Name: liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems
Uploaded: 2021-09-23T14:45:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Esta investigación fue patrocinada por el Programa de Ciencia Genómica, el Departamento de Energía de los Estados Unidos, la Oficina de Ciencia, Investigación Biológica y Ambiental, como parte del Área de Enfoque Científico de Interfaces de Microbios Vegetales (http://pmi.ornl.gov). El Laboratorio Nacional de Oak Ridge es administrado por UT-Battelle, LLC, para el Departamento de Energía de los Estados Unidos bajo el contrato DE-AC05-00OR22725. Este manuscrito ha sido escrito por UT-Battelle, LLC bajo el Contrato DE-AC05- 00OR22725 con el Departamento de Energía de los Estados Unidos. El Gobierno de los Estados Unidos retiene y el editor, al aceptar el artículo para su publicación, reconoce que el Gobierno de los Estados Unidos conserva una licencia no exclusiva, pagada, irrevocable y mundial para publicar o reproducir la forma publicada de este manuscrito, o permitir que otros lo hagan, para fines del Gobierno de los Estados Unidos. El Departamento de Energía proporcionará acceso público a estos resultados de investigaciones patrocinadas por el gobierno federal de acuerdo con el Plan de Acceso Público (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan) del DOE.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia conocidos u otros conflictos de intereses.

El enfoque HPLC-RID descrito se puede utilizar para cuantificar con éxito el consumo de sustrato de azúcar y las conversiones posteriores a los principales productos de ácido orgánico y alcohol del metabolismo central de lisato a lo largo del tiempo. Además, este protocolo emplea un método isocrático simple que utiliza una sola fase móvil, requiere una preparación mínima de la muestra y permite un análisis simple dirigido hacia abajo. Los analitos medidos por el método HPLC-RID se distinguen únicamente por sus tiempos de retención y, por lo tanto, por sus interacciones con la resina de columna seleccionada. La columna de HPLC utilizada aquí fue particularmente diseñada para separar carbohidratos, ácidos orgánicos y alcoholes mediante la combinación de exclusión de tamaño e intercambio de ligandos (es decir, cromatografía de partición moderada por iones). El método descrito es, por lo tanto, útil para un análisis más específico de sustratos de carbohidratos y productos finales seleccionados de vías de fermentación de glucosa que se espera que faciliten y energizen principalmente las bioformaciones basadas en lisato8,15,21. Sin embargo, este protocolo no tiene en cuenta la activación de otras vías metabólicas en los extractos celulares. Las tuberías que emplean otras técnicas de separación cromatográfica (es decir, cromatografía de interacción hidrofílica), métodos de elución por gradiente, preparación de muestras más complicada (es decir, derivatización) y diferentes detectores ópticos (por ejemplo, detectores de dispersión de luz ultravioleta o luz evaporativa) podrían usarse para detectar otros metabolitos como aminoácidos y fosfatos de azúcar23,24 . Alternativamente, se puede adoptar un enfoque global para estudiar el metabolismo del lisato utilizando LC-MS / MS.
El método LC-MS/MS descrito es un flujo de trabajo único para medir e identificar una gama más amplia de metabolitos. LC-MS/MS es una herramienta analítica de última generación para el perfilado de metabolomas debido a su sensibilidad y capacidad para distinguir metabolitos por tiempo de retención y relaciones m/z con alta resolución16. Con un enfoque en las vías metabólicas del carbono central y el anabolismo de aminoácidos, se implementó el modo negativo MS / MS para detectar específicamente ácidos orgánicos polares, fosfatos de azúcar y aminoácidos. Junto con una técnica de cromatografía nanolíquida, el método proporciona una alta sensibilidad para detectar moléculas pequeñas en el fondo de lisato complejo17. Sin embargo, en términos de perfil del metabolismo CFME basado en lisato, una limitación del protocolo LC-MS / MS descrito es su límite de detección inferior de 50 m / z, que impide la medición del etanol, un producto importante en el metabolismo de la glucosa lisada, así como el formiato, que de otro modo se cuantifican fácilmente mediante el método detallado HPLC-RID. En comparación con LC-MS/MS, HPLC-RID tiene la ventaja adicional de la accesibilidad relativa en términos de costo y dificultad. Para este último punto, la solución de problemas del método LC-MS / MS descrito aquí puede requerir cierto grado de experiencia en espectrometría de masas. No obstante, la detección de EM tiene aplicaciones excepcionalmente atractivas sobre RID, ya que también puede distinguir isótopos etiquetados en metabolomas, una excelente técnica para comprender el movimiento de carbono de sustratos suplementados a través de la compleja red metabólica de lisato18. Tal enfoque se aplicó aquí complementando las reacciones con 13C6-glucosa y analizando los valores de abundancia relativa de los metabolitos que incorporan 13C aguas abajo. El análisis permitió la definición de vías activas e inactivas, apoyando suposiciones previamente informadas y proporcionando nuevos conocimientos sobre el flujo metabólico en los lisados. También se pueden realizar modificaciones dentro del método para análisis específicos. Por ejemplo, las soluciones estándar de 13compuestos objetivo etiquetados con C se pueden analizar junto con muestras para lograr mediciones cuantitativas absolutas de moléculas derivadas de la glucosa a lo largo del tiempo y sacar conclusiones sobre las distribuciones de flujo. También se puede habilitar una mejor detección de compuestos cargados positivamente dentro del flujo de trabajo actual ejecutando secuencias con archivos .meth ajustados para la detección de modo positivo.
El muestreo analítico en ambos métodos descritos está convenientemente automatizado, lo que garantiza una alta reproducibilidad. Además, se pueden esperar ejecuciones analíticas suaves siempre que se observen las prácticas adecuadas de manejo y mantenimiento del instrumento. Al utilizar estas herramientas para analizar las reacciones de CFME, se deben hacer consideraciones más críticas aguas arriba y aguas abajo del muestreo. Durante la preparación de la muestra, es importante que los controles del curso de tiempo sean representativos del tiempo cero. Aquí, las proteínas se precipitaron en lisados por acidificación para detener las reacciones metabólicas. Para muestras de tiempo cero, el disolvente ácido se combinó con lisato antes de agregar la mezcla de reacción que contenía glucosa. La acidificación con ácido tricloroacético aseguró efectivamente que la glucosa no se metaboliza en el momento cero, como se muestra en los datos de HPLC-RID(Figura 2). Si bien se realizó un procedimiento similar para calmar el metabolismo de la glucosa en el análisis LC-MS / MS informado, se detectaron 13metabolitos etiquetados con C en muestras de tiempo cero, aunque a valores de abundancia significativamente bajos en relación con las muestras extraídas en puntos de tiempo posteriores. Además, estas observaciones se limitaron a los intermedios de la glucólisis. Los datos sugieren que las reacciones retienen cierto grado de actividad glucolítica después de la acidificación con el disolvente de extracción que se detecta por este método altamente sensible. Sin embargo, debe cuantificarse el alcance de esta actividad. Un estudio previo informó que los disolventes de extracción ácida pueden no saciar suficientemente las reacciones glucolíticas intermedias, pero pueden detener el consumo significativo de glucosa10. Si bien esto aún no se ha investigado más a fondo en el sistema utilizado aquí, los cambios drásticos en los valores de abundancia relativa entre las muestras de tiempo cero y punto de tiempo posterior pueden interpretarse como tendencias en el metabolismo de la glucosa. Sin embargo, se recomienda explorar métodos alternativos de enfriamiento en aplicaciones similares, específicamente para obtener cantidades absolutas de intermedios metabólicos10. Además, también deben observarse las buenas prácticas durante los análisis de software posteriores. La consistencia es imperativa cuando se integran manualmente las áreas de pico de las señales RID para reducir el error humano. La integración manual también debe aplicarse a las zonas pico de las normas siempre que se utilicen zonas pico integradas manualmente para cuantificar las concentraciones de metabolitos en las muestras. A lo largo del análisis LC-MS/MS dirigido, las anotaciones tentativas del análisis MZmine deben validarse mediante la comprobación manual de picos utilizando un navegador de calidad MS, y las características m/z solo deben anotarse cuando los errores de masa calculados son aceptables. Aquí, estos análisis se realizaron manualmente para un conjunto limitado de objetivos, ya que aún no se ha establecido un software completo y robusto para la búsqueda de isótopos. Sin embargo, tales métodos automatizados para buscar metabolitos etiquetados con 13C están surgiendo actualmente y también agilizarían los análisis más complicados, como la elaboración de perfiles de lisados más allá del metabolismo central del carbono25.
La cromatografía líquida avanzada es un método robusto y ampliamente aplicado para separar moléculas pequeñas en mezclas metabólicas complejas11. Los métodos descritos acoalifican esta técnica de separación con el índice de refracción o la detección espectrométrica de masas para analizar con éxito las conversiones de metabolitos en reacciones CFME basadas en lisato. HPLC-RID y LC-MS/MS son herramientas individualmente poderosas para perfilar el metabolismo activo del lisato, y su complementariedad se puede aprovechar aún más para abordar las limitaciones inherentes de cada técnica. Los métodos reportados permiten la aplicación y el desarrollo de CFME, ya que se pueden utilizar para comprender el metabolismo del lisato, monitorear las mejoras en las conversiones de metabolitos dirigidos y dilucidar las alteraciones del flujo de metabolitos al manipular el metabolismo del lisato.

Las limitaciones en la ingeniería de microbios para la producción química pueden abordarse recapitulando reacciones bioquímicas in vitro donde las funciones de supervivencia celular competidoras están ausentes1. Además, el entorno de reacción abierto (es decir, la ausencia de una membrana celular) es más susceptible de manipulación y es más fácil de monitorear en comparación con las células vivas. Este concepto fundamental de ingeniería metabólica libre de células (CFME) ha sido elegantemente demostrado por la reconstitución de vías metabólicas para sintetizar productos químicos valiosos como el hidrógeno y los monoterpenos con métricas de producción que son órdenes de magnitud más altas que las presentadas en las fábricas de células microbianas hasta ahora1,2,3 . Los métodos para purificar vías enteras, sin embargo, están actualmente limitados por el tiempo y el costo. Alternativamente, los sistemas metabólicos libres de células pueden derivarse de extractos de células crudas a través de métodos rápidos y económicos en relación con la reconstitución de toda la vía4. El metabolismo central que se retiene en los extractos celulares se puede complementar con sustratos energéticos (por ejemplo, glucosa y cofactores enzimáticos) y sales en soluciones tamponadas para generar precursores metabólicos centrales durante más de 24 h5,6. La adición de enzimas exógenas a la reacción CFME basada en lisato permite bio-transformaciones más complejas de glucosa en sustancias químicas más valiosas a títulos altos4,6,7. Aunque el rendimiento tiende a verse comprometido en estos sistemas debido a su complejidad metabólica similar a la de las células, se han desarrollado y se están desarrollando métodos únicos para curar proteomas de lisato para una mayor conversión de rendimiento7,8.
La facilidad de llevar a cabo transformaciones metabólicas en sistemas libres de células basados en lisato hace que estas plataformas sean excelentes para mover la fabricación de productos químicos fuera de la célula por completo o para crear prototipos de nuevas vías con alto rendimiento antes de construir y probar estos diseños in vivo2,9. Para cualquiera de las aplicaciones, las herramientas para monitorear las conversiones metabólicas u observar alteraciones generales del flujo metabólico en los lisados son parte integral del avance de CFME. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se puede utilizar para separar los componentes químicos de las reacciones CFME con alta resolución y se puede acoplar a detectores ópticos o espectrométricos de masas para la cuantificación de metabolitos5,10. El principio subyacente de la HPLC es que los analitos disueltos en un disolvente (es decir, la fase móvil) y bombeados a través de una columna interactuarán con el material específico de embalaje de la columna (es decir, la fase estacionaria)11. Dependiendo de sus propiedades químicas, estos analitos exhiben tiempos de retención variables antes de que finalmente sean eluidos de la fase estacionaria y llevados por la fase móvil a un detector. Este informe detalla la preparación y el análisis de las reacciones CFME basadas en lisato de E. coli a través de métodos basados en HPLC que aprovechan la detección de RID y MS / MS.
HpLC acoplado a la detección de índice de refracción (HPLC-RID) es un método generalmente accesible para identificar rápidamente precursores metabólicos centrales y productos finales. Brevemente, RID mide cómo los analitos cambian la deflexión de la luz por la fase móvil12. Las señales RID correspondientes a analitos objetivo en muestras se pueden cuantificar mediante comparaciones con señales RID de soluciones estándar. En aplicaciones CFME, este modo de detección se ha utilizado más comúnmente con columnas de HPLC que separan compuestos en función de una combinación de mecanismos de exclusión de tamaño e intercambio de ligandos, o cromatografía de partición moderada poriones 5,6,8,13. Esta técnica en particular se utiliza para cuantificar rápidamente el consumo de sustratos de azúcar como la glucosa, así como la formación de productos de fermentación como succinato, lactato, formiato, acetato y etanol en reacciones CFME a base de lisato8. El registro de los cambios de concentración de estos compuestos a través de HPLC ha sido útil tanto para dilucidar el potencial de los extractos de células crudas para agrupar precursores metabólicos centrales como para comprender cómo se redirige el flujo de vías a través de vías fermentativas durante las conversiones metabólicas complejas de glucosa en lisados6,8,14. Los estudios seminales de CFME en extractos de células de E. coli confirman que los compuestos de fermentación se acumulan como productos finales del catabolismo de la glucosa y también ocurren como subproductos no deseados en lisados que sobreexpresan enzimas exógenas6,15. Se sugiere que el metabolismo fermentativo desempeña un papel necesario en la regeneración de equivalentes redox de cofactores (es decir, NAD(P)H y ATP) para mantener las reacciones glucolíticas8. Por lo tanto, un método de detección óptica basado en HPLC diseñado para separar los productos de fermentación es una herramienta útil y comúnmente aplicada cuando se ejecutan varias tareas cfME basadas en lisato.
CFME se puede implementar para acumular productos finales metabólicos que no son carbohidratos, ácidos orgánicos o alcoholes4. La medición de los intermedios que se consumen tan rápido como se sintetizan también puede ser deseable10. Si bien HPLC-RID es accesible en términos de costo y dificultad, este método está limitado por su capacidad de distinguir solo metabolitos en función del tiempo de retención. Se puede analizar una gama más amplia de metabolitos cuando la cromatografía líquida se acopla a la detección de EM/EM (LC-MS/MS)16. Por este método, los analitos en la fase móvil se ionizan y se detectan diferencialmente en función de las propiedades de masa y carga de cada molécula. El conocimiento tanto de la relación masa-carga (m/z) del metabolito como del tiempo de retención en la columna facilita así la separación de la mayoría de los intermedios metabólicos y los productos finales con alta resolución16. Esta técnica de detección también se puede acoplar a la cromatografía nanolíquida, que ofrece caudales y volúmenes de inyección de muestras mucho más bajos, lo que permite una detección más sensible de moléculas pequeñas en el complejo fondo de lisado17. LC-MS/MS también se puede aplicar con el etiquetado de isótopos, ya que las etiquetas incorporadas imparten cambios en los valores m/z de los analitos18. Las mediciones de punto de tiempo extraídas de una reacción CFME suplementada con un sustrato de 13C6-glucosa pueden determinar así los productos finales o subproductos derivados específicamente de la glucosa suplementada. Aunque este método de rastreo de isótopos aún no se aplica comúnmente en los estudios de CFME, es una herramienta poderosa para comprender las conversiones metabólicas en sistemas CFME basados en lisato, específicamente porque los contraiones de sal (es decir, acetato y glutamato) en estas reacciones también se catabolizan como sustratos secundarios19. Aprovechar esta técnica puede dibujar una imagen completa del metabolismo de la glucosa en lisados, que hasta el día de hoy no se entiende completamente. Aquí, el protocolo detalla un método para la cromatografía nano-líquida acoplada a la ionización nanoelectrospray (nano ESI) MS /MS que se puede utilizar para interrogar un posible modelo de metabolismo de la glucosa, específicamente en lisatos de E. coli (Figura 1). El modelo se basa en informes de vías fermentativas y la vía de la pentosa fosfato activa en lisatos de E. coli derivados de cepas cultivadas en medios enriquecidos5,6,8,14. La técnica se utiliza adicionalmente para investigar la producción de aminoácidos, ya que el conocimiento actual sobre el anabolismo de aminoácidos a partir de glucosa en lisados se limita a algunos ejemplos como la síntesis de aminoácidos aromáticos7. Dada la naturaleza principalmente polar de los productos finales e intermedios en estas vías (es decir, ácidos orgánicos, fosfatos de azúcar y aminoácidos), aquí se utilizó la cromatografía líquida en fase inversa. Esta técnica separa los compuestos polares por elución de una fase estacionaria no polar. Estos compuestos fueron ionizados por nano ESI en modo de iones negativos que permite la detección de analitos con al menos una carga elemental negativa y, por lo tanto, es útil para detectar compuestos ácidos. Esta técnica se emplea aquí para analizar los metabolitos derivados de la glucosa 13C-incorporando y demuestra la utilidad de LC-MS / MS para comprender el metabolismo de la glucosa en lisados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m centrifuge tube filters (spin columns)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Binary LC Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1312B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity High Performance Degasser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4225A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Refractive Index Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7162A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Standard Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1329B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374</td>
			<td>CFME reaction mix component (LC-MS/MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.20 &#956;m pore (PES membrane) filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminex HPX 87-H column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1250140</td>
			<td>Chromatography column for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1376</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vial caps (yellow, snap)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-50Y</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W225181</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-dextrose (Glucose)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9230</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8281</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC/MS grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica (internal diameter of 100 &#956;m, external diameter of 375 &#956;m)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>WM22005-ND</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetex 5 &#956;m C18 stationary phase (100 &#197;)</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0632</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanospray Ionization Source</td>
			<td>ThermoFisher Scientific/Proxeon</td>
			<td>ES071 (newest model)</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenLab CDS (Online) Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 2.15.26</td>
			<td>Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 2.7</td>
			<td>Software for tuning the LC-MS/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps (with septa, 9 mm)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29315-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwthread glass vials (2 mL)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29376-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>247596</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71716</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>398055</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>Solvent preparation for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-acetate</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-090-100</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Solvent Rack: SRD-3600</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6500</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 3.0.63</td>
			<td>Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems

La ingeniería del metabolismo celular para la biosíntesis dirigida puede requerir extensos ciclos de diseño-construcción-prueba-aprendizaje (DBTL) a medida que el ingeniero trabaja en torno a los requisitos de supervivencia de la célula. Alternativamente, llevar a cabo ciclos DBTL en entornos libres de células puede acelerar este proceso y aliviar las preocupaciones con la compatibilidad del host. Un enfoque prometedor para la ingeniería metabólica libre de células (CFME) aprovecha los extractos de células crudas metabólicamente activos como plataformas para la biofabricación y para descubrir y crear rápidamente prototipos de proteínas y vías modificadas. La realización de estas capacidades y la optimización del rendimiento de CFME requieren métodos para caracterizar el metaboloma de las plataformas libres de células basadas en lisato. Es decir, las herramientas analíticas son necesarias para monitorear las mejoras en las conversiones de metabolitos dirigidos y para dilucidar las alteraciones en el flujo de metabolitos al manipular el metabolismo del lisato. Aquí, se aplicaron análisis de metabolitos utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) junto con detección óptica o espectrométrica de masas para caracterizar la producción y el flujo de metabolitos en los lisatos de E. coli S30. Específicamente, este informe describe la preparación de muestras de lisatos cfme para análisis de HPLC utilizando detección de índice de refracción (RID) para cuantificar la generación de intermedios metabólicos centrales y subproductos en la conversión de sustratos de bajo costo (es decir, glucosa) a varios productos de alto valor. También se presenta el análisis de la conversión de metabolitos en reacciones CFME alimentadas con 13glucosas marcadas en C a través de cromatografía líquida de fase inversa acoplada a espectrometría de masas en tándem (MS / MS), una poderosa herramienta para caracterizar rendimientos específicos de metabolitos y flujo metabólico de lisato a partir de materiales de partida. En conjunto, la aplicación de estos métodos analíticos al metabolismo del lisato CFME permite el avance de estos sistemas como plataformas alternativas para ejecutar tareas de ingeniería metabólica más rápidas o novedosas.

Para cuantificar la síntesis libre de células a base de lisato de productos de fermentación comunes a partir de glucosa, los lisatos derivados de cepas cultivadas en medios 2xYPTG fueron alimentados con 100 μM de glucosa como fuente primaria de carbono8. Las reacciones se detuvieron durante un curso de tiempo de 24 horas por acidificación de proteínas. Los sobrenadantes filtrados que contienen piruvato, succinato, lactato, formiato, acetato y etanol producidos a partir del catabolismo de glucosa se cargaron en el módulo de automuestreo de un sistema HPLC equipado con un módulo RID. Los viales con mezclas filtradas de productos finales fermentativos y glucosa a 1,17 μM, 2,34 μM, 4,69 μM, 9,38 μM, 18,75 μM, 37,50 μM, 75 μM y 150 μM en el tampón S30 se cargaron en el instrumento como estándares. Los analitos fueron eluidos isocráticamente desde una columna de HPLC hasta el RID. Los picos de glucosa, succinato, lactato, formiato, acetato y etanol dentro del rango de 1 a 150 μM podrían resolverse mediante RID. Las áreas pico de glucosa se derivaron mediante la integración manual de los datos rid para muestras de curso de tiempo y curva estándar. Las áreas pico extraídas para succinato, lactato, formiato, acetato y etanol se tomaron de señales integradas automáticamente. Todas las curvas estándar (área pico vs. concentración conocida) tenían valores de R2 >0,99 y eran lineales en todo el rango de concentraciones utilizadas aquí.
Las concentraciones molares para todos los analitos objetivo se calcularon a partir de sus respectivas curvas estándar. La glucosa se consumió dentro de las primeras 3 h de la reacción y se fermentó principalmente a lactato(Figura 2A,B). La acumulación de etanol también ocurrió significativamente dentro de las primeras 3 h de la reacción y se detuvo a partir de entonces(Figura 2C). La observación de una producción significativa de lactato y etanol con un consumo significativo de glucosa después de 3 h no fue sin precedentes, ya que las vías de producción de lactato y etanol permiten la regeneración de 1 mol neto de NAD+ a partir de NADH glicolítico requerido para el consumo continuo de glucosa a través de la glucólisis (Figura 1). Por lo tanto, el lactato y el etanol pueden considerarse como los principales productos finales de fermentación en el metabolismo de la glucosa libre de células a base de lisato. El acetato estuvo presente inicialmente en las reacciones como un componente del tampón S30 e inesperadamente solo se acumuló debido al metabolismo después de 6 h cuando el consumo de glucosa se había ralentizado(Figura 2D). Este resultado sugiere que la fermentación de acetato no necesariamente permite un flujo glucolítico rápido en puntos de tiempo anteriores. Mientras tanto, el formiato y el succinato se sintetizaron como productos de fermentación menores(Figura 2E,F). En conjunto, el método permitió la cuantificación absoluta del agotamiento del sustrato de azúcar y la formación de productos fermentativos en los lisatos de E. coli S30.
La detección de EM para perfilar el metabolismo de la glucosa lisada específicamente se aplicó aquí. Los lisatos derivados de cepas cultivadas en medios 2xYPTG fueron alimentados con 13C6-glucosa como fuente de carbono. Las reacciones de CFME se ejecutaron por triplicado durante 0 h, 1 h, 2 h y 3 h. Las muestras de cada punto de tiempo se cargaron en un sistema LC equipado con una columna de fase invertida y se acoplaron a la transformada de Fourier y a los espectrómetros de masas de trampa de iones. Se obtuvieron y procesaron espectros de modo iónico negativo para analizar ácidos orgánicos, fosfatos de azúcar y aminoácidos. Se buscaron masas teóricas calculadas de 13especies etiquetadas con C pertenecientes al metabolismo central del carbono para identificar específicamente compuestos derivados de la glucosa. Sobre la base de las condiciones de cultivo de la cepa de origen utilizada y los informes previos de vías activas en E. coli CFME, se supone aquí que el proteoma de lisato comprende una red metabólica que alimenta la glucosa en la fermentación glucolítica, la vía de la pentosa fosfato y, posiblemente, el anabolismo de aminoácidos5,6,7,8,14 (Figura 1). Por lo tanto, la búsqueda se redujo a los miembros de estas vías, de los cuales 16 metabolitos que incorporan etiquetas 13C derivadas de la glucosa fueron anotados inequívocamente(Tabla suplementaria 1).
13 C6-glucosa se consumió observablemente a través de la glucólisis, como lo demuestran las fluctuaciones en las abundancias intermedias glucolíticas (Figura 3A-E). De acuerdo con los datos de HPLC-RID, la glucosa se acumuló a 13C3-lactato y también se fermentó a 13C3-succinato dentro de las primeras 3 h de la reacción(Figura 4A,B). La formación de 13C3-isotopólogo de succinato apoya el modelo propuesto de metabolismo de la glucosa lisada(Figura 1),donde es probable que el succinato se genere por la carboxilación de la molécula de fosfoenolpiruvato de 3 carbonos (PEP) y no a partir de la entrada de una molécula de acetil-CoA de 2 carbonos al ciclo de TCA. La activación del ciclo de TCA se ha asumido en estudios previos de CFME, pero otros 13intermedios de TCA etiquetados con C no se detectaron aquí8,19,21. 13 Sinembargo, la síntesis de C 3-aspartato ocurrió dentro de la primera h y se consumió, reforzando la idea de que la PEP se convierte directamente en oxaloacetato(Figura 1, Figura 6C). Los datos reflejan un proteoma de lisato de cepas de origen cosechadas durante el crecimiento fermentativo en medios ricos en glucosa (2xYPTG). Esto implicaría además que el resto de las enzimas TCA que no participan en la producción de succinato forman una rama oxidativa de TCA(Figura 1). Sin embargo, no se detectó ninguno de los metabolitos en esta vía, posiblemente porque las altas concentraciones de glutamato agregadas a la reacción CFME como un contraión de sal impiden la progresión de esta rama. 
Los datos de HPLC-RID se complementan adicionalmente con la falta de detección de 13C2-acetato dentro del marco de tiempo de reacción de 3 h, lo que sugiere que no hay acumulación de acetato a partir de glucosa hasta 3 h(Figura 2B). Sin embargo, el precursor directo del acetato, el acetil-fosfato (acetil-P), se acumuló, lo que sugiere que el brazo Pta de la vía Pta-AckA para la síntesis de acetato a partir de acetil-CoA está activo(Figura 4C,D). La desfosforilación catalizada por AckA de 13C2-acetil-P a 13C2-acetato probablemente no ocurra dentro de este período de tiempo debido a que el acetato es un componente importante del tampón S30 utilizado en las reacciones(Figura 1, Figura 2B).
También se observó la incorporación de 13C6-carbonos derivados de la glucosa a los fosfatos de azúcar 6-fosfogluconolactona (6PGL), 6-fosfogluconato (6PG), ribulosa-5-fosfato (Ru5P) y sedoheptulosa-7-fosfato (S7P)(Figura 5). Estos resultados confirman la participación de la vía de la pentosa fosfato en el metabolismo de la glucosa lisada y probablemente alimenta la síntesis de 13C9-tirosina,lo que ha sido sugerido antes por un estudio proteómico, al tiempo que proporciona un precursor para la producción de 13C5-histidina( Figura6A,B)7. La fenilalanina y el triptófano etiquetados no se observaron aquí, y tampoco la mayoría de los aminoácidos esenciales. Sin embargo, esto no es del todo sorprendente ya que es probable que el anabolismo de aminoácidos se enriquezca en lisatos derivados de células cultivadas en condiciones de privación de nutrientes o en la fase estacionaria7,22. Además, los datos hasta ahora sugieren que los intermediarios de la glucólisis y la fermentación se canalizan hacia reacciones finales regeneradoras de cofactores, lo que debe impedir la síntesis de muchos aminoácidos derivados de gliceraldehído-3-fosfato, piruvato y acetil-CoA (es decir, glicina, cisteína, serina, alanina, valina, leucina y lisina) (Figura 1). Como se mencionó, 13C3-aspartato se produjo dentro de la primera hora, mientras que el aspartato derivado de 13aminoácidos que incorporan C (es decir, treonina, isoleucina, metionina y asparagina) no se observaron posiblemente porque el aspartato derivado de la glucosa participa en la fermentación(Figura 1, Figura 6C). Por último, el flujo hacia el glutamato etiquetado y los aminoácidos derivados del glutamato puede haber sido impedido por altos niveles de glutamato en el entorno de reacción (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig01.jpg"> Figura 1: Un supuesto modelo metabólico de lisatos derivados de E. coli BL21DE3-Star que crece exponencialmente en altas concentraciones de glucosa. Se han notificado productos intermedios y finales de la glucólisis (verde), la vía de la pentosa fosfato (naranja oscuro) y las vías fermentativas (azul) de acetil-CoA en CFME a base de lisato. La presencia de fermentación succinata implica la activación de la rama oxidativa del TCA (gris). El anabolismo de aminoácidos (oro) en los lisados no está bien definido y se investiga aquí. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig02.jpg"> Figura 2:Datos de HPLC-RID para el consumo de glucosa y la síntesis fermentativa del producto final en reacciones CFME preparadas con extractos crudos de E. coli. (A) Consumo de glucosa y (B) lactato, (C) etanol, (D) acetato , (E) formiato y (F) succinato en reacciones CFME se monitorizaron durante 24 h. Se presentan concentraciones medias de mM y barras de error (SE) cuantificadas con curvas estándar (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig03.jpg"> Figura 3: Tendencias del curso temporal de 13C6-glucosa y 13intermedios glicolíticos C-etiquetados en E. coli lisato CFME. Abundancias relativas de (A) 13C6-glucosa, (B) 13C6-glucosa-6-fosfato/fructosa-6-fosfato, (C) 13C6-fructosa-1,6-bisfosfato, (D) 13C3-gliceraldehído-3-fosfato/fosfato de dihidroxiacetona, y (E) 13C6 -piruvato en reacciones CFME durante 3 h. Las áreas de pico en bruto extraídas por el software mzMINE se utilizaron para calcular promedios y barras de error (SE) para anotaciones positivas (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig04.jpg"> Figura 4: Tendencias del curso temporal de los productos intermedios y finales en la fermentación de 13C6-glucosa en E. coli lisato CFME. Abundancias relativas de (A) 13C3-lactato, (B) 13C3-succinato, (C) 13C2-acetil-fosfato, y (D) 13C2-acetil-CoA en reacciones CFME durante 3 h. Las áreas de pico en bruto extraídas por el software mzMINE se utilizaron para calcular promedios y barras de error (SE) para anotaciones positivas (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig05.jpg"> Figura 5: Tendencias del curso temporal de 13C6-intermedios de la vía de la pentosa fosfato derivada de la glucosa en E. coli lisato CFME. Abundancias relativas de (A) 13C6-6-fosfogluconolactona, (B) 13C6-6-fosfogluconato, (C) 13C5-ribulosa-5-fosfato, y (D) 13C7-sedoheptulosa-7-fosfato durante 3 h. Las áreas de pico en bruto extraídas por el software mzMINE se utilizaron para calcular promedios y barras de error (SE) para anotaciones positivas (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig06.jpg"> Figura 6: Tendencias del curso temporal de los aminoácidos derivados de la glucosa 13C6detectados en el lisato de E. coli CFME. Abundancias relativas de (A) 13C9-tirosina, (B) 13C5-histidina, y (C) 13C3-aspartato durante 3 h. Las áreas de pico en bruto extraídas por el software mzMINE se utilizaron para calcular promedios y barras de error (SE) para anotaciones positivas (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria 1:Cromatograma HPLC-RID representativo que muestra picos para los principales productos fermentativos en una reacción CFME incubada a 37 °C durante 24 h. Los picos de glucosa, succinato, lactato, formiato, acetato y etanol son suficientemente distinguibles por sus tiempos de retención en una columna de HPLC durante la elución isocrática con disolvente de ácido sulfúrico de 5 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-Suppfig1.eps" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria 2:Espectros de masas representativos para metabolitos etiquetados con 13C, específicamente (A) lactato, (B) glucosa y (C) 6-fosfogluconato (6PG) en una reacción CFME incubada a 37 ° C durante 1 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-SuppFig2.eps" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria 1:Lista de 13metabolitos marcados con C detectados, tiempos de retención (alineados entre muestras usando MZmine), valores teóricos de modo negativo marcado con C completamente m/ z, valores m / z de características detectadas y errores de masa calculados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/Supplemental%20Table%201.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Los protocolos describen métodos de cromatografía líquida de alto rendimiento acoplados al índice de refracción o a la detección espectrométrica de masas para estudiar reacciones metabólicas en sistemas complejos libres de células basados en lisato.

Cromatografía líquida acoplada a la detección de índice de refracción o espectrometría de masas para perfiles de metabolitos en sistemas libres de células basados en lisato

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

Este protocolo utiliza la detección del índice de refracción para medir los subproductos del metabolismo del carbono que se acumulan comúnmente en sistemas libres de células basados en lisato. También hace uso de la espectrometría de masas para detectar un panel aún más amplio de metabolitos centrales que se generan en los lisados metabólicamente activos. Las dos técnicas utilizadas en este protocolo proporcionan la capacidad de describir cuantitativamente las reacciones químicas que ocurren en un sistema basado en lisato y libre de células, lo que permite detectar una gama más amplia de metabolitos, incluidos los presentes en bajas concentraciones en el fondo de lisato complejo.En la demostración de los procedimientos estarán Jaime Lorenzo Dinglasan y David Reeves, investigadores graduados de la División de Biociencias. Comience combinando los diferentes componentes en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para preparar reacciones finales con 4,5 miligramos por mililitro de proteína de lisato total. Preparar reacciones de ingeniería metabólica libre de células, o CFME, con volúmenes finales de 50 microlitros por triplicado por punto de tiempo.Terminar las reacciones triplicadas en sus puntos de tiempo apropiados inmediatamente agregando un volumen igual de ácido tricloroacético al 5% al volumen de reacción final de cada muestra. Luego diluya cada muestra agregando dos veces el volumen de agua estéril a cada mezcla de reacción. Para recapitular el tiempo cero, mezcle el mismo volumen de ácido tricloroacético al 5% que el volumen total de reacción final con el lisato antes de agregar el resto de los componentes de la reacción.Este paso de acidificación precipita las enzimas de lisato antes de que metabolizen significativamente la glucosa. Vórtice las muestras y centrífuga en una microcentrífuga de sobremesa a 11, 600 veces g durante cinco minutos, y transfiera los sobrenadantes que contienen los analitos orgánicos a los tubos limpios. Almacene las muestras a menos 20 grados centígrados si los análisis de HPLC se realizarán más adelante.Asegúrese de descongelar las muestras almacenadas en hielo antes de continuar con el siguiente paso. Filtre cada sobrenadante con un filtro de poro de 0,22 micrómetros. Después de la centrifugación, transfiera cada filtrado a un vial de vidrio HPLC limpio.Cargue los viales en la bandeja de muestreado automático del sistema HPLC que ya se ha configurado para su análisis. En la barra de menús, seleccione Secuencia, Nueva plantilla de secuencia. Seleccione Secuencia.Guarde la plantilla de secuencia como nombre de plantilla de secuencia S.Seleccione secuencia, tabla de secuencia. Anexar N filas correspondientes a N viales. A continuación, introduzca las posiciones de los viales y los nombres de las muestras en Vial y Nombre de la muestra, respectivamente, de acuerdo con su disposición en la bandeja del muestreador automático.Seleccione el método generado como se describe en el manuscrito en el menú desplegable Nombre del método e introduzca 50 microlitros como inyección por vial para cada fila. Haga clic en Aplicar y guarde la plantilla de secuencia seleccionando Secuencia, Guardar plantilla de secuencia. Asegúrese de que la plantilla de secuencia esté cargada seleccionando Secuencia, Plantilla de secuencia de carga, nombre de plantilla de secuencia S.Después de lograr una línea de base estable en la gráfica en línea, haga clic con el botón derecho en el panel Módulo RID, Control, Válvula de reciclaje desactivada para dirigir el flujo de disolvente a través del detector RID al desperdicio.Para iniciar la adquisición de datos, seleccione Secuencia en la barra de menús y, a continuación, seleccione Tabla de secuencia, Ejecutar. Seleccione Vista de análisis de datos en el menú Ver. Busque el nombre del archivo de secuencia en la lista de archivos en el lado izquierdo de la pantalla.En el panel central de la pantalla, vaya a Selección de vista de señal, Señal RID para ver los cromatogramas de muestra. Seleccione una fila correspondiente a cualquiera de las muestras en el panel superior de la pantalla. Los picos correspondientes a los analitos objetivo se organizarán a lo largo del eje de tiempo de retención como glucosa, succinato, lactato, formiato, acetato y etanol en muestras donde todos estos metabolitos están presentes.Discernir si los picos de interés están bien integrados por el software. Se debe dibujar automáticamente una línea roja como base de cada pico. Si la línea roja está torcida, la integración automática ha fallado.A continuación, seleccione el botón Integración manual del conjunto de herramientas de integración y dibuje manualmente una base de pico para integrar el área de pico. Seleccione la herramienta Cursor del Conjunto de herramientas común para hacer clic en los picos correctamente integrados. El área de pico y el tiempo de reacción correspondiente del pico seleccionado se resaltarán como una fila de tabla en el panel inferior fuera de la pantalla.Para exportar áreas pico, seleccione Archivo, Exportar, Resultados de integración. Trazar los valores del área pico frente a las concentraciones conocidas de muestras en una hoja de cálculo. Haga clic con el botón secundario en los datos trazados y, a continuación, seleccione Agregar línea de tendencia, Formato de línea de tendencia, Mostrar ecuación en el gráfico.En una hoja de cálculo separada, use las ecuaciones de las líneas de tendencia de curva estándar para convertir los valores de área pico en concentraciones para cada analito de cada muestra. Calcule las áreas pico promedio y los valores de error estándar entre triplicados para la visualización de datos. Establezca reacciones triplicadas por punto de tiempo, excepto el tiempo cero, en hielo como se describe en el manuscrito.En lugar de glucosa, use una concentración final de glucosa 100-milimolar-13C6 en las reacciones. Incubar las reacciones a 37 grados centígrados durante una, dos y tres horas. Para comenzar con el análisis, pipetee un volumen equivalente del disolvente de extracción a cada muestra.Si las muestras se congelaron, agregue el disolvente de extracción antes de que las muestras se descongelen por completo para evitar la reactivación del metabolismo de la glucosa. Realice todos los pasos de procesamiento de muestras en hielo. Para recapitular el tiempo cero, pipetear el volumen final del disolvente de extracción a un volumen apropiado de lisato para la concentración final deseada de 4,5 miligramos por mililitro en 50 microlitros de volumen de reacción.Agregue el resto de los componentes de reacción como se describió anteriormente. Este paso de acidificación precipita las enzimas de lisato antes de que metabolizen significativamente la glucosa. Incubar las muestras en disolvente de extracción sobre hielo durante 30 minutos con un suave agitación.Luego centrifuge las muestras a 21, 000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius para separar el sobrenadante de la proteína precipitada. Transfiera 50 microlitros del sobrenadante a viales de automuestreador y cargue los viales en la bandeja dentro del muestreador automático de cuatro grados centígrados. Después de preparar el instrumento para el análisis, configure una secuencia de ejecución utilizando el software de adquisición e interpretación de datos del sistema LC-MS/MS.En Roadmap, Sequence Setup, haga clic con el botón derecho en la tabla para insertar tantas filas como ejemplos. Para cada fila, ajuste el volumen de inyección a cinco microlitros y la posición a la posición respectiva del vial en la bandeja del muestreador automático. Introduzca nombres de archivo como nombres de ejemplo y establezca la ruta de archivo deseada para los resultados de la ejecución.Para iniciar la ejecución, resalte todos los nombres de archivo de la secuencia. En la barra de menús, seleccione Acciones, Ejecutar secuencia. Abra MZmine e importe los archivos de salida sin procesar obtenidos anteriormente.En la barra de menús, seleccione Métodos de datos sin procesar, Importación de datos sin formato y seleccione los archivos correspondientes a los ejemplos. Siga los pasos descritos en el manuscrito para completar el análisis de MZmine. Exporte las áreas de pico sin procesar al final del análisis de MZmine como un archivo CSV.Abra una hoja de cálculo para calcular las masas de metabolitos etiquetados con 13C del metabolismo de la glucosa para la búsqueda dirigida. Utilice masas calculadas de metabolitos etiquetados con 13C para buscar y anotar características de masa a carga a partir de los resultados de MZmine. Compruebe manualmente los espectros de las anotaciones putativas en un navegador de calidad para confirmar las anotaciones.Abra Roadmap, Qual Browser. Desde la barra de herramientas, abra el archivo sin procesar para importar datos de MS sin procesar de cada muestra. Dibuje una línea por debajo del rango deseado de tiempos de retención correspondiente a la anotación putativa en el cromatograma iónico total para ver un espectro de masas.En los experimentos de HPLC-RID, la glucosa se consumió dentro de las primeras tres horas de la reacción y se fermentó principalmente a lactato. La acumulación de etanol también ocurrió significativamente dentro de las primeras tres horas de la reacción y se detuvo a partir de entonces. El acetato estuvo presente inicialmente en las reacciones como un componente del tampón S30 y solo se acumuló debido al metabolismo después de seis horas, cuando el consumo de glucosa se había ralentizado.Por lo tanto, el lactato y el etanol pueden considerarse como los principales productos finales de fermentación en el metabolismo de la glucosa libre de células a base de lisato. Se observó que tanto el formiato como el succinato se sintetizaron como productos de fermentación menores. La glucosa-13C6 se consumió observablemente a través de la glucólisis, como lo demuestran las fluctuaciones en los intermedios glicolíticos.De acuerdo con los datos de detección del índice de refracción de HPLC, la glucosa se acumuló en lactato-13C3 y también se fermentó a succinato-13C3 dentro de las primeras tres horas de la reacción. También se observó la incorporación de carbonos derivados de la glucosa-13C6 a los fosfatos de azúcar 6-fosfogluconolactona, 6-fosfogluconato, ribulosa-5-fosfato y sedoheptulosa-7-fosfato, confirmando la participación de la vía de la pentosa fosfato en el metabolismo de la glucosa de lisato. Se encontró que el metabolismo de la glucosa lisada alimenta la síntesis de tirosina-13C9, al tiempo que proporciona un precursor para la producción de histidina-13C5.Es importante que las muestras de control representen con precisión el tiempo cero. Por lo tanto, asegúrese de que las proteínas en el lisato se inactivan antes de mezclar en la solución que contiene fuentes de energía. También asegúrese de que la integración automática de picos de muestras de prueba, muestras de control y estándares también sea consistente, de modo que las áreas de pico extraídas sean comparables.

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