Detta protokoll använder brytning index detektering för att mäta biprodukter av kol metabolism som ofta ackumuleras i lysat-baserade, cellfria system. Det använder också masspektrometri för att upptäcka en ännu bredare panel av centrala metaboliter som genereras i metaboliskt aktiva lysater. De två tekniker som används i detta protokoll ger möjlighet att kvantitativt beskriva de kemiska reaktioner som förekommer i ett lysatbaserat, cellfritt system, vilket gör det möjligt att upptäcka ett bredare spektrum av metaboliter, inklusive de som finns vid låga koncentrationer i den komplexa lysatbakgrunden.

Jaime Lorenzo Dinglasan och David Reeves, forskarutbildningsforskare från Biosciences Division, kommer att demonstrera procedurerna. Börja med att kombinera de olika komponenterna i 1,5 milliliter mikrocentrifugrör för att förbereda slutliga reaktioner med 4,5 milligram per milliliter totalt lysatprotein. Förbered cellfria metaboliska tekniker, eller CFME, reaktioner med slutliga volymer på 50 mikroliter i tre exemplar per tidpunkt.

Avsluta trelika reaktionerna vid lämpliga tidpunkter omedelbart genom att tillsätta en lika stor volym 5% trikloracetsyra till varje provs slutliga reaktionsvolym. Späd sedan varje prov genom att tillsätta två gånger volymen sterilt vatten till varje reaktionsblandning. För att rekapitulera tid noll, blanda samma volym av 5%trikloracetsyra som den totala slutliga reaktionsvolymen med lysatet innan du tillsätter resten av reaktionskomponenterna.

Detta försurningssteg fäller ut lysatenzymer innan de metaboliserar glukos avsevärt. Virvelproverna och centrifugera på en bänkskiva mikrocentrifug vid 11 600 gånger g i fem minuter och överför supernatanter som innehåller de organiska analyterna till rena rör. Förvara proverna på minus 20 grader Celsius om HPLC-analyser ska utföras senare.

Se till att tina upp de lagrade proverna på is innan du går vidare till nästa steg. Filtrera varje supernatant med ett 0,22-mikrometers porfilter. Efter centrifug, överför varje filtrate till en ren HPLC glasflaska.

Ladda injektionsflaskan på det automatiskasamplerfacket i HPLC-systemet som redan har ställts in för analys. Välj Sekvens, Ny sekvensmall på menyraden. Välj Sekvens.

Spara sekvensmallen som sekvensmallnamn S.Select Sequence, Sequence Table. Lägg till N-rader som motsvarar N-injektionsflaska. Mata sedan in injektionsflaska positioner och exempel namn under Injektionsflaskan respektive prov namn, enligt deras arrangemang på autosampler facket.

Välj den metod som genereras enligt beskrivningen i manuskriptet på rullgardinsmenyn Metodnamn och mata in 50 mikroliter som injektion per flaska för varje rad. Klicka på Använd och spara sekvensmallen genom att välja Sekvens, Spara sekvensmall. Se till att sekvensmallen läses in genom att välja sekvens, belastningssekvensmall, sekvensmallnamn S.När du har uppnått en stabil baslinje på onlinediagrammen högerklickar du på panelen RID-modulen, styr, av återvinningsventilen för att rikta lösningsmedelsflödet genom RID-detektorn till avfall.

Om du vill starta datainsamlingen väljer du Sekvens på menyraden och väljer sedan Sekvenstabell, Kör. Välj dataanalysvy på Visa-menyn. Leta reda på sekvensfilens namn från fillistan till vänster på skärmen.

På mittenpanelen på skärmen går du till val av signalvy, RID-signal för att visa exempelkromatogrammen. Välj en rad som motsvarar något av exemplen på den övre panelen på skärmen. Toppar som motsvarar målanalyterna kommer att ordnas längs retentionstidsaxeln som glukos, succinate, laktat, format, acetat och etanol i prover där alla dessa metaboliter finns.

Urskilja om topparna av intresse är väl integrerade av programvaran. En röd linje ska automatiskt ritas som bas för varje topp. Om den röda linjen är askew har den automatiska integrationen misslyckats.

Välj sedan knappen Manuell integration i integrationsverktygsuppsättningen och rita en toppbas manuellt för att integrera toppområdet. Välj markörverktyget i common tool set för att klicka på korrekt integrerade toppar. Toppområdet och motsvarande reaktionstid för den markerade toppen markeras som en tabellrad på den nedre panelen utanför skärmen.

Om du vill exportera toppområden väljer du Arkiv, Exportera, Integrationsresultat. Rita topparealvärden jämfört med kända koncentrationer av prover i ett kalkylblad. Högerklicka på de ritade data och välj sedan Lägg till trendlinje, formatera trendlinje, Visa ekvation i diagram.

I ett separat kalkylblad använder du ekvationerna för standardkurvans trendlinjer för att konvertera toppområdesvärden till koncentrationer för varje analyt från varje prov. Beräkna genomsnittliga toppområden och standardfelvärden för trelikater för datavisualisering. Ställ in triplicate reaktioner per tidpunkt, förutom tid noll, på is enligt beskrivningen i manuskriptet.

Istället för glukos, använd en slutlig koncentration av 100-millimolär glukos-13C6 i reaktionerna. Inkubera reaktionerna vid 37 grader Celsius i en, två och tre timmar. Till att börja med, pipett en motsvarande volym av extraktionsmedel till varje prov.

Om proverna frystes, tillsätt extraktionsmedel innan proverna helt tinar ut för att förhindra återaktivering av glukosmetabolismen. Utför alla provbearbetningssteg på is. För att rekapitulera tid noll, pipett den slutliga volymen av extraktion lösningsmedel till en lämplig volym lysat för önskad slutlig koncentration av 4,5 milligram per milliliter i 50 mikroliter reaktionsvolym.

Lägg till resten av reaktionskomponenterna enligt beskrivningen tidigare. Detta försurningssteg fäller ut lysatenzymer innan de metaboliserar glukos avsevärt. Inkubera proverna i extraktionsmedel på is i 30 minuter med skonsam skakning.

Centrifugera sedan proverna vid 21 000 gånger g i 15 minuter vid fyra grader Celsius för att separera supernatanten från det fällda proteinet. Överför 50 mikroliter av supernaten till autosampler injektionsflaska och ladda injektionsflaskan på brickan inom fyra grader Celsius autosampler. När du har förberett instrumentet för analys ställer du in en körningssekvens med hjälp av LC-MS/MS-systemets programvara för datainsamling och tolkning.

Högerklicka på tabellen i Översikt, Sekvensinställningar, för att infoga så många rader som exempel. För varje rad ställer du in injektionsvolymen på fem mikroliter och positionen till injektionsflaskans respektive position på autosamplerfacket. Mata in filnamn som exempelnamn och ange önskad filsökväg för körningsresultat.

Om du vill starta körningen markerar du alla filnamn i sekvensen. Välj Åtgärder, Kör sekvens på menyraden. Öppna MZmine och importera de råa utdatafilerna som erhållits tidigare.

Välj Rådatametoder, Import av rådata i menyraden och välj de filer som motsvarar exemplen. Följ stegen som beskrivs i manuskriptet för att slutföra MZmine-analysen. Exportera de råa toppområdena i slutet av MZmine-analysen som en CSV-fil.

Öppna ett kalkylblad för att beräkna massorna av 13C-märkta metaboliter från glukosmetabolism för den riktade sökningen. Använd beräknade massor av 13C-märkta metaboliter för att söka och kommentera mass-till-laddning funktioner från MZmine resultat. Kontrollera manuellt spektra av de förmodade anteckningarna i en kvalitetswebbläsare för att bekräfta anteckningarna.

Öppna Översikt, Qual Browser. Öppna obehandlad fil i verktygsfältet för att importera rådata för ms för varje exempel. Rita en linje under önskat intervall av retentionstider som motsvarar den förmodade anteckningen på det totala jonkromatogrammet för att visa ett masspektrum.

I HPLC-RID experiment konsumerades glukos inom de första tre timmarna av reaktionen och främst fermenteras till laktat. Etanolackumulering inträffade också signifikant inom de första tre timmarna efter reaktionen och slutade därefter. Acetat var ursprungligen närvarande i reaktionerna som en komponent i S30-bufferten och ackumulerades endast på grund av metabolism efter sex timmar, när glukoskonsumtionen hade saktat ner.

Laktat och etanol kan därmed betraktas som de viktigaste fermenteringsslutprodukterna i lysatbaserad, cellfri glukosmetabolism. Det observerades att både format och kortfattat syntetiserades som mindre jäsningsprodukter. Glukos-13C6 konsumerades observably genom glykolys, vilket framgår av fluktuationerna i glykolytiska intermediärer.

Överensstämmer med HPLC brytning index detektion data, glukos ackumuleras till laktat-13C3 och var också fermenteras till kortfattad-13C3 inom de första tre timmarna av reaktionen. Införlivandet av glukos-13C6-härledda kol till sockerfosfater 6-fosfoglukonolat, 6-fosfoglukonat, ribulosa-5-fosfat och sedoheptulosa-7-fosfat observerades också, vilket bekräftar deltagandet av pentofosfatväg i lysat glukosmetabolism. Lysate glukos metabolism konstaterades mata tyrosin-13C9 syntes, samtidigt som ger en föregångare för histidin-13C5 produktion.

Det är viktigt att kontrollproverna exakt representerar tid noll. Se därför till att proteinerna i lysatet inaktiveras före blandning i lösningen som innehåller energikällor. Se också till att den automatiska integreringen av toppar från testprover, kontrollprover och standarder också är konsekvent, så att extraherade toppområden är jämförbara.

Summary

Explore More Videos

Bioengineering

nummer 175