Name: liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems
Uploaded: 2021-09-23T14:45:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

この研究は、植物微生物インタフェース科学フォーカスエリア(http://pmi.ornl.gov)の一環として、米国エネルギー省科学生物環境研究局ゲノム科学プログラムが主催しました。オークリッジ国立研究所は、契約DE-AC05-00OR22725の下で米国エネルギー省のUT-Battelle、LLCによって管理されています。この原稿は、米国エネルギー省との契約DE-AC05-00OR22725の下でUT-Battelle, LLCによって作成されています。米国政府は、出版のための記事を受け入れることによって、出版社は、米国政府が米国政府の目的のために、この原稿の出版された形態を公開または複製したり、他の人に許可したりする非独占的、有料、取り消し不可能な、世界的なライセンスを保持していることを認めます。エネルギー省は、DOE公共アクセス計画(http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan に従って連邦政府主催の研究のこれらの結果への一般アクセスを提供します。

<ol>
	<li>Rollin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+hydrogen+production+from+biomass+by+in+vitro+metabolic+engineering:+Mixed+sugars+coutilization+and+kinetic+modeling.">High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).</li><li>Bowie, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biochemistry:+The+bio-inspired+cell-free+approach+to+commodity+chemical+production.">Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production.</a> Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).</li><li>Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+platform+for+cell+free+production+of+monoterpenes+from+glucose.">A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose.</a> Nature Communications. 8, 1-8 (2017).</li><li>Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosynthesis+of+limonene+using+enzyme-enriched+Escherichia+coli+lysates.">Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates.</a> Synthetic Biology. 4 (1), 003 (2019).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+potential+of+crude+cell+extracts+for+producing+pyruvate+from+glucose.">Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose.</a> Synthetic Biology. 3, (2018).</li><li>Kay, J. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysate+of+engineered+Escherichia+coli+supports+high-level+conversion+of+glucose+to+2,3-butanediol.">Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol.</a> Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).</li><li>Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+growth+medium+dropouts+promote+aromatic+compound+synthesis+in+crude+E.+coli+cell-free+systems.">Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysate+proteome+engineering+strategy+for+enhancing+cell-free+metabolite+production.">A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production.</a> Metabolic Engineering Communications. 12, 00162 (2021).</li><li>Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+pathway+prototyping.">Cell-free synthetic biology for pathway prototyping.</a> Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+cell-free+extract+reaction+(CFER)+system+in+Clostridium+thermocellum+to+identify+metabolic+limitations+to+ethanol+production.">Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production.</a> Frontiers in Energy Research. 8, 72 (2020).</li><li>Coskun, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Separation Tecniques: Chromatography. 3, (2016).</li><li>Bernardes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+acids+and+alcohols+quantification+by+HPLC/RID+in+sugarcane+vinasse:+analytical+method+validation+and+matrix+effect+assessment.">Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment.</a> International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computationally+guided+discovery+and+experimental+validation+of+indole-3-acetic+acid+synthesis+pathways.">Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways.</a> ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).</li><li>Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+control+of+cell-free+metabolism+through+pH+modulation.">Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation.</a> Synthetic Biology. 5, (2020).</li><li>Bujara, M., Sch&#252;mperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+cell-free+systems:+Implementation+and+debugging+of+a+system+of+biotransformations.">Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).</li><li>Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+identification+and+quantitation+in+LC-MS/MS-based+metabolomics.">Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics.</a> TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).</li><li>Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-liquid+chromatography.">Nano-liquid chromatography.</a> Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).</li><li>Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+mass+spectrometry-based+metabolomics:+Opportunities+and+challenges.">Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).</li><li>O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+CoA+metabolites+by+SAMDI-MS+to+optimize+the+cell-free+biosynthesis+of+HMG-CoA.">High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA.</a> Science Advances. 5, (2019).</li><li>Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unimod:+Protein+modifications+for+mass+spectrometry.">Unimod: Protein modifications for mass spectrometry.</a> Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).</li><li>Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+mixing+of+Escherichia+coli+crude+extracts+to+prototype+and+rationally+engineer+high-titer+mevalonate+synthesis.">Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).</li><li>Jaishankar, J., Srivastava, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+stationary+phase+survival+and+applications.">Molecular basis of stationary phase survival and applications.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2000 (2017).</li><li>Bartolomeo, M. P., Maisano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+for+quantitative+amino+acid+analysis.">Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).</li><li>Hauck, T., Landmann, C., Br&#252;hlmann, F., Schwab, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone+in+cytosolic+extracts+obtained+from+Zygosaccharomyces+rouxii.">Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).</li><li>Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsoSearch:+An+untargeted+and+unbiased+metabolite+and+lipid+isotopomer+tracing+strategy+from+HR-LC-MS/MS+datasets.">IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets.</a> Methods and Protocols. 3 (3), 54 (2020).</li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益やその他の利益相反は知られていないと宣言している。

概説されたHPLC-RIDアプローチは、糖基質の消費を定量化し、その後の主要な有機酸およびリセート中枢代謝のアルコール製品への変換を経時的に正常に定量するために使用することができます。さらに、このプロトコルは単一の移動相を用いた単純なアイソクラティック法を採用し、サンプル調製を最小限に抑え、簡単なターゲットダウンストリーム解析を可能にする。HPLC-RID法で測定された検体は、その保持時間と、よって選択されたカラム樹脂との相互作用によってのみ区別されます。ここで利用されるHPLCカラムは、特にサイズ排除とリガンド交換(すなわち、イオンモデレートされた分配クロマトグラフィー)を組み合わせることによって、炭水化物、有機酸、およびアルコールを分離するように設計された。したがって、記載された方法は、糖質基質のより標的分析に有用であり、主にライセートベースのバイオトランスフォーメーション8、15、21を促進し、通電することが期待されるグルコース発酵経路の末端産物を選択する。しかし、このプロトコルは、細胞抽出物中の他の代謝経路の活性化を考慮していない。他のクロマトグラフィー分離技術(すなわち、親水性相互作用クロマトグラフィー)、勾配溶出法、より複雑なサンプル調製(すなわち、誘導体化)、および異なる光学検出器(例えば、紫外線または蒸発光散乱検出器)を用いるパイプラインは、アミノ酸およびリン酸塩などの他の代謝物を検出するために使用することができる23,24, 24, .また、LC-MS/MSを用いて、ライセート代謝を研究するグローバルなアプローチを取ることができます。
記述されたLC-MS/MS法は、より広範な範囲の代謝産物を測定および同定するための単一のワークフローである。LC-MS/MS は、メタボロームプロファイリングの最新式の分析ツールであり、その感度と保持時間による代謝物と高解像度16の m/z 比を区別する能力を備えています。中枢炭素代謝経路とアミノ酸のアボレーションに焦点を当て、極性有機酸、リン酸糖、アミノ酸を特異的に検出するために、ネガティブモードMS/MSが実装されました。ナノ液体クロマトグラフィー技術と相まって、この方法は、複雑な溶解物の背景17における小分子を検出するための高感度を提供する。しかし、プロファイルリセートベースのCFME代謝の面では、記述されたLC-MS/MSプロトコルの制限は、エタノール、糖代謝の主要産物であるエタノールの測定を妨げる50m/zの低検出限界であり、また、詳細なHPLC-RID法によって容易に定量化される。LC-MS/MSと比較して、HPLC-RIDにはコストと難易度の点で相対的なアクセシビリティの付加的な利点があります。後者の点では、ここで説明する LC-MS/MS 法のトラブルシューティングには、質量分析に関するある程度の専門知識が必要になる場合があります。それにもかかわらず、MS検出は、メタボロムにおける標識同位体をさらに区別することができるので、RID上で独特に魅力的な用途を有し、複雑なリセート代謝ネットワーク18を介して補足された基質からの炭素移動を理解するための優れた技術である。このようなアプローチは 、13C6-グルコースで反応を補い、下流 の13C組み込み代謝産物の相対的な存在量値を分析することによって、ここで適用された。この分析により、活性経路と非アクティブな経路の定義が可能になり、以前に報告された仮定をサポートし、ライセート中の代謝フラックスに関する新しい洞察を提供しました。特定の解析の方法内で変更を行うこともできます。例えば 、13個のC標識対象化合物の標準的な溶液をサンプルと一緒に分析して、グルコース由来分子の時間の経過とともに絶対的な定量的測定を達成し、フラックス分布に関する結論を出すことができます。正のモード検出用に調整された .meth ファイルを使用してシーケンスを実行することで、正に帯電した化合物の検出を現在のワークフロー内で有効にすることもできます。
両方の方法での分析サンプリングは、容易に自動化され、高い再現性を保証します。また、適切な機器処理の実施やメンテナンスが守られ、スムーズな分析が期待できます。これらのツールを使用して CFME の反応を分析する場合は、サンプリングのアップストリームとダウンストリームに関するより重要な考慮事項を作成する必要があります。サンプルの準備中に、タイム コース コントロールがタイム ゼロを表す必要があります。ここで、タンパク質は、代謝反応を停止させる酸性化によってライセート中に沈殿した。タイムゼロサンプルの場合、グルコースを含む反応ミックスを添加する前に、酸溶媒を溶解物と組み合わせた。トリクロロ酢酸による酸性化は、HPLC-RIDデータに示すように、グルコースが時間ゼロで代謝されないことを効果的に保証した(図2)。報告されたLC-MS/MS分析ではグルコース代謝をクエンチする同様の手順が行われたが 、13のC標識代謝物は、後の時点で抽出されたサンプルに対して有意に低い存在量値ではあるが、タイムゼロサンプルで検出された。また、これらの観察は解糖の中間体に限られていた。このデータは、この高感度法で検出された抽出溶媒による酸性化後、反応がある程度の解糖活性を保持することを示唆している。ただし、このアクティビティの範囲は定量化する必要があります。以前の研究では、酸性抽出溶媒は中間解糖反応を十分にクエンチしないかもしれないが、有意なグルコース消費を止めることができると報告した10。これはここで使用されるシステムではさらに調査される予定ですが、タイムゼロ以降のタイムポイントサンプル間の相対的な豊富な値の急激な変化は、グルコース代謝の傾向として解釈することができます。しかし、同様の用途では、特に代謝中間体10の絶対量を得るために、代替的なクエンチング法を探索することが推奨される。さらに、下流のソフトウェア分析中の良い慣行も観察する必要があります。RID信号からピーク領域を手動で統合して人為的ミスを減らすには、一貫性が不可欠です。手動統合は、サンプル中の代謝産物の濃度を定量化するために手動で統合されたピーク領域が使用されている場合に、標準のピーク領域にも適用する必要があります。対象となる LC-MS/MS 分析では、MZmine 分析の仮注釈を MS 品質ブラウザを使用した手動ピーク チェックで検証し、計算された質量エラーが許容される場合にのみ m/z フィーチャに注釈を付ける必要があります。ここでは、同位体探索のための包括的かつ堅牢なソフトウェアがまだ確立されていないので、これらの分析は限られたターゲットのセットに対して手動で実行されました。しかし 、13C標識代謝産物を探索するためのこのような自動化された方法は、現在出現しており、中央炭素代謝25を超えてライセートをプロファイリングするような、より複雑な分析も合理化するだろう。
高度液体クロマトグラフィーは、複雑な代謝混合物11中で小分子を分離するための堅牢で広く適用される方法である。この分離手法と屈折率または質量分析検出を組み合わせて、リセートベースのCFME反応における代謝産物の変換を正常に分析します。HPLC-RIDおよびLC-MS/MSは、アクティブなライゼート代謝をプロファイリングするための個別に強力なツールであり、その相補性は、各技術の固有の限界に対処するためにさらに活用することができます。報告された方法は、それがリゼート代謝を理解し、ターゲット代謝物の変換の改善を監視し、そして、リセート代謝を操作するときの代謝産物の変化を解明するために利用することができるようにCFMEの適用および開発を可能にする。

化学生産のための工学微生物の限界は、競合する細胞生存機能が存在しないインビトロで生化学的反応を再現することによって対処することができる1。また、開放反応環境(すなわち、細胞膜の存在)は、操作に対してより適性であり、生細胞に比べて監視が容易である。この無細胞代謝工学(CFME)の基礎的概念は、これまで微生物細胞工場で提示された数桁の生産指標を用いて水素やモノテルペンのような貴重な化学物質を合成するための代謝経路の再構成によってエレガントに実証されています1,2,3.しかし、経路全体を浄化する方法は、現在時間とコストによって制約されています。あるいは、無細胞代謝系は、経路再構成4全体に対する迅速かつ安価な方法を通じて粗細胞抽出物から誘導することができる。細胞抽出物に保持される中央代謝は、エネルギー基質(例えば、グルコースおよび酵素的補因子)および塩を緩衝溶液中に補い、24時間5,6を超える中央代謝前駆体を生成する。外因性酵素をライゼベースのCFME反応に加えることは、グルコースをより複雑なバイオトランスフォーメーションで高力価4、6、7でより価値のある化学物質にすることを可能にする。これらの系では、細胞様代謝の複雑さのために降伏が損なわれる傾向があるが、より高い収率変換のためにライセートプロテオームをキュレーションする独自の方法が7,8に開発されている。
ライセートベースの無細胞システムで代謝変換を行う容易さは、細胞の外で化学製造を完全に移動させるか、または生体内でこれらの設計を構築してテストする前に、高スループットで新しい経路を試作するためのこれらの優れたプラットフォームを作ります2,9.どちらのアプリケーションでも、代謝変換をモニタリングしたり、リセート中の代謝フラックスの全体的な変化を観察するためのツールは、CFMEの進歩に不可欠です。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、CFME反応の化学成分を高解像度で分離するために使用することができ、代謝産物定量化用の光学または質量分析検出器に結合することができます5,10.HPLCの根底にある原理は、検体が溶媒に溶解し(すなわち、移動相)カラムを通してポンプで送り込まれ、特定のカラムパッキング材料(すなわち、定常相)11と相互作用するということである。これらの分析物は、その化学的性質に応じて、最終的に静止相から溶出し、移動相によって検出器に運ばれる前に、様々な保持時間を示す。このレポートでは、RIDおよびMS/MS検出を利用したHPLCベースの方法による大腸菌系CFME反応の調製と分析について詳しく説明します。
HPLC結合して屈折率検出(HPLC-RID)は、中枢代謝前駆体および末端産物を迅速に同定するための一般にアクセス可能な方法である。簡単に言えば、RID は、移動相12によって光のたわみを検数がどのように変化するかを測定します。サンプル中の標的分析物に対応するRID信号は、標準ソリューションのRID信号との比較により定量化できます。CFMEアプリケーションにおいて、この検出モードは、サイズ排除とリガンド交換機構、またはイオンモデレートパーティションクロマトグラフィー5、6、8、13の組み合わせに基づいて化合物を分離するHPLCカラムで最も一般的に使用されてきた。この特定の技術は、グルコースのような糖基質の消費を迅速に定量化するとともに、コハク酸、乳酸、formate、酢酸、およびエタノールなどの発酵産物の形成を、リセートベースのCFME反応8に含む。HPLCを介してこれらの化合物の濃度変化を記録することは、粗細胞抽出物が中央代謝前駆体をプールする可能性を解明し、ライセート6,8,14におけるグルコースからの複雑な代謝変換中に発酵経路を介して経路フラックスがどのようにリダイレクトされるかを理解するのに有用であった。大腸菌細胞抽出物におけるセミナルCFME研究は、発酵化合物がグルコース異化の終わりの産物として蓄積し、また外因性酵素6,15を過剰発現するライセート中の望ましくない副産物として生じることを確認した。発酵代謝は、糖分解反応を持続させるコファクター(すなわちNAD(P)HおよびATP)のレドックス等価物を再生する上で必要な役割を果たしていることを示唆している。そのため、発酵製品を分離するように設計されたHPLCベースの光学検出方法は、さまざまなライセートベースのCFMEタスクを実行する際に有用で一般的に適用されるツールです。
CFMEは、炭水化物、有機酸、またはアルコールではない代謝エンド製品を蓄積するために実装することができます4.合成されるのと同じくらい速く消費される中間体の測定も望ましい10であってもよい。HPLC-RIDはコストと難易度の面でアクセス可能ですが、この方法は保持時間に基づいて代謝産物のみを区別する能力によって制約されます。液体クロマトグラフィーが MS/MS 検出 (LC-MS/MS)16に結合されている場合、より広範な代謝産物を分析できます。この方法により、移動相中の分析物は、各分子の質量と電荷特性に基づいてイオン化され、微分検出される。このように、カラム上の代謝産物の質量電荷(m/z)比および保持時間の両方に関する知識は、ほとんどの代謝中間体と高分解能16の終末産物の分離を容易にする。この検出技術は、ナノ液体クロマトグラフィーに結合することもできるが、これは、はるかに低い流量およびサンプル注入量を与え、複雑な溶解物の背景17における小分子のより敏感な検出を可能にする。LC-MS/MS は、組み込まれたラベルが、検体の m/z 値18に変化を与えるので、同位体のラベリングで加えることができます。13C6-グルコース基質を補ったCFME反応から抽出されたタイムポイント測定は、このようにして、補充されたグルコースから特異的に誘導される末端または副産物を決定することができる。この同位体トレーシング法はCFME研究ではまだ一般的には適用されていないが、これらの反応における塩対イオン(すなわち、酢酸塩およびグルタミン酸)が二次基質としても代謝されるため、特にリセートベースのCFME系における代謝変換を理解するための強力なツールである。この技術を活用すると、ライセートの糖代謝の包括的な画像を描くことができますが、これは完全には理解されていません。ここで、プロトコルは、グルコース代謝の可能性のあるモデル、特に大腸菌溶解物に関して問い合わせるに使用できるナノエレクトロスプレーイオン化(ナノESI)MS/MSに結合したナノ液体クロマトグラフィーの方法を詳述する(図1)。このモデルは、発酵経路およびペントースリン酸経路が、リッチメディア5、6、8、14で増殖した株に由来する大腸菌リセートで活性であるという報告に基づいている。この技術は、糖類中のグルコースからのアミノ酸同化に関する現在の知識が芳香族アミノ酸の合成例として数例に限定されているためアミノ酸の産生を調べるのに加えて使用される。これらの経路における末端産物および中間体(すなわち、有機酸、リン酸糖、およびアミノ酸)の主に極性の性質を考えると、逆相液体クロマトグラフィーがここで利用された。この技術は、非極定常相からの溶出によって極性化合物を分離する。これらの化合物は、少なくとも1つの負の初代電荷で検体の検出を可能にする陰イオンモードでナノESIによってイオン化され、酸性化合物の検出に有用である。この技術は、糖由来の13C組み込み代謝産物を分析するためにここで使用され、ライセートにおける糖代謝を理解するためのLC-MS/MSの有用性を示す。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m centrifuge tube filters (spin columns)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Binary LC Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1312B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity High Performance Degasser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4225A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Refractive Index Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7162A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Standard Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1329B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374</td>
			<td>CFME reaction mix component (LC-MS/MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.20 &#956;m pore (PES membrane) filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminex HPX 87-H column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1250140</td>
			<td>Chromatography column for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1376</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vial caps (yellow, snap)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-50Y</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W225181</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-dextrose (Glucose)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9230</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8281</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC/MS grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica (internal diameter of 100 &#956;m, external diameter of 375 &#956;m)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>WM22005-ND</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetex 5 &#956;m C18 stationary phase (100 &#197;)</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0632</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanospray Ionization Source</td>
			<td>ThermoFisher Scientific/Proxeon</td>
			<td>ES071 (newest model)</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenLab CDS (Online) Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 2.15.26</td>
			<td>Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 2.7</td>
			<td>Software for tuning the LC-MS/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps (with septa, 9 mm)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29315-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwthread glass vials (2 mL)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29376-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>247596</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71716</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>398055</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>Solvent preparation for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-acetate</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-090-100</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Solvent Rack: SRD-3600</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6500</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 3.0.63</td>
			<td>Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems

標的生合成のための細胞代謝工学は、エンジニアが細胞の生存要件を回避する際に、広範な設計構築-テスト学習(DBTL)サイクルを必要とする可能性があります。あるいは、セルフリー環境で DBTL サイクルを実行することで、このプロセスを加速し、ホストの互換性に関する懸念を軽減できます。無細胞代謝工学(CFME)への有望なアプローチは、代謝活性粗細胞抽出物をバイオマニュファクチャリングのプラットフォームとして、また、変化したタンパク質や経路を迅速に発見し、プロトタイピングするためのプラットフォームとして活用します。これらの機能を実現し、CFMEのパフォーマンスを最適化するには、lysateベースの無細胞プラットフォームのメタロームを特徴付ける方法が必要です。すなわち、分析ツールは、ターゲット代謝物の変換の改善を監視し、リセート代謝を操作する際の代謝物束への変化を解明するために必要です。ここでは、光学または質量分析の検出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いた代謝産物分析を適用し、 大腸菌 S30溶解物における代謝産物の産生およびフラックスを特徴付けるために適用した。具体的には、低コストの基質(すなわち、グルコース)から様々な高価値産物への転換における中枢代謝中間体および副産物の生成を定量化するために、屈折率検出(RID)を用いたHPLC分析用のCFMEライセートからのサンプルの調製について説明する。また、特定の代謝産物収量を特徴付け、原料からのリゼート代謝フラックスを特徴付ける強力なツールである逆相液体クロマトグラフィーを介して 13C標識されたグルコースを供給したCFME反応における代謝物変換の解析も提示される。全体として、これらの分析方法をCFMEライセート代謝に適用することで、これらのシステムをより速くまたは新規の代謝工学タスクを実行するための代替プラットフォームとしての進歩が可能になります。

グルコースからの一般的な発酵産物のライセートベースの無細胞合成を定量化するために、2xYPTG培地で増殖した株に由来するライセートを、一次炭素源8として100μMグルコースを供給した。反応は、タンパク質酸性化により24時間経過で停止した。ピルビン酸、コハク酸、乳酸塩、糖、酢酸、およびグルコース異化から生成されたエタノールを含む濾過された上清を、RIDモジュールを搭載したHPLCシステムのオートサンプラーモジュールに積載した。1.17 μM、2.34 μM、4.69 μM、9.38 μM、18.75 μM、37.50 μM、75 μM、および150 μM濃度の発酵製品とグルコースの濾過混合物を含むバイアルを、標準として機器にロードしました。検体は、HPLCカラムからRIDにイソクラシーに溶出した。1~150μMの範囲内のグルコース、コハク酸、乳酸塩、シマ質、酢酸、エタノールのピークは、RIDによって解決できます。グルコースのピーク領域は、時間経過および標準曲線サンプルのRIDデータから手動積分することによって導出された。コハク酸塩、乳酸塩、formate、酢酸、エタノールの抽出ピーク領域を、自動的に集積したシグナルから採取した。すべての標準曲線(ピーク面積対既知の濃度)はR2 値>0.99を持ち、ここで使用される濃度の範囲全体にわたって線形であった。
すべての標的検体に対するモル濃度は、それぞれの標準曲線から計算した。グルコースは、反応の最初の3時間以内に消費され、主に乳酸に発酵させた(図2A、B)。エタノールの蓄積もまた、反応の最初の3時間以内に顕著に起こり、その後停止した(図2C)。3時間後に有意なグルコース消費を伴う有意な乳酸塩およびエタノール生産の観察は、乳酸塩およびエタノール生産経路が、糖分解による継続的なグルコース消費に必要な1ネットモルNAD+の分解を可能にするので前例がない(図1)。乳酸およびエタノールは、このように、ライセート系無細胞性グルコース代謝における主要な発酵の終末生成物と考えることができる。酢酸塩は、当初、S30バッファーの成分として反応中に存在し、予想外にグルコース消費量が減速した6時間後の代謝のために蓄積された(図2D)。この結果から、酢酸発酵は、早期の時点で迅速な解糖流を必ずしも可能にするわけではないことが示唆された。一方、コハク酸との間に、小さな発酵製品として合成した(図2E、F)。全体として、この方法は、大腸菌S30糖における糖基質枯渇および発酵生成物の絶対定量化を可能にした。
MS検出は、具体的に糖代謝を促進する糖代謝をプロファイルするために、ここで適用した。2xYPTG培地で増殖した株に由来するリセートは、炭素源として13C6-グルコースを供給した。 CFME反応は、0時間、1時間、2時間、および3時間の三重で実行した。各タイムポイントからのサンプルは、逆相カラムを装備したLCシステムにロードされ、フーリエ変換およびイオントラップ質量分析計に結合されました。負イオンモードスペクトルを取得し、有機酸、リン酸糖、アミノ酸を分析するために処理しました。計算された、中央炭素代謝に属する13種のC標識種の計算された理論塊を探索し、具体的にグルコース由来化合物を同定した。大腸菌CFMEにおける活性経路の利用されたソース株培養条件および以前の報告に基づいて、このライセートプロテオームは、グルコースを解糖発酵に供給する代謝ネットワーク、ペントースリン酸経路、およびおそらくアミノ酸解離性5、6、7、8、14(図1)を含むと仮定する。したがって、これらの経路のメンバーに絞り込んだ検索は、グルコース由来の13Cラベルを組み込んだ16個の代謝産物が明確にアポイントニングされた(補足表1)。
13C6-グルコースは、解糖性中量の変動によって証明されるように、解糖分解を通じて観察的に消費された(図3A-E)。HPLC-RIDデータと一致して、グルコースは13C3-乳酸に蓄積し、また、反応の最初の3時間以内に13C3-コハク酸塩に発酵させた(図4A、B)。13C3-コハク酸イソトポログの形成は、2-炭素アセチルCoA分子のTCAサイクルへの侵入ではなく、3-炭素ホスホエノールピルビン酸(PEP)分子のカルボキシル化によってコハク酸が生成される可能性が高い、糖代謝の提案されたモデルを支持する(図 1) 。TCAサイクルの活性化は以前のCFME研究では想定されていたが、TCAの他の13C標識中間体はここでは検出されなかった8,19,21。13しかし、C3-アスパラギン酸合成は、最初のh内で起こり、消費され、PEPが直接オキサセテートに変換されるという考えを補強した(図1、図6C)。データは、グルコースリッチ培地(2xYPTG)上で発酵成長中に収穫されたソース株からのリゼートプロテオームを反映しています。これは、コハク酸産生に関与していないTCA酵素の残りの部分が酸化的TCA分岐を形成することをさらに示唆するであろう(図1)。しかし、この経路中の代謝産物はいずれも検出されなかったが、おそらく高濃度のグルタミン酸が塩対イオンとしてCFME反応に添加されたため、この枝の進行を妨げる。 
HPLC-RIDデータは、3h反応期間内の13C2-アセテート検出の欠如によってさらに補完され、グルコースから3hまでの酢酸の蓄積がないことを示唆している(図2B)。しかし、酢酸の直接前駆体は、アセチルリン酸(アセチル-P)が蓄積し、アセチルCoAから酢酸合成のためのPta-AckA経路のPtaアームが活性であることを示唆している(図4C、D)。AckA触媒13C2-アセチル-P〜13C-2-アセテートの触媒は、アセテートが反応に使用されるS30バッファーの主要成分であるため、この期間内に発生しない可能性が高い(図1、図2B)。
13C6-グルコース由来炭素を糖リン酸塩6-ホスホグルコノラクトン(6PGL)、6-ホスホグルコナトナート(6PG)、リプロス-5リン酸(Ru5P)、セドエプツロース-7-リン酸(S7P)に取り込むことも観察された(図5)。これらの結果は、タンパク質研究によって以前に示唆された13C9-チロシン合成を供給する可能性のある13C9-チロシン合成におけるペントースリン酸経路の関与を確認し、同時に13C5-ヒスチジン産生の前駆体を提供する(図6A、B)7。ここではフェニルアラニンとトリプトファンの標識は認められず、必須アミノ酸のほとんども認められなかった。しかし、アミノ酸の同化作用は、栄養不足の条件下で、または定常期7、22で増殖した細胞に由来するリセートに富む可能性が高いため、これは全く驚くべきことではない。さらに、これまでのデータは、グリコ分解と発酵の中間体が、グリセアルデヒド-3リン酸、ピルビン酸、アセチルCoA(すなわち、グリシン、システイン、セリン、アラニン、バリン、レイン、レイン)に由来する多くのアミノ酸の合成を妨げなければならない補因子再生反応に向けて漏斗されていることを示唆している。前述のように、13C3-アスパラギン酸は最初の1時間以内に産生されたが、アスパラギン酸由来の13C組み込みアミノ酸(すなわち、スレオニン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン)は、グルコース由来アスパラギンが発酵に関与するため、おそらく観察されなかった(図1、図6C)。最後に、標識されたグルタミン酸およびグルタミン酸由来のアミノ酸に向かうフラックスは、反応環境において高レベルのグルタミン酸によって妨げられている可能性がある(図1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig01.jpg"> 図1:高グルコース濃度で指数関数的に成長する 大腸菌 BL21DE3-スターに由来するリゼートの推定代謝モデル。 解糖(緑色)の中間体および末端産物、ペントースリン酸経路(ダークオレンジ)、およびアセチルCoAからの発酵経路(青)が、リセートベースCFMEで報告されている。コハク酸発酵の存在は、酸化TCA枝(灰色)の活性化を意味する。リセート中のアミノ酸のアボシズム(金)は明確に定義されておらず、ここで調査されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig02.jpg"> 図2:大腸菌粗抽出物を用いて調製したCFME反応におけるグルコース消費量及び発酵終製品合成に関するHPLC-RIDデータ(A)グルコース消費量及び(B)乳酸塩、(C)エタノール、(D)酢酸、(E)formate、および(F)CFME反応におけるコハク酸産生を24時間にわたってモニタリングした。標準曲線で定量化された平均mM濃度と誤差範囲(SE)が提示されます(n = 3)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig03.jpg"> 図3:大腸菌のCFMEにおける13C6-グルコースおよび13C標識糖分解中間体の経時推移(A) 13C6-グルコース、 (B) 13C6-グルコース-6-リン酸/フルクトース-6-リン酸、 (C ) 13C6-フルクトース-1,6-ビスリン酸塩、 (D) 13C3-グリセアルデヒド-3-リン酸/ジヒドロキシアセトリン酸、および(E)13C63 63 -ピルビン酸は3時間を超えるCFME反応で行う。mzMINEソフトウェアによって抽出された生のピーク領域は、正の注釈(n =3)の平均および誤差範囲(SE)を計算するために使用された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig04.jpg"> 図4:大腸菌のCFMEにおける13C6-グルコース発酵における中間体および末端生成物の経時推移(A) 13C3-乳酸の相対存在量, (B) 13C3-コハク酸塩,(C) 13C2-アセチルリン酸塩, および(D) 13C2-アセチルCoAのCFME反応で 3時間を超える.mzMINEソフトウェアによって抽出された生のピーク領域は、正の注釈(n =3)の平均および誤差範囲(SE)を計算するために使用された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig05.jpg"> 図5:大腸菌のリン酸経路中間体である13C6-グルコース由来のリン酸経路の経時傾向CFME.相対存在量(A) 13C6-6-ホスホグルコノラクトン,(B) 13C6-6-ホスホグルコン酸塩,(C) 13C5-リブロース-5-リン酸塩, および (D) 13C7-セドエプトゥロース-7-リン酸塩 3 h.mzMINEソフトウェアによって抽出された生のピーク領域は、正の注釈(n =3)の平均および誤差範囲(SE)を計算するために使用された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig06.jpg"> 図6:大腸菌の糖由来アミノ酸を検出した13C6-グルコースCFMEの経時傾向(A) 13C9-チロシンの相対存在量, (B) 13C5-ヒスチジン, 及び (C) 13C3-アスパラギンテ 3 h.mzMINEソフトウェアによって抽出された生のピーク領域は、正の注釈(n =3)の平均および誤差範囲(SE)を計算するために使用された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:代表的なHPLC-RIDクロマトグラムは、37°Cで24時間インキュベートしたCFME反応における主要発酵生成物のピークを示す。グルコース、コハク酸塩、乳酸塩、formate、酢酸、およびエタノールピークは、5 mM硫酸溶媒によるアイソクラティック溶出時のHPLCカラム上での保持時間によって十分に区別可能である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-Suppfig1.eps" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:13C標識代謝産物、具体的には(A)乳酸、(B)グルコース、および(C)37°CでインキュベートされたCFME反応中の(6PG)の代表的な質量スペクトルを1時間ダウンロード <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-SuppFig2.eps" target="_blank">してください。</a>
補足表1: 検出された 13個のC標識代謝産物のリスト、保持時間(MZmineを使用したサンプル間で整列)、理論上 の完全13Cラベルの負モードm/Z値、検出された特徴のm/Z値、および計算された質量誤差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/Supplemental%20Table%201.docx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

プロトコルは、複雑な溶解物ベースの無細胞系における代謝反応を研究するための屈折率または質量分析検出に結合された高速液体クロマトグラフィー法を記述する。

リセートベースの無細胞システムにおける代謝物プロファイリングのためのリキッドクロマトグラフィー結合と屈折率または質量分析法検出

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

このプロトコルは、屈折率検出を使用して、一般的にライセートベースの無細胞系に蓄積される炭素代謝の副産物を測定します。また、質量分析を利用して、代謝的に活性なライセートで生成される中央代謝産物のより広範なパネルを検出します。このプロトコルで使用される2つの技術は、リセートベースの無細胞系で起こる化学反応を定量的に記述する能力を提供し、複雑なライセートバックグラウンドで低濃度に存在するものを含む、より広い範囲の代謝産物を検出することを可能にする。この手順のデモンストレーションは、ハイメ・ロレンツォ・ディングラサンとデビッド・リーブス(バイオサイエンス部門の大学院研究員)です。1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブで異なる成分を組み合わせて、全糖タンパク質のミリリットル当たり4.5ミリグラムで最終的な反応を調製し始めます。無細胞代謝工学、またはCFME、時間のポイントあたりの三重で50マイクロリットルの最終量との反応を準備します。各サンプルの最終反応量に5%トリクロロ酢酸等量を加えて、適切な時点で三重反応を直ちに終了します。次に、各反応混合物に滅菌水の2倍の体積を加えて各サンプルを希釈する。時間ゼロを再現するには、反応成分の残りを添加する前に、リセートとの総最終反応量と同じ5%トリクロロ酢酸の体積を混合します。この酸性化工程は、糖を著しく代謝する前に、ライセート酵素を沈殿させる。ベンチトップのマイクロ遠心分離機上のサンプルと遠心分離機を11、600回gで5分間ボルテックスし、有機検体を含む上清を清浄なチューブに移した。HPLC分析を後で行う場合は、サンプルをマイナス20°Cで保存します。次のステップに進む前に、氷の上に保存されたサンプルを解凍することを確認してください。0.22マイクロメートルの細孔フィルターで各上清をフィルター処理します。遠心分離機の後、各濾液をきれいなHPLCガラスバイアルに移します。すでに分析用に設定されているHPLCシステムのオートサンプラートレイにバイアルをロードします。メニューバーから、シーケンス、新規シーケンステンプレートを選択します。[シーケンス] を選択します。シーケンステンプレートをシーケンステンプレート名 S.Select シーケンス、シーケンステーブルとして保存します。N バイラルに対応する N 行を追加します。次に、オートサンプラートレイ上の配置に従って、バイアルとサンプル名の下にバイアルの位置とサンプル名を入力します。[メソッド名]ドロップダウンメニューから原稿に記載されている方法を選択し、各行にバイアル当たり注入として50マイクロリットルを入力します。[適用]をクリックし、[シーケンス]、[シーケンステンプレートの保存]の順に選択して、シーケンステンプレートを保存します。シーケンス、ロードシーケンステンプレート、シーケンステンプレート名S.オンラインプロットで安定したベースラインを達成した後、パネルのRIDモジュール、制御、オフリサイクルバルブを右クリックして、RID検出器を通して溶媒の流れを廃棄物に導くことによって、シーケンステンプレートがロードされていることを確認してください。データ取得を開始するには、メニュー バーから [シーケンス] を選択し、[シーケンス テーブル、実行] を選択します。[表示] メニューから [データ分析ビュー] を選択します。画面左側のファイルリストからシーケンスファイル名を見つけます。画面の中央パネルで、信号ビュー選択、RID信号に移動してサンプルクロマトグラムを表示します。画面上の上部パネルから、サンプルのいずれかに対応する行を選択します。標的検体に対応するピークは、これらの代謝産物がすべて存在するサンプルにおいて、グルコース、コハク酸、乳酸塩、定酸、酢酸塩、およびエタノールとして保持時間軸に沿って配置される。対象となるピークがソフトウェアによって十分に統合されているかどうかを確認します。赤い線は、各ピークのベースとして自動的に描画されます。赤い線が斜めの場合、自動統合は失敗しました。次に、統合ツールセットから手動統合ボタンを選択し、ピークベースを手動で描画してピーク領域を統合します。共通ツールセットからカーソルツールを選択して、適切に統合されたピークをクリックします。選択したピークのピーク領域と対応する反応時間は、画面の下パネルに表の行として強調表示されます。ピークエリアをエクスポートするには、[ファイル]、[エクスポート]、[統合結果]の順に選択します。スプレッドシート内のサンプルの既知の濃度に対して、ピークエリア値をプロットします。プロットされたデータを右クリックし、[近似曲線の追加]、[近似曲線の書式設定]、[グラフに数式を表示] を選択します。別のスプレッドシートで、標準曲線トレンドラインの方程式を使用して、各サンプルから各分析対象のピーク領域値を濃度に変換します。データビジュアライゼーションの三数にまたがる平均ピークエリアと標準誤差値を計算します。原稿に記載されているように氷の上に、タイムゼロを除く、時間ポイントごとに三重反応を設定します。グルコースの代わりに、反応に100ミリモルグルコース-13C6の最終濃度を使用する。1時間、2度、3時間、摂氏37度で反応をインキュベートします。分析を開始するために、各サンプルに抽出溶媒の同等の体積をピペットする。サンプルを凍結した場合は、サンプルが完全に解凍する前に抽出溶媒を添加して、グルコース代謝の再活性化を防ぎます。氷上ですべてのサンプル処理手順を実行します。時間ゼロを再現するには、抽出溶媒の最終体積を適切な量の溶解物にピペットし、50マイクロリットルの反応体積で1ミリリットル当たり4.5ミリグラムの所望の最終濃度を得る。前述のように残りの反応成分を加えます。この酸性化工程は、糖を著しく代謝する前に、ライセート酵素を沈殿させる。氷上の抽出溶媒にサンプルを穏やかな揺れで30分間インキュベートします。次いで、サンプルを摂氏4度で15分間21,000倍のgで遠心分離し、沈殿したタンパク質から上清を分離する。50マイクロリットルの上清をオートサンプラーバイアルに移し、バイアルを4°Cオートサンプラー内のトレイに積み込みます。計測器の分析準備を終えたら、LC-MS/MSシステムのデータ取得および解釈ソフトウェアを使用して、実行シーケンスを設定します。ロードマップの[シーケンス設定]で、テーブルを右クリックしてサンプルと同じ数の行を挿入します。各行に対して、射出量を5マイクロリットルに、位置をオートサンプラートレイ上のバイアルのそれぞれの位置に設定します。サンプル名としてファイル名を入力し、実行結果に必要なファイル パスを設定します。実行を開始するには、シーケンス内のすべてのファイル名を強調表示します。メニュー バーから、[アクション]、[シーケンスの実行] の順に選択します。MZmine を開き、前に取得した生の出力ファイルをインポートします。メニューバーから「生データ方式」「生データの読み込み」を選択し、サンプルに対応するファイルを選択します。原稿に記載されている手順に従って、MZmine 分析を完了します。MZmine 分析の最後に生のピーク領域を CSV ファイルとしてエクスポートします。スプレッドシートを開いて、対象検索のグルコース代謝から 13C 標識代謝物の質量を計算します。MZmine 結果から質量電荷フィーチャーを検索してアサインするには、計算された 13C ラベルの代謝物の質量を使用します。品質ブラウザで、注釈のスペクトルを手動で確認し、注釈を確認します。ロードマップ、クアルブラウザを開きます。ツールバーから、生のファイルを開いて、各サンプルの生の MS データをインポートします。質量スペクトルを表示するには、合計イオンクロマトグラムの推定注釈に対応する保持時間の所望の範囲の下に線を引きます。HPLC-RID実験では、グルコースを反応の最初の3時間以内に消費し、主に乳酸に発酵させた。エタノールの蓄積も、反応の最初の3時間以内に顕著に発生し、その後停止した。酢酸塩は、最初はS30バッファーの成分として反応中に存在し、グルコース消費量が減速した6時間後に代謝のために蓄積された。乳酸およびエタノールは、このように、ライセートベースの細胞を含まないグルコース代謝における主要な発酵の終末生成物と考えることができる。また、コハク酸との両方をマイナー発酵生成物として合成することが観察された。グルコース-13C6は、解糖性中間体の変動によって明らかなように、解糖分解を通じて観察的に消費された。HPLC屈折率検出データと一致して、グルコースは乳酸-13C3に蓄積し、また、反応の最初の3時間以内にコハク酸-13C3に発酵させた。グルコース-13C6由来炭素を6-ホスホグルコノラクトン、6-ホスホグルコノラクトン、6-ホスホグルコナート、リブロース-5-リン酸、セドオエプツロース-7-リン酸に組み込むことも観察され、リセートグルコース代謝におけるペントースリン酸経路の関与を確認した。ライセートグルコース代謝はチロシン-13C9合成を供給し、ヒスチジン-13C5産生の前駆体も提供することが判明した。コントロール サンプルがタイム ゼロを正確に表していることは重要です。したがって、溶解物中のタンパク質がエネルギー源を含む溶液中で混合する前に不活性化されることを確認してください。また、試験サンプル、制御サンプル、標準からのピークの自動統合も一貫しており、抽出されたピーク領域が同等になるようにします。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS対応の非侵襲メタボリック·プロファイリング

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

A Coupled Experiment-finite Element Modeling Methodology for Assessing High Strain Rate Mechanical Response of Soft Biomaterials

ソフトバイオマテリアルの高ひずみ速度機械的応答を評価するための結合実験、有限要素モデリング手法

This study offers a combined experimental and finite element (FE) simulation approach for examining the mechanical behavior of soft biomaterials (e.g. ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

無細胞生物学のための密封可能なフェムトリットル商工配列

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

3D空間の細胞培養のための細胞骨格などの生体適合性液晶エラストマー発泡体の合成

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

大腸菌の伝染性のバクテリオファージの合成による無細胞発現系

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

キャピラリー配列で複数の核酸の視覚的検出

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

長期無細胞遺伝子発現の伝導のための多層マイクロ流体プラットフォーム

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

光音響フローサイトメトリーを用いた卵巣癌検出

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

癌細胞培養から採取した培地における液体クロマトグラフィー-質量分析法による選択キヌレニンの同時定量化

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...