Name: liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems
Uploaded: 2021-09-23T14:45:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Это исследование было спонсировано Программой геномных наук Министерства энергетики США, Управлением научных, биологических и экологических исследований в рамках научной области взаимодействия микробов растений (http://pmi.ornl.gov). Национальная лаборатория Оук-Ридж управляется компанией UT-Battelle, LLC для Министерства энергетики США по контракту DE-AC05-00OR22725. Эта рукопись была написана UT-Battelle, LLC по контракту DE-AC05-00OR22725 с Министерством энергетики США. Правительство Соединенных Штатов сохраняет за собой, а издатель, принимая статью к публикации, признает, что правительство Соединенных Штатов сохраняет за собой неисключительную, оплаченную, безотзывную всемирную лицензию на публикацию или воспроизведение опубликованной формы этой рукописи или разрешение другим лицам делать это для целей правительства Соединенных Штатов. Министерство энергетики обеспечит публичный доступ к этим результатам исследований, спонсируемых федеральным правительством, в соответствии с Планом общественного доступа Министерства энергетики США (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

<ol>
	<li>Rollin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+hydrogen+production+from+biomass+by+in+vitro+metabolic+engineering:+Mixed+sugars+coutilization+and+kinetic+modeling.">High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).</li><li>Bowie, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biochemistry:+The+bio-inspired+cell-free+approach+to+commodity+chemical+production.">Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production.</a> Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).</li><li>Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+platform+for+cell+free+production+of+monoterpenes+from+glucose.">A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose.</a> Nature Communications. 8, 1-8 (2017).</li><li>Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosynthesis+of+limonene+using+enzyme-enriched+Escherichia+coli+lysates.">Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates.</a> Synthetic Biology. 4 (1), 003 (2019).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+potential+of+crude+cell+extracts+for+producing+pyruvate+from+glucose.">Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose.</a> Synthetic Biology. 3, (2018).</li><li>Kay, J. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysate+of+engineered+Escherichia+coli+supports+high-level+conversion+of+glucose+to+2,3-butanediol.">Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol.</a> Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).</li><li>Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+growth+medium+dropouts+promote+aromatic+compound+synthesis+in+crude+E.+coli+cell-free+systems.">Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysate+proteome+engineering+strategy+for+enhancing+cell-free+metabolite+production.">A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production.</a> Metabolic Engineering Communications. 12, 00162 (2021).</li><li>Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+pathway+prototyping.">Cell-free synthetic biology for pathway prototyping.</a> Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+cell-free+extract+reaction+(CFER)+system+in+Clostridium+thermocellum+to+identify+metabolic+limitations+to+ethanol+production.">Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production.</a> Frontiers in Energy Research. 8, 72 (2020).</li><li>Coskun, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Separation Tecniques: Chromatography. 3, (2016).</li><li>Bernardes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+acids+and+alcohols+quantification+by+HPLC/RID+in+sugarcane+vinasse:+analytical+method+validation+and+matrix+effect+assessment.">Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment.</a> International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computationally+guided+discovery+and+experimental+validation+of+indole-3-acetic+acid+synthesis+pathways.">Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways.</a> ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).</li><li>Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+control+of+cell-free+metabolism+through+pH+modulation.">Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation.</a> Synthetic Biology. 5, (2020).</li><li>Bujara, M., Sch&#252;mperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+cell-free+systems:+Implementation+and+debugging+of+a+system+of+biotransformations.">Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).</li><li>Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+identification+and+quantitation+in+LC-MS/MS-based+metabolomics.">Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics.</a> TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).</li><li>Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-liquid+chromatography.">Nano-liquid chromatography.</a> Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).</li><li>Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+mass+spectrometry-based+metabolomics:+Opportunities+and+challenges.">Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).</li><li>O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+CoA+metabolites+by+SAMDI-MS+to+optimize+the+cell-free+biosynthesis+of+HMG-CoA.">High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA.</a> Science Advances. 5, (2019).</li><li>Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unimod:+Protein+modifications+for+mass+spectrometry.">Unimod: Protein modifications for mass spectrometry.</a> Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).</li><li>Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+mixing+of+Escherichia+coli+crude+extracts+to+prototype+and+rationally+engineer+high-titer+mevalonate+synthesis.">Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).</li><li>Jaishankar, J., Srivastava, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+stationary+phase+survival+and+applications.">Molecular basis of stationary phase survival and applications.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2000 (2017).</li><li>Bartolomeo, M. P., Maisano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+for+quantitative+amino+acid+analysis.">Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).</li><li>Hauck, T., Landmann, C., Br&#252;hlmann, F., Schwab, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone+in+cytosolic+extracts+obtained+from+Zygosaccharomyces+rouxii.">Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).</li><li>Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsoSearch:+An+untargeted+and+unbiased+metabolite+and+lipid+isotopomer+tracing+strategy+from+HR-LC-MS/MS+datasets.">IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets.</a> Methods and Protocols. 3 (3), 54 (2020).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.

Изложенный подход ВЭЖХ-RID может быть использован для успешной количественной оценки потребления сахарного субстрата и последующих превращений в основные органические кислоты и спиртовые продукты центрального метаболизма лисата с течением времени. Кроме того, этот протокол использует простой изократический метод, использующий одну мобильную фазу, требует минимальной подготовки образцов и позволяет проводить простой целевой анализ. Аналиты, измеренные методом ВЭЖХ-RID, различают исключительно по времени их удержания и, следовательно, их взаимодействию с выбранной колонной смолой. Колонка ВЭЖХ, используемая здесь, была специально разработана для разделения углеводов, органических кислот и спиртов путем объединения исключения размера и лигандного обмена (т. Е. Хроматография с ионно-умеренным разделением). Поэтому описанный способ полезен для более целенаправленного анализа углеводных субстратов и выбора конечных продуктов путей ферментации глюкозы, которые, как ожидается, в первую очередь облегчат и активируют биоквалирования на основе лизата8,15,21. Однако этот протокол не учитывает активацию других метаболических путей в клеточных экстрактах. Трубопроводы, использующие другие методы хроматографического разделения (например, хроматографию гидрофильного взаимодействия), методы градиентного элюирования, более сложную пробоподготовку (т.е. дериватизацию) и различные оптические детекторы (например, детекторы ультрафиолетового света или испарительного рассеяния света) могут быть использованы для обнаружения других метаболитов, таких как аминокислоты и сахарные фосфаты23,24 . В качестве альтернативы, глобальный подход к изучению метаболизма лисата может быть принят с использованием LC-MS / MS.
Описанный метод LC-MS/MS представляет собой единый рабочий процесс для измерения и идентификации более широкого спектра метаболитов. LC-MS/MS является современным аналитическим инструментом для профилирования метаболомов из-за его чувствительности и способности различать метаболиты по времени удержания и соотношениям m/z с высоким разрешением16. С акцентом на центральные метаболические пути углерода и аминокислотный анаболизм, отрицательный режим MS / MS был реализован для конкретного обнаружения полярных органических кислот, сахарных фосфатов и аминокислот. В сочетании с методом наножидкой хроматографии способ обеспечивает высокую чувствительность для обнаружения малых молекул в сложном лизатном фоне17. Однако с точки зрения профилирования метаболизма CFME на основе лизата ограничением описанного протокола LC-MS/MS является его нижний предел обнаружения 50 м/z, что исключает измерение этанола, основного продукта метаболизма глюкозы лизата, а также формата, которые в противном случае легко поддаются количественной оценке с помощью подробного метода ВЭЖХ-RID. По сравнению с LC-MS/MS, ВЭЖХ-RID имеет дополнительное преимущество относительной доступности с точки зрения стоимости и сложности. В последнем случае устранение неполадок метода LC-MS/MS, описанного здесь, может потребовать некоторой степени знаний в области масс-спектрометрии. Тем не менее, обнаружение РС имеет уникально привлекательные применения по сравнению с RID, поскольку оно может дополнительно различать меченые изотопы в метаболомах, отличный метод для понимания движения углерода из дополненных субстратов через сложную метаболическую сетьлисата 18. Такой подход был применен здесь путем дополнения реакций 13С6-глюкозойи анализа значений относительного изобилия последующих 13С-включающих метаболитов. Анализ позволил дать определение активным и неактивным путям, подкрепив ранее сообщенные предположения и предоставив новое представление о метаболическом потоке в лизатах. Изменения также могут быть сделаны в рамках метода для конкретных анализов. Например, стандартные растворы 13С-меченых целевых соединений могут быть проанализированы вместе с образцами для достижения абсолютных количественных измерений молекул, полученных из глюкозы, с течением времени и сделать выводы о распределении потоков. Лучшее обнаружение положительно заряженных соединений также может быть включено в текущем рабочем процессе путем запуска последовательностей с файлами .meth, настроенными на обнаружение положительного режима.
Аналитическая выборка в обоих описанных методах удобно автоматизирована, обеспечивая высокую воспроизводимость. Кроме того, можно ожидать плавных аналитических запусков при тех пор, пока соблюдаются надлежащие методы обращения с приборами и технического обслуживания. При использовании этих инструментов для анализа реакций CFME следует учитывать более важные соображения до и после отбора проб. Во время подготовки проб важно, чтобы контроль времени курса был репрезентативным для нулевого времени. Здесь белки были осаждены в лизатах путем подкисления, чтобы остановить метаболические реакции. Для образцов с нулевым временем кислотный растворитель соединяли с лисатом перед добавлением реакционной смеси, содержащей глюкозу. Подкисление трихлоруксусной кислотой эффективно обеспечивало, чтобы глюкоза не метаболизировалась в нулевое время, как показано в данных ВЭЖХ-RID(рисунок 2). В то время как процедура, аналогичная утвенчаемого метаболизма глюкозы, была выполнена в отчетном анализе LC-MS / MS, 13С-меченых метаболитов были обнаружены в образцах с нулевым временем, хотя и при значительно низких значениях изобилия по сравнению с образцами, извлеченными в более поздние моменты времени. Причем эти наблюдения ограничивались промежуточными продуктами гликолиза. Данные свидетельствуют о том, что реакции сохраняют некоторую степень гликолитической активности после подкисления экстракционным растворителем, который обнаруживается этим высокочувствительным методом. Вместе с тем масштабы этой деятельности следует количественно оценить. В предыдущем исследовании сообщалось, что кислотные экстракционные растворители могут недостаточно гасять промежуточные гликолитические реакции, но могут остановить значительное потребление глюкозы10. Хотя это еще предстоит дополнительно исследовать в системе, используемой здесь, резкие изменения значений относительного изобилия между образцами с нулевым временем и более поздними временными точками могут быть интерпретированы как тенденции метаболизма глюкозы. Однако изучение альтернативных методов закалки рекомендуется в аналогичных приложениях, в частности для получения абсолютных количеств метаболических промежуточных продуктов10. Кроме того, следует также соблюдать надлежащую практику в ходе анализа программного обеспечения на последующих этапах. Согласованность является обязательным условием при ручной интеграции пиковых областей из сигналов RID для уменьшения количества человеческих ошибок. Ручная интеграция должна также применяться к пиковым областям стандартов всякий раз, когда для количественной оценки концентраций метаболитов в образцах используются интегрированные вручную пиковые районы. На протяжении всего целевого анализа LC-MS/MS предварительные аннотации из анализа MZmine должны быть проверены ручной пиковой проверкой с использованием браузера качества MS, а функции m/z должны быть аннотированы только тогда, когда допускаются ошибки расчетной массы. Здесь эти анализы были выполнены вручную для ограниченного набора целей, поскольку всеобъемлющее и надежное программное обеспечение для поиска изотопов еще не создано. Однако такие автоматизированные методы поиска метаболитов, меченных 13С, в настоящее время появляются и будут оптимизировать более сложные анализы, такие как профилирование лизатов за пределами центрального углеродного метаболизма25.
Усовершенствованная жидкостная хроматография является надежным и широко применяемым методом разделения малых молекул в сложных метаболических смесях11. Описанные методы соединяют этот метод разделения с показателем преломления или масс-спектрометрическим обнаружением для успешного анализа превращений метаболитов в реакциях CFME на основе лизата. ВЭЖХ-РИД и LC-MS/MS являются индивидуально мощными инструментами для профилирования активного метаболизма лизата, и их взаимодополняемость может быть дополнительно использована для устранения ограничений, присущих каждому методу. Представленные методы позволяют применять и разработать CFME, поскольку они могут быть использованы для понимания метаболизма лизата, мониторинга улучшений в целевых превращениях метаболитов и выяснения изменений метаболитов в потоке метаболитов при манипулировании метаболизмом лизата.

Ограничения в инженерии микробов для химического производства могут быть устранены путем рекапитуляции биохимических реакций in vitro, где конкурирующие функции выживания клеток отсутствуют1. Более того, открытая реакционная среда (т.е. отсутствие клеточной мембраны) более поддалась манипуляциям и легче контролируется по сравнению с живыми клетками. Эта основополагающая концепция бесклеточной метаболической инженерии (CFME) была элегантно продемонстрирована восстановлением метаболических путей для синтеза ценных химическихвеществ,таких как водород и монотерпены, с производственными метриками, которые на порядки выше, чем представленные на микробных клеточных фабриках до сих пор1,2,3. . Однако методы очистки целых путей в настоящее время ограничены временем и стоимостью. Альтернативно, бесклеточные метаболические системы могут быть получены из сырых клеточных экстрактов с помощью быстрых и недорогих методов относительно восстановления всего пути4. Центральный метаболизм, который сохраняется в клеточных экстрактах, может быть дополнен энергетическими субстратами (например, глюкозой и ферментативными кофакторами) и солями в буферных растворах для генерации центральных метаболических предшественников в течение более 24 ч5,6. Добавление экзогенных ферментов к реакции CFME на основе лизата позволяет более сложные био-превращения глюкозы в более ценные химические вещества при высоких титрах4,6,7. Хотя выход имеет тенденцию быть скомпрометирован в этих системах из-за их клеточной метаболической сложности, уникальные методы курирования протеомов лизата для преобразования более высокого выхода были и разрабатываются7,8.
Простота проведения метаболических преобразований в бесклеточных системах на основе лизата делает эти платформы отличными либо для перемещения химического производства за пределы клетки в целом, либо для прототипирования новых путей с высокой пропускной способностью перед созданием и тестированием этих конструкций in vivo2,9. Для любого применения инструменты для мониторинга метаболических превращений или наблюдения за общими изменениями метаболического потока в лизатах являются неотъемлемой частью продвижения CFME. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) может быть использована для разделения химических компонентов реакций CFME с высоким разрешением и может быть соединена с оптическими или масс-спектрометрическими детекторами для количественной оценки метаболитов5,10. Основной принцип ВЭЖХ заключается в том, что аналиты, растворенные в растворителе (т.е. подвижной фазе) и перекачиваемые через колонну, будут взаимодействовать с конкретным упаковочным материалом колонны (т.е. стационарной фазой)11. В зависимости от своих химических свойств эти аналиты демонстрируют различное время удержания, прежде чем они в конечном итоге элюируются из стационарной фазы и переносятся подвижной фазой в детектор. В настоящем докладе подробно описывается подготовка и анализ реакций ХМЭ на основе лизата E. coli с помощью методов на основе ВЭЖХ, использующих обнаружение RID и MS/MS.
ВЭЖХ в сочетании с обнаружением показателя преломления (ВЭЖХ-РИД) является общедоступным методом быстрой идентификации центральных метаболических прекурсоров и конечных продуктов. Вкратце, МПОГ измеряет, как аналиты изменяют отклонение света подвижной фазой12. Затем сигналы RID, соответствующие целевым аналитам в образцах, могут быть количественно определены путем сравнения с сигналами МПОГ стандартных растворов. В приложениях CFME этот способ обнаружения чаще всего используется с колонками ВЭЖХ, которые разделяют соединения на основе комбинации механизмов исключения размера и лигандного обмена, или ионной хроматографии5,6,8,13. Этот конкретный метод используется для быстрой количественной оценки потребления сахарных субстратов, таких как глюкоза, а также для образования продуктов ферментации, таких как сукцинат, лактат, формиат, ацетат и этанол в реакциях CFME на основе лизата8. Регистрация изменений концентрации этих соединений с помощью ВЭЖХ была полезна как для выяснения потенциала экстрактов сырых клеток для объединения центральных метаболических предшественников, так и для понимания того, как поток путей перенаправляется через ферментативные пути во время сложных метаболических превращений из глюкозы в лизатах6,8,14. Семенные исследования CFME в экстрактах клеток E. coli подтверждают, что ферментационные соединения накапливаются в качестве конечных продуктов катаболизма глюкозы, а также встречаются в качестве нежелательных побочных продуктов в лизатах, которые чрезмерно экспрессируют экзогенные ферменты6,15. Предполагается, что ферментативный метаболизм играет необходимую роль в регенерации окислительно-восстановительных эквивалентов кофакторов (т.е. NAD(P)H и АТФ) для поддержания гликолитических реакций8. Следовательно, оптический метод обнаружения на основе ВЭЖХ, предназначенный для разделения продуктов ферментации, является полезным и широко применяемым инструментом при выполнении различных задач CFME на основе лизата.
CFME может быть реализован для накопления метаболических конечных продуктов, которые не являются углеводами, органическими кислотами или спиртами4. Измерение промежуточных продуктов, которые потребляются так же быстро, как они синтезируются, также может быть желательным10. Хотя ВЭЖХ-RID доступен с точки зрения стоимости и сложности, этот метод ограничен его способностью различать метаболиты только на основе времени удержания. Более широкий спектр метаболитов может быть проанализирован, когда жидкостная хроматография связана с обнаружением MS/MS (LC-MS/MS)16. С помощью этого метода аналиты в подвижной фазе ионизируются и дифференциально обнаруживаются на основе свойств массы и заряда каждой молекулы. Таким образом, знание как отношения массы к заряду метаболита (м/з), так и времени удержания на колонке облегчает разделение большинства метаболических промежуточных продуктов и конечных продуктов с высоким разрешением16. Этот метод обнаружения также может быть соединен с наножидкой хроматографией, которая обеспечивает гораздо более низкие скорости потока и объемы впрыска образца, что позволяет более чувствительно обнаруживать малые молекулы в сложном лисатном фоне17. LC-MS/MS может дополнительно наноситься с изотопной маркировкой, поскольку встроенные метки передают изменения в значениях m/z аналитов18. Таким образом, измерения временных точек, извлеченные из реакции CFME, дополненной субстратом глюкозы 13C6,могут, таким образом, определять конечные или побочные продукты, полученные конкретно из дополненной глюкозы. Хотя этот метод отслеживания изотопов еще не широко применяется в исследованиях CFME, он является мощным инструментом для понимания метаболических превращений в системах CFME на основе лизата, в частности, поскольку солевые контрионы (т.е. ацетат и глутамат) в этих реакциях также катаболизируются в качестве вторичных субстратов19. Таким образом, использование этой техники может нарисовать всеобъемлющую картину метаболизма глюкозы в лизатах, которая по сей день не полностью понята. Здесь протокол детализирует метод наножидкой хроматографии, связанный с наноэлектросыпной ионизацией (нано ESI) MS / MS, который может быть использован для опроса возможной модели метаболизма глюкозы, в частности в лизатах E. coli (рисунок 1). Модель основана на сообщениях о ферментативных путях и пентозфосфатном пути, активном в лизатах E. coli, полученных изштаммов,выращенных в богатых средах5,6,8,14. Метод дополнительно используется для исследования производства аминокислот, поскольку современные знания об анаболизме аминокислот из глюкозы в лизатах ограничены несколькими примерами, такими как синтез ароматических аминокислот7. Учитывая в основном полярную природу конечных продуктов и промежуточных продуктов в этих путях (т.е. органических кислот, сахарных фосфатов и аминокислот), здесь использовалась обратная фазовая жидкостная хроматография. Этот метод отделяет полярные соединения путем элюирования от неполярной стационарной фазы. Затем эти соединения ионизировали нано ESI в режиме отрицательных ионов, что позволяет обнаруживать аналиты с по меньшей мере одним отрицательным элементарным зарядом и, таким образом, полезно для обнаружения кислотных соединений. Этот метод используется здесь для анализа метаболитов, полученных из глюкозы 13С, и демонстрирует полезность LC-MS / MS для понимания метаболизма глюкозы в лизатах.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m centrifuge tube filters (spin columns)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Binary LC Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1312B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity High Performance Degasser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4225A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Refractive Index Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7162A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Standard Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1329B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374</td>
			<td>CFME reaction mix component (LC-MS/MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.20 &#956;m pore (PES membrane) filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminex HPX 87-H column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1250140</td>
			<td>Chromatography column for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1376</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vial caps (yellow, snap)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-50Y</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W225181</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-dextrose (Glucose)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9230</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8281</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC/MS grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica (internal diameter of 100 &#956;m, external diameter of 375 &#956;m)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>WM22005-ND</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetex 5 &#956;m C18 stationary phase (100 &#197;)</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0632</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanospray Ionization Source</td>
			<td>ThermoFisher Scientific/Proxeon</td>
			<td>ES071 (newest model)</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenLab CDS (Online) Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 2.15.26</td>
			<td>Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 2.7</td>
			<td>Software for tuning the LC-MS/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps (with septa, 9 mm)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29315-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwthread glass vials (2 mL)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29376-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>247596</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71716</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>398055</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>Solvent preparation for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-acetate</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-090-100</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Solvent Rack: SRD-3600</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6500</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 3.0.63</td>
			<td>Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems

Инженерия клеточного метаболизма для целевого биосинтеза может потребовать обширных циклов проектирования-сборки-тестирования-обучения (DBTL), поскольку инженер работает над требованиями выживания клетки. В качестве альтернативы, выполнение циклов DBTL в бесклеточных средах может ускорить этот процесс и облегчить проблемы с совместимостью с хостом. Многообещающий подход к бесклеточной метаболической инженерии (CFME) использует метаболически активные экстракты сырых клеток в качестве платформ для биопроизводства и для быстрого обнаружения и прототипирования модифицированных белков и путей. Реализация этих возможностей и оптимизация производительности CFME требует методов для характеристики метаболома бесклеточных платформ на основе лизата. То есть аналитические инструменты необходимы для мониторинга улучшений в целевых превращениях метаболитов и в выяснении изменений потока метаболитов при манипулировании метаболизмом лизата. Здесь анализ метаболитов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с оптическим или масс-спектрометрическим обнаружением был применен для характеристики производства метаболитов и потока в лизатах E. coli S30. В частности, в настоящем отчете описывается подготовка образцов из лизатов CFME для анализа ВЭЖХ с использованием детектирования показателя преломления (RID) для количественной оценки генерации центральных метаболических промежуточных продуктов и побочных продуктов при превращении недорогих субстратов (т.е. глюкозы) в различные ценные продукты. Также представлен анализ превращения метаболитов в реакциях CFME, подаваемых 13С-меченой глюкозой с помощью жидкостной хроматографии с обратной фазой в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (MS/MS), мощным инструментом для характеристики конкретных выходов метаболитов и метаболического потока лизата из исходных материалов. В целом, применение этих аналитических методов к метаболизму лизата CFME позволяет работать с этими системами в качестве альтернативных платформ для выполнения более быстрых или новых задач метаболической инженерии.

Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Протоколы описывают высокоэффективные методы жидкостной хроматографии в сочетании с показателем преломления или масс-спектрометрическим обнаружением для изучения метаболических реакций в сложных бесклеточных системах на основе лизата.

Жидкостная хроматография в сочетании с показателем преломления или масс-спектрометрическим обнаружением для профилирования метаболитов в бесклеточных системах на основе лизата

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

Этот протокол использует обнаружение показателя преломления для измерения побочных продуктов метаболизма углерода, которые обычно накапливаются в бесклеточных системах на основе лисата. Он также использует масс-спектрометрию для обнаружения еще более широкой панели центральных метаболитов, которые генерируются в метаболически активных лизатах. Два метода, используемые в настоящем протоколе, обеспечивают возможность количественного описания химических реакций, происходящих в бесклеточной системе на основе лисата, что позволяет обнаруживать более широкий спектр метаболитов, включая те, которые присутствуют при низких концентрациях в сложном лисатном фоне.Демонстрировать процедуры будут Хайме Лоренцо Дингласан и Дэвид Ривз, аспиранты-исследователи из Отдела биологических наук. Начните с объединения различных компонентов в 1,5-миллилитровых микроцентрифужных пробирках для подготовки конечных реакций с 4,5 миллиграммами на миллилитр общего белка лизата. Подготовьте бесклеточную метаболическую инженерию, или CFME, реакции с конечными объемами 50 микролитров в трех литрах в расчете на момент времени.Немедленно прекратите трипликатные реакции в соответствующих временных точках, добавив равный объем 5% трихлоруксусной кислоты к конечному реакционному объему каждого образца. Затем разбавьте каждый образец, добавив в два раза больше стерильной воды к каждой реакционной смеси. Чтобы рекапитулировать нулевое время, смешайте тот же объем 5% трихлоруксусной кислоты, что и общий конечный объем реакции с лизатом, прежде чем добавлять остальные компоненты реакции.Эта ступень подкисления осаждает ферменты лизата, прежде чем они значительно метаболизируют глюкозу. Вращайте образцы и центрифугу на настоечную микроцентрифугу в 11, 600 раз в г в течение пяти минут и перенесите супернатанты, содержащие органические аналиты, в чистые пробирки. Храните образцы при температуре минус 20 градусов по Цельсию, если анализ ВЭЖХ будет проведен позже.Убедитесь, что хранящиеся образцы разморажены на льду, прежде чем переходить к следующему шагу. Фильтруйте каждый супернатант с помощью порового фильтра 0,22 микрометра. После центрифуги переложите каждый фильтрат в чистый стеклянный флакон ВЭЖХ.Загрузите флаконы в лоток автоподборника системы ВЭЖХ, которая уже настроена для анализа. В строке меню выберите Последовательность, Новый шаблон последовательности. Выберите Последовательность.Сохраните шаблон последовательности как имя шаблона последовательности S.Select Sequence, Sequence Table. Добавьте N строк, соответствующих N флаконов. Затем введите позиции флакона и имена образцов в разделе «Имя флакона» и «Имя образца» соответственно, в соответствии с их расположением на лотке автозаборника.Выберите метод, сгенерированный в соответствии с описанием в рукописи, из раскрывающегося меню Название метода и введите 50 микролитров в качестве инъекции на флакон для каждой строки. Нажмите кнопку Применить и сохраните шаблон последовательности, выбрав Последовательность, Сохранить шаблон последовательности. Убедитесь, что шаблон последовательности загружен, выбрав Sequence, Load Sequence Template, имя шаблона последовательности S.После достижения стабильной базовой линии на онлайн-графике щелкните правой кнопкой мыши панель RID Module, Control, Off Recycling Valve, чтобы направить поток растворителя через детектор RID в отходы.Чтобы начать сбор данных, выберите Sequence в строке меню, а затем выберите Sequence Table, Run. Выберите представление Анализ данных в меню Вид. Найдите имя файла последовательности в списке файлов в левой части экрана.На центральной панели экрана перейдите в области Выбор представления сигнала, Сигнал RID для просмотра образцов хроматограмм. Выберите строку, соответствующую любому из примеров, на верхней панели экрана. Пики, соответствующие целевым аналитам, будут расположены вдоль оси времени удержания в виде глюкозы, сукцината, лактата, формиата, ацетата и этанола в образцах, где присутствуют все эти метаболиты.Различайте, хорошо ли интегрированы пики интереса программным обеспечением. Красная линия должна быть автоматически нарисована в качестве основы каждого пика. Если красная линия неровная, автоматическая интеграция не удалась.Затем нажмите кнопку «Ручная интеграция» в наборе инструментов интеграции и вручную нарисуйте пиковую базу, чтобы интегрировать пиковую область. Выберите инструмент «Курсор» из общего набора инструментов, чтобы щелкнуть по правильно интегрированным пикам. Область пика и соответствующее время реакции выбранного пика будут выделены в виде строки таблицы на нижней панели экрана.Чтобы экспортировать пиковые области, выберите Файл, Экспорт, Результаты интеграции. Построение значений пиковой площади в сопоставлении с известными концентрациями образцов в электронной таблице. Щелкните правой кнопкой мыши по нанесенным данным и выберите Добавить линию тренда, Формат линии тренда, Отобразить уравнение на графике.В отдельной электронной таблице используйте уравнения стандартных линий тренда кривой для преобразования значений пиковой площади в концентрации для каждого анализируемого вещества из каждой выборки. Рассчитайте средние пиковые области и стандартные значения ошибок в трех значениях для визуализации данных. Установите тройные реакции за точку времени, за исключением нулевого времени, на льду, как описано в рукописи.Вместо глюкозы используйте конечную концентрацию 100-миллимолярной глюкозы-13C6 в реакциях. Инкубируют реакции при 37 градусах Цельсия в течение одного, двух и трех часов. Для начала анализа пипетку на каждый образец высыпают эквивалентный объем экстракционного растворителя.Если образцы были заморожены, добавьте экстракционный растворитель до того, как образцы полностью разморозятся, чтобы предотвратить реактивацию метаболизма глюкозы. Выполните все этапы обработки образцов на льду. Чтобы рекапитулировать нулевое время, пипетку окончательного объема экстракционного растворителя до соответствующего объема лизата для желаемой конечной концентрации 4,5 миллиграмма на миллилитр в 50 микролитрах реакционного объема.Добавьте остальные компоненты реакции, как описано выше. Эта ступень подкисления осаждает ферменты лизата, прежде чем они значительно метаболизируют глюкозу. Инкубировать образцы в экстракционном растворителе на льду в течение 30 минут с легким встряхиванием.Затем центрифугируют образцы в 21 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы отделить супернатант от осажденного белка. Переложите 50 микролитров супернатанта на флаконы автосамплера и загрузите флаконы на лоток в пределах четырех градусов Цельсия автопросэмплера. После подготовки прибора к анализу настройте последовательность выполнения с помощью программного обеспечения для сбора и интерпретации данных системы LC-MS/MS.В Roadmap, Sequence Setup щелкните правой кнопкой мыши таблицу, чтобы вставить столько строк, сколько образцов. Для каждого ряда установите объем впрыска в пять микролитров, а положение — соответствующее положение флакона на лотке автопробоотборника. Введите имена файлов в качестве имен образцов и задайте требуемый путь к файлу для результатов выполнения.Чтобы начать запуск, выделите все имена файлов в последовательности. В строке меню выберите Действия, Выполнить последовательность. Откройте MZmine и импортируйте необработанные выходные файлы, полученные ранее.В строке меню выберите Методы необработанных данных, Импорт необработанных данных и выберите файлы, соответствующие образцам. Выполните действия, описанные в рукописи, чтобы завершить анализ MZmine. Экспортируйте необработанные пиковые области в конце анализа MZmine в виде CSV-файла.Откройте электронную таблицу, чтобы рассчитать массы меченых 13C метаболитов из метаболизма глюкозы для целевого поиска. Используйте рассчитанные массы метаболитов, меченых 13C, для поиска и аннотирования характеристик массы заряда из результатов MZmine. Вручную проверьте спектры предполагаемой аннотации в качественном браузере, чтобы подтвердить аннотации.Откройте дорожную карту, Qual Browser. На панели инструментов откройте необработанный файл, чтобы импортировать необработанные MS-данные каждого образца. Провести линию под нужным диапазоном времени удержания, соответствующим предполагаемой аннотации на общей ионной хроматограмме, чтобы просмотреть массовый спектр.В экспериментах ВЭЖХ-РИД глюкоза потреблялась в течение первых трех часов реакции и в основном ферментировалась до лактата. Накопление этанола также значительно происходило в течение первых трех часов реакции и после этого прекращалось. Ацетат первоначально присутствовал в реакциях в качестве компонента буфера S30 и накапливался только из-за метаболизма через шесть часов, когда потребление глюкозы замедлилось.Таким образом, лактат и этанол можно рассматривать как основные конечные продукты ферментации в бесклеточном метаболизме глюкозы на основе лисата. Было отмечено, что как фориат, так и сукцинат синтезируются в качестве незначительных продуктов ферментации. Глюкоза-13C6 наблюдалась при гликолизе, о чем свидетельствуют колебания гликолитических промежуточных продуктов.В соответствии с данными обнаружения показателя преломления ВЭЖХ глюкоза накапливалась до лактата-13C3, а также ферментировалась до сукцината-13C3 в течение первых трех часов реакции. Также наблюдалось включение углерода, полученного из глюкозы-13C6, в сахарные фосфаты 6-фосфоглюконолактон, 6-фосфоглюконат, рибулоза-5-фосфат и седогептулоза-7-фосфат, что подтверждает участие пентозофосфатного пути в метаболизме глюкозы лизата. Было обнаружено, что метаболизм глюкозы лисата питает синтез тирозина-13C9, а также обеспечивает предшественник для производства гистидина-13C5.Важно, чтобы контрольные образцы точно представляли нулевое время. Поэтому убедитесь, что белки в лизате инактивированы перед смешиванием в растворе, содержащем источники энергии. Также убедитесь, что автоматическая интеграция пиков из тестовых образцов, контрольных образцов и стандартов также согласована, чтобы извлеченные пиковые области были сопоставимы.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Сотовая Добыча липидов для целевой Стабильный изотопного разбавления жидкостной хроматографии-масс-спектрометрического анализа

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

ФИБС поддержкой неинвазивной метаболического профилирования

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

A Coupled Experiment-finite Element Modeling Methodology for Assessing High Strain Rate Mechanical Response of Soft Biomaterials

В сочетании Эксперимент-конечных элементов методология моделирования для оценки высокого скорости деформации механический отклик в мягких биоматериалов

This study offers a combined experimental and finite element (FE) simulation approach for examining the mechanical behavior of soft biomaterials (e.g. ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Пломбируемая Femtoliter палата массивы для сотового без биологии

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Синтез биосовместимых жидкого кристалла эластомерных пен, как Cell Каркасы для 3D-пространственных культур клеток

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Синтез инфекционных бактериофагов в E. coli-на основе свободных клеток выражение системы

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Визуального обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в массиве капилляров

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Многослойная микрофлюидная платформа для проведения длительного выражения генов без клеток

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Обнаружение рака яичников с использованием фотоакустической цитометрии потока

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Одновременной количественной оценки выбранных kynurenines проанализированы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии в средних собранных из культур раковых клеток

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...