Name: liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems
Uploaded: 2021-09-23T14:45:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Esta pesquisa foi patrocinada pelo Programa de Ciência Genômica, Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciência, Pesquisa Biológica e Ambiental, como parte da Área de Foco Científico de Interfaces de Micróbios Vegetais (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory é gerenciado pela UT-Battelle, LLC, para o Departamento de Energia dos EUA sob contrato DE-AC05-00OR22725. Este manuscrito foi de autoria da UT-Battelle, LLC sob o contrato DE-AC05-00OR22725 com o Departamento de Energia dos EUA. O Governo dos Estados Unidos mantém e o editor, ao aceitar o artigo para publicação, reconhece que o Governo dos Estados Unidos mantém uma licença mundial não exclusiva, paga, irrevogável para publicar ou reproduzir a forma publicada deste manuscrito, ou permitir que outros o façam, para fins do Governo dos Estados Unidos. O Departamento de Energia fornecerá acesso público a esses resultados de pesquisas patrocinadas pelo governo federal de acordo com o Plano de Acesso Público do DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

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P., Maisano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+for+quantitative+amino+acid+analysis.">Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).</li><li>Hauck, T., Landmann, C., Br&#252;hlmann, F., Schwab, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone+in+cytosolic+extracts+obtained+from+Zygosaccharomyces+rouxii.">Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).</li><li>Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. 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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou outros conflitos de interesse.

A abordagem desmeque HPLC-RID pode ser usada para quantificar com sucesso o consumo de substrato de açúcar e conversões subsequentes para grandes produtos orgânicos de ácido orgânico e álcool do metabolismo central de lisato ao longo do tempo. Além disso, este protocolo emprega um método isocrático simples usando uma única fase móvel, requer uma preparação mínima da amostra e permite uma simples análise a jusante direcionada. Os analitos medidos pelo método HPLC-RID são distinguidos unicamente por seus tempos de retenção e, portanto, suas interações com a resina de coluna selecionada. A coluna HPLC utilizada aqui foi particularmente projetada para separar carboidratos, ácidos orgânicos e álcoois, combinando exclusão de tamanho e troca de ligantes (ou seja, cromatografia de partição moderada por íons). O método descrito é, portanto, útil para uma análise mais direcionada de substratos de carboidratos e selecionar produtos finais de vias de fermentação de glicose que devem facilitar e energizar principalmente as biotransividamentos à base de lysato8,15,21. No entanto, este protocolo não contabiliza a ativação de outras vias metabólicas em extratos celulares. Os gasodutos que empregam outras técnicas de separação cromatográfica (ou seja, cromatografia de interação hidrofílica), métodos de elução gradiente, preparação de amostras mais complicadas (ou seja, derivatização) e diferentes detectores ópticos (por exemplo, detectores de dispersão de luz ultravioleta ou evaporativo) poderiam ser usados para detectar outros metabólitos, como aminoácidos e fosfatos de açúcar23,24 . Alternativamente, uma abordagem global para estudar o metabolismo do lysato pode ser tomada usando LC-MS/MS.
O método LC-MS/MS descrito é um único fluxo de trabalho para medir e identificar uma gama mais ampla de metabólitos. O LC-MS/MS é uma ferramenta analítica de última geração para o perfil metabolome devido à sua sensibilidade e capacidade de distinguir metabólitos por tempo de retenção e razões m/z com alta resolução16. Com foco nas vias metabólicas de carbono central e anabolismo aminoácido, o modo negativo MS/MS foi implementado para detectar especificamente ácidos orgânicos polares, fosfatos de açúcar e aminoácidos. Aliado a uma técnica de cromatografia nano-líquida, o método proporciona alta sensibilidade para detectar pequenas moléculas no fundo de lise complexa17. Em termos de perfil do metabolismo CFME baseado em lysate, no entanto, uma limitação do protocolo LC-MS/MS descrito é o seu limite de detecção mais baixo de 50 m/z, o que impede a medição do etanol, um produto importante no metabolismo de glicose lysate, bem como formato, ambos são facilmente quantificados pelo método detalhado HPLC-RID. Em comparação com o LC-MS/MS, o HPLC-RID tem a vantagem adicional de acessibilidade relativa em termos de custo e dificuldade. Até o último ponto, a solução de problemas do método LC-MS/MS descrito aqui pode exigir algum grau de experiência em espectrometria de massa. No entanto, a detecção de MS tem aplicações exclusivamente atraentes sobre rid, pois pode também distinguir isótopos rotulados em metabolomas, uma excelente técnica para entender o movimento de carbono a partir de substratos suplementados através da complexa rede metabólica18. Tal abordagem foi aplicada aqui suplementando reações com 13C6-glicose e analisando os valores relativos de abundância de metabólitos de 13C a jusante. A análise permitiu a definição de vias ativas e inativas, apoiando suposições relatadas anteriormente e fornecendo novos insights sobre o fluxo metabólico em lysates. Modificações também podem ser feitas dentro do método para análises específicas. Por exemplo, soluções padrão de compostos-alvo com 13C podem ser analisadas juntamente com amostras para alcançar medições quantitativas absolutas de moléculas derivadas de glicose ao longo do tempo e tirar conclusões sobre distribuições de fluxo. Uma melhor detecção de compostos carregados positivamente também pode ser habilitada dentro do fluxo de trabalho atual executando sequências com arquivos .meth ajustados para detecção positiva do modo.
A amostragem analítica em ambos os métodos descritos é convenientemente automatizada, garantindo alta reprodutibilidade. Além disso, podem ser esperadas corridas analíticas suaves, desde que sejam observadas práticas adequadas de manuseio de instrumentos e manutenção. Ao usar essas ferramentas para analisar as reações do CFME, considerações mais críticas devem ser feitas rio acima e a jusante da amostragem. Durante a preparação da amostra, é importante que os controles do curso de tempo sejam representativos do tempo zero. Aqui, as proteínas foram precipitadas em lisatos por acidificação para parar as reações metabólicas. Para amostras de tempo zero, o solvente ácido foi combinado com lisato antes de adicionar a mistura de reação contendo glicose. A acidificação com ácido tricloroacético efetivamente garantiu que a glicose não seja metabolizada no tempo zero, como mostrado nos dados HPLC-RID(Figura 2). Enquanto um procedimento semelhante para saciar o metabolismo da glicose foi realizado na análise relatada de LC-MS/MS, 13metabólitos rotulados por C foram detectados em amostras de tempo zero, embora em valores de abundância significativamente baixos em relação às amostras extraídas em momentos posteriores. Além disso, essas observações limitavam-se a intermediários da glicólise. Os dados sugerem que as reações retêm algum grau de atividade glicóltica após a acidificação com o solvente de extração detectado por este método altamente sensível. A extensão dessa atividade, no entanto, deve ser quantificada. Um estudo anterior relatou que solventes de extração ácida podem não saciar suficientemente reações glicolíticas intermediárias, mas podem parar o consumo significativo de glicose10. Embora isso continue sendo investigado no sistema utilizado aqui, mudanças drásticas nos valores relativos de abundância entre o tempo zero e as amostras de ponto de tempo posterior podem ser interpretadas como tendências no metabolismo da glicose. A exploração de métodos alternativos de extinção, no entanto, é recomendada em aplicações semelhantes, especificamente para a obtenção de quantidades absolutas de intermediários metabólicos10. Além disso, também devem ser observadas boas práticas durante análises de software a jusante. A consistência é imperativa ao integrar manualmente áreas de pico de sinais RID para reduzir o erro humano. A integração manual também deve ser aplicada às áreas de pico de padrões sempre que áreas de pico integradas manualmente estiverem sendo usadas para quantificar concentrações metabólicas em amostras. Ao longo da análise LC-MS/MS direcionada, as anotações provisórias da análise do MZmine devem ser validadas por verificação manual de pico usando um navegador de qualidade MS, e os recursos m/z só devem ser anotados quando erros de massa calculados forem aceitáveis. Aqui, essas análises foram realizadas manualmente para um conjunto limitado de metas, uma vez que ainda não está estabelecido um software abrangente e robusto para a busca de isótopos. No entanto, tais métodos automatizados para a busca de metabólitos rotulados em 13C estão atualmente emergindo e simplificariam análises mais complicadas também, como o perfil de lysates além do metabolismo central de carbono25.
A cromatografia líquida avançada é um método robusto e amplamente aplicado para separar pequenas moléculas em misturas metabólicas complexas11. Os métodos descritos acoplam essa técnica de separação com o índice refrativo ou detecção espectrométrica de massa para analisar com sucesso conversões metabólicas em reações CFME baseadas em lysato. O HPLC-RID e o LC-MS/MS são ferramentas individualmente poderosas para traçar o perfil do metabolismo de lises, e sua complementaridade pode ser ainda mais aproveitada para atender às limitações inerentes de cada técnica. Os métodos relatados permitem a aplicação e o desenvolvimento do CFME, pois podem ser utilizados para entender o metabolismo de lisestê, monitorar melhorias nas conversões de metabólicas e elucidar alterações no fluxo metabólito ao manipular o metabolismo de lise.

Limitações nos micróbios de engenharia para produção química podem ser abordadas recapitulando reações bioquímicas in vitro onde as funções de sobrevivência celular concorrentes estão ausentes1. Além disso, o ambiente de reação aberta (ou seja, ausência de membrana celular) é mais resistente à manipulação e é mais fácil de monitorar em comparação com células vivas. Este conceito fundamental de engenharia metabólica livre de células (CFME) tem sido elegantemente demonstrado pela reconstituição de vias metabólicas para sintetizar produtos químicos valiosos como hidrogênio e monoterpenos com métricas de produção que são ordens de magnitude superiores às apresentadas em fábricas de células microbianas até agora1,2,3 . Os métodos para purificar caminhos inteiros, no entanto, são atualmente limitados pelo tempo e custo. Alternativamente, sistemas metabólicos livres de células podem ser derivados de extratos de células brutas através de métodos rápidos e baratos em relação à reconstituição de toda a via4. O metabolismo central retido nos extratos celulares pode ser suplementado com substratos de energia (por exemplo, glicose e cofatores enzimáticos) e sais em soluções tamponadas para gerar precursores metabólicos centrais por mais de 24horas, 5,6. A adição de enzimas exógenas à reação cfme baseada em lisato permite bio-transformações mais complexas de glicose em produtos químicos mais valiosos em títulos elevados4,6,7. Embora o rendimento tende a ser comprometido nesses sistemas devido à sua complexidade metabólica semelhante à célula, métodos únicos para curadoria de proteomes de liseto para maior conversão de rendimento foram e estão sendo desenvolvidos7,8.
A facilidade de realizar transformações metabólicas em sistemas livres de células baseadas em liseto faz com que essas excelentes plataformas para mover a fabricação química fora da célula completamente ou para prototipar novas vias com alta produtividade antes de construir e testar esses projetos in vivo2,9. Para qualquer aplicação, ferramentas para monitorar conversões metabólicas ou observar alterações globais no fluxo metabólico em lysates são fundamentais para o avanço do CFME. A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) pode ser usada para separar os constituintes químicos das reações cfme com alta resolução e pode ser acoplado a detectores ópticos ou espectrométricos em massa para quantificação metabólica5,10. O princípio subjacente do HPLC é que os analitos dissolvidos em uma fase solvente (ou seja, fase móvel) e bombeados através de uma coluna interagirão com o material específico de embalagem de coluna (ou seja, fase estacionária)11. Dependendo de suas propriedades químicas, esses analitos apresentam tempos de retenção variados antes de serem eventualmente elucidos da fase estacionária e transportados pela fase móvel para um detector. Este relatório detalha a preparação e análise das reações de CFME baseadas em E. coli através de métodos baseados em HPLC que aproveitam a detecção rid e MS/MS.
O HPLC acoplado à detecção de índices refrativos (HPLC-RID) é um método geralmente acessível para identificar rapidamente precursores metabólicos centrais e produtos finais. Brevemente, rid mede como os analitos alteram a deflexão da luz pela fasemóvel 12. Os sinais RID correspondentes aos analitos de destino em amostras podem então ser quantificados por comparações com sinais RID de soluções padrão. Em aplicações CFME, este modo de detecção tem sido mais comumente utilizado com colunas HPLC que separam compostos baseados em uma combinação de mecanismos de exclusão de tamanho e troca de ligantes, ou cromatografia de partição moderadapor íons 5,6,8,13. Esta técnica em particular é usada para quantificar rapidamente o consumo de substratos de açúcar como glicose, bem como a formação de produtos de fermentação como succinato, lactato, formato, acetato e etanol nas reações CFME à base de lysato8. Registrar as mudanças de concentração desses compostos via HPLC tem sido útil tanto para elucidar o potencial de extratos de células brutas para agrupar precursores metabólicos centrais quanto entender como o fluxo de vias é redirecionado através de vias fermentativas durante conversões metabólicas complexas de glicose noslysates 6,8,14. Estudos seminal de CFME em extratos de células E. coli confirmam que os compostos de fermentação se acumulam como produtos finais de catabolismo de glicose e também ocorrem como subprodutos indesejados em lises que expressam enzimas exógenasexcessivas 6,15. Sugere-se que o metabolismo fermentativo desempenha um papel necessário na regeneração de equivalentes de redox de cofatores (ou seja, NAD(P)H e ATP) para sustentar reações glicolíticos8. Assim, um método de detecção óptica baseado em HPLC projetado para separar produtos de fermentação é uma ferramenta útil e comumente aplicada ao executar várias tarefas cfme baseadas em lysate.
O CFME pode ser implementado para acumular produtos finais metabólicos que não sejam carboidratos, ácidos orgânicos ou álcoois4. A medição de intermediários que são consumidos tão rapidamente quanto sintetizados também pode ser desejável10. Embora o HPLC-RID seja acessível em termos de custo e dificuldade, este método é limitado por sua capacidade de distinguir apenas metabólitos com base no tempo de retenção. Uma gama mais ampla de metabólitos pode ser analisada quando a cromatografia líquida é acoplado à detecção de MS/MS (LC-MS/MS)16. Por este método, os analitos na fase móvel são ionizados e detectados diferencialmente com base na massa de cada molécula e propriedades de carga. O conhecimento tanto da relação massa-carga (m/z) do metabólito quanto do tempo de retenção na coluna facilita assim a separação da maioria dos intermediários metabólicos e produtos finais com alta resolução16. Esta técnica de detecção também pode ser acoplada à cromatografia nano-líquida, que proporciona taxas de fluxo muito mais baixas e volumes de injeção de amostra, permitindo uma detecção mais sensível de pequenas moléculas no fundo de lysato complexo17. O LC-MS/MS pode ser aplicado adicionalmente com rotulagem de isótopos, uma vez que as etiquetas incorporadas transmitem alterações nos valores m/z deanalitos 18. As medidas de ponto de tempo extraídas de uma reação de CFME suplementada com um substrato de 13C6-glicose podem, assim, determinar o final ou subprodutos derivados especificamente da glicose suplementada. Embora este método de rastreamento de isótopos ainda não seja comumente aplicado em estudos de CFME, é uma ferramenta poderosa para entender conversões metabólicas em sistemas CFME baseados em lisato, especificamente uma vez que as contra-contrações de sal (ou seja, acetato e glutamato) nessas reações também são catabolizadas como substratos secundários19. Aproveitar essa técnica pode, assim, desenhar uma imagem abrangente do metabolismo da glicose em lysates, que até hoje não é completamente compreendido. Aqui, o protocolo detalha um método de cromatografia nano-líquida acoplado à ionização nanoeletrática (nano ESI) MS que pode ser usado para interrogar um possível modelo de metabolismo de glicose, especificamente em E. coli lysates(Figura 1). O modelo baseia-se em relatos de vias fermentativas e a via fosfato pentose ativa em E. coli lysates derivados de cepas cultivadas em mídia rica5,6,8,14. A técnica também é usada para investigar a produção de aminoácidos, uma vez que o conhecimento atual sobre o anabolismo aminoácido a partir da glicose em lisatos limita-se a alguns exemplos, como a síntese de aminoácidos aromáticos7. Dada a natureza majoritariamente polar dos produtos finais e intermediários nessas vias (ou seja, ácidos orgânicos, fosfatos de açúcar e aminoácidos), utilizou-se cromatografia líquida em faseversa. Esta técnica separa compostos polares por eluição de uma fase estacionária não polar. Esses compostos foram então ionizados por nano ESI no modo íon negativo que permite a detecção de analitos com pelo menos uma carga elementar negativa e, portanto, é útil para detectar compostos ácidos. Esta técnica é utilizada aqui para analisar metabólitos derivados da glicose de 13C e demonstra a utilidade da LC-MS/MS para a compreensão do metabolismo da glicose em lysates.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m centrifuge tube filters (spin columns)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Binary LC Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1312B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity High Performance Degasser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4225A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Refractive Index Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7162A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Standard Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1329B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374</td>
			<td>CFME reaction mix component (LC-MS/MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.20 &#956;m pore (PES membrane) filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminex HPX 87-H column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1250140</td>
			<td>Chromatography column for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1376</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vial caps (yellow, snap)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-50Y</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W225181</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-dextrose (Glucose)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9230</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8281</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC/MS grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica (internal diameter of 100 &#956;m, external diameter of 375 &#956;m)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>WM22005-ND</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetex 5 &#956;m C18 stationary phase (100 &#197;)</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0632</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanospray Ionization Source</td>
			<td>ThermoFisher Scientific/Proxeon</td>
			<td>ES071 (newest model)</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenLab CDS (Online) Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 2.15.26</td>
			<td>Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 2.7</td>
			<td>Software for tuning the LC-MS/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps (with septa, 9 mm)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29315-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwthread glass vials (2 mL)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29376-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>247596</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71716</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>398055</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>Solvent preparation for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-acetate</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-090-100</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Solvent Rack: SRD-3600</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6500</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 3.0.63</td>
			<td>Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems

O metabolismo celular de engenharia para biossíntese direcionada pode exigir extensos ciclos de aprendizado de projeto-construção-teste (DBTL) à medida que o engenheiro trabalha em torno dos requisitos de sobrevivência da célula. Alternativamente, a realização de ciclos DBTL em ambientes livres de células pode acelerar esse processo e aliviar as preocupações com a compatibilidade do host. Uma abordagem promissora para a engenharia metabólica livre de células (CFME) aproveita extratos de células brutas metabolicamente ativos como plataformas para a biocoformação e para a rápida descoberta e prototipagem de proteínas e caminhos modificados. Realizar esses recursos e otimizar o desempenho do CFME requer métodos para caracterizar o metabolome de plataformas sem células baseadas em lysato. Ou seja, ferramentas analíticas são necessárias para monitorar melhorias nas conversões metabólicas e em elucidar alterações ao fluxo metabólito ao manipular o metabolismo do lysate. Aqui, foram aplicadas análises metabólicas utilizando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) juntamente com detecção espectrométrica óptica ou de massa para caracterizar a produção metabólica e o fluxo em lysatos E. coli S30. Especificamente, este relatório descreve a preparação de amostras de lises CFME para análises de HPLC utilizando detecção de índices refrativos (RID) para quantificar a geração de intermediários metabólicos centrais e subprodutos na conversão de substratos de baixo custo (ou seja, glicose) para vários produtos de alto valor. A análise da conversão metabólica em reações de CFME alimentadas com glicose rotulada em 13C através de cromatografia líquida de fase inversa acoplada à espectrometria de massa tandem (MS/MS), uma poderosa ferramenta para caracterizar rendimentos específicos de metabólitos e fluxo metabólico de liseto a partir de materiais iniciais, também é apresentada. Ao todo, a aplicação desses métodos analíticos ao metabolismo de lisesato CFME permite o avanço desses sistemas como plataformas alternativas para a execução de tarefas de engenharia metabólica mais rápidas ou novas.

Para quantificar a síntese sem células à base de lysato de produtos de fermentação comum a partir da glicose, os lysates derivados de cepas cultivadas em mídia 2xYPTG foram alimentados com 100 μM de glicose como fonte primária de carbono8. As reações foram interrompidas durante um curso de tempo de 24 horas por acidificação de proteínas. Supernantes filtrados contendo piruvato, succinato, lactato, formate, acetato e etanol produzidos a partir do catabolismo de glicose foram carregados no módulo autosampler de um sistema HPLC equipado com um módulo RID. Frascos com misturas filtradas de produtos finais fermentativos e glicose a 1,17 μM, 2,34 μM, 4,69 μM, 9,38 μM, 18,75 μM, 37,50 μM, 75 μM e 150 μM de concentrações no buffer S30 foram carregadas no instrumento como padrões. Os analitos foram eluted isocraticamente de uma coluna HPLC para o RID. Os picos de glicose, succinato, lactato, formate, acetato e etanol dentro da faixa de 1 a 150 μM poderiam ser resolvidos pela RID. As áreas de pico para glicose foram derivadas pela integração manual dos dados RID para o curso de tempo e amostras de curva padrão. As áreas de pico extraídas para succinato, lactato, formate, acetato e etanol foram retiradas de sinais automaticamente integrados. Todas as curvas padrão (área de pico versus concentração conhecida) tinham valores R2 >0,99 e eram lineares em toda a gama de concentrações utilizadas aqui.
As concentrações molares para todos os analitos-alvo foram calculadas a partir de suas respectivas curvas padrão. A glicose foi consumida nas primeiras 3h da reação e fermentada principalmente para lactato (Figura 2A,B). O acúmulo de etanol também ocorreu significativamente nas primeiras 3h da reação e parou depois(Figura 2C). A observação da significativa produção de lactato e etanol com consumo significativo de glicose após 3h não foi inédita, uma vez que as vias de produção de lactato e etanol permitem a regeneração de 1 nadh de nadh de nadh glilítico necessário para o consumo contínuo de glicose por meio da glicolise(Figura 1). O lactato e o etanol podem, portanto, ser considerados como os principais produtos finais de fermentação no metabolismo de glicose sem células à base de lysato. O acetato estava inicialmente presente nas reações como um componente do tampão S30 e inesperadamente só se acumulou devido ao metabolismo após 6h quando o consumo de glicose havia desacelerado(Figura 2D). Este resultado sugere que a fermentação de acetatos não necessariamente permite fluxo glicolítico rápido em pontos de tempo anteriores. Enquanto isso, formato e succininato foram sintetizados como produtos de fermentação menor (Figura 2E,F). Ao todo, o método possibilitou a quantificação absoluta do esgotamento do substrato de açúcar e a formação de produtos fermentativos em e. coli S30.
A detecção de ESM para traçar o metabolismo de glicose de lysate foi aplicada especificamente aqui. Os lysatos derivados de cepas cultivadas em mídia 2xYPTG foram alimentados com 13C6-glicose como fonte de carbono. As reações do CFME foram realizadas em triplicado por 0h, 1 h, 2 h e 3h. Amostras de cada ponto de tempo foram carregadas em um sistema LC equipado com uma coluna de fase invertida e acoplado a espectrômetros de massa de fourier e de captura de íons. Espectros do modo íon negativo foram obtidos e processados para analisar ácidos orgânicos, fosfatos de açúcar e aminoácidos. Foram pesquisadas massas teóricas calculadas de 13espécies rotuladas por C pertencentes ao metabolismo central de carbono para identificar especificamente compostos derivados da glicose. Com base nas condições de cultivo da cepa de origem utilizada e relatórios prévios de vias ativas em E. coli CFME, presume-se aqui que o proteome lisato compreende uma rede metabólica que alimenta a glicose na fermentação glicóltica, na via fosfato pentose e possivelmente no anabolismo de aminoácidos5,6,7,8,14 (Figura 1). Portanto, a busca foi reduzida aos membros dessas vias, dos quais 16 metabólitos que incorporam rótulos de 13C derivados da glicose foram inequivocamente anotados(Tabela Suplementar 1).
13 C6-glicose foi consumida observamente através da glicólise, como evidenciado pelas flutuações em abundâncias intermediárias glicolíticas(Figura 3A-E). Consistente com os dados HPLC-RID, a glicose acumulou até 13C3-lactato e também foi fermentada para 13C3-succinato nas primeiras 3h da reação (Figura 4A,B). A formação de isotopologue de 13C3-succinato suporta o modelo proposto de metabolismo de glicose de lysato(Figura 1),onde o succinato provavelmente será gerado pela carboxilação da molécula de fosfoenolpyruvate de 3 carbonos (PEP) e não desde a entrada de uma molécula de acetil-CoA de 2 carbonos até o ciclo TCA. A ativação do ciclo TCA foi assumida em estudos anteriores do CFME, mas outros 13intermediários rotulados por C de TCA não foram detectados aqui8,19,21. 13 C3-aspartate síntese no entanto ocorreu dentro do primeiro h e foi consumida, reforçando a ideia de que pep é diretamente convertido em oxaloacetato (Figura 1, Figura 6C). Os dados refletem um proteome de liseto de cepas de origem colhidas durante o crescimento fermentativo em mídia rica em glicose (2xYPTG). Isso implicaria ainda que o resto das enzimas TCA que não participam da produção de succinato formam um ramo oxidativo de TCA(Figura 1). Nenhum dos metabólitos nesta via, no entanto, foi detectado, possivelmente porque altas concentrações de glutamato adicionadas à reação do CFME como contração do sal impedem a progressão deste ramo. 
Os dados HPLC-RID são adicionalmente complementados pela falta de detecção de acetato de 13C2dentro do prazo de reação de 3 horas, sugerindo que não há acúmulo de acetato de glicose até 3 h(Figura 2B). No entanto, o precursor direto do acetato, acetil-fosfato (acetil-P), acumulou, sugerindo que o braço Pta da via Pta-AckA para síntese de acetato de acetil-CoA está ativo(Figura 4C,D). A desfosforilação catalisada de 13C2-acetil-P a 13C2-acetato provavelmente não ocorre dentro deste prazo devido ao acetato ser um componente principal do tampão S30 usado nas reações (Figura 1, Figura 2B).
Também foi observada a incorporação de 13C6-carbonos derivados da glicose aos fosfatos de açúcar 6-fosfogluconolactona (6PGL), 6-fosfogluconato (6PG), ribulose-5-fosfato (Ru5P) e sedoheptulose-7-fosfato (S7P) (Figura 5). Esses resultados confirmam a participação da via fosfato pentose no metabolismo da glicose de lysato e provavelmente alimentam 13C 9-tyrosine síntese, que já foi sugerida antes por um estudo proteômico, ao mesmo tempo em que fornece um precursor para a produção de 13C5-histidina(Figura 6A, B)7. Fenilalanina e triptofano não foram observados aqui, e nem a maioria dos aminoácidos essenciais. No entanto, isso não é totalmente surpreendente, uma vez que o anabolismo aminoácido provavelmente será enriquecido em lisatos derivados de células cultivadas em condições famintas de nutrientes ou na fase estacionária7,22. Além disso, os dados até agora sugerem que os intermediários da glicólise e da fermentação são funneled para cofator regenerando reações finais, que devem impedir a síntese de muitos aminoácidos derivados do gliceraldeído-3-fosfato, piruvato e acetil-CoA (ou seja, glicina, cisteína, serina, alanina, valina, leucina e lisina)(Figura 1). Como mencionado, 13C3-aspartato foi produzido na primeira hora, enquanto os aminoácidos derivados de aspartato derivados de aspartato de 13C (ou seja, threonina, isoleucina, metona e asparagine) não foram observados possivelmente porque o aspartato derivado da glicose participa da fermentação(Figura 1, Figura 6C). Por fim, o fluxo para glutamato rotulado e aminoácidos derivados do glutamato pode ter sido impedido por altos níveis de glutamato no ambiente de reação(Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig01.jpg"> Figura 1: Um modelo metabólico putativo de lises derivados de E. coli BL21DE3-Star crescendo exponencialmente em altas concentrações de glicose. Intermediários e produtos finais de glicólise (verde), a via fosfato pentose (laranja escura) e vias fermentativas (azul) de acetil-CoA foram relatados em CFME à base de lysato. A presença de fermentação de succinita implica a ativação do ramo oxidativo TCA (cinza). O anabbolismo aminoácido (ouro) em lisatos não é bem definido e é investigado aqui. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig02.jpg"> Figura 2: Dados HPLC-RID para consumo de glicose e síntese de produtos finais fermentativos em reações CFME preparadas com extratos brutos de E. coli. (A) Consumo de glicose e(B) lactato,(C) etanol, (D) acetato, (E) formato e (F) produção de succinato em reações CFME foram monitorados ao longo de 24 h. Concentrações médias de MM e barras de erro (SE) quantificadas com curvas padrão são apresentadas (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig03.jpg"> Figura 3: Tendências do curso de tempo de 13C6-glicose e intermediários glicolíticos com 13C no E. coli lysate CFME. Abundância relativa de (A) 13C6-glicose, (B) 13C6-glicose-6-fosfato/frutose-6-fosfato, (C) 13C6-frutose-1,6-bisfosfato, (D) 13C3-glicealdeído-3-fosfato/dihidroxyaceona fosfato, e (E) 13C6 -piruvato em reações CFME acima de 3 h. Áreas de pico brutas extraídas pelo software mzMINE foram utilizadas para calcular médias e barras de erro (SE) para anotações positivas (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig04.jpg"> Figura 4: Tendências do curso de tempo de intermediários e produtos finais em 13C6-fermentação de glicose em E. coli lysate CFME. Abundâncias relativas de (A) 13C3-lactato, (B) 13C3-succinato, (C) 13C2-acetil-fosfato, e (D) 13C2-acetil-CoA em reações CFME acima de 3 h. Áreas de pico brutas extraídas pelo software mzMINE foram utilizadas para calcular médias e barras de erro (SE) para anotações positivas (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig05.jpg"> Figura 5: Tendências do curso de tempo de 13C6-glicose derivadas da via fosfato de fosfato em E. coli lysate CFME. Abundâncias relativas de (A) 13C6-6-fosfogluconolactona, (B) 13C6-6-fosfogluconato, (C) 13C5-ribulose-5-fosfato, e (D) 13C7-sedoheptulose-7-fosfato sobre 3 h. Áreas de pico brutas extraídas pelo software mzMINE foram utilizadas para calcular médias e barras de erro (SE) para anotações positivas (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig06.jpg"> Figura 6: Tendências do curso de tempo detectadas 13C6-aminoácidos derivados de glicose em E. coli lysate CFME. Abundâncias relativas de (A) 13C9-tyrosine, (B) 13C5-histidina, e (C) 13C3-aspartate acima de 3 h. Áreas de pico brutas extraídas pelo software mzMINE foram utilizadas para calcular médias e barras de erro (SE) para anotações positivas (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Cromograma HPLC-RID representativo mostrando picos para produtos fermentativos principais em uma reação CFME incubada a 37 °C por 24 h. Picos de glicose, succinito, lactato, formato, acetato e etanol são suficientemente distinguíveis por seus tempos de retenção em uma coluna HPLC durante a eluição isocrática com solvente de ácido sulfúrico de 5 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-Suppfig1.eps" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura suplementar 2: Espectros de massa representativos para metabólitos rotulados em 13C, especificamente (A) lactato,(B) glicose e (C) 6-fosfogluconato (6PG) em uma reação CFME incubada a 37 °C por 1 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-SuppFig2.eps" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Tabela suplementar 1: Lista de metabólitos detectados com 13C, tempos de retenção (alinhados entre amostras usando MZmine), teóricos de modo negativo de 13C, valores m/z, valores m/z de recursos detectados e erros de massa calculados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/Supplemental%20Table%201.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Os protocolos descrevem métodos de cromatografia líquida de alto desempenho acoplados ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para estudar reações metabólicas em sistemas complexos de isenta de células baseadas em lysato.

Cromatografia líquida acoplada ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para perfil metabólito em sistemas livres de células baseadas em lysato

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

Este protocolo usa a detecção de índices refrativos para medir subprodutos do metabolismo de carbono que são comumente acumulados em sistemas sem células baseados em lysato. Ele também faz uso de espectrometria de massa para detectar um painel ainda mais amplo de metabólitos centrais que são gerados em lisatos metabolicamente ativos. As duas técnicas utilizadas neste protocolo fornecem a capacidade de descrever quantitativamente as reações químicas ocorridas em um sistema sem células, com base em lisesto, possibilitando detectar uma gama mais ampla de metabólitos, incluindo aqueles presentes em baixas concentrações no complexo fundo lysate.Os procedimentos serão Jaime Lorenzo Dinglasan e David Reeves, pesquisadores graduados da Divisão de Biociências. Comece combinando os diferentes componentes em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro para preparar reações finais com 4,5 miligramas por mililitro de proteína total de liseto. Prepare a engenharia metabólica livre de células, ou CFME, reações com volumes finais de 50 microliters em triplicado por ponto de tempo.Termine as reações triplicadas em seus pontos de tempo apropriados imediatamente adicionando um volume igual de ácido tricloroacético de 5% ao volume final de reação de cada amostra. Em seguida, diluir cada amostra adicionando duas vezes o volume de água estéril a cada mistura de reação. Para recapitular o tempo zero, misture o mesmo volume de ácido tricloroacético de 5% como o volume total de reação final com o lisato antes de adicionar o resto dos componentes de reação.Esta etapa de acidificação precipita enzimas lisato antes de metabolizar significativamente a glicose. Vórtice as amostras e centrífugas em uma microcentrifuagem benchtop a 11.600 vezes g por cinco minutos, e transfira os supernacantes contendo os analitos orgânicos para tubos limpos. Armazene as amostras a menos 20 graus Celsius se as análises do HPLC forem realizadas mais tarde.Certifique-se de descongelar as amostras armazenadas no gelo antes de prosseguir para o próximo passo. Filtre cada supernante com um filtro de poros de 0,22 micrômetro. Após a centrífuga, transfira cada filtrado para um frasco de vidro HPLC limpo.Carregue os frascos na bandeja do autosampler do sistema HPLC que já foi configurado para análise. Na barra de menu, selecione Sequência, Novo Modelo de Sequência. Selecione Sequência.Salvar o modelo de sequência como nome de modelo de sequência S.Selecionar sequência, tabela de sequência. Linhas de apêndice N correspondentes aos frascos N. Em seguida, insira posições de frasco e nomes de amostra sob frasco e nome da amostra, respectivamente, de acordo com seu arranjo na bandeja do autosampler.Selecione o método gerado como descrito no manuscrito do menu suspenso Method Name e insira 50 microliters como injeção por frasco para cada linha. Clique em Aplicar e salvar o modelo de sequência selecionando Sequência, Modelo de sequência. Certifique-se de que o modelo de sequência seja carregado selecionando sequência, modelo de sequência, nome do modelo de sequência S.Depois de alcançar uma linha de base estável no plot on-line, clique com o botão direito do mouse no módulo RID do painel, controle, válvula de reciclagem para direcionar o fluxo de solventes através do detector RID para o lixo.Para iniciar a aquisição de dados, selecione Sequência na barra de menu e selecione Tabela de sequência, Executar. Selecione a exibição de análise de dados no menu Exibir. Localize o nome do arquivo de sequência da lista de arquivos no lado esquerdo da tela.No painel central na tela, vá para a Seleção de exibição de sinal, SINAL RID para visualizar os cromatogramas de amostra. Selecione uma linha correspondente a qualquer uma das amostras do painel superior na tela. Os picos correspondentes aos analitos alvo serão organizados ao longo do eixo do tempo de retenção como glicose, succinato, lactato, formate, acetato e etanol em amostras onde todos esses metabólitos estão presentes.Discerna se os picos de interesse estão bem integrados pelo software. Uma linha vermelha deve ser automaticamente desenhada como base de cada pico. Se a linha vermelha for askew, a integração automática falhou.Em seguida, selecione o botão Integração Manual no Conjunto de Ferramentas de Integração e desenhe manualmente uma base de pico para integrar a área de pico. Selecione a ferramenta Cursor no Conjunto de Ferramentas Comuns para clicar em picos devidamente integrados. A área de pico e o tempo de reação correspondente do pico selecionado serão destacados como uma linha de mesa no painel inferior da tela.Para exportar áreas de pico, selecione Arquivo, Exportação, Resultados de Integração. Valores de área de pico de gráfico versus concentrações conhecidas de amostras em uma planilha. Clique com o botão direito do mouse nos dados plotados e selecione Adicionar linha de tendência, linha de tendência de formato, exibir equação no gráfico.Em uma planilha separada, use as equações das linhas de tendência de curva padrão para converter valores de área de pico em concentrações para cada analito de cada amostra. Calcule as áreas de pico média e os valores de erro padrão entre os triplicados para visualização de dados. Configure reações triplicadas por ponto de tempo, exceto o tempo zero, no gelo, conforme descrito no manuscrito.Em vez de glicose, use uma concentração final de glicose de 100 milimões-13C6 nas reações. Incubar as reações a 37 graus Celsius por uma, duas e três horas. Para começar com a análise, pipeta um volume equivalente do solvente de extração para cada amostra.Se as amostras foram congeladas, adicione o solvente de extração antes que as amostras descongelem completamente para evitar a reativação do metabolismo da glicose. Realize todas as etapas de processamento de amostras no gelo. Para recapitular o tempo zero, pipeta o volume final de solvente de extração a um volume apropriado de lise para a concentração final desejada de 4,5 miligramas por mililitro em 50 microlitradores de volume de reação.Adicione o resto dos componentes de reação conforme descrito anteriormente. Esta etapa de acidificação precipita enzimas lisato antes de metabolizar significativamente a glicose. Incubar as amostras em solvente de extração no gelo por 30 minutos com agitação suave.Em seguida, centrifugar as amostras a 21.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius para separar o sobrenante da proteína precipitada. Transfira 50 microlitadores do supernatante para frascos de automapeador e carregue os frascos na bandeja dentro do autosampler de quatro graus Celsius. Após a preparação do instrumento para análise, configure uma sequência de execução usando o software de aquisição e interpretação de dados do sistema LC-MS/MS.Dentro do Roteiro, Configuração de sequência, clique com o botão direito do mouse na tabela para inserir tantas linhas quanto amostras. Para cada linha, ajuste o volume de injeção para cinco microlitrais e a posição para a respectiva posição do frasco na bandeja do autosampler. Insira nomes de arquivos como nomes de exemplo e defina o caminho de arquivo desejado para obter resultados de execução.Para iniciar a execução, destaque todos os nomes de arquivos na sequência. Na barra de menu, selecione Ações, Executar sequência. Abra mzmine, e importe os arquivos de saída bruto obtidos anteriormente.Na barra de menu, selecione Métodos de Dados Brutos, Importação bruta de dados e selecione os arquivos correspondentes às amostras. Siga os passos descritos no manuscrito para concluir a análise de MZmine. Exporte as áreas de pico bruto no final da análise de MZmine como um arquivo CSV.Abra uma planilha para calcular as massas de metabólitos rotulados em 13C do metabolismo da glicose para a pesquisa direcionada. Use massas calculadas de metabólitos com etiqueta 13C para pesquisar e anotar recursos de massa para carga a partir dos resultados do MZmine. Verifique manualmente os espectros das anotações putativas em um navegador de qualidade para confirmar as anotações.Mapa de estrada aberto, Qual Browser. A partir da barra de ferramentas, abra arquivo bruto para importar dados de MS brutos de cada amostra. Desenhe uma linha sob a faixa desejada de tempos de retenção correspondente à anotação putativa no cromatágrama de íon total para visualizar um espectro de massa.Nos experimentos HPLC-RID, a glicose foi consumida nas primeiras três horas da reação e, principalmente, fermentada ao lactato. O acúmulo de etanol também ocorreu significativamente nas primeiras três horas da reação e parou depois disso. O acetato estava inicialmente presente nas reações como um componente do tampão S30 e só se acumulou devido ao metabolismo após seis horas, quando o consumo de glicose havia desacelerado.O lactato e o etanol podem, portanto, ser considerados como os principais produtos finais de fermentação no metabolismo de glicose à base de lysato e livre de células. Observou-se que tanto o formate quanto o succinato foram sintetizados como produtos de fermentação menores. A glicose-13C6 foi consumida observamente através da glicólise, como evidente pelas flutuações em intermediários glicógliticos.Consistente com os dados de detecção do índice de refração HPLC, a glicose acumulou-13C3 e também foi fermentada para succinato-13C3 nas primeiras três horas da reação. Também foi observada a incorporação de carbonos derivados de glicose-13C6 em fosfatos de açúcar 6-fosfogluconolactona, 6-fosfogluconato, ribulose-5-fosfato e sedoheptulose-7-fosfato, confirmando a participação da via fosfato pentose no metabolismo de glicose de lyse. O metabolismo da glicose de lysato alimentou a síntese de tiranosina-13C9, ao mesmo tempo em que forneceu um precursor para a produção de histidina-13C5.É importante que as amostras de controle representem precisamente o tempo zero. Portanto, certifique-se de que as proteínas do lysate sejam inativadas antes da mistura na solução que contém fontes de energia. Também garanta que a integração automática de picos a partir de amostras de teste, amostras de controle e padrões também seja consistente, de modo que as áreas de pico extraídas sejam comparáveis.

Research

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