Name: liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems
Uploaded: 2021-09-23T14:45:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

이 연구는 유전체 과학 프로그램, 미국 에너지부, 과학, 생물학 및 환경 연구실이 식물 미생물 인터페이스 과학 초점 영역 (http://pmi.ornl.gov)의 일환으로 후원했습니다. 오크 리지 국립 연구소는 UT-Battelle에 의해 관리됩니다, LLC, 계약에 따라 미국 에너지부에 대한 DE-AC05-00OR22725. 이 원고는 미국 에너지부와 계약 DE-AC05-00OR22725에 따라 UT-Battelle, LLC에 의해 작성되었습니다. 미국 정부는 출판 기사를 수락함으로써 미국 정부가 이 원고의 출판 양식을 게시하거나 재현하거나 다른 사람이 미국 정부의 목적을 위해 그렇게 할 수 있도록 독점, 지불, 돌이킬 수없는 전 세계 라이센스를 보유하고 있음을 인정합니다. 에너지부는 DOE 공공 접근 계획 (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan)에 따라 연방 정부가 후원하는 연구의 이러한 결과에 대한 대중의 접근을 제공 할 것입니다.

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저자는 그들이 경쟁 금융 이익이나 이해 관계의 다른 충돌이 알려져 있지 않다고 선언합니다.

설명된 HPLC-RID 접근법은 시간이 지남에 따라 주요 유기산 및 알코올 제품으로 설탕 기판 소비량과 후속 변환을 성공적으로 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 단일 모바일 단계를 사용하여 간단한 동면 방법을 채택하고 최소한의 샘플 준비가 필요하며 간단한 표적 다운스트림 분석을 허용합니다. HPLC-RID 방법으로 측정된 Aalytes는 보존 시간, 따라서 선택한 컬럼 수지와의 상호 작용에 의해서만 구별됩니다. 여기에서 이용된 HPLC 컬럼은 크기 배제 및 리간드 교환(즉, 이온 중재된 분할 크로마토그래피)을 결합하여 탄수화물, 유기산 및 알코올을 분리하도록 특별히 설계되었습니다. 따라서, 상기 상기 방법은, 탄수화물 기판의 보다 표적화된 분석에 유용하고, 포도당 발효 경로의 선택 단산물은 주로 용이성 기반 바이오변환8,15,21을용이하게 하고 활력을 불어넣을 것으로 예상된다. 그러나, 이 프로토콜세포 추출물에서 다른 신진 대사 경로의 활성화에 대 한 계정 되지 않습니다. 다른 크로마토그래피 분리 기술(즉, 수성 성작용 크로마토그래피), 그라데이션 용출 방법, 더 복잡한 시료 제제(즉, 파생), 및 다른 광학 검출기(예: 자외선 또는 증발광 산란 검출기)를 사용하는 파이프라인은 아미노산 및 가산염 과같은 다른 대사산물을 검출하는 데 사용될 수있다. . 또는 LC-MS/MS를 사용하여 용해 대사를 연구하는 글로벌 접근 방식을 취할 수 있습니다.
설명된 LC-MS/MS 방법은 광범위한 대사산물을 측정하고 식별하기 위한 단일 워크플로우입니다. LC-MS/MS는 고해상도16을가진 유지 시간 및 m/z 비율로 대사 산물을 구별하는 민감도 및 능력 때문에 메타볼로메 프로파일링을 위한 최첨단 분석 도구이다. 중앙 탄소 대사 경로 와 아미노산 분석에 초점을 맞추고, 음성 모드 MS/MS는 특히 극성 유기산, 설탕 인산염 및 아미노산을 검출하기 위해 구현되었다. 나노 액체 크로마토그래피 기술과 결합된 이 방법은 복잡한 용해배경(17)에서소분자를 검출하는 데 높은 민감도를 제공한다. 그러나, 설명된 LC-MS/MS 프로토콜의 제한은 50m/z의 검출 한계이며, 이는 포도당 대사의 주요 제품인 에탄올의 측정을 배제하고, 상세한 HPLC-RID 방법에 의해 쉽게 정량화되는 상근제입니다. LC-MS/MS에 비해 HPLC-RID는 비용과 난이도 면에서 상대적 접근성의 추가적인 이점을 가지고 있습니다. 후자의 관점에서, 여기에 설명된 LC-MS/MS 방법을 트러블슈팅하려면 질량 분석에 대한 어느 정도의 전문지식이 필요할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 MS 검출은 복잡한 용액 대사망(18)을통해 보충기판에서 탄소 이동을 이해하는 훌륭한 기술인 메타볼로메에서 표기된 동위원소를 추가로 구별할 수 있기 때문에 RID에 비해 유일하게 매력적인 응용 분야입니다. 이러한 접근법은 13 C 6-포도당으로반응을 보완하고 다운스트림 13C 통합 대사 산물의 상대적 풍부 값을 분석하여 여기에 적용되었다. 분석은 액티브하고 비활성 통로의 정의를 허용하고, 이전에 보고된 가정을 지원하고 lysates에 있는 신진 대사 플럭스에 관하여 새로운 통찰력을 제공했습니다. 특정 분석을 위해 메서드 내에서 수정할 수도 있습니다. 예를 들어, 13C표지 표적 화합물의 표준 용액은 시간이 지남에 따라 포도당 유래 분자의 절대 정량적 측정을 달성하고 플럭스 분포에 대한 결론을 내리기 위해 샘플과 함께 분석될 수 있습니다. 양전하 화합물을 더 잘 감지하면 양수 모드 감지를 위해 조정된 .meth 파일로 시퀀스를 실행하여 현재 워크플로 내에서 활성화할 수도 있습니다.
두 가지 설명된 방법 모두에서 분석 샘플링이 편리하게 자동화되어 높은 재현성을 보장합니다. 또한 적절한 계측기 취급 관행과 유지 보수가 관찰되는 한 원활한 분석 실행을 기대할 수 있습니다. 이러한 도구를 사용하여 CFME 반응을 분석할 때 샘플링의 업스트림 및 다운스트림을 보다 중요하게 고려해야 합니다. 샘플 준비 중에 시간 과정 컨트롤이 시간 제로를 대표하는 것이 중요합니다. 여기서, 단백질은 신진 대사 반응을 중단하기 위하여 산성화에 의해 lysates에서 침전되었습니다. 시간 제로 샘플의 경우, 산용매는 포도당을 포함하는 반응 혼합을 추가하기 전에 용액과 결합되었다. 트리클로로아세트산을 가진 산성화는 HPLC-RID데이터(그림 2)에도시된 바와 같이 포도당이 시간 제로에서 대사되지 않도록 효과적으로 보장하였다. 보고된 LC-MS/MS 분석에서 포도당 대사를 담금질하는 유사한 절차가 수행되었지만, 13C-표지대사산물은 이후 시점에서 추출된 샘플에 비해 상당히 낮은 풍부값임에도 불구하고 시간 제로 샘플에서 검출되었다. 더욱이, 이러한 관측은 글리코리시스의 중간체로 제한되었다. 데이터는 반응이 매우 민감한 방법에 의해 검출되는 추출 용매를 가진 산성화 후에 당화 활성의 어느 정도를 유지한다는 것을 건의합니다. 그러나 이 활동의 범위는 정량화되어야 합니다. 이전 연구는 산성 추출 용매가 중간 혈당 반응을 충분히 담금질하지 않을 수 있지만 상당한 포도당 소비를 중지 할 수 있다고보고10. 이 여기에 사용 되는 시스템에서 더 조사 될 남아 있는 동안, 시간 제로 와 이후 시간 점 샘플 사이 상대적인 풍부 한 값에 있는 급격한 변화는 포도 당 물질 대사에 있는 동향으로 해석될 수 있습니다. 그러나 대체 담금질 방법을 탐구하는 것은 특히 대사중급제(10)의절대수량을 얻기 위해 유사한 응용 분야에서 권장된다. 또한 다운스트림 소프트웨어 분석 중 의 모범 사례도 준수해야 합니다. RID 신호에서 피크 영역을 수동으로 통합하여 사람의 오류를 줄일 때 일관성이 필수적입니다. 수동으로 통합된 피크 영역이 샘플의 대사산물 농도를 정량화하는 데 사용될 때마다 표준의 피크 영역에도 수동 통합을 적용해야 합니다. 대상 LC-MS/MS 분석 전반에 걸쳐 MS 품질 브라우저를 사용하여 수동 피크 검사를 통해 MZmine 분석의 잠정 주석을 검증해야 하며, m/z 기능은 계산된 질량 오류가 허용되는 경우에만 주석을 달아야 합니다. 여기서 이러한 분석은 동위원소 검색을 위한 포괄적이고 강력한 소프트웨어가 아직 확립되지 않았기 때문에 제한된 대상 집합에 대해 수동으로 수행되었습니다. 그러나, 13C 표지된 대사산물을 검색하기 위한 이러한 자동화된 방법은 현재 등장하고 있으며 중앙 탄소대사(25)를넘어 용재 프로파일링과 같은 더 복잡한 분석도 간소화할 것이다.
고급 액체 크로마토그래피는 복잡한 대사혼합물(11)에서소분자를 분리하기 위한 견고하고 널리 적용되는 방법입니다. 설명된 방법은 이 분리 기술을 굴절지수 또는 질량 분광 검출과 결합하여 lysate-based CFME 반응에서 대사산물 변환을 성공적으로 분석합니다. HPLC-RID 및 LC-MS/MS는 활성 리자트 대사 프로파일링을 위한 개별적으로 강력한 도구이며, 상호 보완성은 각 기술의 고유한 한계를 해결하기 위해 더욱 활용될 수 있습니다. 보고된 방법은 용액 대사를 이해하고, 표적 대사산물 변환의 개선을 모니터링하고, 용액 대사대사를 조작할 때 대사산물 플럭스로의 변경을 해명하는 데 활용할 수 있기 때문에 CFME의 적용 및 개발을 가능하게 한다.

화학 생산을 위한 엔지니어링 미생물의 한계는 경쟁세포 생존 기능이 없는 시험관내에서 생화학반응을 재구성함으로써 해결될 수있다. 더욱이, 개방반응 환경(즉, 세포막의 부재)은 조작에 더 순종하며 살아있는 세포에 비해 모니터링하기 쉽다. 세포없는 대사 공학 (CFME)의 이 기본 개념은 지금까지 미생물 세포 공장에서 제시된 것보다 더 높은 크기의 생산 메트릭으로 수소 및 단테르펜과 같은 귀중한 화학 물질을 합성하는 대사 경로의 재구성에 의해 우아하게 입증되었습니다1,2,3 . 그러나 전체 경로를 정화하는 방법은 현재 시간과 비용에 의해 제한됩니다. 대안적으로, 세포없는 대사 시스템은 전체 통로 재구성에 비해 신속하고 저렴한 방법을 통해 조세포 추출물로부터 유래 될 수있다4. 세포 추출물에 유지되는 중앙 대사는 24h5,6이상에 대한 중앙 대사 전구체를 생성하기 위해 완충 된 솔루션에서 에너지 기판 (예를 들어, 포도당 및 효소 공동 요소) 및 소금으로 보충 될 수 있습니다. 용액 계 CFME 반응에 외인성 효소를 첨가하면포도당의보다 복잡한 생체 변환을 하이 티터4,6,7에서더 가치 있는 화학물질로 변환할 수 있습니다. 수율은 세포와 같은 대사 복잡성으로 인해 이러한 시스템에서 손상되는 경향이 있지만, 더 높은 수율 변환을 위해 lysate 프로테옴을 큐레이터하는 독특한 방법은7,8개발되고있다.
용액 기반 세포 없는 시스템에서 대사 변환을 수행의 용이성 또는 생체2,9에서이러한 설계를 구축하고 테스트하기 전에 높은 처리량으로 새로운 경로를 프로토타이핑하는 이러한 우수한 플랫폼을 만든다. 응용 프로그램에 대 한, 신진 대사 변환을 모니터링 하거나 lysates에 신진 대사 플럭스에 전반적인 변화를 관찰 하는 도구는 CFME의 발전에 필수적인. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 CFME 반응의 화학 성분을 고해상도로 분리하는 데 사용될 수 있으며 대사산물 정량화5,10에대한 광학 또는 질량 분광 검출기에 결합될 수 있다. HPLC의 기본 원리는 용매(즉, 모바일 상)에 용해되고 컬럼을 통해 펌핑된 해석물이 특정 컬럼 패킹 재료(즉, 고정상)11과상호 작용한다는 것이다. 그들의 화학 적 특성에 따라, 이러한 분석을 전시 하는 그들은 결국 고정 된 단계에서 발레 하 고 검출기에 이동 단계에 의해 수행 되기 전에 다양 한 보존 시간을 전시. 이 보고서는 RID 및 MS/MS 검출을 활용하는 HPLC 기반 방법을 통해 대장균 용액 계 CFME 반응의 준비 및 분석을 자세히 설명합니다.
굴절률 검출(HPLC-RID)에 결합된 HPLC는 중앙 대사 전구체 및 최종 제품을 신속하게 식별할 수 있는 일반적으로 접근할 수 있는 방법입니다. 간단히, RID는 어떻게 해석이 모바일12상에의해 빛의 편향을 바꾸는지 측정한다. 그런 다음 샘플의 표적 별채에 대응하는 RID 신호는 표준 솔루션의 RID 신호와 비교하여 정량화될 수 있습니다. CFME 응용 프로그램에서, 이러한 검출 모드는 크기 배제 및 리간드 교환 메커니즘, 또는 이온 중재 된 파티션 크로마토그래피5,6,8,13의조합을 기반으로 화합물을 분리하는 HPLC 열과 가장 일반적으로 사용되었습니다. 이 특정 기술은 포도당과 같은 설탕 기판의 소비뿐만 아니라 용액계 CFME 반응8에서간결, 젖산, 포르메이트, 아세테이트 및 에탄올과 같은 발효 제품의 형성을 신속하게 정량화하는 데 사용됩니다. HPLC를 통해 이러한 화합물의 농도 변화를 기록하는 것은 조세포 추출물의 잠재력을 해명하여 중앙 대사 전구체를 풀로 하고, 리자6,8,14의포도당에서 포도당에서 복잡한 대사 변환 동안 발효 경로를 통해 통로 플럭스가 어떻게 리디렉션되는지 이해하는 데 유용하다. 대장균 세포 추출물의 정액 CFME 연구는 발효 화합물이 포도당 이화작용의 최종 제품으로 축적되고 외인성효소6,15를과발현하는 용액의 원치 않는 부산물로서도 발생한다는 것을 확인한다. 발효 대사가 당화 반응8을유지하기 위해 공동인자(즉, NAD(P)H 및 ATP)의 레독스 등가물을 재생하는 데 필요한 역할을 한다는 것이 좋습니다. 따라서 발효 제품을 분리하도록 설계된 HPLC 기반 광학 검출 방법은 다양한 lysate 기반 CFME 작업을 실행할 때 유용하고 일반적으로 적용되는 도구입니다.
CFME는 탄수화물, 유기산 또는 알코올4가아닌 신진 대사 최종 제품을 축적하기 위해 구현될 수 있다. 합성되는 만큼 빠르게 소비되는 중급자의 측정도 바람직한10일수있다. HPLC-RID는 비용과 난이도면에서 액세스할 수 있지만, 이 방법은 보존 시간에 따라 대사 산물만 구별하는 능력에 의해 제한됩니다. 액체 크로마토그래피가 MS/MS 검출(LC-MS/MS)16에결합될 때 더 넓은 범위의 대사산물을 분석할 수 있다. 이 방법에 의해, 이동 상에서 의 별과는 각 분자의 질량 및 전하 특성에 따라 이온화 되고 분화된다. 대사 산물의 질량 투-충전(m/z) 비율과 열의 보존 시간을 모두 지식으로 대부분의 대사 중급자 및 고해상도16을가진 최종 제품의 분리를 용이하게 한다. 이러한 검출 기술은 또한 나노 액체 크로마토그래피와 결합될 수 있으며, 이는 유량과 시료 주입 량을 훨씬 더 낮게 제공하여 복잡한 용해배경(17)에서소분자를 보다 민감하게 검출할 수 있다. LC-MS/MS는 통합 된 레이블이 aalytes의 m / z 값18에변화를 부여하기 때문에 동위원소 라벨링과 함께 추가로 적용 할 수 있습니다. 13C6-포도당 기판으로 보충된 CFME반응에서 추출된 타임포인트 측정은 따라서 보충 된 포도당에서 특별히 파생된 최종 또는 부산물을 결정할 수 있다. 이 동위원소 추적 방법은 아직 CFME 연구에서 일반적으로 적용되지 않지만, 특히 이러한 반응에서 염반작용(즉, 아세테이트 및 글루타메이트)이 이차기판으로촉매되기 때문에 lysate 기반 CFME 시스템의 대사 전환을 이해하는 강력한 도구이다. 이 기술을 활용하면 lysates에서 포도당 대사의 포괄적 인 그림을 그릴 수 있으며, 오늘날까지완전히 이해되지는 않습니다. 여기서, 프로토콜은 나노전기분무분무소(nano ESI) MS/MS에 결합된 나노액체 크로마토그래피를 위한 방법을 상세히 설명하여 포도당 대사의 가능한 모델을 심문하는 데 사용될 수 있으며, 특히 대장균 리자츠(도1)에서. 이 모델은 풍부한 미디어5,6,8,14에서자란 균주에서 유래한 대장균 리세이트에서 활성 중인 발효 경로 및 펜토제 인산염 경로의 보고를 기반으로 한다. 이 기술은 또한 아미노산 생산을 조사하는 데 사용되며, 현재 는 용해에서 포도당에서 아미노산 의 해부학에 대한 현재 지식이 방향족 아미노산7의 합성과 같은 몇 가지 예로제한됩니다. 이러한 경로(즉, 유기산, 설탕 인산염 및 아미노산)에서 최종 제품 및 중간체의 대부분 극성 특성을 감안할 때 역단계 액체 크로마토그래피가 여기에 활용되었습니다. 이 기술은 극성 고정 단계에서 용출하여 극성 화합물을 분리합니다. 이러한 화합물은 적어도 하나의 음의 기본 충전으로 분석물의 검출을 허용하고 따라서 산성 화합물을 검출하는 데 유용 부정적인 이온 모드에서 나노 ESI에 의해 이온화되었다. 이 기술은 포도당 유래 13C 통합 대사 산물을 분석하기 위해 여기에서 사용되며 lysates에서 포도당 대사를 이해하기 위한 LC-MS/MS의 유용성을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m centrifuge tube filters (spin columns)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Binary LC Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1312B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity High Performance Degasser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4225A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Refractive Index Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7162A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Standard Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1329B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374</td>
			<td>CFME reaction mix component (LC-MS/MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.20 &#956;m pore (PES membrane) filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminex HPX 87-H column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1250140</td>
			<td>Chromatography column for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1376</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vial caps (yellow, snap)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-50Y</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W225181</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-dextrose (Glucose)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9230</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8281</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC/MS grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica (internal diameter of 100 &#956;m, external diameter of 375 &#956;m)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>WM22005-ND</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetex 5 &#956;m C18 stationary phase (100 &#197;)</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0632</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanospray Ionization Source</td>
			<td>ThermoFisher Scientific/Proxeon</td>
			<td>ES071 (newest model)</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenLab CDS (Online) Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 2.15.26</td>
			<td>Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 2.7</td>
			<td>Software for tuning the LC-MS/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps (with septa, 9 mm)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29315-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwthread glass vials (2 mL)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29376-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>247596</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71716</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>398055</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>Solvent preparation for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-acetate</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-090-100</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Solvent Rack: SRD-3600</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6500</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 3.0.63</td>
			<td>Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems

표적 생합성을 위한 세포 대사를 엔지니어링하려면 엔지니어가 세포의 생존 요구 사항을 중심으로 작업할 때 광범위한 설계-빌드-테스트-학습(DBTL) 주기가 필요할 수 있습니다. 또는 셀 프리 환경에서 DBTL 주기를 수행하면 이 프로세스를 가속화하고 호스트 호환성에 대한 우려를 완화할 수 있습니다. 세포 없는 신진 대사 공학(CFME)에 대한 유망한 접근법은 신진대사활성 원유 세포 추출물을 바이오 제조플랫폼으로 활용하고 수정된 단백질과 경로를 빠르게 발견하고 프로토타이핑하는 데 활용합니다. 이러한 기능을 실현하고 CFME 성능을 최적화하려면 lysate 기반 셀 프리 플랫폼의 메타볼로메를 특성화하는 방법이 필요합니다. 즉, 분석 도구는 표적 대사산물 변환의 개선을 모니터링하고 용액 대사를 조작할 때 대사산물 플럭스로의 변경을 해명하기 위해 필요합니다. 여기서, 대장균 S30 용액에서 대사산물 생산 및 플럭스를 특성화하기 위해 광학 또는 질량 분광 검출과 결합된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용한 대사산물 분석이 적용되었다. 구체적으로, 본 보고서는 굴절률 검출(RID)을 사용하여 HPLC 분석을 위한 CFME 분석에서 샘플의 제조를 설명하여 저비용 기판(즉, 포도당)을 다양한 고부가가치 제품으로 변환하는 과정에서 중앙 대사 중기 및 부산물의 생성을 정량화한다. CFME 반응에서 대사 산물 변환의 분석은 특정 대사 산물 수율을 특성화하고 시작 재료로부터 대사 플럭스를 반사하는 강력한 도구인 질량 분석법(MS/MS)과 결합된 반전 상 액체 크로마토그래피를 통해 13C표지된 포도당으로 공급되는 분석도 제시된다. 전부, CFME lysate 신진 대사에 이러한 분석 방법을 적용하면 더 빠르거나 새로운 신진 대사 엔지니어링 작업을 실행하기위한 대체 플랫폼으로 이러한 시스템의 발전을 가능하게.

포도당으로부터 의 일반적인 발효 제품의 용액 계 세포 무첨가 합성을 정량화하기 위해, 2xYPTG 미디어에서 자란 균주에서 유래한 용액은 1차 탄소원으로 100 μM 포도당을 공급하였다8. 단백질 산성화에 의해 24시간 동안 반응이 멈췄다. 피루바테, 간결, 젖산, 포르메이트, 아세테이트, 에탄올을 함유한 여과된 슈퍼나탕은 RID 모듈이 장착된 HPLC 시스템의 오토샘플러 모듈에 적재되었다. 발효 최종 제품 및 포도당의 여과 혼합물을 1.17 μM, 2.34 μM, 4.69 μM, 9.38 μM, 18.75 μM, 37.50 μM, 75 μM 및 S30 완충제의 150 μM 농도가 계측 기준으로 계측기로 적재했다. Aalytes는 HPLC 열에서 RID로 이약적으로 출화되었습니다. 1 에서 150 μM 범위 내에서 포도당, 간결, 젖산, 포르메이트, 아세테이트 및 에탄올의 피크는 RID에 의해 해결될 수 있었다. 포도당피크 영역은 시간 과정 및 표준 곡선 샘플에 대한 RID 데이터로부터의 수동 통합에 의해 도출되었다. 간결한, 젖산, 포르메이트, 아세테이트 및 에탄올을 위한 추출된 피크 영역은 자동으로 통합된 신호에서 채취되었다. 모든 표준 곡선(피크 영역 대 알려진 농도)은R2 값이 >0.99이며 여기에 사용되는 농도 범위에 걸쳐 선형이었다.
모든 표적 점액에 대한 몰 농도는 각각의 표준 곡선에서 계산되었다. 포도당은 반응의 첫 3 시간 내에서 소비되었고 주로 젖산(도 2A,B)으로발효되었다. 에탄올 축적또한 반응의 첫 3시간 내에서 크게 발생했으며 그 이후에 중단하였다(도2C). 3시간 후 상당한 포도당 소비를 가진 상당한 젖산 및 에탄올 생산의 관찰은 유산과 에탄올 생산 경로가 글리코리시스를 통해 지속적인 포도당 소비에 필요한 글리코리스틱 NADH로부터 1개의 그물 몰 NAD+의 재생을 허용하기 때문에 전례가 없는 것이아니었다(그림 1). 따라서 젖산 및 에탄올은 lysate 기반 세포 없는 포도당 대사의 주요 발효 최종 제품으로 간주될 수 있다. 아세테이트는 처음에 S30 완충제의 성분으로서 반응에 존재했으며, 포도당 소비가 느려졌을 때 6h 후에 신진대사로 인해 예기치 않게 축적되었다(도2D). 이 결과는 아세테이트 발효가 반드시 초기 시간 점에 있는 급속한 당계 플럭스를 가능하게 하지 않는다는 것을 건의합니다. 한편, 포르마트와 간결한 것은 사소한 발효제품(그림 2E,F)으로합성되었다. 전부, 이 방법은 대장균 S30 리자테에서 당기질 고갈 및 발효 제품 형성의 절대적인 정량화를 가능하게 하였다.
MS 검출은 프로필 리자트 포도당 대사에 구체적으로 적용되었다. 2xYPTG 미디어에서 자란 균주에서 유래한 용액은 탄소원으로 13C6-포도당을공급받았다. CFME 반응은 0시간, 1시간, 2시간, 3시간 동안 트리플리케이트로 실행되었다. 각 시점의 샘플은 역상 컬럼을 장착한 LC 시스템에 로드되었고 푸리에 변환 및 이온 트랩 질량 분광기에 결합되었습니다. 음의 이온 모드 스펙트럼은 유기산, 설탕 인산염 및 아미노산을 분석하기 위해 얻어서 가공하였다. 중앙 탄소 대사에 속하는 13개의 C 라벨 종의 계산 된 이론질량은 특히 포도당 유래 화합물을 식별하기 위해 검색되었다. E. coli CFME에서 활성 경로의 활용 된 소스 균주 재배 조건 및 이전 보고서에 기초하여, 리자테 프로테오메는 글리코리성 발효로 포도당을 공급하는 대사 네트워크를 포함하는 것으로 가정된다, 펜토제 인산염 경로, 아마도 아미노산 anabolism 5,6,7,8,14 (그림 1) . 따라서, 이러한 경로의 구성원으로 검색이 좁혀졌으며, 그 중 포도당 유래 13C 라벨을 통합한 16개의 대사산물은 명백하게 인장되었다(보충표1).
13 C6-포도당은글리코리시즘을 통해 관찰가능한 소비되었으며, 글리코리스틱 중간 풍요량의 변동에 의해 입증된 바와 같이(도3A-E). HPLC-RID 데이터와 일치하여, 포도당은 13C3-젖산으로 축적되고 또한 반응의 첫 3 시간 내에서 13C3-간결하게발효되었다(도4A,B). 13C 3-succinate 이소톨로그 형성은 리자이트 포도당대사(도 1)의제안된 모델을 지원하며, 여기서 간결한 것은 3탄소 인지질(PEP) 분자의 카복틸화에 의해 생성될 가능성이 높으며 TCA 사이클에 대한 2탄소 아세틸-CoA 분자의 진입로부터 가아니라. TCA 주기의 활성화는 이전 CFME 연구에서 가정되었지만, TCA의 다른 13C 라벨 중간체는 여기에서검출되지않았다8,19,21. 13 C3-아스파르타트 합성은 그러나 첫 번째 h 내에서 발생하였고, 펩이 직접 옥살로아테이트(도1, 도 6C)로변환된다는 생각을 강화하여 소비되었다. 데이터는 포도당이 풍부한 매체 (2xYPTG)에 발효 성장 도중 수확한 근원 긴장에서 lysate proteome의 반사입니다. 이것은 더 산화 TCA 분기(그림 1)를형성 간결한 생산 양식에 참여하지 않는 TCA 효소의 나머지 부분을 의미할 것이다. 그러나 이 경로의 대사 산물은 염반소로서 CFME 반응에 첨가된 고농도글루타민이 이 분기의 진행을 막기 때문에 검출되지 않았다. 
HPLC-RID 데이터는 3h 의 반응 기간 내에 13C 2-아세테이트 검출의 부족에 의해 추가적으로 보완되어 최대 3h(도2B)까지포도당에서 아세테이트의 축적을 시사합니다. 그러나, 아세틸-인산염(아세틸-P)의 직접적인 전구체는 아세틸-코아로부터 아세테이트 합성을 위한 Pta-AckA 통로의 Pta 암이 활성화되어 있음을시사한다(도 4C,D). AckA 촉매 탈포일화 13C 2-아세틸-P ~ 13C2-아세테이트는반응에 사용되는 S30 버퍼의 주요 성분인 아세테이트로 인해 이 기간 내에 발생하지 않을 가능성이 있다(도1, 도 2B).
13C6-포도당유래 탄을 당인산염 6-인산코놀락톤(6PGL), 6-인포글루코네이트(6PG), 리불로오스-5-인산염(Ru5P), 및 세도헤플루로오스-7-인산염(S7P)에 통합하였다( 그림5). 이러한 결과는 용해 포도당 대사에 있는 펜토제 인산염 통로의 참여를 확인하고 프로테오믹 연구에 의해 이전에 제안된 13C 9-티로신 합성을 공급하고, 또한 13C5-히스티딘생산에 대한 선구자를 제공하면서(도 6A,B)7. 표기 엘라닌과 트립토판은 여기에서 관찰되지 않았으며, 필수 아미노산의 대부분은 아니었다. 그러나 아미노산 anabolism은 영양 에 굶주린 조건 또는 고정 된 단계7,22에서자란 세포에서 파생 된 용재에서 농축 될 가능성이 있기 때문에 이것은 완전히 놀라운 일이 아니다. 더욱이, 지금까지의 데이터는 글리코분해와 발효의 중간체가 최종 반응을 재생하는 공동 인자 재생쪽으로 유입된다는 것을 시사합니다. 글리세랄데히드-3-인산염, 피루바테 및 아세틸-코아(즉, 글리신, 시스테인, 세린, 알라닌, 발린, 류신 및 라이신)에서 유래한 많은 아미노산의 합성을 배제해야 한다(도 1). 언급했듯이, 13C3-아스파르타테는 첫 번째 시간 내에 생산되었지만, 아스파르타테 는 13C통합 아미노산(즉, 스루닌, 이솔루신, 메티오닌 및 아스파라진)은 포도당 유래 아스파르타테가 발효에 참여하기 때문에 관찰되지 않았을 가능성이 있다(그림1, 그림 6C). 마지막으로, 글루타민산염에서 유래한 글루타민산과 아미노산을 향한 플루스는 반응 환경에서 높은 수준의 글루타민에 의해 방해되었을 수있다(도 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig01.jpg"> 도 1: 대장균 BL21DE3-Star로부터 유래한 용액의 퍼티디드 대사 모델은 높은 포도당 농도에서 기하급수적으로 증가한다. 글리코리시스(녹색), 펜토제 인산염 통로(다크 오렌지), 아세틸-코아의 발효 경로(blue)의 중간 및 최종 제품은 용해계 CFME에서 보고되었다. 간결한 발효의 존재는 산화 TCA 분기 (회색)의 활성화를 의미한다. 아미노산 anabolism (금) lysates에서 잘 정의 되지 않은 하 고 여기에서 조사. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig02.jpg"> 그림 2: 대장균 조취추출물로 제조된 CFME 반응에서 포도당 소비 및 발효 최종 생성물 합성을 위한 HPLC-RID 데이터는 (A) 포도당 소비 및(B)젖산,(C)에탄올,(D)아세테이트,(E)포메이트,(F)CFME 반응에서 의자생산을 모니터링하였다. 표준 곡선으로 정량화된 평균 mM 농도 및 오류 막대(SE)가 표시됩니다(n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig03.jpg"> 그림 3: 대장균 리세테 CFME에서 13C6-포도당및 13C 라벨 글리코리틱 중급제의 타임 코스 동향. (A) 13 C6-포도당의상대적 풍부,(B) 13C6-포도당-6-인산염/과당-6-인산염,(C) 13C6-과당-1,6-비스포스페이트,(D) 13C 3-글리세랄데히드-3-인산염/디하이드록시아세이세톤 인산염, 13C(13C3-글리세랄데히드/디하이드하이드아이세이세톤) -3시간 이상 CFME 반응에서 피루바테. mzMINE 소프트웨어에서 추출한 원시 피크 영역은 양음 부음(n = 3)에 대한 평균 및 오류 막대(SE)를 계산하는 데 사용되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig04.jpg"> 그림 4: 대장균 리자테 CFME에서 13C6-포도당발효에서 중간 및 최종 제품의 타임 코스 동향. (A) 13C 3-젖산,(B) 13C3-수치네이트,(C)13 C2-아세틸-인산염,(D) 13C2-아세틸-코아의상대적 풍부도 3h 이상의 CFME 반응. mzMINE 소프트웨어에서 추출한 원시 피크 영역은 양음 부음(n = 3)에 대한 평균 및 오류 막대(SE)를 계산하는 데 사용되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig05.jpg"> 그림 5: 대장균 리세테 CFME에서 13C6-포도당유래 펜토제 인산염 경로 중간체의 시간 과정 동향. (A) 13C6-6-인포글루코놀락톤,(B) 13C6-6-인산글루코네이트,(C) 13C 5-리불로오스-5-인산염,(D) 13C7-세도헤플라스-7-인산염의상대적 풍부. mzMINE 소프트웨어에서 추출한 원시 피크 영역은 양음 부음(n = 3)에 대한 평균 및 오류 막대(SE)를 계산하는 데 사용되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig06.jpg"> 도 6: 대장균 리자테 CFME에서 13C6-포도당유래 아미노산을 검출한 시간 과정 동향. (A) 13C 9-티로신,(B) 13C5-히스티딘,(C) 13C3-3h이상 아파르타트의 상대적 풍부함. mzMINE 소프트웨어에서 추출한 원시 피크 영역은 양음 부음(n = 3)에 대한 평균 및 오류 막대(SE)를 계산하는 데 사용되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충도 1: 대표적인 HPLC-RID 크로마토그램은 24시간 동안 37°C에서 배양된 CFME 반응에서 주요 발효 제품에 대한 피크를 보여 주는 것을 보여 주는 다. 포도당, 간결, 젖산, 포메이트, 아세테이트 및 에탄올 피크는 5mM 황산 용매가 있는 동위 원소 용출 중 HPLC 컬럼에서 의 보존 시간에 의해 충분히 구별됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-Suppfig1.eps" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충도 2: 13C 표지 대사산물, 구체적으로 (A) 젖산, (B) 포도당, (C) 6-인포글루코네이트(6PG)에 대한 대표적인 질량 스펙트럼은 37°C에서 1시간 동안 배양된 CFME 반응에서 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-SuppFig2.eps" target="_blank">이 파일을 다운로드해 주세요.</a>
보충 표 1: 검출 된 13C 라벨 대사 산물 목록, 보존 시간 (MZmine을 사용하여 샘플에 걸쳐 정렬), 이론적으로 완전히 13C 라벨 음수 모드 m / z 값, 감지 된 기능의 m / z 값, 계산 된 질량 오류. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/Supplemental%20Table%201.docx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

프로토콜은 복잡한 lysate 기반 세포 없는 시스템에서 대사 반응을 연구하기 위한 굴절 지수 또는 질량 분광 검출에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 설명합니다.

리자테 기반 세포 없는 시스템에서 대사산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분광 검출에 결합된 액체 크로마토그래피

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

이 프로토콜은 굴절률 검출을 사용하여 용액 기반의 세포 없는 시스템에서 일반적으로 축적되는 탄소 대사의 부산물을 측정합니다. 그것은 또한 대사 활성 lysates에서 생성 되는 중앙 대사 산물의 더 넓은 패널을 감지 하기 위해 질량 분광법을 사용 하 여. 이 프로토콜에 사용되는 두 가지 기술은 lysate 기반의 세포 없는 시스템에서 발생하는 화학 반응을 정량적으로 설명할 수 있는 기능을 제공하므로 복잡한 lysate 배경에서 낮은 농도에 존재하는 대사 산물을 포함하여 더 넓은 범위의 대사산물을 검출할 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 생명 과학 과에서 대학원 연구원 인 제이미 로렌조 딩글라산과 데이비드 리브스입니다. 1.5 밀리리터 미세 센심 분리기 튜브에 다른 성분을 결합하여 총 lysate 단백질의 밀리리터 당 4.5 밀리그램으로 최종 반응을 준비하십시오. 시간 당 삼중판에 50 마이크로 리터의 최종 볼륨으로 세포없는 신진 대사 공학, 또는 CFME, 반응을 준비합니다.각 시료의 최종 반응 부피에 5%트리클로로아세트산의 동일한 부피를 추가하여 적절한 시간 지점에서 즉시 삼중 반응을 종료합니다. 그런 다음 각 반응 혼합물에 멸균수의 2배를 첨가하여 각 샘플을 희석시 희석시다. 시간 0을 다시 수주하려면, 반응 성분의 나머지 부분을 추가하기 전에 용액과 총 최종 반응 부피와 5%트리클로로아세트산의 동일한 부피를 혼합한다.이 산성화 단계는 포도당을 현저하게 대사하기 전에 효소를 침전시합니다. 5분 동안 11, 600배 g의 벤치탑 미세원심분리기의 시료와 원심분리기를 소용돌이시키고, 유기 적폐물을 함유한 수퍼나티를 깨끗한 튜브로 옮긴다. HPLC 분석을 나중에 수행하려면 샘플을 섭씨 영하 20도에 저장합니다.다음 단계로 진행하기 전에 얼음에 저장된 샘플을 해동하십시오. 0.22 마이크로미터 모공 필터로 각 상체를 필터링합니다. 원심분리기 후 각 여과물을 깨끗한 HPLC 유리 유리 바이알로 옮기습니다.분석을 위해 이미 설정된 HPLC 시스템의 자동 샘플러 트레이에 바이알을 로드합니다. 메뉴 표시줄에서 시퀀스, 새 시퀀스 템플릿을 선택합니다. 시퀀스를 선택합니다.시퀀스 템플릿을 시퀀스 템플릿 이름 S.Select Sequence, 시퀀스 테이블로 저장합니다. N 바이알에 해당하는 N 행을 부속시다. 그런 다음 자동 샘플러 트레이의 배열에 따라 바이알 및 샘플 이름 아래에 각각 바이알 위치 및 샘플 이름을 입력합니다.메서드 이름 드롭다운 메뉴에서 원고에 설명된 대로 생성된 메서드를 선택하고 각 행에 대해 바이알당 주입으로 50 마이크로리터를 입력합니다. 시퀀스를 선택하여 적용을 클릭하고 시퀀스 템플릿을 저장합니다. 시퀀스 템플릿을 선택하 여 로드 되어 있는지 확인, 로드 시퀀스 템플릿, 시퀀스 템플릿 이름 S.온라인 플롯에 안정적인 기준을 달성 한 후, 패널 RID 모듈을 마우스 오른쪽 버튼 클릭, 제어, 오프 재활용 밸브 낭비에 RID 검출기를 통해 용매 흐름을 지시.데이터 수집을 시작하려면 메뉴 모음에서 시퀀스를 선택한 다음 시퀀스 테이블을 선택합니다. 보기 메뉴에서 데이터 분석 보기를 선택합니다. 화면 왼쪽에 있는 파일 목록에서 시퀀스 파일 이름을 찾습니다.화면의 중앙 패널에서 시그널 뷰 선택, RID 신호로 이동하여 샘플 크로마토그램을 봅니다. 화면의 상단 패널에서 샘플에 해당하는 행을 선택합니다. 표적 성역에 대응하는 피크는 포도당, 간결한, 젖산, 포르메이트, 아세테이트 및 에탄올로서 보존 시간 축을 따라 배치됩니다.관심의 피크가 소프트웨어에 의해 잘 통합되어 있는지 여부를 분별하십시오. 빨간색 선은 각 피크의 기준으로 자동으로 그려져야 합니다. 빨간색 선이 스큐인 경우 자동 통합이 실패했습니다.그런 다음 통합 도구 세트에서 수동 통합 단추를 선택하고 피크 베이스를 수동으로 그려 피크 영역을 통합합니다. 제대로 통합된 피크를 클릭하여 공통 도구 집합에서 커서 도구를 선택합니다. 선택한 피크의 피크 영역과 해당 반응 시간은 화면 의 하단 패널의 테이블 행으로 강조 표시됩니다.피크 영역을 내보내려면 파일, 내보내기, 통합 결과를 선택합니다. 스프레드시트에서 샘플농도에 비해 피크 영역 값을 플롯합니다. 플롯된 데이터를 마우스 오른쪽 단추로 클릭한 다음 추세선 추가, 형식 추세선, 차트에 방정식 표시를 선택합니다.별도의 스프레드시트에서 표준 곡선 추세선의 방정식을 사용하여 각 샘플의 모든 별분별에 대해 피크 영역 값을 농도로 변환합니다. 데이터 시각화를 위한 트리클리세이트 에서 평균 피크 영역과 표준 오류 값을 계산합니다. 원고에 설명된 대로 얼음에 시간 제로를 제외한 시간당 삼중 반응을 설정합니다.포도당 대신, 반응에 100 밀리머 포도당-13C6의 최종 농도를 사용. 1, 2, 3시간 동안 섭씨 37도에서 반응을 배양합니다. 분석부터 시작하여 각 샘플에 추출 용매의 동등한 부피를 피펫합니다.시료가 동결된 경우, 포도당 대사의 재활성화를 방지하기 위해 샘플이 완전히 해동하기 전에 추출 용매를 추가합니다. 얼음의 모든 샘플 처리 단계를 수행합니다. 시간 0을 재구성하기 위해, 50 마이크로리터의 반응 부피에서 밀리리터당 4.5 밀리그램의 원하는 최종 농도를 위해 추출 용매의 최종 부피를 적절한 양의 용액으로 피펫합니다.앞에서 설명한 반응 구성 요소의 나머지 부분을 추가합니다. 이 산성화 단계는 포도당을 현저하게 대사하기 전에 효소를 침전시합니다. 부드러운 흔들림으로 30분 동안 얼음에 추출 용매로 샘플을 배양합니다.그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 15분 동안 21, 000배 g에서 원심분리하여 침전된 단백질과 상수체를 분리합니다. 슈퍼리소르의 50마이크로리터를 자동 샘플러 바이알로 옮기고 바이알을 섭씨 4도 내의 트레이에 적재합니다. 분석을 위해 계측기를 준비한 후 LC-MS/MS 시스템의 데이터 수집 및 해석 소프트웨어를 사용하여 실행 시퀀스를 설정합니다.로드맵 내에서 시퀀스 설정, 테이블을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 샘플만큼 많은 행을 삽입합니다. 각 행에 대해 사출 볼륨을 5마이크로리터로 설정하고 오토샘플러 트레이에서 바이알의 각 위치로 위치를 설정합니다. 파일 이름을 샘플 이름으로 입력하고 실행 결과에 대해 원하는 파일 경로를 설정합니다.실행을 시작하려면 시퀀스의 모든 파일 이름을 강조 표시합니다. 메뉴 표시줄에서 작업, 실행 시퀀스를 선택합니다. MZmine을 열고 이전에 얻은 원시 출력 파일을 가져옵니다.메뉴 표시줄에서 원시 데이터 메서드, 원시 데이터 가져오기를 선택하고 샘플에 해당하는 파일을 선택합니다. MZmine 분석을 완료하기 위해 원고에 설명된 단계를 따릅니다. MZmine 분석 끝에 있는 원시 피크 영역을 CSV 파일로 내보냅니다.스프레드시트를 열어 표적 검색을 위해 포도당 대사로부터 13C 표지대사산물의 질량을 계산합니다. 13C 라벨 대사 산물의 계산 된 질량을 사용하여 MZmine 결과에서 대량 충전 기능을 검색하고 송신하십시오. 품질 브라우저에서 푸티에 주석의 스펙트럼을 수동으로 확인하여 주석을 확인합니다.로드맵 오픈, 퀄리티 브라우저. 도구 표시줄에서 원시 파일을 열어 각 샘플의 원시 MS 데이터를 가져옵니다. 질량 스펙트럼을 보기 위해 총 이온 크로마토그램에 푸티트 음장에 해당하는 원하는 보존 시간 아래에 선을 그립니다.HPLC-RID 실험에서, 포도당은 반응의 처음 3 시간 이내에 소비되었고 주로 젖산으로 발효되었다. 에탄올 축적또한 반응의 첫 3시간 이내에 현저히 발생하였고 그 이후에 중단하였다. 아세테이트는 처음에 S30 완충제의 성분으로서 반응에 존재했으며, 포도당 소비가 느려졌을 때 6시간 후에만 신진대사로 인해 축적되었다.따라서 젖산 및 에탄올은 lysate 기반의 세포 없는 포도당 대사의 주요 발효 최종 제품으로 간주될 수 있습니다. 그것은 소두근과 간결 모두 사소한 발효 제품으로 합성 된 것으로 관찰되었다. 포도당-13C6은 글리코리스틱 중급제의 변동에 의해 명백히 드러나는 글리코리시스를 통해 관찰 가능하게 소비되었다.HPLC 굴절률 검출 데이터와 일치하여, 포도당은 젖산-13C3에 축적되고 또한 반응의 첫번째 3 시간 안에-13C3를 간결하게 하기 위하여 발효되었다. 포도당-13C6 유래 탄본을 당인산염 6-인산글루코놀락톤, 6-인포글루코놀락톤, 6-인플루오코네이트, 리불로오스-5-인산염 및 세도헤플루로오스-7-인산염에 통합하여 포도당 대사에 펜토세 인산염의 참여를 확인하는 것이 관찰되었다. 용액 포도당 물질 대사 티로신-13C9 합성을 공급 하는 것으로 나타났습니다., 또한 히스티딘-13C5 생산을 위한 선구자를 제공 하는 동안.컨트롤 샘플은 시간 제로를 정확하게 나타내는 것이 중요합니다. 따라서, 용액을 함유하는 용액에서 혼합하기 전에 용액의 단백질이 비활성화되어 있는지 확인한다. 또한 테스트 샘플, 제어 샘플 및 표준에서 피크를 자동으로 통합하여 추출된 피크 영역과 비교할 수 있도록 일관성을 유지합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

연구

생체공학

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

A Coupled Experiment-finite Element Modeling Methodology for Assessing High Strain Rate Mechanical Response of Soft Biomaterials

소프트 생체 재료의 높은 변형 속도 기계 응답을 평가하기위한 결합 실험 - 유한 요소 모델링 방법론

This study offers a combined experimental and finite element (FE) simulation approach for examining the mechanical behavior of soft biomaterials (e.g. ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

무 세포 생물학 밀봉 Femtoliter 상공 회의소 배열

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

3D 공간 세포 배양을위한 세포 발판으로 생체 적합성 액정 엘라스토머 거품의 합성

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

에는 대장균-감염 살 균 소의 합성 기반 셀 무료 식 시스템

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

장기간 무세포 유전자 발현의 전도를 위한 다층 미세유체 플랫폼

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

광음향 유동 세포측정을 이용한 난소암 검출

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

암 세포 배양에서 수집된 매체에서 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 분석된 선택된 Kynurenines의 동시 정량화

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...