Name: liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems
Uploaded: 2021-09-23T14:45:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Denne forskningen ble sponset av Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, som en del av Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory administreres av UT-Battelle, LLC, for det amerikanske energidepartementet under kontrakt DE-AC05-00OR22725. Dette manuskriptet er skrevet av UT-Battelle, LLC under Contract DE-AC05- 00OR22725 med det amerikanske energidepartementet. Den amerikanske regjeringen beholder og utgiveren, ved å godta artikkelen for publisering, erkjenner at den amerikanske regjeringen beholder en ikke-eksklusiv, betalt, ugjenkallelig, verdensomspennende lisens til å publisere eller reprodusere den publiserte formen for dette manuskriptet, eller la andre gjøre det, for amerikanske regjeringsformål. Institutt for energi vil gi offentlig tilgang til disse resultatene av føderalt sponset forskning i samsvar med DOE Public Access Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

<ol>
	<li>Rollin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+hydrogen+production+from+biomass+by+in+vitro+metabolic+engineering:+Mixed+sugars+coutilization+and+kinetic+modeling.">High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).</li><li>Bowie, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biochemistry:+The+bio-inspired+cell-free+approach+to+commodity+chemical+production.">Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production.</a> Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).</li><li>Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+platform+for+cell+free+production+of+monoterpenes+from+glucose.">A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose.</a> Nature Communications. 8, 1-8 (2017).</li><li>Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosynthesis+of+limonene+using+enzyme-enriched+Escherichia+coli+lysates.">Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates.</a> Synthetic Biology. 4 (1), 003 (2019).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+potential+of+crude+cell+extracts+for+producing+pyruvate+from+glucose.">Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose.</a> Synthetic Biology. 3, (2018).</li><li>Kay, J. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysate+of+engineered+Escherichia+coli+supports+high-level+conversion+of+glucose+to+2,3-butanediol.">Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol.</a> Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).</li><li>Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+growth+medium+dropouts+promote+aromatic+compound+synthesis+in+crude+E.+coli+cell-free+systems.">Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysate+proteome+engineering+strategy+for+enhancing+cell-free+metabolite+production.">A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production.</a> Metabolic Engineering Communications. 12, 00162 (2021).</li><li>Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+pathway+prototyping.">Cell-free synthetic biology for pathway prototyping.</a> Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+cell-free+extract+reaction+(CFER)+system+in+Clostridium+thermocellum+to+identify+metabolic+limitations+to+ethanol+production.">Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production.</a> Frontiers in Energy Research. 8, 72 (2020).</li><li>Coskun, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Separation Tecniques: Chromatography. 3, (2016).</li><li>Bernardes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+acids+and+alcohols+quantification+by+HPLC/RID+in+sugarcane+vinasse:+analytical+method+validation+and+matrix+effect+assessment.">Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment.</a> International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computationally+guided+discovery+and+experimental+validation+of+indole-3-acetic+acid+synthesis+pathways.">Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways.</a> ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).</li><li>Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+control+of+cell-free+metabolism+through+pH+modulation.">Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation.</a> Synthetic Biology. 5, (2020).</li><li>Bujara, M., Sch&#252;mperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+cell-free+systems:+Implementation+and+debugging+of+a+system+of+biotransformations.">Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).</li><li>Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+identification+and+quantitation+in+LC-MS/MS-based+metabolomics.">Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics.</a> TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).</li><li>Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-liquid+chromatography.">Nano-liquid chromatography.</a> Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).</li><li>Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+mass+spectrometry-based+metabolomics:+Opportunities+and+challenges.">Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).</li><li>O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+CoA+metabolites+by+SAMDI-MS+to+optimize+the+cell-free+biosynthesis+of+HMG-CoA.">High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA.</a> Science Advances. 5, (2019).</li><li>Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unimod:+Protein+modifications+for+mass+spectrometry.">Unimod: Protein modifications for mass spectrometry.</a> Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).</li><li>Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+mixing+of+Escherichia+coli+crude+extracts+to+prototype+and+rationally+engineer+high-titer+mevalonate+synthesis.">Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).</li><li>Jaishankar, J., Srivastava, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+stationary+phase+survival+and+applications.">Molecular basis of stationary phase survival and applications.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2000 (2017).</li><li>Bartolomeo, M. P., Maisano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+for+quantitative+amino+acid+analysis.">Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).</li><li>Hauck, T., Landmann, C., Br&#252;hlmann, F., Schwab, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone+in+cytosolic+extracts+obtained+from+Zygosaccharomyces+rouxii.">Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).</li><li>Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsoSearch:+An+untargeted+and+unbiased+metabolite+and+lipid+isotopomer+tracing+strategy+from+HR-LC-MS/MS+datasets.">IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets.</a> Methods and Protocols. 3 (3), 54 (2020).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har noen kjente konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Den skisserte HPLC-RID-tilnærmingen kan brukes til å kvantifisere sukkersubstratforbruk og etterfølgende konverteringer til store organiske syre- og alkoholprodukter av lysat sentral metabolisme over tid. Videre bruker denne protokollen en enkel isokratisk metode ved hjelp av en enkelt mobil fase, krever minimal prøvepreparering, og tillater en enkel målrettet nedstrømsanalyse. Analytter målt ved HPLC-RID-metoden utmerker seg utelukkende av oppbevaringstidene, og derfor deres interaksjoner med den valgte kolonneharpiksen. HPLC-kolonnen som brukes her, ble spesielt designet for å skille karbohydrater, organiske syrer og alkoholer ved å kombinere størrelsesekskludering og ligandutveksling (dvs. ion-moderert partisjonskromatografi). Den beskrevne metoden er derfor nyttig for mer målrettet analyse av karbohydratsubstrater og utvalgte sluttprodukter av glukosegjæringsveier som forventes å primært lette og energisere lysatebaserte biotransformasjoner8,15,21. Denne protokollen tar imidlertid ikke hensyn til aktivering av andre metabolske veier i celleekstrakter. Rørledninger som benytter andre kromatografiske separasjonsteknikker (dvs. hydrofil interaksjonskromatografi), gradient elutionmetoder, mer komplisert prøvepreparering (dvs. avledning) og forskjellige optiske detektorer (f.eks. ultrafiolett lys eller fordampende lysspredningsdetektorer) kan brukes til å oppdage andre metabolitter som aminosyrer og sukkerfosfater23,24 . Alternativt kan en global tilnærming til å studere lysatmetabolisme tas ved hjelp av LC-MS / MS.
Den beskrevne LC-MS/MS-metoden er en enkelt arbeidsflyt for måling og identifisering av et bredere spekter av metabolitter. LC-MS/MS er et toppmoderne analyseverktøy for metabolomprofilering på grunn av følsomheten og evnen til å skille mellom metabolitter ved oppbevaringstid og m/z-forhold med høy oppløsning16. Med fokus på sentrale karbonmetabolske veier og aminosyre anabolisme, negativ modus MS / MS ble implementert for å spesifikt oppdage polare organiske syrer, sukkerfosfater og aminosyrer. Kombinert med en nano-væske kromatografi teknikk, gir metoden høy følsomhet for å oppdage små molekyler i den komplekse lysatbakgrunnen17. Når det gjelder profilering av lysatbasert CFME-metabolisme, er imidlertid en begrensning av den beskrevne LC-MS / MS-protokollen dens nedre deteksjonsgrense på 50 m / z, som utelukker måling av etanol, et hovedprodukt i lysat glukosemetabolisme, samt format, som begge ellers lett kvantifiseres av den detaljerte HPLC-RID-metoden. Sammenlignet med LC-MS/MS har HPLC-RID den ekstra fordelen med relativ tilgjengelighet når det gjelder kostnader og vanskeligheter. Til sistnevnte punkt kan feilsøking av LC-MS/MS-metoden som er beskrevet her, kreve en viss grad av ekspertise innen massespektrometri. Likevel har MS-deteksjon unikt tiltalende applikasjoner over RID, da det i tillegg kan skille merkede isotoper i metabolomer, en utmerket teknikk for å forstå karbonbevegelse fra supplerte substrater gjennom det komplekse lysate metabolske nettverket18. En slik tilnærming ble brukt her ved å supplere reaksjoner med 13C6-glukose og analysere de relative overflodsverdiene til nedstrøms 13C-inkorporerende metabolitter. Analysen tillot definisjonen av aktive og inaktive veier, støttet tidligere rapporterte forutsetninger og ga ny innsikt om metabolsk flux i lysater. Endringer kan også gjøres innenfor metoden for spesifikke analyser. For eksempel kan standardløsninger av 13C-merkede målforbindelser analyseres sammen med prøver for å oppnå absolutte kvantitative målinger av glukoseavledede molekyler over tid og konkludere om fluksfordelinger. Bedre deteksjon av positivt ladede forbindelser kan også aktiveres i gjeldende arbeidsflyt ved å kjøre sekvenser med METH-filer justert for registrering av positiv modus.
Analytisk prøvetaking i begge beskrevne metoder er praktisk automatisert, noe som sikrer høy reproduserbarhet. Videre kan det forventes jevne analytiske løp så lenge riktig instrumenthåndteringspraksis og vedlikehold overholdes. Ved bruk av disse verktøyene for å analysere CFME-reaksjoner, bør det tas mer kritiske hensyn oppstrøms og nedstrøms prøvetaking. Under prøveforberedelsene er det viktig at tidskurskontrollene er representative for tids-null. Her ble proteiner utfelt i lysater ved forsuring for å stoppe metabolske reaksjoner. For tids-null-prøver ble syreløsningsmidlet kombinert med lysat før tilsetning av reaksjonsblandingen som inneholder glukose. Forsuring med trichloroacetic acid sørget effektivt for at glukose ikke metaboliseres ved tids-null, som vist i HPLC-RID-dataene (Figur 2). Mens en lignende prosedyre for å slukke glukosemetabolismen ble utført i den rapporterte LC-MS /MS-analysen, ble 13C-merkede metabolitter påvist i tids-null-prøver, om enn ved betydelig lave overflodsverdier i forhold til prøver ekstrahert på senere tidspunkter. Videre var disse observasjonene begrenset til mellomprodukter av glykolyse. Dataene tyder på at reaksjonene beholder en viss grad av glykolytisk aktivitet etter forsuring med ekstraksjonsløsningsmidlet som oppdages ved denne svært følsomme metoden. Omfanget av denne aktiviteten bør imidlertid kvantifiseres. En tidligere studie rapporterte at sure ekstraksjonsløsningsmidler kanskje ikke tilstrekkelig slukker mellomliggende glykolytiske reaksjoner, men kan stoppe betydelig glukoseforbruk10. Selv om dette gjenstår å undersøke nærmere i systemet som brukes her, kan drastiske endringer i relative overflodsverdier mellom tids-null og senere tidspunktprøver tolkes som trender i glukosemetabolismen. Utforske alternative slukkingsmetoder, men anbefales i lignende applikasjoner, spesielt for å oppnå absolutte mengder metabolske mellomprodukter10. Videre bør god praksis under nedstrøms programvareanalyser også observeres. Konsistens er viktig når du manuelt integrerer toppområder fra RID-signaler for å redusere menneskelig feil. Manuell integrasjon bør også brukes på toppområder av standarder når manuelt integrerte toppområder brukes til å kvantifisere metabolittkonsentrasjoner i prøver. Gjennom den målrettede LC-MS/MS-analysen bør foreløpige merknader fra MZmine-analysen valideres ved manuell toppkontroll ved hjelp av en MS-kvalitetsleser, og m/z-funksjoner bør bare kommenteres når beregnede massefeil er akseptable. Her ble disse analysene utført manuelt for et begrenset sett med mål siden omfattende og robust programvare for isotopsøk ennå ikke er etablert. Imidlertid er slike automatiserte metoder for å søke 13C-merkede metabolitter for tiden fremvoksende og vil effektivisere mer kompliserte analyser også, som profilering av lysater utover sentralkarbonmetabolisme25.
Avansert væskekromatografi er en robust og mye anvendt metode for å skille små molekyler i komplekse metabolske blandinger11. De beskrevne metodene kombinerer denne separasjonsteknikken med brytningsindeksen eller massespektrometrisk deteksjon for å analysere metabolittkonverteringer i lysatebaserte CFME-reaksjoner. HPLC-RID og LC-MS/MS er individuelt kraftige verktøy for profilering av aktiv lysatmetabolisme, og deres komplementaritet kan videre utnyttes for å adressere hver teknikks iboende begrensninger. De rapporterte metodene muliggjør anvendelse og utvikling av CFME som de kan brukes til å forstå lysate metabolisme, overvåke forbedringer i målrettede metabolitt konverteringer, og belyse endringer til metabolitt flux når manipulere lysat metabolisme.

Begrensninger i tekniske mikrober for kjemisk produksjon kan løses ved å rekapitlere biokjemiske reaksjoner in vitro der konkurrerende cellulære overlevelsesfunksjoner er fraværende1. Videre er det åpne reaksjonsmiljøet (dvs. fravær av cellemembran) mer egnet til manipulering og er lettere å overvåke sammenlignet med levende celler. Dette grunnleggende konseptet med cellefri metabolsk engineering (CFME) har blitt elegant demonstrert ved rekonstituering av metabolske veier for å syntetisere verdifulle kjemikalier som hydrogen og monoterpener med produksjonsmålinger som er størrelsesorden høyere enn presentert i mikrobielle cellefabrikker så langt1,2,3 . Metoder for rensing av hele veier er imidlertid for tiden begrenset av tid og kostnad. Alternativt kan cellefrie metabolske systemer avledes fra råcelleekstrakter gjennom raske og rimelige metoder i forhold til rekonstituering av hele banen4. Den sentrale metabolismen som beholdes i celleekstrakter kan suppleres med energisubstrater (f.eks. glukose og enzymatiske kofaktorer) og salter i bufrede løsninger for å generere sentrale metabolske forløpere i over 24 timer5,6. Ved å tilsette eksogene enzymer til den lysatebaserte CFME-reaksjonen, kan mer komplekse biotransformasjoner av glukose til mer verdifulle kjemikalier ved høye titere4,6,7. Selv om utbyttet har en tendens til å bli kompromittert i disse systemene på grunn av deres cellelignende metabolske kompleksitet, har unike metoder for å kuratere lysate proteomer for konvertering med høyere avkastning vært og utvikles7,8.
Den enkle å utføre metabolske transformasjoner i lysate-baserte cellefrie systemer gjør disse utmerkede plattformene for enten å flytte kjemisk produksjon utenfor cellen helt eller for å prototyping nye veier med høy gjennomstrømning før du bygger og tester disse designene in vivo2,9. For begge bruksområdene er verktøy for overvåking av metabolske konverteringer eller observasjon av generelle endringer i metabolsk flux i lysater integrert i utviklingen av CFME. Høyytelses væskekromatografi (HPLC) kan brukes til å skille de kjemiske bestanddelene av CFME-reaksjoner med høy oppløsning og kan kobles til optiske eller massespektrometriske detektorer for metabolitt kvantifisering5,10. Det underliggende prinsippet for HPLC er at analytter oppløst i et løsningsmiddel (dvs. mobilfase) og pumpet gjennom en kolonne vil samhandle med det spesifikke kolonneemballasjematerialet (dvs. stasjonær fase)11. Avhengig av deres kjemiske egenskaper, viser disse analyttene varierende oppbevaringstider før de til slutt blir unndratt fra den stasjonære fasen og båret av den mobile fasen til en detektor. Denne rapporten beskriver utarbeidelse og analyse av E. coli lysate-baserte CFME-reaksjoner gjennom HPLC-baserte metoder som utnytter RID og MS / MS-deteksjon.
HPLC koblet til refraktiv indeksdeteksjon (HPLC-RID) er en generelt tilgjengelig metode for raskt å identifisere sentrale metabolske forløpere og sluttprodukter. Kort sagt måler RID hvordan analytter endrer avbøyningen av lys av den mobile fase12. RID-signaler som tilsvarer målanalytter i prøver, kan deretter kvantifiseres ved sammenligninger med RID-signaler om standardløsninger. I CFME-programmer har denne deteksjonsmodusen blitt mest brukt med HPLC-kolonner som skiller forbindelser basert på en kombinasjon av størrelsesekskludering og ligandutvekslingsmekanismer, eller ionmoderert partisjonskromatografi5,6,8,13. Denne spesielle teknikken brukes til raskt å kvantifisere forbruket av sukkersubstrater som glukose samt dannelse av gjæringsprodukter som succinat, laktat, format, acetat og etanol i lysatebaserte CFME-reaksjoner8. Registrering av konsentrasjonsendringene til disse forbindelsene via HPLC har vært nyttig for både å belyse potensialet til råcelleekstrakter for å samle sentrale metabolske forløpere og forstå hvordan banefluks omdirigeres gjennom gjæringsveier under komplekse metabolske konverteringer fra glukose i lysater6,8,14. Seminal CFME-studier i E. coli-celleekstrakter bekrefter at gjæringsforbindelser akkumuleres som sluttprodukter av glukosekabolisme og forekommer også som uønskede biprodukter i lysater som overekspresserer eksogene enzymer6,15. Det foreslås at fermentativ metabolisme spiller en nødvendig rolle i å regenerere redoksekvivalenter av kofaktorer (dvs. NAD (P)H og ATP) for å opprettholde glykolytiske reaksjoner8. Derfor er en HPLC-basert optisk deteksjonsmetode designet for å skille gjæringsprodukter et nyttig og vanlig brukt verktøy når du utfører forskjellige lysatebaserte CFME-oppgaver.
CFME kan implementeres for å akkumulere metabolske sluttprodukter som ikke er karbohydrater, organiske syrer eller alkoholer4. Måling av mellomprodukter som forbrukes så raskt som de syntetiseres, kan også være ønskelig10. Mens HPLC-RID er tilgjengelig når det gjelder kostnader og vanskeligheter, er denne metoden begrenset av dens evne til bare å skille metabolitter basert på oppbevaringstid. Et bredere spekter av metabolitter kan analyseres når flytende kromatografi er koblet til MS/MS-deteksjon (LC-MS/MS)16. Ved denne metoden blir analytter i mobilfasen ionisert og differensialt oppdaget basert på hvert molekyls masse- og ladeegenskaper. Kunnskap om både metabolittens masse-til-kostnad (m / z) forhold og oppbevaringstid på kolonnen letter dermed separasjonen av de fleste metabolske mellomprodukter og sluttprodukter med høy oppløsning16. Denne deteksjonsteknikken kan også kobles til nano-væskekromatografi, som gir mye lavere strømningshastigheter og prøveinjeksjonsvolumer, noe som gir mer sensitiv deteksjon av små molekyler i den komplekse lysatbakgrunnen17. LC-MS/MS kan i tillegg brukes med isotopmerking siden innebygde etiketter gir endringer i analyttenes m/z-verdier18. Timepoint-målinger ekstrahert fra en CFME-reaksjon supplert med et 13C6-glukosesubstrat kan dermed bestemme ende- eller biproduktene som er avledet spesielt fra supplert glukose. Selv om denne isotopsporingsmetoden ennå ikke brukes ofte i CFME-studier, er det et kraftig verktøy for å forstå metabolske konverteringer i lysatebaserte CFME-systemer, spesielt siden salttellerioner (dvs. acetat og glutamat) i disse reaksjonene også er katabolisert som sekundære substrater19. Utnytte denne teknikken kan dermed tegne et omfattende bilde av glukosemetabolismen i lysater, som til denne dagen ikke er helt forstått. Her beskriver protokollen en metode for nano-flytende kromatografi koblet til nanoelektrosprayionisering (nano ESI) MS/MS som kan brukes til å forhøre en mulig modell for glukosemetabolisme, spesielt i E. coli lysates (Figur 1). Modellen er basert på rapporter om fermentative veier og pentosefosfatveien som er aktiv i E. coli lysater avledet fra stammer vokst i rike medier5,6,8,14. Teknikken brukes i tillegg til å undersøke aminosyreproduksjon siden dagens kunnskap om aminosyre anabolisme fra glukose i lysater er begrenset til noen få eksempler som syntese av aromatiske aminosyrer7. Gitt den mest polare naturen til sluttprodukter og mellomprodukter i disse veiene (dvs. organiske syrer, sukkerfosfater og aminosyrer), ble omvendt faset væskekromatografi brukt her. Denne teknikken skiller polarforbindelser ved elution fra en ikke-polar stasjonær fase. Disse forbindelsene ble deretter ionisert av nano ESI i negativ ionmodus som tillater påvisning av analytter med minst en negativ elementær ladning og er dermed nyttig for å oppdage sure forbindelser. Denne teknikken brukes her for å analysere glukose-avledet 13C-inkorporerende metabolitter og demonstrerer nytten av LC-MS / MS for å forstå glukosemetabolisme i lysater.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m centrifuge tube filters (spin columns)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Binary LC Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1312B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity High Performance Degasser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4225A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Refractive Index Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7162A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Standard Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1329B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374</td>
			<td>CFME reaction mix component (LC-MS/MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.20 &#956;m pore (PES membrane) filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminex HPX 87-H column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1250140</td>
			<td>Chromatography column for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1376</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vial caps (yellow, snap)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-50Y</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W225181</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-dextrose (Glucose)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9230</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8281</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC/MS grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica (internal diameter of 100 &#956;m, external diameter of 375 &#956;m)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>WM22005-ND</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetex 5 &#956;m C18 stationary phase (100 &#197;)</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0632</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanospray Ionization Source</td>
			<td>ThermoFisher Scientific/Proxeon</td>
			<td>ES071 (newest model)</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenLab CDS (Online) Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 2.15.26</td>
			<td>Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 2.7</td>
			<td>Software for tuning the LC-MS/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps (with septa, 9 mm)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29315-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwthread glass vials (2 mL)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29376-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>247596</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71716</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>398055</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>Solvent preparation for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-acetate</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-090-100</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Solvent Rack: SRD-3600</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6500</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 3.0.63</td>
			<td>Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems

Teknisk cellulær metabolisme for målrettet biosyntese kan kreve omfattende design-build-test-learn (DBTL) sykluser som ingeniøren arbeider rundt cellens overlevelseskrav. Alternativt kan utføre DBTL-sykluser i cellefrie miljøer akselerere denne prosessen og lindre bekymringer med vertskompatibilitet. En lovende tilnærming til cellefri metabolsk engineering (CFME) utnytter metabolsk aktive råcelleekstrakter som plattformer for bioproduksjon og for raskt å oppdage og prototyping av modifiserte proteiner og veier. Å realisere disse funksjonene og optimalisere CFME-ytelsen krever metoder for å karakterisere metabolomen til lysatebaserte cellefrie plattformer. Det vil si at analytiske verktøy er nødvendige for å overvåke forbedringer i målrettede metabolittkonverteringer og i å belyse endringer i metabolittfluks ved manipulering av lysatmetabolisme. Her ble metabolittanalyser ved hjelp av høyytelses væskekromatografi (HPLC) kombinert med enten optisk eller massespektrometrisk deteksjon brukt til å karakterisere metabolittproduksjon og fluss i E. coli S30 lysater. Nærmere bestemt beskriver denne rapporten utarbeidelsen av prøver fra CFME-lysater for HPLC-analyser ved hjelp av brytningsindeksdeteksjon (RID) for å kvantifisere genereringen av sentrale metabolske mellomprodukter og biprodukter i konverteringen av lavkostnads substrater (dvs. glukose) til ulike produkter av høy verdi. Analysen av metabolittkonvertering i CFME-reaksjoner matet med 13C-merket glukose gjennom omvendt fase flytende kromatografi koblet til tandemmassespektrometri (MS / MS), et kraftig verktøy for å karakterisere spesifikke metabolittutbytter og lysat metabolsk flux fra startmaterialer, presenteres også. Til sammen gjør bruk av disse analytiske metodene på CFME lysatmetabolisme det mulig å fremme disse systemene som alternative plattformer for å utføre raskere eller nye metabolske ingeniøroppgaver.

For å kvantifisere den lysatebaserte cellefrie syntesen av vanlige gjæringsprodukter fra glukose, ble lysater avledet fra stammer dyrket i 2xYPTG-medier matet 100 μM glukose som en primær karbonkilde8. Reaksjonene ble stoppet over et 24 timers tidsforløp ved proteinforsuring. Filtrerte supernatanter som inneholder pyruvat, succinat, laktat, format, acetat og etanol produsert av glukosekabosabolisme ble lastet inn i autosamplermodulen til et HPLC-system utstyrt med en RID-modul. Hetteglass med filtrerte blandinger av fermentative sluttprodukter og glukose ved 1,17 μM, 2,34 μM, 4,69 μM, 9,38 μM, 18,75 μM, 37,50 μM, 75 μM og 150 μM konsentrasjoner i S30 buffer ble lastet på instrumentet som standarder. Analytter ble unndratt isocratically fra en HPLC-kolonne til RID. Topper for glukose, succinat, laktat, format, acetat og etanol innenfor området 1 til 150 μM kan løses av RID. Toppområder for glukose ble avledet ved manuell integrasjon fra RID-dataene for tidskurs og standard kurveprøver. Utpakkede toppområder for succinat, laktat, format, acetat og etanol ble tatt fra automatisk integrerte signaler. Alle standardkurver (toppområde vs. kjent konsentrasjon) hadde R2-verdier >0,99 og var lineære i hele konsentrasjonsområdet som ble brukt her.
Molarkonsentrasjoner for alle målanalytter ble beregnet ut fra deres respektive standardkurver. Glukose ble konsumert i løpet av de første 3 t av reaksjonen og hovedsakelig gjæret til laktat (Figur 2A, B). Etanolakkumulering skjedde også betydelig i løpet av de første 3 t av reaksjonen og stoppet deretter (Figur 2C). Observasjonen av betydelig laktat- og etanolproduksjon med betydelig glukoseforbruk etter 3 timer var ikke enestående siden laktat- og etanolproduksjonsveier tillater regenerering av 1 netto mol NAD + fra glykolytisk NADH som kreves for fortsatt glukoseforbruk gjennom glykolyse (figur 1). Laktat og etanol kan dermed betraktes som de viktigste gjæringssluttproduktene i lysatbasert cellefri glukosemetabolisme. Acetat var i utgangspunktet til stede i reaksjonene som en komponent i S30-bufferen og uventet bare akkumulert på grunn av metabolisme etter 6 timer da glukoseforbruket hadde avtatt (Figur 2D). Dette resultatet antyder at acetatgjæring ikke nødvendigvis muliggjør rask glykolytisk flux i tidligere tidspunkter. I mellomtiden ble format og succinat syntetisert som mindre gjæringsprodukter (Figur 2E, F). Til sammen muliggjorde metoden absolutt kvantifisering av sukkersubstratnedbrytning og fermentativ produktdannelse i E. coli S30 lysater.
MS-deteksjon for å profilere lysat glukosemetabolisme ble spesielt brukt her. Lysater avledet fra stammer dyrket i 2xYPTG media ble matet 13C6-glukose som karbonkilde. CFME-reaksjoner ble kjørt i triplikat i 0 timer, 1 t, 2 t og 3 timer. Prøver fra hvert tidspunkt ble lastet på et LC-system utstyrt med en omvendt fasekolonne og koblet til Fouriertransformasjon og ionfellemassespektrometre. Negativ ionmodusspektra ble oppnådd og behandlet for å analysere organiske syrer, sukkerfosfater og aminosyrer. Beregnede teoretiske masser av 13C-merkede arter som tilhører sentral karbonmetabolisme ble søkt for å identifisere spesielt glukoseavledede forbindelser. Basert på de utnyttede kildestammedyrkingsforholdene og tidligere rapporter om aktive veier i E. coli CFME, antas det her at lysate proteom består av et metabolsk nettverk som mater glukose i glykolytisk gjæring, pentosefosfatbanen og muligens aminosyre anabolisme5,6,7,8,14 ( figur1). Derfor ble søket innsnevret til medlemmer av disse veiene, hvorav 16 metabolitter som inkorporerte glukoseavledede 13C-etiketter, ble entydig kommentert (Supplerende tabell 1).
13 C6-glukose ble observabelt konsumert gjennom glykolyse, som det fremgår av svingningene i glykolytiske mellomliggende overflod (Figur 3A-E). I samsvar med HPLC-RID-dataene akkumulerte glukose til 13C3-laktat og ble også gjæret til 13C3-succinat i løpet av de første 3 t av reaksjonen (Figur 4A,B). Dannelsen av 13C3-succinat isotopologue støtter den foreslåtte modellen for lysat glukosemetabolisme (figur 1), hvor succinat sannsynligvis vil bli generert av karboksylering av 3-karbon fosfoenolpyruvat (PEP) molekyl og ikke fra innføringen av et 2-karbon acetyl-CoA molekyl til TCA-syklusen. Aktivering av TCA-syklusen er antatt i tidligere CFME-studier, men andre 13C-merkede mellomprodukter av TCA ble ikke oppdaget her8,19,21. 13 C3-aspartatsyntesen forekom imidlertid i løpet av den første h og ble konsumert, noe som forsterket ideen om at PEP konverteres direkte til oksaacetat (Figur 1, Figur 6C). Dataene reflekterer en lysate proteom fra kildestammer høstet under gjærende vekst på glukoserike medier (2xYPTG). Dette vil videre innebære at resten av TCA-enzymene som ikke deltar i succinate produksjon danner en oksidativ TCA-gren (figur 1). Ingen av metabolittene i denne banen ble imidlertid oppdaget, muligens fordi høye konsentrasjoner av glutamat tilsatt CFME-reaksjonen som en saltteller forhindrer progresjonen av denne grenen. 
HPLC-RID-dataene suppleres i tillegg av mangelen på 13C2-acetatdeteksjon innen 3 h reaksjonstidsrammen som antyder ingen opphopning av acetat fra glukose opp til 3 timer (Figur 2B). Imidlertid akkumuleres den direkte forløperen til acetat, acetyl-fosfat (acetyl-P), akkumulert, noe som tyder på at Pta-armen til Pta-AckA-banen for acetatsyntese fra acetyl-CoA er aktiv (Figur 4C, D). AckA katalysert defosforylering av 13C2-acetyl-P til 13C2-acetat forekommer sannsynligvis ikke innen denne tidsrammen på grunn av at acetat er en hovedkomponent i S30-bufferen som brukes i reaksjonene (Figur 1, Figur 2B).
Inkorporering av 13C6-glukose-avledede karboner til sukkerfosfater 6-fosfoglukonolakton (6PGL), 6-fosfoglukonat (6PG), ribulose-5-fosfat (Ru5P) og sedoheptulose-7-fosfat (S7P) ble også observert (Figur 5). Disse resultatene bekrefter deltakelsen av pentosefosfatbanen i lysat glukosemetabolisme og gir sannsynligvis 13C 9-tyrosinsyntese, som tidligere har blitt foreslått av en proteomisk studie, samtidig som den gir en forløper for 13C5-histidinproduksjon (Figur 6A,B)7. Merket fenylalanin og tryptofan ble ikke observert her, og heller ikke de fleste essensielle aminosyrer. Dette er imidlertid ikke helt overraskende siden aminosyre anabolisme er sannsynlig å bli beriket i lysater avledet fra celler som vokser i næringssultne forhold eller i den stasjonære fase7,22. Videre antyder dataene så langt at mellomprodukter av glykolyse og gjæring er traktert mot kofaktorregenerering av sluttreaksjoner, som må utelukke syntesen av mange aminosyrer avledet fra glyseraldehyd-3-fosfat, pyruvat og acetylsyre (dvs. glycin, cystein, serin, alanin, valin, leucin og lysin) (Figur 1). Som nevnt ble 13C3-aspartat produsert i løpet av den første timen, mens aspartat avledet 13C-inkorporerende aminosyrer (dvs. treonin, isoleucin, metionin og aspargin) ikke ble observert muligens fordi glukose-avledet aspartat deltar i gjæring (Figur 1, Figur 6C). Til slutt kan fluks mot merket glutamat og aminosyrer avledet fra glutamat ha blitt hindret av høye nivåer av glutamat i reaksjonsmiljøet (Figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig01.jpg"> Figur 1: En putativ metabolsk modell av lysater avledet fra E. coli BL21DE3-Star vokser eksponentielt i høye glukosekonsentrasjoner. Mellomprodukter og sluttprodukter av glykolyse (grønn), pentosefosfatbanen (mørk oransje) og fermentative veier (blå) fra acetyl-CoA er rapportert i lysatbasert CFME. Tilstedeværelsen av kortfattet gjæring innebærer aktivering av den oksidative TCA-grenen (grå). Aminosyre anabolisme (gull) i lysater er ikke godt definert og undersøkes her. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig02.jpg"> Figur 2: HPLC-RID-data for glukoseforbruk og fermentativ sluttproduktsyntese i CFME-reaksjoner tilberedt med E. coli-råoljeekstrakter. (A) Glukoseforbruk og (B) laktat, (C) etanol, (D) acetat, (E) formate, og (F) succinate produksjon i CFME-reaksjoner ble overvåket over 24 timer. Gjennomsnittlig mM-konsentrasjon og feilfelt (SE) kvantifisert med standardkurver presenteres (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig03.jpg"> Figur 3: Tidskurstrender på 13C6-glukose og 13C-merkede glykolytiske mellomprodukter i E. coli lysate CFME. Relative overflod av (A) 13C6-glukose, (B) 13C6-glukose-6-fosfat/fruktose-6-fosfat, (C) 13C6-fruktose-1,6-bisfosfat, (D) 13C3-glyseraldehyd-3-fosfat/dihydroksyacetonfosfat, og (E) 13C -pyruvat i CFME-reaksjoner over 3 timer. Raw peak områder hentet av mzMINE programvare ble brukt til å beregne gjennomsnitt og feilfelt (SE) for positive merknader (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig04.jpg"> Figur 4: Tidskurstrender for mellomprodukter og sluttprodukter i 13C6-glukosegjæring i E. coli lysate CFME. Relative overfloder av (A) 13C3-laktat, (B) 13C3-succinate, (C) 13C2-acetyl-fosfat, og (D) 13C2-acetyl-CoA i CFME-reaksjoner over 3 timer. Raw peak områder hentet av mzMINE programvare ble brukt til å beregne gjennomsnitt og feilfelt (SE) for positive merknader (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig05.jpg"> Figur 5: Tidskurstrender på 13C6-glukoseavledede pentosefosfatbane mellomprodukter i E. coli lysate CFME. Relative overfloder av (A) 13C6-6-fosfogluconolakton, (B) 13C6-6-fosfoglukonat, (C) 13C5-ribulose-5-fosfat, og (D) 13C7-sedoheptulose-7-fosfat over 3 t. Raw peak områder hentet av mzMINE programvare ble brukt til å beregne gjennomsnitt og feilfelt (SE) for positive merknader (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig06.jpg"> Figur 6: Tidsforløptrender for påviste 13C6-glukoseavledede aminosyrer i E. coli lysate CFME. Relative overfloder av (A) 13C9-tyrosin, (B) 13C5-histidin, og (C) 13C3-aspartat over 3 timer. Raw peak områder hentet av mzMINE programvare ble brukt til å beregne gjennomsnitt og feilfelt (SE) for positive merknader (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Supplerende figur 1: Representativt HPLC-RID-kromatogram som viser topper for store gjæringsprodukter i en CFME-reaksjon inkubert ved 37 °C i 24 timer. Glukose-, succinat-, laktat-, format-, acetat- og etanoltopper er tilstrekkelig preget av oppbevaringstidene på en HPLC-kolonne under isokratisk elution med 5 mM svovelsyreløsningsmiddel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-Suppfig1.eps" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 2: Representativ massespektra for 13C-merkede metabolitter, spesielt (A) laktat,(B) glukose, og (C) 6-fosfoglukonat (6PG) i en CFME-reaksjon inkubert ved 37 °C i 1 t. Klikk her for <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-SuppFig2.eps" target="_blank">å laste ned denne filen.</a>
Supplerende tabell 1: Liste over påviste 13C-merkede metabolitter, oppbevaringstider (justert på tvers av prøver ved hjelp av MZmine), teoretiske fullstendig 13C-merkede negative modus m/z-verdier, m/z-verdier for oppdagede funksjoner og beregnede massefeil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/Supplemental%20Table%201.docx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Protokollene beskriver høyytelses væskekromatografimetoder kombinert for å brytningsindeks eller massespektrometrisk deteksjon for å studere metabolske reaksjoner i komplekse lysatebaserte cellefrie systemer.

Flytende kromatografi kombinert med brytningsindeks eller massespektrometrisk deteksjon for metabolittprofilering i lysatebaserte cellefrie systemer

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

Denne protokollen bruker brytning av indeksdeteksjon for å måle biprodukter av karbonmetabolisme som ofte akkumuleres i lysatebaserte, cellefrie systemer. Det gjør også bruk av massespektrometri for å oppdage et enda bredere panel av sentrale metabolitter som genereres i metabolsk aktive lysater. De to teknikkene som brukes i denne protokollen gir evnen til kvantitativt å beskrive de kjemiske reaksjonene som forekommer i et lysatbasert, cellefritt system, noe som gjør det mulig å oppdage et bredere spekter av metabolitter, inkludert de som er tilstede ved lave konsentrasjoner i den komplekse lysate bakgrunnen.Demonstrere prosedyrene vil være Jaime Lorenzo Dinglasan og David Reeves, utdannet forskere fra Biosciences Division. Begynn med å kombinere de forskjellige komponentene i 1,5 milliliter mikrosenterrør for å forberede endelige reaksjoner med 4,5 milligram per milliliter totalt lysatprotein. Forbered cellefri metabolsk ingeniørkunst, eller CFME, reaksjoner med endelige volumer på 50 mikroliter i triplikat per tidspunkt.Avslutt triplikatreaksjonene på passende tidspunkter umiddelbart ved å legge til et likt volum på 5%trichloroacetic acid til hver prøves endelige reaksjonsvolum. Fortynn deretter hver prøve ved å legge til to ganger volumet av sterilt vann til hver reaksjonsblanding. For å rekapitulere tid null, bland samme volum på 5%trichloroacetic acid som det totale endelige reaksjonsvolumet med lysatet før du legger til resten av reaksjonskomponentene.Dette forsuringstrinnet utfeller lysate enzymer før de betydelig metaboliserer glukose. Virvel prøvene og sentrifugen på en stasjonær mikrosenter ved 11 600 ganger g i fem minutter, og overfør supernatantene som inneholder organiske analytter til rene rør. Oppbevar prøvene på minus 20 grader Celsius hvis HPLC-analyser skal gjennomføres senere.Sørg for å tine de lagrede prøvene på is før du går videre til neste trinn. Filtrer hver supernatant med et porefilter på 0,22 mikrometer. Etter sentrifugering overfører du hvert filtrat til et rent HPLC-hetteglass.Legg hetteglassene på autosamplerskuffen på HPLC-systemet som allerede er konfigurert for analyse. Velg Sekvens, Ny sekvensmal på menylinjen. Velg Sekvens.Lagre sekvensmal som sekvensmalnavn S.Select Sequence, Sequence Table. Tilføy N-rader som tilsvarer N-hetteglass. Skriv deretter inn hetteglassposisjoner og prøvenavn under henholdsvis Hetteglass og Prøvenavn, i henhold til deres arrangement på autosampler-skuffen.Velg metoden som genereres som beskrevet i manuskriptet, fra rullegardinmenyen Metodenavn, og skriv inn 50 mikroliter som injeksjon per hetteglass for hver rad. Klikk Bruk, og lagre sekvensmalen ved å velge Sekvens, Lagre sekvensmal. Forsikre deg om at sekvensmalen er lastet inn ved å velge Sekvens, Lastsekvensmal, sekvensmalnavn S.Etter å ha oppnådd en stabil grunnlinje på den elektroniske tomten, høyreklikker du på panelet RID-modul, kontroll, av resirkuleringsventil for å lede løsningsmiddelstrømmen gjennom RID-detektoren til avfall.Hvis du vil starte datainnsamlingen, velger du Sekvens på menylinjen, og deretter velger du Sekvenstabell, Kjør. Velg Dataanalysevisning på Vis-menyen. Finn sekvensfilnavnet fra fillisten til venstre på skjermen.På det midterste panelet på skjermen går du til Valg av signalvisning, RID-signal for å vise prøvekromatogrammene. Velg en rad som tilsvarer et av eksemplene fra det øverste panelet på skjermen. Topper som tilsvarer målanalyttene vil bli arrangert langs oppbevaringstidsaksen som glukose, succinat, laktat, format, acetat og etanol i prøver der alle disse metabolittene er til stede.Se om toppene av interesse er godt integrert av programvaren. En rød linje skal tegnes automatisk som basis for hver topp. Hvis den røde linjen er skjev, har den automatiske integreringen mislyktes.Velg deretter Manuell integrasjon-knappen fra integreringsverktøysettet, og tegn en toppbase manuelt for å integrere toppområdet. Velg markørverktøyet fra common tool set for å klikke på riktig integrerte topper. Toppområdet og den tilsvarende reaksjonstiden for den valgte toppen vil bli uthevet som en bordrad på det nederste panelet utenfor skjermen.Hvis du vil eksportere toppområder, velger du Fil, Eksporter, Integrasjonsresultater. Tegn inn toppområdeverdier i forhold til kjente konsentrasjoner av prøver i et regneark. Høyreklikk de tegnede dataene, og velg deretter Legg til trendlinje, Formater trendlinje, Vis formel i diagrammet.I et eget regneark bruker du ligningene for standardkurvetrendlinjer til å konvertere toppområdeverdier til konsentrasjoner for hver analytt fra hvert utvalg. Beregn gjennomsnittlige toppområder og standard feilverdier på tvers av triplikater for datavisualisering. Sett opp triplikatreaksjoner per tidspunkt, unntatt tid null, på is som beskrevet i manuskriptet.I stedet for glukose, bruk en endelig konsentrasjon på 100 millimolar glukose-13C6 i reaksjonene. Inkuber reaksjonene ved 37 grader Celsius i en, to og tre timer. Til å begynne med analysen, pipette et tilsvarende volum av ekstraksjonsløsningsmidlet til hver prøve.Hvis prøvene var frosset, legg til ekstraksjonsløsningsmidlet før prøvene helt tiner ut for å forhindre reaktivering av glukosemetabolismen. Utfør alle prøvebehandlingstrinn på is. For å rekapitulere tid null, pipette det endelige volumet av ekstraksjonsløsningsmiddel til et passende volum lysat for ønsket sluttkonsentrasjon på 4,5 milligram per milliliter i 50 mikroliter reaksjonsvolum.Legg til resten av reaksjonskomponentene som beskrevet tidligere. Dette forsuringstrinnet utfeller lysate enzymer før de betydelig metaboliserer glukose. Inkuber prøvene i ekstraksjonsløsningsmiddel på is i 30 minutter med forsiktig risting.Sentrifuger deretter prøvene ved 21.000 ganger g i 15 minutter ved fire grader Celsius for å skille supernatanten fra det utfelte proteinet. Overfør 50 mikroliter av supernatanten til autosampler hetteglass, og last hetteglassene på brettet innen de fire grader Celsius autosampler. Når du har forberedt instrumentet for analyse, konfigurerer du en kjøresekvens ved hjelp av LC-MS/MS-systemets programvare for datainnsamling og tolkning.I Veikart, Sekvensoppsett høyreklikker du tabellen for å sette inn så mange rader som eksempler. For hver rad setter du injeksjonsvolumet til fem mikroliter og posisjonen til hetteglassets respektive posisjon på autosamplerskuffen. Skriv inn filnavn som eksempelnavn, og angi ønsket filbane for kjøreresultater.Hvis du vil starte kjøringen, merker du alle filnavnene i sekvensen. Velg Handlinger, Kjør sekvens på menylinjen. Åpne MZmine, og importer de rå utdatafilene som er hentet tidligere.Velg Rådatametoder, Rådataimport på menylinjen, og velg filene som tilsvarer eksemplene. Følg trinnene som er beskrevet i manuskriptet for å fullføre MZmine-analysen. Eksporter rå toppområdene på slutten av MZmine-analysen som en CSV-fil.Åpne et regneark for å beregne massene av 13C-merkede metabolitter fra glukosemetabolisme for det målrettede søket. Bruk beregnede masser av 13C-merkede metabolitter til å søke etter og kommentere masse-til-kostnad-funksjoner fra MZmine-resultater. Kontroller spektraet av putative merknader manuelt i en kvalitetsleser for å bekrefte merknadene.Åpne Veikart, Qual Browser. Åpne raw-filen på verktøylinjen for å importere rå MS-data for hvert eksempel. Tegn en linje under ønsket område av oppbevaringstider som tilsvarer den putative merknaden på det totale ionkromatogrammet for å se et massespekter.I HPLC-RID-eksperimenter ble glukose konsumert innen de tre første timene etter reaksjonen og hovedsakelig gjæret til laktat. Etanolakkumulering skjedde også betydelig i løpet av de tre første timene etter reaksjonen og stoppet deretter. Acetat var i utgangspunktet til stede i reaksjonene som en komponent i S30-bufferen og akkumulerte bare på grunn av metabolisme etter seks timer, da glukoseforbruket hadde avtatt.Laktat og etanol kan dermed betraktes som de viktigste gjæringssluttproduktene i lysatbasert, cellefri glukosemetabolisme. Det ble observert at både format og succinat ble syntetisert som mindre gjæringsprodukter. Glukose-13C6 ble observabelt konsumert gjennom glykolyse, som tydelig av svingningene i glykolytiske mellomprodukter.I samsvar med HPLC brytning indeks deteksjonsdata, glukose akkumulert til laktat-13C3 og ble også gjæret til succinate-13C3 innen de tre første timene etter reaksjonen. Inkorporering av glukose-13C6-avledede karboner til sukkerfosfater 6-fosfoglukonolakton, 6-fosfoglukonat, ribulose-5-fosfat og sedoheptulose-7-fosfat ble også observert, noe som bekrefter deltakelsen av pentosefosfatbanen i lysate glukosemetabolisme. Lysate glukosemetabolismen ble funnet å mate tyrosin-13C9 syntese, samtidig som den ga en forløper for histidin-13C5 produksjon.Det er viktig at kontrollprøvene nøyaktig representerer tid null. Sørg derfor for at proteinene i lysatet deaktiveres før blanding i løsningen som inneholder energikilder. Sørg også for at den automatiske integreringen av topper fra testprøver, kontrollprøver og standarder også er konsistent, slik at utpakkede toppområder kan sammenlignes.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Uttak for Målrettet Stabil isotopfortynning Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS-aktivert Noninvasiv Metabolsk profilering

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

A Coupled Experiment-finite Element Modeling Methodology for Assessing High Strain Rate Mechanical Response of Soft Biomaterials

En Sammen Experiment-Finite Element Modeling Methodology for Assessing Høy Strain Rate Mekanisk Response av Soft biomaterialer

This study offers a combined experimental and finite element (FE) simulation approach for examining the mechanical behavior of soft biomaterials (e.g. ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Lukkbar Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Syntese av Biokompatible Liquid Crystal Elastomer Skum som Cell Stillas for 3D Spatial cellekulturer

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntese av smittsomme Bacteriophages i en E. coli -basert Cell-free uttrykk System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Visuell gjenkjenning av flere nukleinsyrer i kapillær arrayet

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En flerlags Mikrovæskebasert plattform for gjennomføring av langvarig Cell-gratis Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Kreft deteksjon av eggstokkene bruke Photoacoustic Flow flowcytometri

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Samtidig kvantifisering av utvalgte kynureniner analysert av flytende kromatografi-massespektrometri i medium samlet fra kreftcellekulturer

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...