Name: liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems
Uploaded: 2021-09-23T14:45:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Questa ricerca è stata sponsorizzata dal Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, come parte della Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory è gestito da UT-Battelle, LLC, per il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti sotto contratto DE-AC05-00OR22725. Questo manoscritto è stato scritto da UT-Battelle, LLC sotto contratto DE-AC05- 00OR22725 con il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti. Il governo degli Stati Uniti conserva e l'editore, accettando l'articolo per la pubblicazione, riconosce che il governo degli Stati Uniti conserva una licenza non esclusiva, pagata, irrevocabile e mondiale per pubblicare o riprodurre la forma pubblicata di questo manoscritto, o consentire ad altri di farlo, per scopi del governo degli Stati Uniti. Il Dipartimento dell'Energia fornirà l'accesso pubblico a questi risultati della ricerca sponsorizzata a livello federale in conformità con il Piano di accesso pubblico del DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

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	<li>Rollin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+hydrogen+production+from+biomass+by+in+vitro+metabolic+engineering:+Mixed+sugars+coutilization+and+kinetic+modeling.">High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).</li><li>Bowie, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biochemistry:+The+bio-inspired+cell-free+approach+to+commodity+chemical+production.">Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production.</a> Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).</li><li>Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+platform+for+cell+free+production+of+monoterpenes+from+glucose.">A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose.</a> Nature Communications. 8, 1-8 (2017).</li><li>Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosynthesis+of+limonene+using+enzyme-enriched+Escherichia+coli+lysates.">Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates.</a> Synthetic Biology. 4 (1), 003 (2019).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+potential+of+crude+cell+extracts+for+producing+pyruvate+from+glucose.">Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose.</a> Synthetic Biology. 3, (2018).</li><li>Kay, J. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysate+of+engineered+Escherichia+coli+supports+high-level+conversion+of+glucose+to+2,3-butanediol.">Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol.</a> Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).</li><li>Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+growth+medium+dropouts+promote+aromatic+compound+synthesis+in+crude+E.+coli+cell-free+systems.">Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysate+proteome+engineering+strategy+for+enhancing+cell-free+metabolite+production.">A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production.</a> Metabolic Engineering Communications. 12, 00162 (2021).</li><li>Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+pathway+prototyping.">Cell-free synthetic biology for pathway prototyping.</a> Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+cell-free+extract+reaction+(CFER)+system+in+Clostridium+thermocellum+to+identify+metabolic+limitations+to+ethanol+production.">Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production.</a> Frontiers in Energy Research. 8, 72 (2020).</li><li>Coskun, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Separation Tecniques: Chromatography. 3, (2016).</li><li>Bernardes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+acids+and+alcohols+quantification+by+HPLC/RID+in+sugarcane+vinasse:+analytical+method+validation+and+matrix+effect+assessment.">Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment.</a> International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computationally+guided+discovery+and+experimental+validation+of+indole-3-acetic+acid+synthesis+pathways.">Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways.</a> ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).</li><li>Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+control+of+cell-free+metabolism+through+pH+modulation.">Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation.</a> Synthetic Biology. 5, (2020).</li><li>Bujara, M., Sch&#252;mperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+cell-free+systems:+Implementation+and+debugging+of+a+system+of+biotransformations.">Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).</li><li>Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+identification+and+quantitation+in+LC-MS/MS-based+metabolomics.">Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics.</a> TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).</li><li>Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-liquid+chromatography.">Nano-liquid chromatography.</a> Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).</li><li>Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+mass+spectrometry-based+metabolomics:+Opportunities+and+challenges.">Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).</li><li>O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+CoA+metabolites+by+SAMDI-MS+to+optimize+the+cell-free+biosynthesis+of+HMG-CoA.">High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA.</a> Science Advances. 5, (2019).</li><li>Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unimod:+Protein+modifications+for+mass+spectrometry.">Unimod: Protein modifications for mass spectrometry.</a> Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).</li><li>Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+mixing+of+Escherichia+coli+crude+extracts+to+prototype+and+rationally+engineer+high-titer+mevalonate+synthesis.">Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).</li><li>Jaishankar, J., Srivastava, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+stationary+phase+survival+and+applications.">Molecular basis of stationary phase survival and applications.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2000 (2017).</li><li>Bartolomeo, M. P., Maisano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+for+quantitative+amino+acid+analysis.">Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).</li><li>Hauck, T., Landmann, C., Br&#252;hlmann, F., Schwab, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone+in+cytosolic+extracts+obtained+from+Zygosaccharomyces+rouxii.">Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).</li><li>Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsoSearch:+An+untargeted+and+unbiased+metabolite+and+lipid+isotopomer+tracing+strategy+from+HR-LC-MS/MS+datasets.">IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets.</a> Methods and Protocols. 3 (3), 54 (2020).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o altri conflitti di interesse.

L'approccio HPLC-RID delineato può essere utilizzato per quantificare con successo il consumo di substrato di zucchero e le successive conversioni in importanti prodotti organici acidi e alcolici del metabolismo centrale del lsato nel tempo. Inoltre, questo protocollo impiega un semplice metodo isocratico che utilizza una singola fase mobile, richiede una preparazione minima del campione e consente una semplice analisi mirata a valle. Gli analeti misurati con il metodo HPLC-RID si distinguono esclusivamente per i loro tempi di ritenzione e quindi per le loro interazioni con la resina della colonna selezionata. La colonna HPLC utilizzata qui è stata particolarmente progettata per separare carboidrati, acidi organici e alcoli combinando l'esclusione delle dimensioni e lo scambio di ligandi (cioè la cromatografia della partizione moderata da ioni). Il metodo descritto è, quindi, utile per un'analisi più mirata dei substrati di carboidrati e per selezionare i prodotti finali delle vie di fermentazione del glucosio che dovrebbero principalmente facilitare ed energizzare le bio-trasformazioni a base di lisato8,15,21. Tuttavia, questo protocollo non tiene conto dell'attivazione di altre vie metaboliche negli estratti cellulari. Per rilevare altri metaboliti come amminoacidi efosfatativi, è possibile utilizzare tubazioni che impiegano altre tecniche di separazione cromatografica (ad esempio, cromatografia di interazione idrofila), metodi di eluizione a gradiente, preparazione del campione più complicata (ad esempio, derivatizzazione) e diversi rivelatori ottici (ad esempio, rilevatori di luce ultravioletta o di diffusione della luce evaporativa) . In alternativa, un approccio globale allo studio del metabolismo del lsato può essere adottato utilizzando LC-MS / MS.
Il metodo LC-MS/MS descritto è un unico flusso di lavoro per misurare e identificare una gamma più ampia di metaboliti. LC-MS/MS è uno strumento analitico all'avanguardia per la profilazione del metaboloma grazie alla sua sensibilità e capacità di distinguere i metaboliti per tempo di ritenzione e rapporti m/z ad alta risoluzione16. Con particolare attenzione alle vie metaboliche centrali del carbonio e all'anabolismo degli aminoacidi, la modalità negativa MS / MS è stata implementata per rilevare specificamente acidi organici polari, fosfati di zucchero e amminoacidi. Accoppiato con una tecnica di cromatografia nano-liquida, il metodo fornisce un'elevata sensibilità per rilevare piccole molecole nel complesso fondo di lisato17. In termini di profilazione del metabolismo CFME basato sul lsato, tuttavia, una limitazione del protocollo LC-MS / MS descritto è il suo limite di rilevamento inferiore di 50 m / z, che preclude la misurazione dell'etanolo, un prodotto importante nel metabolismo del glucosio del lsato, così come il formato, che sono entrambi altrimenti facilmente quantificati dal metodo DETTAGLIATO HPLC-RID. Rispetto a LC-MS/MS, HPLC-RID ha l'ulteriore vantaggio di una relativa accessibilità in termini di costi e difficoltà. A quest'ultimo punto, la risoluzione dei problemi del metodo LC-MS/MS qui descritto potrebbe richiedere un certo grado di esperienza nella spettrometria di massa. Tuttavia, il rilevamento della SM ha applicazioni straordinariamente interessanti rispetto al RID in quanto può inoltre distinguere gli isotopi etichettati nei metabolomi, una tecnica eccellente per comprendere il movimento del carbonio da substrati integrati attraverso la complessa rete metabolica del lsato18. Tale approccio è stato applicato qui integrando le reazioni con 13C6-glucosio e analizzando i valori di abbondanza relativa dei metaboliti a valle 13C-incorporanti. L'analisi ha permesso la definizione di vie attive e inattive, supportando ipotesi precedentemente riportate e fornendo nuove intuizioni sul flusso metabolico nei lisati. Le modifiche possono anche essere apportate all'interno del metodo per analisi specifiche. Ad esempio, le soluzioni standard di 13composti bersaglio marcati con C possono essere analizzate insieme a campioni per ottenere misurazioni quantitative assolute delle molecole derivate dal glucosio nel tempo e trarre conclusioni sulle distribuzioni del flusso. Una migliore rilevazione di composti caricati positivamente può anche essere abilitata all'interno del flusso di lavoro corrente eseguendo sequenze con file .meth regolati per il rilevamento in modalità positiva.
Il campionamento analitico in entrambi i metodi descritti è opportunamente automatizzato, garantendo un'elevata riproducibilità. Inoltre, ci si può aspettare un regolare funzionamento analitico purché si osservino adeguate pratiche di gestione e manutenzione degli strumenti. Quando si utilizzano questi strumenti per analizzare le reazioni CFME, è necessario fare considerazioni più critiche a monte e a valle del campionamento. Durante la preparazione del campione, è importante che i controlli del percorso temporale siano rappresentativi del tempo zero. Qui, le proteine sono state precipitate nei lizzati mediante acidificazione per fermare le reazioni metaboliche. Per i campioni a tempo zero, il solvente acido è stato combinato con il lisato prima di aggiungere la miscela di reazione contenente glucosio. L'acidificazione con acido tricloroacetico ha efficacemente assicurato che il glucosio non venga metabolizzato al tempo zero, come mostrato nei dati HPLC-RID (Figura 2). Mentre una procedura simile per estinguere il metabolismo del glucosio è stata eseguita nell'analisi LC-MS / MS riportata, 13metaboliti C-labeled sono stati rilevati in campioni time-zero, anche se a valori di abbondanza significativamente bassi rispetto ai campioni estratti in momenti successivi. Inoltre, queste osservazioni erano limitate agli intermedi della glicolisi. I dati suggeriscono che le reazioni mantengono un certo grado di attività glicolitica dopo l'acidificazione con il solvente di estrazione che viene rilevato con questo metodo altamente sensibile. La portata di questa attività, tuttavia, dovrebbe essere quantificata. Uno studio precedente ha riportato che i solventi da estrazione acidi potrebbero non spegnere sufficientemente le reazioni glicolitiche intermedie, ma possono fermare il consumo significativo di glucosio10. Mentre questo rimane da indagare ulteriormente nel sistema utilizzato qui, drastici cambiamenti nei valori di abbondanza relativa tra campioni time-zero e timepoint successivi possono essere interpretati come tendenze nel metabolismo del glucosio. L'esplorazione di metodi di tempra alternativi, tuttavia, è raccomandata in applicazioni simili, in particolare per ottenere quantità assolute di intermedi metabolici10. Inoltre, dovrebbero essere osservate anche le buone pratiche durante le analisi a valle del software. La coerenza è fondamentale quando si integrano manualmente le aree di picco dai segnali RID per ridurre l'errore umano. L'integrazione manuale dovrebbe essere applicata anche alle aree di picco degli standard ogni volta che vengono utilizzate aree di picco integrate manualmente per quantificare le concentrazioni di metaboliti nei campioni. Durante l'analisi LC-MS/MS mirata, le annotazioni provvisorie dell'analisi MZmine devono essere convalidate mediante il controllo manuale dei picchi utilizzando un browser di qualità MS e le funzionalità m/z devono essere annotate solo quando gli errori di massa calcolati sono accettabili. Qui, queste analisi sono state eseguite manualmente per un insieme limitato di obiettivi poiché il software completo e robusto per la ricerca di isotopi non è ancora stato stabilito. Tuttavia, tali metodi automatizzati per la ricerca di metaboliti etichettati con 13C stanno attualmente emergendo e semplificherebbero anche analisi più complicate, come la profilazione dei lasati oltre il metabolismo centrale del carbonio25.
La cromatografia liquida avanzata è un metodo robusto e ampiamente applicato per separare piccole molecole in miscele metaboliche complesse11. I metodi descritti accoppiano questa tecnica di separazione con l'indice di rifrazione o il rilevamento spettrometrico di massa per analizzare con successo le conversioni di metaboliti nelle reazioni CFME a base di llysate. HPLC-RID e LC-MS/MS sono strumenti individualmente potenti per profilare il metabolismo attivo del lizzato e la loro complementarità può essere ulteriormente sfruttata per affrontare i limiti intrinseci di ciascuna tecnica. I metodi riportati consentono l'applicazione e lo sviluppo di CFME in quanto possono essere utilizzati per comprendere il metabolismo del lisato, monitorare i miglioramenti nelle conversioni mirate dei metaboliti e chiarire le alterazioni del flusso di metaboliti quando si manipola il metabolismo del lisato.

Le limitazioni nell'ingegneria dei microbi per la produzione chimica possono essere affrontate ricapitolando le reazioni biochimiche in vitro in cui le funzioni di sopravvivenza cellulare concorrenti sono assenti1. Inoltre, l'ambiente di reazione aperto (cioè l'assenza di una membrana cellulare) è più suscettibile di manipolazione ed è più facile da monitorare rispetto alle cellule vive. Questo concetto fondamentale di ingegneria metabolica senza cellule (CFME) è stato elegantemente dimostrato dalla ricostituzione delle vie metaboliche per sintetizzare sostanze chimiche preziose come idrogeno e monoterpeni con metriche di produzione che sono ordini di grandezza superiori a quelli presentati nelle fabbriche di cellule microbiche finora1,2,3 . I metodi per purificare interi percorsi, tuttavia, sono attualmente limitati da tempi e costi. In alternativa, i sistemi metabolici privi di cellule possono essere derivati da estratti di cellule grezze attraverso metodi rapidi ed economici relativi alla ricostituzione dell'intero percorso4. Il metabolismo centrale che viene trattenuto negli estratti cellulari può essere integrato con substrati energetici (ad esempio, glucosio e cofattori enzimatici) e sali in soluzioni tamponate per generare precursori metabolici centrali per oltre 24 ore5,6. L'aggiunta di enzimi esogeni alla reazione CFME a base di losato consente bio-trasformazioni più complesse del glucosio in sostanze chimiche più preziose a titoli elevati4,6,7. Sebbene la resa tenda ad essere compromessa in questi sistemi a causa della loro complessità metabolica simile a quella cellulare, metodi unici per curare i proteomi del lisato per una conversione a resa più elevata sono stati e sono in fase di sviluppo7,8.
La facilità di effettuare trasformazioni metaboliche in sistemi privi di cellule a base di lisato rende queste eccellenti piattaforme per spostare del tutto la produzione chimica al di fuori della cellula o per prototipare nuovi percorsi con un alto rendimento prima di costruire e testare questi progetti in vivo2,9. Per entrambe le applicazioni, gli strumenti per il monitoraggio delle conversioni metaboliche o l'osservazione delle alterazioni complessive del flusso metabolico nei lisati sono parte integrante del progresso della CFME. La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) può essere utilizzata per separare i costituenti chimici delle reazioni CFME ad alta risoluzione e può essere accoppiata a rivelatori ottici o spettrometrici di massa per la quantificazione dei metaboliti5,10. Il principio alla base dell'HPLC è che gli analiti disciolti in un solvente (cioè in fase mobile) e pompati attraverso una colonna interagiranno con il materiale specifico di imballaggio della colonna (cioè fase stazionaria)11. A seconda delle loro proprietà chimiche, questi analiti mostrano tempi di ritenzione variabili prima di essere eventualmente eluiti dalla fase stazionaria e trasportati dalla fase mobile a un rivelatore. Questo rapporto descrive in dettaglio la preparazione e l'analisi delle reazioni CFME a base di E. coli lysate attraverso metodi basati su HPLC che sfruttano il rilevamento RID e MS / MS.
L'HPLC accoppiato al rilevamento dell'indice di rifrazione (HPLC-RID) è un metodo generalmente accessibile per identificare rapidamente i precursori metabolici centrali e i prodotti finali. In breve, RID misura come gli analeti cambiano la deflessione della luce dalla fase mobile12. I segnali RID corrispondenti agli analiti bersaglio nei campioni possono quindi essere quantificati mediante confronti con i segnali RID di soluzioni standard. Nelle applicazioni CFME, questa modalità di rilevamento è stata più comunemente utilizzata con colonne HPLC che separano i composti in base a una combinazione di esclusione dimensionale e meccanismi di scambio del ligando, o cromatografia di partizione moderata da ioni5,6,8,13. Questa particolare tecnica viene utilizzata per quantificare rapidamente il consumo di substrati di zucchero come il glucosio e la formazione di prodotti di fermentazione come succinato, lattato, formate, acetato ed etanolo nelle reazioni CFME a base di llitasi8. Registrare i cambiamenti di concentrazione di questi composti tramite HPLC è stato utile sia per chiarire il potenziale degli estratti di cellule grezze per mettere in comune i precursori metabolici centrali sia per capire come il flusso della via viene reindirizzato attraverso le vie fermentative durante complesse conversioni metaboliche dal glucosio nei lisati6,8,14. Studi CFME seminali in estratti di cellule di E. coli confermano che i composti di fermentazione si accumulano come prodotti finali del catabolismo del glucosio e si verificano anche come sottoprodotti indesiderati nei lizzati che sovraesprimono gli enzimi esogeni6,15. Si suggerisce che il metabolismo fermentativo svolga un ruolo necessario nella rigenerazione degli equivalenti redox dei cofattori (cioè NAD(P)H e ATP) per sostenere le reazioni glicolitiche8. Quindi, un metodo di rilevamento ottico basato su HPLC progettato per separare i prodotti di fermentazione è uno strumento utile e comunemente applicato quando si eseguono varie attività CFME basate su il lsato.
CFME può essere implementato per accumulare prodotti finali metabolici che non sono carboidrati, acidi organici o alcoli4. La misurazione degli intermedi che vengono consumati con la stessa rapidità con cui vengono sintetizzati può anche essere desiderabile10. Mentre HPLC-RID è accessibile in termini di costi e difficoltà, questo metodo è limitato dalla sua capacità di distinguere i metaboliti solo in base al tempo di ritenzione. Una gamma più ampia di metaboliti può essere analizzata quando la cromatografia liquida è accoppiata al rilevamento MS/MS (LC-MS/MS)16. Con questo metodo, gli analiti nella fase mobile vengono ionizzati e rilevati in modo differenziale in base alle proprietà di massa e carica di ciascuna molecola. La conoscenza sia del rapporto massa-carica (m/z) del metabolita che del tempo di ritenzione sulla colonna facilita così la separazione della maggior parte degli intermedi metabolici e dei prodotti finali ad alta risoluzione16. Questa tecnica di rilevamento può anche essere accoppiata alla cromatografia nano-liquida, che offre portate e volumi di iniezione del campione molto più bassi, consentendo il rilevamento più sensibile di piccole molecole nel complesso fondo di lisato17. LC-MS/MS può anche essere applicato con l'etichettatura isotopica poiché le etichette incorporate impartiscono modifiche nei valori m/z degli analti18. Le misurazioni del punto temporale estratte da una reazione CFME integrata con un substrato di glucosio a 13C6possono quindi determinare i prodotti finali o i sottoprodotti derivati specificamente dal glucosio integrato. Sebbene questo metodo di tracciamento degli isotopi non sia ancora comunemente applicato negli studi CFME, è un potente strumento per comprendere le conversioni metaboliche nei sistemi CFME a base di lisato, in particolare poiché i controioni di sale (cioè acetato e glutammato) in queste reazioni sono anche catabolizzati come substrati secondari19. Sfruttando questa tecnica si può quindi tracciare un quadro completo del metabolismo del glucosio nei lizzati, che ancora oggi non è completamente compreso. Qui, il protocollo descrive in dettaglio un metodo per la cromatografia nano-liquida accoppiata alla ionizzazione nanoelettrospray (nano ESI) MS / MS che può essere utilizzato per interrogare un possibile modello di metabolismo del glucosio, in particolare nei lisati di E. coli (Figura 1). Il modello si basa su segnalazioni di vie fermentative e della via del pentoso fosfato attive nei lasati di E. coli derivati da ceppi coltivati in rich media5,6,8,14. La tecnica viene inoltre utilizzata per studiare la produzione di aminoacidi poiché le attuali conoscenze sull'anabolismo degli aminoacidi dal glucosio nei lizzati sono limitate a pochi esempi come la sintesi di amminoacidi aromatici7. Data la natura prevalentemente polare dei prodotti finali e degli intermedi in queste vie (cioè acidi organici, fosfati di zucchero e amminoacidi), qui è stata utilizzata la cromatografia liquida a fase inversa. Questa tecnica separa i composti polari per eluizione da una fase stazionaria non polare. Questi composti sono stati poi ionizzati da nano ESI in modalità ionica negativa che consente la rilevazione di analiti con almeno una carica elementare negativa ed è quindi utile per rilevare composti acidi. Questa tecnica è impiegata qui per analizzare i metaboliti 13C-incorporanti derivati dal glucosio e dimostra l'utilità di LC-MS / MS per comprendere il metabolismo del glucosio nei lizzati.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m centrifuge tube filters (spin columns)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Binary LC Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1312B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity High Performance Degasser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4225A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Refractive Index Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7162A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Standard Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1329B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374</td>
			<td>CFME reaction mix component (LC-MS/MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.20 &#956;m pore (PES membrane) filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminex HPX 87-H column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1250140</td>
			<td>Chromatography column for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1376</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vial caps (yellow, snap)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-50Y</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W225181</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-dextrose (Glucose)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9230</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8281</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC/MS grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica (internal diameter of 100 &#956;m, external diameter of 375 &#956;m)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>WM22005-ND</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetex 5 &#956;m C18 stationary phase (100 &#197;)</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0632</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanospray Ionization Source</td>
			<td>ThermoFisher Scientific/Proxeon</td>
			<td>ES071 (newest model)</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenLab CDS (Online) Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 2.15.26</td>
			<td>Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 2.7</td>
			<td>Software for tuning the LC-MS/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps (with septa, 9 mm)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29315-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwthread glass vials (2 mL)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29376-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>247596</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71716</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>398055</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>Solvent preparation for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-acetate</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-090-100</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Solvent Rack: SRD-3600</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6500</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 3.0.63</td>
			<td>Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems

L'ingegneria del metabolismo cellulare per la biosintesi mirata può richiedere ampi cicli di progettazione-costruzione-test-apprendimento (DBTL) mentre l'ingegnere lavora intorno ai requisiti di sopravvivenza della cellula. In alternativa, l'esecuzione di cicli DBTL in ambienti privi di celle può accelerare questo processo e alleviare i problemi di compatibilità dell'host. Un approccio promettente all'ingegneria metabolica senza cellule (CFME) sfrutta gli estratti di cellule grezze metabolicamente attivi come piattaforme per la bio produzione e per scoprire e prototipare rapidamente proteine e percorsi modificati. Realizzare queste capacità e ottimizzare le prestazioni CFME richiede metodi per caratterizzare il metaboloma delle piattaforme cell-free basate su lisato. Cioè, gli strumenti analitici sono necessari per monitorare i miglioramenti nelle conversioni mirate dei metaboliti e per chiarire le alterazioni del flusso dei metaboliti quando si manipola il metabolismo del lisato. Qui, le analisi dei metaboliti utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata con il rilevamento ottico o spettrometrico di massa sono state applicate per caratterizzare la produzione e il flusso di metaboliti nei lasati di E. coli S30. In particolare, questo rapporto descrive la preparazione di campioni di lisati CFME per analisi HPLC utilizzando il rilevamento dell'indice di rifrazione (RID) per quantificare la generazione di intermedi metabolici centrali e sottoprodotti nella conversione di substrati a basso costo (cioè glucosio) in vari prodotti di alto valore. Viene inoltre presentata l'analisi della conversione dei metaboliti in reazioni CFME alimentate con 13glucosio C-labeled attraverso cromatografia liquida in fase inversa accoppiata alla spettrometria di massa tandem (MS/MS), un potente strumento per caratterizzare le rese di metaboliti specifici e il flusso metabolico di lisato dalle materie prime. Complessivamente, l'applicazione di questi metodi analitici al metabolismo del lisato CFME consente l'avanzamento di questi sistemi come piattaforme alternative per l'esecuzione di compiti di ingegneria metabolica più veloci o nuovi.

Per quantificare la sintesi senza cellule a base di lisato di prodotti di fermentazione comuni dal glucosio, i lisati derivati da ceppi coltivati in mezzi 2xYPTG sono stati alimentati con glucosio da 100 μM come fonte primaria di carbonio8. Le reazioni sono state interrotte in un arco di tempo di 24 ore mediante acidificazione delle proteine. I supernatanti filtrati contenenti piruvato, succinato, lattato, formate, acetato ed etanolo prodotti dal catabolismo del glucosio sono stati caricati sul modulo autocampionatore di un sistema HPLC dotato di un modulo RID. Fiale con miscele filtrate di prodotti finali fermentativi e glucosio a 1,17 μM, 2,34 μM, 4,69 μM, 9,38 μM, 18,75 μM, 37,50 μM, 75 μM e concentrazioni di 150 μM nel tampone S30 sono state caricate sullo strumento come standard. Gli analizzati sono stati eluiti isocraticamente da una colonna HPLC al RID. I picchi per glucosio, succinato, lattato, tesa, acetato ed etanolo entro l'intervallo da 1 a 150 μM potrebbero essere risolti dal RID. Le aree di picco per il glucosio sono state derivate dall'integrazione manuale dai dati RID per i campioni di corso temporale e curva standard. Le aree di picco estratte per succinato, lattato, formate, acetato ed etanolo sono state prelevate da segnali integrati automaticamente. Tutte le curve standard (area di picco vs concentrazione nota) avevano valori R2 >0,99 ed erano lineari in tutto l'intervallo di concentrazioni qui utilizzate.
Le concentrazioni molari per tutti gli analeti bersaglio sono state calcolate dalle rispettive curve standard. Il glucosio è stato consumato entro le prime 3 ore della reazione e fermentato principalmente in lattato (Figura 2A,B). Anche l'accumulo di etanolo si è verificato in modo significativo entro le prime 3 ore della reazione e si è fermato successivamente (Figura 2C). L'osservazione di una significativa produzione di lattato ed etanolo con un consumo significativo di glucosio dopo 3 ore non è stata senza precedenti poiché le vie di produzione di lattato ed etanolo consentono la rigenerazione di 1 mol netta NAD+ dal NADH glicolitico necessario per il consumo continuato di glucosio attraverso la glicolisi (Figura 1). Il lattato e l'etanolo possono quindi essere considerati i principali prodotti finali di fermentazione nel metabolismo del glucosio privo di cellule a base di lizzati. L'acetato era inizialmente presente nelle reazioni come componente del tampone S30 e inaspettatamente si accumulava solo a causa del metabolismo dopo 6 ore quando il consumo di glucosio era rallentato (Figura 2D). Questo risultato suggerisce che la fermentazione dell'acetato non consente necessariamente un rapido flusso glicolitico nei punti temporali precedenti. Nel frattempo, il formate e il succinato sono stati sintetizzati come prodotti di fermentazione minori (Figura 2E, F). Complessivamente, il metodo ha permesso la quantificazione assoluta dell'esaurimento del substrato zuccherino e della formazione di prodotti fermentativi nei lasati di E. coli S30.
Il rilevamento della SM per profilare il metabolismo del glucosio del lsato in particolare è stato applicato qui. I lisati derivati da ceppi coltivati in mezzi 2xYPTG sono stati alimentati con 13C6-glucosio come fonte di carbonio. Le reazioni CFME sono state eseguite in triplice copia per 0 h, 1 h, 2 h e 3 h. I campioni di ciascun punto temporale sono stati caricati su un sistema LC dotato di una colonna a fase inversa e accoppiati a spettrometri di massa a trasformata di Fourier e trappola ioiana. Gli spettri in modalità ionico negativa sono stati ottenuti ed elaborati per analizzare acidi organici, fosfati di zucchero e amminoacidi. Sono state ricercate masse teoriche calcolate di 13specie etichettate con C appartenenti al metabolismo centrale del carbonio per identificare composti specificamente derivati dal glucosio. Sulla base delle condizioni di coltivazione del ceppo di origine utilizzate e delle precedenti segnalazioni di percorsi attivi in E. coli CFME, si presume qui che il proteoma di lisi comprende una rete metabolica che alimenta il glucosio nella fermentazione glicolitica, la via del pentoso fosfato e possibilmente l'anabolismo degli amminoacidi5,6,7,8,14 ( Figura1). Pertanto, la ricerca è stata ristretta ai membri di queste vie, di cui 16 metaboliti che incorporano etichette 13C derivate dal glucosio sono state annotate in modo inequivocabile (Tabella supplementare 1).
13 anni C6-glucosioè stato consumato in modo osservabile attraverso la glicolisi, come evidenziato dalle fluttuazioni delle abbondanze intermedie glicolitiche (Figura 3A-E). Coerentemente con i dati HPLC-RID, il glucosio si è accumulato a 13C3-lattatoed è stato anche fermentato a 13C3-succinatoentro le prime 3 ore dellareazione (Figura 4A,B). La formazione dell'isotopologo 13C3-succinatosupporta il modello proposto del metabolismo del glucosio del lsato ( Figura1), in cui è probabile che il succinato sia generato dalla carbossilazione della molecola di fosfoenolpiruvato a 3 atomi di carbonio (PEP) e non dall'ingresso di una molecola di acetil-CoA a 2 atomi di carbonio al ciclo TCA. L'attivazione del ciclo TCA è stata ipotizzata in precedenti studi CFME, ma altri 13intermedi C-labeled di TCA non sono stati rilevati qui8,19,21. 13 anni La sintesi di C 3-aspartato tuttavia si è verificata entro la prima h ed è stata consumata, rafforzando l'idea che il PEP sia direttamente convertito in ossalacetato (Figura 1, Figura 6C). I dati riflettono un proteoma di lisato da ceppi di origine raccolti durante la crescita fermentativa su mezzi ricchi di glucosio (2xYPTG). Ciò implicherebbe inoltre che il resto degli enzimi TCA che non partecipano alla produzione di succinato formano un ramo ossidativo del TCA (Figura 1). Nessuno dei metaboliti in questa via, tuttavia, è stato rilevato, probabilmente perché alte concentrazioni di glutammato aggiunte alla reazione CFME come contraione salino impediscono la progressione di questo ramo. 
I dati HPLC-RID sono inoltre integrati dalla mancanza di rilevamento di 13C2-acetatoentro il periodo di 3 ore di reazione che suggerisce che non c'è accumulo di acetato da glucosio fino a 3 ore (Figura 2B). Tuttavia, il precursore diretto dell'acetato, l'acetil-fosfato (acetil-P), si è accumulato, suggerendo che il braccio Pta della via Pta-AckA per la sintesi dell'acetato da acetil-CoA è attivo (Figura 4C,D). La defosforilazione catalizzato da AckA di 13C 2-acetil-P a 13C2-acetatoprobabilmente non si verifica entro questo lasso di tempo a causa del fatto che l'acetato è un componente importante del tampone S30 utilizzato nelle reazioni (Figura 1, Figura 2B).
È stata osservata anche l'incorporazione di 13carboni derivati dal glucosio C6ai fosfati di zucchero 6-fosfogluconolattone (6PGL), 6-fosfogluconato (6PG), ribulosio-5-fosfato (Ru5P) e sedoeptosio-7-fosfato (S7P) (Figura 5). Questi risultati confermano la partecipazione della via del pentoso fosfato nel metabolismo del glucosio del lisato e probabilmente alimentano la sintesi di 13C 9-tirosina, che è stata suggerita in precedenza da uno studio proteomico, fornendo anche un precursore per la produzione di 13C5-istidina (Figura 6A, B)7. Fenilalanina e triptofano etichettati non sono stati osservati qui, e nemmeno la maggior parte degli aminoacidi essenziali. Tuttavia, questo non è del tutto sorprendente poiché l'anabolismo degli aminoacidi è probabilmente arricchito in lasati derivati da cellule cresciute in condizioni di fame di nutrienti o nella fase stazionaria7,22. Inoltre, i dati finora suggeriscono che gli intermedi della glicolisi e della fermentazione sono incanalati verso reazioni finali rigeneranti cofattoriali, che devono precludere la sintesi di molti amminoacidi derivati da gliceraldeide-3-fosfato, piruvato e acetil-CoA (cioè glicina, cisteina, serina, alanina, valina, leucina e lisina) (Figura 1). Come accennato, 13C 3-aspartato è stato prodotto entro la prima ora, mentre l'aspartato derivato da 13aminoacidi che incorporano C (cioè treonina, isoleucina, metionina e asparagina) non sono stati osservati probabilmente perché l'aspartato derivato dal glucosio partecipa alla fermentazione (Figura 1, Figura 6C). Infine, il flusso verso il glutammato etichettato e gli amminoacidi derivati dal glutammato potrebbe essere stato ostacolato da alti livelli di glutammato nell'ambiente di reazione (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig01.jpg"> Figura 1: Un presunto modello metabolico di lasati derivato da E. coli BL21DE3-Star che cresce esponenzialmente in alte concentrazioni di glucosio. Intermedi e prodotti finali della glicolisi (verde), la via del pentoso fosfato (arancione scuro) e le vie fermentative (blu) da acetil-CoA sono stati riportati nel CFME a base di lisi. La presenza della fermentazione succinata implica l'attivazione del ramo ossidativo TCA (grigio). L'anabolismo degli aminoacidi (oro) nei lizzati non è ben definito ed è studiato qui. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig02.jpg"> Figura 2: Dati HPLC-RID per il consumo di glucosio e la sintesi fermentativa del prodotto finale nelle reazioni CFME preparate con estratti grezzi di E. coli. (A) Consumo di glucosio e (B) lattato, (C) etanolo , (D) acetato , (E) e (F) produzione di succinato nelle reazioni CFME sono stati monitorati per 24 ore. Vengono presentate le concentrazioni medie di mM e le barre di errore (SE) quantificate con curve standard (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig03.jpg"> Figura 3: Andamento del corso temporale di 13C6-glucosio e 13intermedi glicolitici C-label in E. coli lysate CFME. Abbondanze relative di (A) 13C6-glucosio, (B) 13C6-glucosio-6-fosfato/fruttosio-6-fosfato, (C) 13C6-fruttosio-1,6-bisfosfato, (D) 13C3-gliceraldeide-3-fosfato/diidrossiacetone fosfato, e (E) 13C6 -piruvato in reazioni CFME superiori a 3 ore. Le aree di picco grezze estratte dal software mzMINE sono state utilizzate per calcolare le medie e le barre di errore (SE) per le annotazioni positive (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig04.jpg"> Figura 4: Andamento del corso temporale degli intermedi e dei prodotti finali nella fermentazione del glucosio 13C6nel CFME del lico di E. coli. Abbondanze relative di (A) 13C3-lattato, (B) 13C3-succinato, (C) 13C2-acetil-fosfato e (D) 13C2-acetil-CoA in reazioni CFME superiori a 3 ore. Le aree di picco grezze estratte dal software mzMINE sono state utilizzate per calcolare le medie e le barre di errore (SE) per le annotazioni positive (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig05.jpg"> Figura 5: Andamento del decorso temporale degli intermedi della via del pentoso fosfato derivato dal glucosio 13C6in E. coli lysate CFME. Abbondanze relative di (A) 13C6-6-fosfogluconolattone, (B) 13C6-6-fosfogluconato, (C) 13C5-ribulosio-5-fosfato e (D) 13C7-sedoeptosio-7-fosfato oltre 3 ore. Le aree di picco grezze estratte dal software mzMINE sono state utilizzate per calcolare le medie e le barre di errore (SE) per le annotazioni positive (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig06.jpg"> Figura 6: Tendenze del decorso temporale degli amminoacidi derivati dal glucosio 13C6rilevati in E. coli lysate CFME. Abbondanza relativa di (A) 13C9-tirosina, (B) 13C5-istidina, e (C) 13C3-aspartato su 3 h. Le aree di picco grezze estratte dal software mzMINE sono state utilizzate per calcolare le medie e le barre di errore (SE) per le annotazioni positive (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Cromatogramma HPLC-RID rappresentativo che mostra i picchi per i principali prodotti fermentativi in una reazione CFME incubata a 37 °C per 24 ore. I picchi di glucosio, succinato, lattato, formiato, acetato ed etanolo sono sufficientemente distinguibili per i loro tempi di ritenzione su una colonna HPLC durante l'eluizione isocratica con solvente di acido solforico 5 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-Suppfig1.eps" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 2: Spettri di massa rappresentativi per metaboliti etichettati con 13C, in particolare (A) lattato, glucosio (B) e (C) 6-fosfogluconato (6PG) in una reazione CFME incubata a 37 °C per 1 ora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-SuppFig2.eps" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 1:Elenco dei 13metaboliti marcati C rilevati, tempi di ritenzione (allineati tra i campioni utilizzando MZmine), valori teorici di modalitànegativa m/z completamente marcati con C, valori m/z delle caratteristiche rilevate ed errori di massa calcolati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/Supplemental%20Table%201.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

I protocolli descrivono metodi di cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiati all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per lo studio delle reazioni metaboliche in complessi sistemi privi di cellule a base di lisato.

Cromatografia liquida accoppiata all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per la profilazione dei metaboliti in sistemi privi di cellule a base di lisato

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

Questo protocollo utilizza il rilevamento dell'indice di rifrazione per misurare i sottoprodotti del metabolismo del carbonio che sono comunemente accumulati in sistemi a base di lisato e privi di cellule. Fa anche uso della spettrometria di massa per rilevare un pannello ancora più ampio di metaboliti centrali che vengono generati nei lisati metabolicamente attivi. Le due tecniche utilizzate in questo protocollo forniscono la capacità di descrivere quantitativamente le reazioni chimiche che si verificano in un sistema a base di lsato, privo di cellule, consentendo di rilevare una gamma più ampia di metaboliti, compresi quelli presenti a basse concentrazioni nel complesso fondo del lisi.A dimostrare le procedure saranno Jaime Lorenzo Dinglasan e David Reeves, ricercatori laureati della Divisione Bioscienze. Inizia combinando i diversi componenti in tubi microcentrifuga da 1,5 millilitro per preparare le reazioni finali con 4,5 milligrammi per millilitro di proteina di lizzata totale. Preparare reazioni di ingegneria metabolica senza cellule, o CFME, con volumi finali di 50 microlitri in triplice copia per punto temporale.Terminare immediatamente le reazioni triplicate nei punti temporali appropriati aggiungendo un volume uguale di acido tricloroacetico al 5% del volume di reazione finale di ciascun campione. Quindi diluire ogni campione aggiungendo due volte il volume di acqua sterile a ciascuna miscela di reazione. Per ricapitolare il tempo zero, mescolare lo stesso volume di acido tricloroacetico al 5% del volume totale della reazione finale con il l'lisito prima di aggiungere il resto dei componenti della reazione.Questa fase di acidificazione precipita gli enzimi del lsato prima che metabolizzano significativamente il glucosio. Vortice i campioni e centrifuga su una microcentrifuga da banco a 11.600 volte g per cinque minuti e trasferire i supernatanti contenenti gli analiti organici in tubi puliti. Conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius se le analisi HPLC devono essere condotte in un secondo momento.Assicurarsi di scongelare i campioni conservati sul ghiaccio prima di procedere al passaggio successivo. Filtrare ogni surnatante con un filtro a pori da 0,22 micrometri. Dopo la centrifuga, trasferire ogni filtrato in un flaconcino di vetro HPLC pulito.Caricare i flaconcini sul vassoio autocampionatore del sistema HPLC che è già stato impostato per l'analisi. Dalla barra dei menu, selezionate Sequenza, Nuovo modello di sequenza. Selezionate Sequenza (Sequence).Salvare il modello di sequenza come nome del modello di sequenza S.Select Sequence, Sequence Table. Aggiungere N righe corrispondenti a N flaconcini. Quindi inserire le posizioni del flaconcino e i nomi dei campioni rispettivamente in Vial e Sample Name, in base alla loro disposizione sul vassoio dell'autocampionatore.Selezionare il metodo generato come descritto nel manoscritto dal menu a discesa Nome metodo e inserire 50 microlitri come iniezione per flaconcino per ogni riga. Fare clic su Applica e salvare il modello di sequenza selezionando Sequenza, Salva modello sequenza. Assicurarsi che il modello di sequenza sia caricato selezionando Sequenza, Modello di sequenza di carico, nome del modello di sequenza S.Dopo aver raggiunto una linea di base stabile sul grafico online, fare clic con il pulsante destro del mouse sul pannello Modulo RID, Controllo, Valvola di riciclaggio Off per dirigere il flusso di solvente attraverso il rilevatore RID ai rifiuti.Per avviare l'acquisizione dei dati, selezionare Sequenza dalla barra dei menu, quindi selezionare Tabella sequenza, Esegui. Selezionare la vista Analisi dati dal menu Visualizza. Individuate il nome del file di sequenza dall'elenco dei file sul lato sinistro dello schermo.Nel pannello centrale sullo schermo, vai a Signal View Selection, RID Signal per visualizzare i cromatogrammi campione. Selezionare una riga corrispondente a uno qualsiasi dei campioni dal pannello superiore sullo schermo. I picchi corrispondenti agli analiti bersaglio saranno disposti lungo l'asse del tempo di ritenzione come glucosio, succinato, lattato, formate, acetato ed etanolo in campioni in cui sono presenti tutti questi metaboliti.Discernere se i picchi di interesse sono ben integrati dal software. Una linea rossa dovrebbe essere disegnata automaticamente come base di ogni picco. Se la linea rossa è storta, l'integrazione automatica non è riuscita.Quindi selezionare il pulsante Integrazione manuale dal set di strumenti di integrazione e disegnare manualmente una base di picco per integrare l'area di picco. Selezionate lo strumento Cursore dal set di strumenti comune per fare clic sui picchi correttamente integrati. L'area del picco e il tempo di reazione corrispondente del picco selezionato verranno evidenziati come una riga di tabella sul pannello inferiore fuori dallo schermo.Per esportare le aree di picco, selezionare File, Esporta, Risultati integrazione. Tracciare i valori dell'area di picco rispetto alle concentrazioni note di campioni in un foglio di calcolo. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui dati tracciati, quindi scegliere Aggiungi linea di tendenza, Formato linea di tendenza, Visualizza equazione sul grafico.In un foglio di calcolo separato, utilizzare le equazioni delle linee di tendenza della curva standard per convertire i valori dell'area di picco in concentrazioni per ogni analita di ciascun campione. Calcola le aree di picco medie e i valori di errore standard su triplicati per la visualizzazione dei dati. Impostare reazioni triplicate per punto temporale, ad eccezione del tempo zero, sul ghiaccio come descritto nel manoscritto.Invece di glucosio, utilizzare una concentrazione finale di glucosio-13C6 100 millimolare nelle reazioni. Incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per una, due e tre ore. Per iniziare con l'analisi, pipettare un volume equivalente del solvente di estrazione a ciascun campione.Se i campioni sono stati congelati, aggiungere il solvente di estrazione prima che i campioni si scongelino completamente per impedire la riattivazione del metabolismo del glucosio. Eseguire tutte le fasi di elaborazione del campione sul ghiaccio. Per ricapitolare il tempo zero, pipettare il volume finale del solvente di estrazione a un volume appropriato di lizzato per la concentrazione finale desiderata di 4,5 milligrammi per millilitro in 50 microlitri di volume di reazione.Aggiungere il resto dei componenti di reazione come descritto in precedenza. Questa fase di acidificazione precipita gli enzimi del lsato prima che metabolizzano significativamente il glucosio. Incubare i campioni in solvente da estrazione su ghiaccio per 30 minuti con un delicato scuotimento.Quindi centrifugare i campioni a 21.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius per separare il surnatante dalla proteina precipitata. Trasferire 50 microlitri del surnatante alle fiale dell'autocampionatore e caricare le fiale sul vassoio entro l'autocampionatore a quattro gradi Celsius. Dopo aver preparato lo strumento per l'analisi, impostare una sequenza di esecuzione utilizzando il software di acquisizione e interpretazione dei dati del sistema LC-MS/MS.All'interno di Roadmap, Sequence Setup, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla tabella per inserire tante righe quanti esempi. Per ogni riga, impostare il volume di iniezione su cinque microlitri e la posizione sulla rispettiva posizione del flaconcino sul vassoio dell'autocampionatore. Immettere i nomi dei file come nomi di esempio e impostare il percorso di file desiderato per i risultati dell'esecuzione.Per avviare l'esecuzione, evidenziare tutti i nomi di file nella sequenza. Dalla barra dei menu, selezionare Azioni, Esegui sequenza. Apri MZmine e importa i file di output grezzi ottenuti in precedenza.Dalla barra dei menu, selezionare Metodi dati non elaborati, Importazione dati grezzi e selezionare i file corrispondenti agli esempi. Seguire i passaggi descritti nel manoscritto per completare l'analisi MZmine. Esporta le aree di picco grezze alla fine dell'analisi MZmine come file CSV.Apri un foglio di calcolo per calcolare le masse dei metaboliti etichettati con 13C dal metabolismo del glucosio per la ricerca mirata. Utilizzare le masse calcolate dei metaboliti etichettati con 13C per cercare e annotare le caratteristiche di massa a carica dai risultati di MZmine. Controllare manualmente gli spettri delle annotazioni putative su un browser di qualità per confermare le annotazioni.Apri Roadmap, Qual Browser. Dalla barra degli strumenti, apri il file raw per importare i dati MS grezzi di ciascun campione. Disegna una linea sotto l'intervallo desiderato di tempi di ritenzione corrispondenti all'annotazione putativa sul cromatogramma iono totale per visualizzare uno spettro di massa.Negli esperimenti HPLC-RID, il glucosio è stato consumato entro le prime tre ore dalla reazione e principalmente fermentato in lattato. Anche l'accumulo di etanolo si è verificato in modo significativo entro le prime tre ore dalla reazione e si è fermato successivamente. L'acetato era inizialmente presente nelle reazioni come componente del tampone S30 e si accumulava solo a causa del metabolismo dopo sei ore, quando il consumo di glucosio era rallentato.Il lattato e l'etanolo possono quindi essere considerati i principali prodotti finali di fermentazione nel metabolismo del glucosio a base di llitasi e senza cellule. È stato osservato che sia il formate che il succinato sono stati sintetizzati come prodotti di fermentazione minori. Il glucosio-13C6 è stato consumato in modo osservabile attraverso la glicolisi, come evidente dalle fluttuazioni degli intermedi glicolitici.Coerentemente con i dati di rilevamento dell'indice di rifrazione HPLC, il glucosio si è accumulato in lattato-13C3 ed è stato anche fermentato a succinato-13C3 entro le prime tre ore dalla reazione. È stata inoltre osservata l'incorporazione di carboni derivati dal glucosio-13C6 ai fosfati di zucchero 6-fosfogluconolattone, 6-fosfogluconato, ribulosio-5-fosfato e sedoeptosio-7-fosfato, confermando la partecipazione della via del pentoso fosfato al metabolismo del glucosio del lsato. Il metabolismo del glucosio del lisato è stato trovato per alimentare la sintesi di tirosina-13C9, fornendo anche un precursore per la produzione di istidina-13C5.È importante che i campioni di controllo rappresentino esattamente il tempo zero. Pertanto, assicurarsi che le proteine nel lisato siano inattivate prima della miscelazione nella soluzione contenente fonti energetiche. Garantire inoltre che anche l'integrazione automatica dei picchi da campioni di prova, campioni di controllo e standard sia coerente, in modo che le aree di picco estratte siano comparabili.

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