijn4. De meting van tussenproducten die net zo snel worden geconsumeerd als ze worden gesynthetiseerd, kan ook wenselijk zijn10. Hoewel HPLC-RID toegankelijk is in termen van kosten en moeilijkheidsgraad, wordt deze methode beperkt door het vermogen om alleen metabolieten te onderscheiden op basis van retentietijd. Een breder scala aan metabolieten kan worden geanalyseerd wanneer vloeistofchromatografie wordt gekoppeld aan MS / MS-detectie (LC-MS / MS)16. Door deze methode worden analyten in de mobiele fase geïoniseerd en differentieel gedetecteerd op basis van de massa- en ladingseigenschappen van elk molecuul. Kennis van zowel de massa-ladingsverhouding (m/z) van de metaboliet als de retentietijd op de kolom vergemakkelijkt zo de scheiding van de meeste metabole tussenproducten en eindproducten met hoge resolutie16. Deze detectietechniek kan ook worden gekoppeld aan nano-vloeistofchromatografie, die veel lagere stroomsnelheden en monsterinjectievolumes biedt, waardoor een gevoeligere detectie van kleine moleculen in de complexe lysaatachtergrond mogelijk is17. LC-MS/MS kan bovendien worden toegepast met isotoopetikettering, aangezien opgenomen labels veranderingen in de m/z-waarden van analytengeven 18. Tijdpuntmetingen geëxtraheerd uit een CFME-reactie aangevuld met een 13C6-glucosesubstraat kunnen dus de eind- of bijproducten bepalen die specifiek zijn afgeleid van aangevulde glucose. Hoewel deze isotooptraceringsmethode nog niet vaak wordt toegepast in CFME-studies, is het een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van metabole conversies in op lysaat gebaseerde CFME-systemen, met name omdat zouttellers (d.w.z. acetaat en glutamaat) in deze reacties ook worden gekataboliseerd als secundaire substraten19. Het gebruik van deze techniek kan dus een uitgebreid beeld schetsen van het glucosemetabolisme in lysaten, dat tot op de dag van vandaag niet volledig wordt begrepen. Hier beschrijft het protocol een methode voor nano-vloeistofchromatografie gekoppeld aan nano-elektrospray ionisatie (nano ESI) MS / MS die kan worden gebruikt om een mogelijk model van glucosemetabolisme te ondervragen, met name in E. coli-lysaten (Figuur 1). Het model is gebaseerd op meldingen van fermentatieve routes en de pentosefosfaatroute die actief is in E. coli-lysaten afgeleid van stammen die zijn gekweekt in rijke media5,6,8,14. De techniek wordt bovendien gebruikt om de productie van aminozuren te onderzoeken, omdat de huidige kennis over aminozuuranabolisme uit glucose in lysaten beperkt is tot enkele voorbeelden zoals de synthese van aromatische aminozuren7. Gezien de meestal polaire aard van eindproducten en tussenproducten in deze routes (d.w.z. organische zuren, suikerfosfaten en aminozuren), werd hier reverse-phased vloeistofchromatografie gebruikt. Deze techniek scheidt polaire verbindingen door elutie van een niet-polaire stationaire fase. Deze verbindingen werden vervolgens geïoniseerd door nano-ESI in negatieve ionenmodus die de detectie van analyten met ten minste één negatieve elementaire lading mogelijk maakt en dus nuttig is voor het detecteren van zure verbindingen. Deze techniek wordt hier gebruikt om glucose-afgeleide 13C-opnemende metabolieten te analyseren en toont het nut van LC-MS / MS voor het begrijpen van glucosemetabolisme in lysaten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m centrifuge tube filters (spin columns)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Binary LC Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1312B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity High Performance Degasser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4225A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Refractive Index Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7162A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Standard Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1329B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374</td>
			<td>CFME reaction mix component (LC-MS/MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.20 &#956;m pore (PES membrane) filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminex HPX 87-H column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1250140</td>
			<td>Chromatography column for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1376</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vial caps (yellow, snap)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-50Y</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W225181</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-dextrose (Glucose)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9230</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8281</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC/MS grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica (internal diameter of 100 &#956;m, external diameter of 375 &#956;m)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>WM22005-ND</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetex 5 &#956;m C18 stationary phase (100 &#197;)</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0632</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanospray Ionization Source</td>
			<td>ThermoFisher Scientific/Proxeon</td>
			<td>ES071 (newest model)</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenLab CDS (Online) Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 2.15.26</td>
			<td>Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 2.7</td>
			<td>Software for tuning the LC-MS/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps (with septa, 9 mm)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29315-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwthread glass vials (2 mL)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29376-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>247596</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71716</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>398055</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>Solvent preparation for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-acetate</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-090-100</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Solvent Rack: SRD-3600</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6500</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 3.0.63</td>
			<td>Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems

Engineering cellulair metabolisme voor gerichte biosynthese kan uitgebreide design-build-test-learn (DBTL) -cycli vereisen, omdat de ingenieur werkt rond de overlevingsvereisten van de cel. Als alternatief kan het uitvoeren van DBTL-cycli in celvrije omgevingen dit proces versnellen en zorgen over hostcompatibiliteit wegnemen. Een veelbelovende benadering van celvrije metabole engineering (CFME) maakt gebruik van metabolisch actieve ruwe celextracten als platforms voor biomanufacturing en voor het snel ontdekken en prototypen van gemodificeerde eiwitten en routes. Het realiseren van deze mogelijkheden en het optimaliseren van CFME-prestaties vereist methoden om het metaboloom van op lysaat gebaseerde celvrije platforms te karakteriseren. Dat wil zeggen, analytische instrumenten zijn nodig voor het monitoren van verbeteringen in gerichte metabolietconversies en in het ophelderen van veranderingen in de metabolietflux bij het manipuleren van het lysaatmetabolisme. Hier werden metabolietanalyses met behulp van high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) in combinatie met optische of massaspectrometrische detectie toegepast om de metabolietproductie en flux in E. coli S30-lysaten te karakteriseren. In het bijzonder beschrijft dit rapport de voorbereiding van monsters van CFME-lysaten voor HPLC-analyses met behulp van brekingsindexdetectie (RID) om de generatie van centrale metabole tussenproducten en bijproducten te kwantificeren bij de omzetting van goedkope substraten (d.w.z. glucose) in verschillende hoogwaardige producten. De analyse van metabolietconversie in CFME-reacties gevoed met 13C-gelabelde glucose door middel van omgekeerde fase vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandemmassaspectrometrie (MS / MS), een krachtig hulpmiddel voor het karakteriseren van specifieke metabolietopbrengsten en lysaat metabole flux uit uitgangsmaterialen, wordt ook gepresenteerd. Al met al maakt het toepassen van deze analytische methoden op cfme-lysaatmetabolisme de vooruitgang van deze systemen mogelijk als alternatieve platforms voor het uitvoeren van snellere of nieuwe metabole engineeringtaken.

Om de op lysaat gebaseerde celvrije synthese van gangbare fermentatieproducten uit glucose te kwantificeren, kregen lysaten afgeleid van stammen gekweekt in 2xYPTG-media 100 μM glucose als primaire koolstofbron8. Reacties werden gedurende een tijdsverloop van 24 uur gestopt door eiwitverzuring. Gefilterde supernatanten die pyruvaat, succinaat, lactaat, formate, acetaat en ethanol bevatten, geproduceerd uit glucosekatabolisme, werden geladen op de autosamplermodule van een HPLC-systeem uitgerust met een RID-module. Injectieflacons met gefilterde mengsels van fermentatieve eindproducten en glucose bij 1,17 μM, 2,34 μM, 4,69 μM, 9,38 μM, 18,75 μM, 37,50 μM, 75 μM en 150 μM in S30-buffer werden als normen op het instrument geladen. Analyten werden isocratisch van een HPLC-kolom naar de RID elutisch afgeleid. Pieken voor glucose, succinaat, lactaat, formate, acetaat en ethanol binnen het bereik van 1 tot 150 μM kunnen worden opgelost door RID. Piekgebieden voor glucose werden afgeleid door handmatige integratie van de RID-gegevens voor tijdsverloop- en standaardcurvemonsters. Geëxtraheerde piekgebieden voor succinaat, lactaat, formate, acetaat en ethanol werden genomen uit automatisch geïntegreerde signalen. Alle standaardcurven (piekgebied versus bekende concentratie) hadden R2-waarden >0,99 en waren lineair over het hele hier gebruikte concentratiebereik.
Molaire concentraties voor alle doelanalyten werden berekend op basis van hun respectieve standaardcurven. Glucose werd binnen de eerste 3 uur van de reactie geconsumeerd en voornamelijk gefermenteerd tot lactaat (figuur 2A, B). Ethanolaccumulatie trad ook significant op binnen de eerste 3 uur van de reactie en stopte daarna (figuur 2C). De waarneming van significante lactaat- en ethanolproductie met een significant glucoseverbruik na 3 uur was niet ongekend, aangezien lactaat- en ethanolproductieroutes de regeneratie van 1 netto mol NAD + van glycolytische NADH mogelijk maken die nodig is voor voortgezet glucoseverbruik door glycolyse (figuur 1). Lactaat en ethanol kunnen dus worden beschouwd als de eindproducten van grote fermentatie in het celvrije glucosemetabolisme op basis van lysaat. Acetaat was aanvankelijk aanwezig in de reacties als onderdeel van de S30-buffer en hoopte zich onverwacht pas op als gevolg van het metabolisme na 6 uur toen het glucoseverbruik was vertraagd (figuur 2D). Dit resultaat suggereert dat acetaatfermentatie niet noodzakelijkerwijs een snelle glycolytische flux in eerdere tijdspunten mogelijk maakt. Ondertussen werden formate en succinaat gesynthetiseerd als kleine fermentatieproducten (Figuur 2E, F). Al met al maakte de methode de absolute kwantificering van suikersubstraatdepletie en fermentatieve productvorming in E. coli S30-lysaten mogelijk.
MS-detectie om het lysaatglucosemetabolisme specifiek te profileren, werd hier specifiek toegepast. Lysaten afgeleid van stammen gekweekt in 2xYPTG media kregen 13C6-glucose als koolstofbron. CFME-reacties werden in drievoud uitgevoerd gedurende 0 uur, 1 uur, 2 uur en 3 uur. Monsters van elk tijdspunt werden geladen op een LC-systeem uitgerust met een kolom met omgekeerde fase en gekoppeld aan Fouriertransformatie- en ionenvalmassaspectrometers. Negatieve ionenmodusspectra werden verkregen en verwerkt om organische zuren, suikerfosfaten en aminozuren te analyseren. Berekende theoretische massa's van 13C-gelabelde soorten die behoren tot het centrale koolstofmetabolisme werden doorzocht om specifiek glucose-afgeleide verbindingen te identificeren. Op basis van de gebruikte bronstamkweekomstandigheden en eerdere rapporten van actieve routes in E. coli CFME, wordt hier aangenomen dat het lysaateproteoom een metabolisch netwerk omvat dat glucose voedt in glycolytische fermentatie, de pentosefosfaatroute en mogelijk aminozuuranabolisme5,6,7,8,14 ( Figuur1). Daarom werd de zoekopdracht beperkt tot leden van deze routes, waarvan 16 metabolieten met glucose-afgeleide 13C-labels ondubbelzinnig werden geannoteerd (Aanvullende tabel 1).
13 C6-glucose werd waarneembaar geconsumeerd door glycolyse, zoals blijkt uit de fluctuaties in glycolytische intermediaire abundanties (Figuur 3A-E). In overeenstemming met de HPLC-RID-gegevens accumuleerde glucose tot 13C3-lactaaten werd het ook gefermenteerd tot 13C3-succinaat binnen de eerste 3 uur van de reactie(figuur 4A, B). De vorming van 13C3-succinaatisotopoloog ondersteunt het voorgestelde model van lysaatglucosemetabolisme (figuur 1), waarbij succinaat waarschijnlijk wordt gegenereerd door de carboxylering van 3-koolstoffosfoenolpyruvaat (PEP) molecuul en niet door de binnenkomst van een 2-koolstofacetyl-CoA-molecuul in de TCA-cyclus. Activering van de TCA-cyclus is verondersteld in eerdere CFME-studies, maar andere 13C-gelabelde tussenproducten van TCA werden hier niet gedetecteerd8,19,21. 13 C3-aspartaatsynthese vond echter plaats binnen de eerste h en werd geconsumeerd, wat het idee versterkt dat PEP direct wordt omgezet in oxaalacetaat (Figuur 1, Figuur 6C). De gegevens weerspiegelen een lysaatproteoom van bronstammen geoogst tijdens fermentatieve groei op glucoserijke media (2xYPTG). Dit zou verder impliceren dat de rest van de TCA-enzymen die niet deelnemen aan de productie van succinaat een oxidatieve TCA-tak vormen(figuur 1). Geen van de metabolieten in deze route werd echter gedetecteerd, mogelijk omdat hoge concentraties glutamaat toegevoegd aan de CFME-reactie als zoutteller de progressie van deze tak voorkomen. 
De HPLC-RID-gegevens worden bovendien aangevuld door het ontbreken van 13C 2-acetaatdetectie binnen het reactietijdframe van 3 uur, wat suggereert dat er geen opbouw van acetaat van glucose tot 3 uur is(figuur 2B). De directe voorloper van acetaat, acetylfosfaat (acetyl-P), heeft zich echter opgehoopt, wat suggereert dat de Pta-arm van de Pta-AckA-route voor acetaatsynthese uit acetyl-CoA actief is(Figuur 4C,D). De AckA gekatalyseerde defosforylering van 13C2-acetyl-P tot 13C2-acetaat treedt waarschijnlijk niet binnen dit tijdsbestek op omdat acetaat een belangrijk onderdeel is van de S30-buffer die in de reacties wordt gebruikt (Figuur 1, Figuur 2B).
De opname van 13C6-glucose-afgeleide koolstofatomen in suikerfosfaten 6-fosfogluconolacton (6PGL), 6-fosfosogluconaat (6PG), ribulose-5-fosfaat (Ru5P) en sedoheptulose-7-fosfaat (S7P) werd ook waargenomen(figuur 5). Deze resultaten bevestigen de deelname van de pentosefosfaatroute in het lysaatglucosemetabolisme en voeden waarschijnlijk 13C9-tyrosinesynthese, wat eerder is gesuggereerd door een proteomische studie, terwijl het ook een voorloper biedt voor de productie van 13C5-histidine (Figuur 6A,B)7. Gelabelde fenylalanine en tryptofaan werden hier niet waargenomen, en de meeste essentiële aminozuren ook niet. Dit is echter niet helemaal verrassend, aangezien aminozuuranabolisme waarschijnlijk wordt verrijkt in lysaten die zijn afgeleid van cellen die zijn gekweekt in voedingsstofarme omstandigheden of in de stationaire fase7,22. Bovendien suggereren de gegevens tot nu toe dat tussenproducten van glycolyse en fermentatie worden geleid naar cofactorregeneratieve eindreacties, die de synthese van veel aminozuren afgeleid van glyceraldehyde-3-fosfaat, pyruvaat en acetyl-CoA (d.w.z. glycine, cysteïne, serine, alanine, valine, leucine en lysine) moeten uitsluiten (figuur 1). Zoals vermeld, werd 13C3-aspartaatgeproduceerd binnen het eerste uur, terwijl aspartaat afgeleide 13C-bevattende aminozuren (d.w.z. threonine, isoleucine, methionine en asparagine) niet werden waargenomen, mogelijk omdat glucose-afgeleid aspartaat deelneemt aan fermentatie ( Figuur1, Figuur 6C). Ten slotte kan de flux naar gelabeld glutamaat en aminozuren afgeleid van glutamaat zijn belemmerd door hoge niveaus van glutamaat in de reactieomgeving(figuur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig01.jpg"> Figuur 1: Een voorlopig metabolisch model van lysaten afgeleid van E. coli BL21DE3-Star die exponentieel groeien in hoge glucoseconcentraties. Tussenproducten en eindproducten van glycolyse (groen), de pentosefosfaatroute (donkeroranje) en fermentatieve routes (blauw) van acetyl-CoA zijn gemeld in op lysaat gebaseerde CFME. De aanwezigheid van succinaatfermentatie impliceert de activering van de oxidatieve TCA-tak (grijs). Aminozuuranabolisme (goud) in lysaten is niet goed gedefinieerd en wordt hier onderzocht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig02.jpg"> Figuur 2: HPLC-RID-gegevens voor glucoseconsumptie en fermentatieve eindproductsynthese in CFME-reacties bereid met ruwe E. coli-extracten. (A) Glucoseverbruik en (B) lactaat, (C) ethanol, (D) acetaat, (E) formate en (F) succinaatproductie in CFME-reacties werden gedurende 24 uur gecontroleerd. Gemiddelde mM-concentraties en foutstaven (SE) gekwantificeerd met standaardcurven worden gepresenteerd (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig03.jpg"> Figuur 3: Tijdsverlooptrends van 13C6-glucose en 13C-gelabelde glycolytische tussenproducten in E. coli-lysaat CFME. Relatieve abundanties van (A) 13C6-glucose, (B) 13C6-glucose-6-fosfaat/fructose-6-fosfaat, (C ) 13C6-fructose-1,6-bisfosfaat, (D) 13C3-glyceraldehyde-3-fosfaat/dihydroxyacetonfosfaat, en (E) 13C6 -pyruvaat bij CFME-reacties gedurende 3 uur. Ruwe piekgebieden geëxtraheerd door mzMINE-software werden gebruikt om gemiddelden en foutbalken (SE) te berekenen voor positieve annotaties (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig04.jpg"> Figuur 4: Tijdsverlooptrends van tussenproducten en eindproducten in 13C6-glucosefermentatie in E. coli lysaat CFME. Relatieve abundanties van (A) 13C3-lactaat, (B) 13C3-succinaat, (C) 13C2-acetylfosfaat en (D) 13C2-acetyl-CoA in CFME-reacties gedurende 3 uur. Ruwe piekgebieden geëxtraheerd door mzMINE-software werden gebruikt om gemiddelden en foutbalken (SE) te berekenen voor positieve annotaties (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig05.jpg"> Figuur 5: Tijdsverlooptrends van 13C6-glucose afgeleide pentosefosfaat pathway intermediates in E. coli lysaat CFME. Relatieve abundanties van (A) 13C6-6-fosfogluconolacton, (B) 13C6-6-fosfosogluconaat, (C) 13C5-ribulose-5-fosfaat en (D) 13C7-sedoheptulose-7-fosfaat over 3 uur. Ruwe piekgebieden geëxtraheerd door mzMINE-software werden gebruikt om gemiddelden en foutbalken (SE) te berekenen voor positieve annotaties (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig06.jpg"> Figuur 6: Tijdsverlooptrends van gedetecteerde 13C6-glucose afgeleide aminozuren in E. coli lysaat CFME. Relatieve abundanties van (A) 13C9-tyrosine, (B) 13C5-histidine en (C) 13C3-aspartaat gedurende 3 uur. Ruwe piekgebieden geëxtraheerd door mzMINE-software werden gebruikt om gemiddelden en foutbalken (SE) te berekenen voor positieve annotaties (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Representatief HPLC-RID-chromatogram met pieken voor belangrijke fermentatieve producten in een CFME-reactie geïncubeerd bij 37 °C gedurende 24 uur. Pieken van glucose, succinaat, lactaat, formate, acetaat en ethanol zijn voldoende te onderscheiden door hun retentietijden op een HPLC-kolom tijdens isaccratische elutie met 5 mM zwavelzuuroplosmiddel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-Suppfig1.eps" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 2: Representatieve massaspectra voor 13C-gelabelde metabolieten, met name (A) lactaat, (B) glucose en (C) 6-fosfosogluconaat (6PG) in een CFME-reactie geïncubeerd bij 37 °C gedurende 1 uur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-SuppFig2.eps" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 1: Lijst van gedetecteerde 13C-gelabelde metabolieten, retentietijden (uitgelijnd over monsters met MZmine), theoretisch volledig 13C-gelabelde negatieve modus m/z-waarden, m/z-waarden van gedetecteerde kenmerken en berekende massafouten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/Supplemental%20Table%201.docx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

De protocollen beschrijven hoogwaardige vloeistofchromatografiemethoden gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor het bestuderen van metabole reacties in complexe op lysaat gebaseerde celvrije systemen.

Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

Dit protocol maakt gebruik van brekingsindexdetectie om bijproducten van koolstofmetabolisme te meten die gewoonlijk worden geaccumuleerd in op lysaat gebaseerde, celvrije systemen. Het maakt ook gebruik van massaspectrometrie om een nog breder panel van centrale metabolieten te detecteren die worden gegenereerd in metabolisch actieve lysaten. De twee technieken die in dit protocol worden gebruikt, bieden de mogelijkheid om de chemische reacties die plaatsvinden in een op lysaat gebaseerd, celvrij systeem kwantitatief te beschrijven, waardoor het mogelijk is om een breder scala aan metabolieten te detecteren, inclusief die welke in lage concentraties aanwezig zijn in de complexe lysaatachtergrond.Jaime Lorenzo Dinglasan en David Reeves, afgestudeerde onderzoekers van de afdeling Biowetenschappen, demonstreren de procedures. Begin met het combineren van de verschillende componenten in microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter om eindreacties voor te bereiden met 4,5 milligram per milliliter totaal lysaateiwit. Bereid celvrije metabole engineering, of CFME, reacties voor met uiteindelijke volumes van 50 microliter in drievoud per tijdspunt.Beëindig de drievoudige reacties onmiddellijk op hun geschikte tijdstippen door een gelijk volume van 5% trichloorazijnzuur toe te voegen aan het uiteindelijke reactievolume van elk monster. Verdun vervolgens elk monster door twee keer het volume steriel water aan elk reactiemengsel toe te voegen. Om tijd nul samen te vatten, mengt u hetzelfde volume van 5% trichloorazijnzuur als het totale eindreactievolume met het lysaat voordat u de rest van de reactiecomponenten toevoegt.Deze verzuringsstap slaat lysaatenzymen neer voordat ze glucose aanzienlijk metaboliseren. Vortex de monsters en centrifugeer op een benchtop microcentrifuge op 11, 600 keer g gedurende vijf minuten, en breng de supernatanten die de organische analyten bevatten over naar schone buizen. Bewaar de monsters bij min 20 graden Celsius als later HPLC-analyses moeten worden uitgevoerd.Zorg ervoor dat u de opgeslagen monsters op ijs ontdooit voordat u doorgaat naar de volgende stap. Filter elk supernatant met een poriefilter van 0,22 micrometer. Breng na de centrifuge elk filtraat over in een schone injectieflacon met HPLC-glas.Plaats de injectieflacons in de autosamplerlade van het HPLC-systeem die al is ingesteld voor analyse. Selecteer in de menubalk Volgorde, Nieuwe reekssjabloon. Selecteer Volgorde.Sla de reekssjabloon op als de naam van de reekssjabloon S.Select Volgorde, Volgordetabel. Voeg N-rijen toe die overeenkomen met N injectieflacons. Voer vervolgens injectieflaconposities en monsternamen in onder respectievelijk de injectieflacon en de monsternaam, volgens hun opstelling op de autosampler-lade.Selecteer de methode die is gegenereerd zoals beschreven in het manuscript in het vervolgkeuzemenu Methodenaam en voer 50 microliter in als injectieflacon per injectieflacon voor elke rij. Klik op Toepassen en sla de reekssjabloon op door Reeks, Reekssjabloon opslaan te selecteren. Zorg ervoor dat de sequentiesjabloon wordt geladen door Sequentie, Load Sequence Template, sequentiesjabloonnaam S. Te selecteren Nadat u een stabiele basislijn op de online plot hebt bereikt, klikt u met de rechtermuisknop op het paneel RID-module, Control, Off Recycling Valve om de oplosmiddelstroom door de RID-detector naar afval te leiden.Als u gegevensverzameling wilt starten, selecteert u Volgorde in de menubalk en selecteert u vervolgens Reekstabel, Uitvoeren. Selecteer Gegevensanalyseweergave in het menu Beeld. Zoek de naam van het reeksbestand in de bestandenlijst aan de linkerkant van het scherm.Ga op het middelste paneel op het scherm naar signaalweergaveselectie, RID-signaal om de samplechromatogrammen te bekijken. Selecteer een rij die overeenkomt met een van de voorbeelden in het bovenpaneel op het scherm. Pieken die overeenkomen met de doelanalyten worden langs de retentietijdas gerangschikt als glucose, succinaat, lactaat, formate, acetaat en ethanol in monsters waar al deze metabolieten aanwezig zijn.Onderscheid of de pieken van interesse goed zijn geïntegreerd door de software. Er moet automatisch een rode lijn worden getrokken als basis van elke piek. Als de rode lijn scheef staat, is de automatische integratie mislukt.Selecteer vervolgens de knop Handmatige integratie in de integratietoolset en teken handmatig een piekbasis om het piekgebied te integreren. Selecteer het gereedschap Cursor in de Common Tool Set om op correct geïntegreerde pieken te klikken. Het piekgebied en de bijbehorende reactietijd van de geselecteerde piek worden gemarkeerd als een tabelrij op het onderste paneel van het scherm.Als u piekgebieden wilt exporteren, selecteert u Bestand, Exporteren, Integratieresultaten. Zet piekgebiedwaarden tegenover bekende concentraties van monsters in een spreadsheet. Klik met de rechtermuisknop op de uitgezette gegevens en selecteer vervolgens Trendlijn toevoegen, Trendlijn opmaken, Vergelijking in grafiek weergeven.Gebruik in een afzonderlijke spreadsheet de vergelijkingen van standaardcurvetrendlijnen om piekgebiedwaarden om te zetten in concentraties voor elke analyt uit elk monster. Bereken de gemiddelde piekgebieden en standaardfoutwaarden voor drievoud voor gegevensvisualisatie. Stel drievoudige reacties in per tijdspunt, behalve tijd nul, op ijs zoals beschreven in het manuscript.Gebruik in plaats van glucose een eindconcentratie van 100 millimolair glucose-13C6 in de reacties. Incubeer de reacties bij 37 graden Celsius gedurende één, twee en drie uur. Pipetteer om te beginnen met de analyse een equivalent volume van het extractiemiddel naar elk monster.Als de monsters zijn ingevroren, voeg dan het extractiemiddel toe voordat de monsters volledig ontdooien om de reactivering van het glucosemetabolisme te voorkomen. Voer alle monsterverwerkingsstappen op ijs uit. Om tijd nul te recamenteren, pipetteert u het uiteindelijke volume extractieoplosmiddel tot een geschikt volume lysaat voor de gewenste eindconcentratie van 4,5 milligram per milliliter in 50 microliter reactievolume.Voeg de rest van de reactiecomponenten toe zoals eerder beschreven. Deze verzuringsstap slaat lysaatenzymen neer voordat ze glucose aanzienlijk metaboliseren. Incubeer de monsters in extractiemiddel op ijs gedurende 30 minuten met zacht schudden.Centrifugeer vervolgens de monsters op 21.000 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om het supernatant van het neergeslagen eiwit te scheiden. Breng 50 microliter van het supernatant over naar autosampler-injectieflacons en laad de injectieflacons op de lade binnen de vier graden Celsius autosampler. Nadat u het instrument hebt voorbereid voor analyse, stelt u een run-reeks in met behulp van de data-acquisitie- en interpretatiesoftware van het LC-MS /MS-systeem.Klik in Roadmap, Sequence Setup, met de rechtermuisknop op de tabel om zoveel rijen als voorbeelden in te voegen. Stel voor elke rij het injectievolume in op vijf microliter en de positie op de respectieve positie van de injectieflacon op de autosamplerlade. Voer bestandsnamen in als voorbeeldnamen en stel het gewenste bestandspad in voor de resultaten van het uitvoeren.Als u het uitvoeren wilt starten, markeert u alle bestandsnamen in de reeks. Selecteer in de menubalk Acties, Reeks uitvoeren. Open MZmine en importeer de eerder verkregen onbewerkte uitvoerbestanden.Selecteer in de menubalk Raw Data Methods, Raw Data Import en selecteer de bestanden die overeenkomen met de voorbeelden. Volg de stappen die in het manuscript worden beschreven om de MZmine-analyse te voltooien. Exporteer de onbewerkte piekgebieden aan het einde van de MZmine-analyse als een CSV-bestand.Open een spreadsheet om de massa's van 13C-gelabelde metabolieten uit het glucosemetabolisme te berekenen voor de gerichte zoekopdracht. Gebruik berekende massa's van 13C-gelabelde metabolieten om massa-to-charge-kenmerken van MZmine-resultaten te zoeken en te annoteren. Controleer handmatig de spectra van de vermeende annotaties in een kwaliteitsbrowser om de annotaties te bevestigen.Open Roadmap, Qual Browser. Open het RAW-bestand op de werkbalk om onbewerkte MS-gegevens van elk monster te importeren. Teken een lijn onder het gewenste bereik van retentietijden die overeenkomen met de vermeende annotatie op het totale ionchromatogram om een massaspectrum te bekijken.In HPLC-RID-experimenten werd glucose binnen de eerste drie uur na de reactie geconsumeerd en voornamelijk gefermenteerd tot lactaat. Ethanolaccumulatie trad ook significant op binnen de eerste drie uur van de reactie en stopte daarna. Acetaat was aanvankelijk aanwezig in de reacties als onderdeel van de S30-buffer en hoopte zich pas op als gevolg van het metabolisme na zes uur, toen de glucoseconsumptie was vertraagd.Lactaat en ethanol kunnen dus worden beschouwd als de eindproducten van grote fermentatie in het op lysaat gebaseerde, celvrije glucosemetabolisme. Er werd waargenomen dat zowel formate als succinaat werden gesynthetiseerd als kleine fermentatieproducten. Glucose-13C6 werd waarneembaar geconsumeerd door glycolyse, zoals blijkt uit de fluctuaties in glycolytische tussenproducten.In overeenstemming met de detectiegegevens van de HPLC-brekingsindex accumuleerde glucose tot lactaat-13C3 en werd het ook gefermenteerd tot succinaat-13C3 binnen de eerste drie uur na de reactie. De opname van glucose-13C6-afgeleide koolstofatomen in suikerfosfaten 6-fosfogluconolacton, 6-fosfogluconaat, ribulose-5-fosfaat en sedoheptulose-7-fosfaat werd ook waargenomen, wat de deelname van de pentosefosfaatroute in het lysaatglucosemetabolisme bevestigt. Het lysaatglucosemetabolisme bleek de tyrosine-13C9-synthese te voeden, terwijl het ook een voorloper was voor de productie van histidine-13C5.Het is belangrijk dat de controlemonsters precies tijd nul weergeven. Zorg er daarom voor dat de eiwitten in het lysaat worden geïnactiveerd voordat de oplossing met energiebronnen wordt gemengd. Zorg er ook voor dat de automatische integratie van pieken uit testmonsters, controlemonsters en normen consistent is, zodat geëxtraheerde piekgebieden vergelijkbaar zijn.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS-enabled Noninvasive metabole

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

A Coupled Experiment-finite Element Modeling Methodology for Assessing High Strain Rate Mechanical Response of Soft Biomaterials

Een combinatie Experiment-eindige elementen modellering Methodologie voor het beoordelen van Hoge Strain Rate mechanische respons van Soft Biomaterialen

This study offers a combined experimental and finite element (FE) simulation approach for examining the mechanical behavior of soft biomaterials (e.g. ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Afsluitbare Femtoliter Kamer Arrays voor Celvrije Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Synthese van biocompatibel Liquid Crystal elastomeerschuimen als Cell Stellingen voor 3D Ruimtelijke Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Visuele detectie van meerdere Nucleic Acids in een capillaire matrix

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Een Multilayer microfluidic platform voor de geleiding van langdurige cel-vrije genexpressie

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Ovariële kanker detectie met Photoacoustic flow Cytometrie

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Gelijktijdige kwantificering van geselecteerde kynurenines geanalyseerd door vloeibare chromatografie-massaspectrometrie in medium verzameld uit kankercelculturen

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...