Name: liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems
Uploaded: 2021-09-23T14:45:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Bu araştırma, Bitki Mikrop Arayüzleri Bilimsel Odak Alanı (http://pmi.ornl.gov) kapsamında Genomik Bilim Programı, ABD Enerji Bakanlığı, Bilim, Biyolojik ve Çevre Araştırmaları Ofisi tarafından desteklenmiştir. Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı, DE-AC05-00OR22725 sözleşmesi kapsamında ABD Enerji Bakanlığı için UT-Battelle, LLC tarafından yönetilmektedir. Bu makale UT-Battelle, LLC tarafından ABD Enerji Bakanlığı ile DE-AC05- 00OR22725 Sözleşmesi kapsamında yazılmıştır. Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti makaleyi yayınlanmak üzere kabul ederek, Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti'nin bu makalenin yayınlanmış formunu yayınlamak veya çoğaltmak veya başkalarının bunu yapmasına izin vermek için münhasır olmayan, ödenmiş, geri alınamaz, dünya çapında bir lisansa sahip olduğunu kabul eder. Enerji Bakanlığı, DOE Kamu Erişim Planı (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan) uyarınca federal sponsorlu araştırmaların bu sonuçlarına kamu erişimi sağlayacaktır.

<ol>
	<li>Rollin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+hydrogen+production+from+biomass+by+in+vitro+metabolic+engineering:+Mixed+sugars+coutilization+and+kinetic+modeling.">High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).</li><li>Bowie, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biochemistry:+The+bio-inspired+cell-free+approach+to+commodity+chemical+production.">Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production.</a> Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).</li><li>Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+platform+for+cell+free+production+of+monoterpenes+from+glucose.">A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose.</a> Nature Communications. 8, 1-8 (2017).</li><li>Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosynthesis+of+limonene+using+enzyme-enriched+Escherichia+coli+lysates.">Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates.</a> Synthetic Biology. 4 (1), 003 (2019).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+potential+of+crude+cell+extracts+for+producing+pyruvate+from+glucose.">Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose.</a> Synthetic Biology. 3, (2018).</li><li>Kay, J. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysate+of+engineered+Escherichia+coli+supports+high-level+conversion+of+glucose+to+2,3-butanediol.">Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol.</a> Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).</li><li>Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+growth+medium+dropouts+promote+aromatic+compound+synthesis+in+crude+E.+coli+cell-free+systems.">Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysate+proteome+engineering+strategy+for+enhancing+cell-free+metabolite+production.">A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production.</a> Metabolic Engineering Communications. 12, 00162 (2021).</li><li>Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+pathway+prototyping.">Cell-free synthetic biology for pathway prototyping.</a> Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).</li><li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+cell-free+extract+reaction+(CFER)+system+in+Clostridium+thermocellum+to+identify+metabolic+limitations+to+ethanol+production.">Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production.</a> Frontiers in Energy Research. 8, 72 (2020).</li><li>Coskun, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Separation Tecniques: Chromatography. 3, (2016).</li><li>Bernardes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+acids+and+alcohols+quantification+by+HPLC/RID+in+sugarcane+vinasse:+analytical+method+validation+and+matrix+effect+assessment.">Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment.</a> International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).</li><li>Garcia, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computationally+guided+discovery+and+experimental+validation+of+indole-3-acetic+acid+synthesis+pathways.">Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways.</a> ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).</li><li>Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+control+of+cell-free+metabolism+through+pH+modulation.">Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation.</a> Synthetic Biology. 5, (2020).</li><li>Bujara, M., Sch&#252;mperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+cell-free+systems:+Implementation+and+debugging+of+a+system+of+biotransformations.">Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).</li><li>Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+identification+and+quantitation+in+LC-MS/MS-based+metabolomics.">Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics.</a> TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).</li><li>Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-liquid+chromatography.">Nano-liquid chromatography.</a> Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).</li><li>Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+mass+spectrometry-based+metabolomics:+Opportunities+and+challenges.">Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).</li><li>O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+CoA+metabolites+by+SAMDI-MS+to+optimize+the+cell-free+biosynthesis+of+HMG-CoA.">High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA.</a> Science Advances. 5, (2019).</li><li>Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unimod:+Protein+modifications+for+mass+spectrometry.">Unimod: Protein modifications for mass spectrometry.</a> Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).</li><li>Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+mixing+of+Escherichia+coli+crude+extracts+to+prototype+and+rationally+engineer+high-titer+mevalonate+synthesis.">Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).</li><li>Jaishankar, J., Srivastava, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+stationary+phase+survival+and+applications.">Molecular basis of stationary phase survival and applications.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2000 (2017).</li><li>Bartolomeo, M. P., Maisano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+for+quantitative+amino+acid+analysis.">Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).</li><li>Hauck, T., Landmann, C., Br&#252;hlmann, F., Schwab, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone+in+cytosolic+extracts+obtained+from+Zygosaccharomyces+rouxii.">Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).</li><li>Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsoSearch:+An+untargeted+and+unbiased+metabolite+and+lipid+isotopomer+tracing+strategy+from+HR-LC-MS/MS+datasets.">IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets.</a> Methods and Protocols. 3 (3), 54 (2020).</li></ol>

Yazarlar, bilinen rakip finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.

Özetlenen HPLC-RID yaklaşımı, şeker substrat tüketimini ve daha sonra zaman içinde lisat merkezi metabolizmanın ana organik asit ve alkol ürünlerine dönüşümlerini başarıyla ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol tek bir mobil faz kullanarak basit bir izokratik yöntem kullanıyor, minimum numune hazırlama gerektiriyor ve basit bir hedeflenen aşağı akış analizine izin veriyor. HPLC-RID yöntemiyle ölçülen analizler, yalnızca saklama süreleri ve dolayısıyla seçilen sütun reçinesi ile etkileşimleri ile ayırt edilir. Burada kullanılan HPLC sütunu özellikle karbonhidratları, organik asitleri ve alkolleri boyut dışlama ve ligand değişimini (yani iyon moderatörlü bölme kromatografisi) birleştirerek ayırmak için tasarlanmıştır. Bu nedenle, açıklanan yöntem, karbonhidrat substratlarının daha hedefli analizi ve öncelikle lisat bazlı biyo-dönüşümleri kolaylaştırması ve enerji vermesi beklenen glikoz fermantasyon yollarının son ürünlerini seçmek için yararlıdır8,15,21. Ancak, bu protokol hücre özlerinde diğer metabolik yolların aktivasyonunu hesaba katmaz. Amino asitler ve şeker fosfatları23 ,24gibi diğer metabolitleri tespit etmek için diğer kromatografik ayırma tekniklerini (yani hidrofilik etkileşim kromatografisi), gradyan elütasyon yöntemlerini, daha karmaşık numune hazırlamayı (yani türetmeyi) ve farklı optik dedektörleri (örneğin, ultraviyole ışık veya buharlaştırıcı ışık saçılma dedektörleri) kullanan boru hatları kullanılabilir. . Alternatif olarak, LC-MS/MS kullanılarak lysate metabolizmasını incelemek için küresel bir yaklaşım alınabilir.
Açıklanan LC-MS/MS yöntemi, daha geniş bir metabolit aralığını ölçmek ve tanımlamak için tek bir iş akışıdır. LC-MS/MS, metabolitleri tutma süresine ve yüksek çözünürlüklü m/z oranlarına göre ayırt etme hassasiyeti ve yeteneği nedeniyle metabolom profilleme için son teknoloji ürünü bir analitik araçtır16. Merkezi karbon metabolik yolları ve amino asit anabolizması üzerinde durulan negatif mod MS/MS, özellikle polar organik asitleri, şeker fosfatlarını ve amino asitleri tespit etmek için uygulanmıştır. Nano-sıvı kromatografi tekniği ile birleştiğinde, yöntem karmaşık lisat arka plan17'dekiküçük molekülleri tespit etmek için yüksek hassasiyet sağlar. Bununla birlikte, lysate tabanlı CFME metabolizmasının profillerinin profillendirilmesi açısından, açıklanan LC-MS / MS protokolünün bir sınırlaması, 50 m / z'lik alt algılama sınırıdır, bu da lysate glikoz metabolizmasında önemli bir ürün olan etanolün ve her ikisinin de ayrıntılı HPLC-RID yöntemiyle kolayca ölçülen formatlanmasını önler. LC-MS/MS ile karşılaştırıldığında, HPLC-RID maliyet ve zorluk açısından göreceli erişilebilirliğin ek avantajına sahiptir. İkinci noktaya kadar, burada açıklanan LC-MS/MS yönteminin sorunlarını gidermek, kütle spektrometresinde bir dereceye kadar uzmanlık gerektirebilir. Bununla birlikte, MS algılaması, metabolomlardaki etiketli izotopları da ayırt edebildiğinden RID üzerinde benzersiz çekici uygulamalara sahiptir, karmaşık lisat metabolik ağ aracılığıyla karbon hareketini takviyeli substratlardan anlamak için mükemmel bir teknik18. Burada 13C6-glikoz ile reaksiyonları destekleyerek ve aşağı akış 13C içeren metabolitlerin göreceli bolluk değerlerini analiz ederek böyle bir yaklaşım uygulandı. Analiz, aktif ve aktif olmayan yolların tanımlanmasına izin vererek, daha önce bildirilen varsayımları destekledi ve lisatlardaki metabolik akı hakkında yeni içgörüler sağladı. Belirli analizler için yöntem dahilinde değişiklikler de yapılabilir. Örneğin, 13C etiketli hedef bileşiğin standart çözümleri, zaman içinde glikoz türevi moleküllerin mutlak nicel ölçümlerini elde etmek ve akı dağılımları hakkında sonuçlar çıkarmak için numunelerle birlikte analiz edilebilir. Pozitif yüklü bileşiklerin daha iyi algılanması, pozitif mod algılama için ayarlanmış .meth dosyalarıyla diziler çalıştırılarak mevcut iş akışında da etkinleştirilebilir.
Açıklanan her iki yöntemde de analitik örnekleme, yüksek tekrarlanabilirlik sağlayarak uygun şekilde otomatikleştirilmiştir. Ayrıca, uygun cihaz taşıma uygulamaları ve bakımı gözlendiği sürece sorunsuz analitik çalıştırmalar beklenebilir. CFME reaksiyonlarını analiz etmek için bu araçları kullanırken, örneklemenin yukarı ve aşağı akışında daha kritik hususlar yapılmalıdır. Numune hazırlama sırasında, zaman kursu kontrollerinin zaman sıfırı temsili olması önemlidir. Burada, metabolik reaksiyonları durdurmak için asitleşme ile proteinler lysates çökebilirsiniz. Zaman sıfır örnekleri için, asit çözücü glikoz içeren reaksiyon karışımını eklemeden önce lysate ile birleştirildi. Trikloroasetik asit ile asitleşme, HPLC-RID verilerinde gösterildiği gibi glikozun sıfır zamanında metabolize edilmesini etkili bir şekilde sağlamıştır (Şekil 2). Bildirilen LC-MS/MS analizinde glikoz metabolizmasını söndürmek için benzer bir prosedür yapılırken, daha sonraki zaman noktalarında çıkarılan örneklere göre önemli ölçüde düşük bolluk değerlerinde de olsa, zaman sıfır örneklerinde 13C etiketli metabolit tespit edildi. Ayrıca, bu gözlemler glikoliz ara maddeleri ile sınırlıydı. Veriler, reaksiyonların bu son derece hassas yöntemle tespit edilen ekstraksiyon çözücü ile asitleşmeden sonra bir dereceye kadar glikolitik aktiviteyi koruduğunu göstermektedir. Ancak bu etkinliğin kapsamı ölçülmelidir. Önceki bir çalışma, asidik ekstraksiyon çözücülerinin ara glikolitik reaksiyonları yeterince söndürmeyebileceğini, ancak önemli glikoz tüketimini durdurabileceğinibildirmiştir 10. Bu, burada kullanılan sistemde daha fazla araştırılmaya devam ederken, zaman-sıfır ve daha sonraki zaman noktası örnekleri arasındaki göreceli bolluk değerlerindeki sert değişiklikler glikoz metabolizmasındaki eğilimler olarak yorumlanabilir. Bununla birlikte, alternatif söndürme yöntemlerinin araştırılması, özellikle mutlak miktarlarda metabolik ara madde elde etmek için benzer uygulamalarda tavsiye edilir10. Ayrıca, aşağı akış yazılım analizleri sırasında iyi uygulamalar da gözlenmelidir. İnsan hatasını azaltmak için RID sinyallerinden tepe alanlarını manuel olarak entegre ederken tutarlılık zorunludur. Manuel entegrasyon, numunelerdeki metabolit konsantrasyonlarını ölçmek için manuel olarak entegre edilmiş tepe alanları kullanıldığında standartların tepe alanlarına da uygulanmalıdır. Hedeflenen LC-MS/MS analizi boyunca, MZmine analizinden gelen belirsiz ek açıklamalar, MS kalitesinde bir tarayıcı kullanılarak manuel tepe denetimi ile doğrulanmalı ve m/z özellikleri yalnızca hesaplanan kütle hataları kabul edilebilir olduğunda açıklama eklenmelidir. Burada, izotop arama için kapsamlı ve sağlam yazılım henüz belirlenmediğinden, bu analizler sınırlı bir hedef kümesi için manuel olarak gerçekleştirildi. Bununla birlikte, 13C etiketli metabolitleri aramak için bu tür otomatik yöntemler şu anda ortaya çıkıyor ve merkezi karbon metabolizması25'inötesindeki lysates'in profil oluşturması gibi daha karmaşık analizleri de kolaylaştıracaktır.
Gelişmiş sıvı kromatografisi, karmaşık metabolik karışımlarda küçük molekülleri ayırmak için sağlam ve yaygın olarak uygulanan bir yöntemdir11. Açıklanan yöntemler, lysate tabanlı CFME reaksiyonlarında metabolit dönüşümlerini başarıyla analiz etmek için bu ayırma tekniğini kırılma indeksi veya kütle spektrometrik algılaması ile birleştirilmiştir. HPLC-RID ve LC-MS/MS, aktif lysate metabolizmasını profilleme için ayrı ayrı güçlü araçlardır ve tamamlayıcılıkları her tekniğin doğal sınırlamalarını gidermek için daha da kullanılabilir. Bildirilen yöntemler, lysate metabolizmasını anlamak, hedeflenen metabolit dönüşümlerindeki gelişmeleri izlemek ve lysate metabolizmasını manipüle ederken metabolit akısına yapılan değişiklikleri emmek için kullanılabilecekleri için CFME'nin uygulanmasını ve geliştirilmesini sağlar.

Kimyasal üretim için mühendislik mikroplarındaki sınırlamalar, rakip hücresel sağkalım fonksiyonlarının bulunmadığı in vitro biyokimyasal reaksiyonların yeniden kapsüllenerek ele alınabilir1. Ayrıca, açık reaksiyon ortamı (yani hücre zarının yokluğu) manipülasyona daha elverişlidir ve canlı hücrelere kıyasla izlenmesi daha kolaydır. Hücresiz metabolik mühendisliğin (CFME) bu temel kavramı, hidrojen ve monoterpenler gibi değerli kimyasalları şimdiye kadar mikrobiyal hücre fabrikalarında sunulandan daha yüksek büyüklükteki üretim metrikleriyle sentezlemek için metabolik yolların yeniden uzlaştırılmasıyla zarif bir şekilde gösterilmiştir. . Bununla birlikte, tüm yolları arındırma yöntemleri şu anda zaman ve maliyetle kısıtlanmıştır. Alternatif olarak, hücresiz metabolik sistemler, tüm yol rekonsitasyonuna göre hızlı ve ucuz yöntemlerle ham hücre özlerinden türetilebilir4. Hücre özlerinde tutulan merkezi metabolizma, 24 saat5,6üzerinde merkezi metabolik öncüller oluşturmak için tamponlanmış çözeltilerde enerji substratları (örneğin, glikoz ve enzimatik kofaktörler) ve tuzlarla desteklenebilir. Lysate bazlı CFME reaksiyonuna eksojen enzimler eklemek, glikozun yüksek titrelerde daha değerli kimyasallara daha karmaşık biyo-dönüşümlerini sağlar4,6,7. Hücre benzeri metabolik karmaşıklıkları nedeniyle bu sistemlerde verim tehlikeye girme eğiliminde olsa da, daha yüksek verim dönüşümü için lisat proteomları küratörlüğünü yapmak için benzersiz yöntemler geliştirilmiştir ve geliştirilmektedir7,8.
Lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik dönüşümleri gerçekleştirme kolaylığı, kimyasal üretimi hücre dışına tamamen taşımak veya bu tasarımları vivo2,9'da oluşturmadan ve test etmeden önce yüksek verime sahip yeni yolları prototipleme için bu mükemmel platformları yapar. Her iki uygulama için de metabolik dönüşümleri izlemek veya lysates metabolik akı genel değişiklikleri gözlemlemek için araçlar CFME ilerlemesinin ayrılmaz bir parçası. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), CFME reaksiyonlarının kimyasal bileşenlerini yüksek çözünürlükle ayırmak için kullanılabilir ve metabolit niceleme5,10için optik veya kütle spektrometrik dedektörleriyle bire bir olabilir. HPLC'nin temel prensibi, bir çözücüde çözünen (yani mobil faz) ve bir sütundan pompalanan analizlerin belirli sütun paketleme malzemesi (yani sabit faz)11ile etkileşime girmesidir. Kimyasal özelliklerine bağlı olarak, bu analitler sonunda sabit fazdan elde tutulmadan ve mobil faz tarafından bir dedektöre taşınmadan önce değişen tutma süreleri gösterir. Bu rapor, RID ve MS/MS algılamasından yararlanan HPLC tabanlı yöntemlerle E. coli lysate tabanlı CFME reaksiyonlarının hazırlanmasını ve analizini detaylandırmamaktadır.
HPLC, kırılma indisi algılaması (HPLC-RID) ile birleştiğinde, merkezi metabolik öncülleri ve son ürünleri hızlı bir şekilde tanımlamak için genel olarak erişilebilir bir yöntemdir. Kısaca, RID, analizlerin mobil faz12ile ışığın saptırılmasını nasıl değiştirdiğini ölçer. Numunelerdeki hedef analizlere karşılık gelen RID sinyalleri daha sonra standart çözümlerin RID sinyalleri ile karşılaştırmalarla ölçülebilir. CFME uygulamalarında, bu algılama modu en yaygın olarak boyut dışlama ve ligand değişim mekanizmalarının bir kombinasyonuna veya iyon moderatörlü bölüm kromatografisi 5 ,6,8,13'e göre bileşikleri ayıran HPLC sütunlarında kullanılmıştır. Bu özel teknik, glisat bazlı CFME reaksiyonlarında süksinit, laktat, format, asetat ve etanol gibi fermantasyon ürünlerinin oluşumunun yanı sıra glikoz gibi şeker substratlarının tüketimini hızlı bir şekilde ölçmek için kullanılır8. Bu bileşiklerin konsantrasyon değişikliklerini HPLC aracılığıyla kaydetmek, hem ham hücre özlerinin merkezi metabolik öncülleri havuza alma potansiyelinin aydınlatıcı olması hem de lysates6,8,14'tekiglikozdan karmaşık metabolik dönüşümler sırasında yol akısının fermentatif yollardan nasıl yönlendirildiğini anlamak için yararlı olmuştur. E. coli hücre özlerinde seminal CFME çalışmaları, fermantasyon bileşiklerinin glikoz katabolizminin son ürünleri olarak biriktiğini ve ayrıca eksojen enzimleri aşırı ifade eden lysates'te istenmeyen yan ürünler olarak ortaya çıktığını doğrulamaz6,15. Glikolitik reaksiyonları sürdürmek için kofaktörlerin (nad(P)H ve ATP) redoks eşdeğerlerinin yenilenmesinde fermentatif metabolizmanın gerekli bir rol oynadığı ileri sürülmektedir8. Bu nedenle, fermantasyon ürünlerini ayırmak için tasarlanmış HPLC tabanlı bir optik algılama yöntemi, çeşitli lisat tabanlı CFME görevlerini yürütürken kullanışlı ve yaygın olarak uygulanan bir araçtır.
CFME karbonhidrat, organik asit veya alkol olmayan metabolik son ürünleri biriktirmek için uygulanabilir4. Sentezlendikleri kadar hızlı tüketilen ara maddelerin ölçümü de istenebilir10. HPLC-RID'e maliyet ve zorluk açısından erişilebilir olsa da, bu yöntem metabolitleri yalnızca saklama süresine göre ayırt etme yeteneği ile kısıtlanır. Sıvı kromatografisi MS/MS algılama (LC-MS/MS)16ile birleştiğinde daha geniş bir metabolit yelpazesi analiz edilebilir. Bu yöntemle, mobil fazdaki analizler iyonize edilir ve her molekülün kütle ve yük özelliklerine göre farklı olarak tespit edilir. Hem metabolit'in kütle-şarj oranı (m/z) oranı hem de sütundaki tutma süresi hakkında bilgi, böylece çoğu metabolik ara ve son ürünün yüksek çözünürlüklü ayrılmasını kolaylaştırır16. Bu algılama tekniği, çok daha düşük akış hızları ve numune enjeksiyon hacimleri sağlayan nano-sıvı kromatografisi ile de birleşerek karmaşık lisat arka plan17'dekiküçük moleküllerin daha hassas bir şekilde algılanmasını sağlar. LC-MS/MS ayrıca izotop etiketleme ile uygulanabilir, çünkü birikmiş etiketler analitlerin m/z değerlerinde değişiklikler verir18. 13C6-glikoz substratı ile desteklenmiş bir CFME reaksiyonundan çıkarılan zaman noktası ölçümleri, özellikle takviye edilen glikozdan elde edilen son veya yan ürünleri belirleyebilir. Bu izotop izleme yöntemi henüz CFME çalışmalarında yaygın olarak uygulanmasa da, özellikle bu reaksiyonlardaki tuz karşıtları (yani asetat ve glutamat) ikincil substratlar olarak katabolize edildiğinden, lysate tabanlı CFME sistemlerinde metabolik dönüşümleri anlamak için güçlü bir araçtır19. Bu teknikten yararlanmak, bu güne kadar tam olarak anlaşılamayan lysates'te glikoz metabolizmasının kapsamlı bir resmini çizebilir. Burada, protokol nano-sıvı kromatografisi için nanoelekrospray iyonizasyonu (nano ESI) MS / MS ile birleştiğinde, özellikle E. coli lisates'te olası bir glikoz metabolizması modelini sorgulamak için kullanılabilecek bir yöntemi detaylandırmaktedir (Şekil 1). Model, fermentatif yolların raporlarına ve pentoz fosfat yolunun zengin medyada yetişen suşlardan elde edilen E. coli lysates'te aktif olduğu raporlarına dayanmaktadır5,6,8,14. Teknik ayrıca amino asit üretimini araştırmak için kullanılır, çünkü lizazlardaki glikozdan amino asit anabolizmi hakkındaki mevcut bilgi aromatik amino asitlerin sentezi gibi birkaç örnekle sınırlıdır7. Bu yollardaki son ürünlerin ve ara ürünlerin (yani organik asitler, şeker fosfatlar ve amino asitler) çoğunlukla polar doğası göz önüne alındığında, burada ters fazlı sıvı kromatografisi kullanılmıştır. Bu teknik kutup bileşiklerini kutupsal olmayan sabit fazdan elution ile ayırır. Bu bileşikler daha sonra nano ESI tarafından en az bir negatif temel yüke sahip analizlerin tespit edilmesine izin veren negatif iyon modunda iyonize edildi ve bu nedenle asidik bileşikleri tespit etmek için yararlıdır. Bu teknik burada glikoz türevi 13C içeren metabolitleri analiz etmek için kullanılır ve lysates glikoz metabolizmasını anlamak için LC-MS / MS'in yararını gösterir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m centrifuge tube filters (spin columns)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Binary LC Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1312B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity High Performance Degasser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4225A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Refractive Index Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G7162A</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1260 Infinity Standard Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1329B</td>
			<td>HPLC-RID system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374</td>
			<td>CFME reaction mix component (LC-MS/MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.20 &#956;m pore (PES membrane) filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminex HPX 87-H column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1250140</td>
			<td>Chromatography column for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1376</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vial caps (yellow, snap)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4011-50Y</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W225181</td>
			<td>Sample storage/delivery for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-dextrose (Glucose)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9230</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8281</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC/MS grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica (internal diameter of 100 &#956;m, external diameter of 375 &#956;m)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>WM22005-ND</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetex 5 &#956;m C18 stationary phase (100 &#197;)</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Chromatography column for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A; special order</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0632</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanospray Ionization Source</td>
			<td>ThermoFisher Scientific/Proxeon</td>
			<td>ES071 (newest model)</td>
			<td>Mass spectrometer for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenLab CDS (Online) Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Version 2.15.26</td>
			<td>Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 2.7</td>
			<td>Software for tuning the LC-MS/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501</td>
			<td>CFME reaction mix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps (with septa, 9 mm)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29315-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwthread glass vials (2 mL)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>29376-U</td>
			<td>Sample storage/delivery for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>247596</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71716</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>398055</td>
			<td>Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>Solvent preparation for HPLC-RID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-acetate</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>T-090-100</td>
			<td>S30 buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Solvent Rack: SRD-3600</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 LC with autosampler</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS</td>
			<td>Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC/MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6500</td>
			<td>Solvent preparation for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Version 3.0.63</td>
			<td>Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based cell-free systems

Hedeflenen biyosentez için mühendislik hücresel metabolizması, mühendis hücrenin hayatta kalma gereksinimleri etrafında çalıştığından kapsamlı tasarım-yap-test-öğrenme (DBTL) döngüleri gerektirebilir. Alternatif olarak, hücresiz ortamlarda DBTL döngüleri gerçekleştirmek bu süreci hızlandırabilir ve ana bilgisayar uyumluluğu ile ilgili endişeleri hafifletebilir. Hücresiz metabolik mühendislik (CFME) için umut verici bir yaklaşım, metabolik olarak aktif ham hücre özlerini biyo-üretim ve modifiye proteinleri ve yolları hızla keşfetmek ve prototipleme için platformlar olarak kullanmaktadır. Bu yetenekleri gerçekleştirmek ve CFME performansını optimize etmek, lysate tabanlı hücresiz platformların metabolomlarını karakterize etmek için yöntemler gerektirir. Yani, analitik araçlar hedeflenen metabolit dönüşümlerindeki iyileştirmeleri izlemek ve lysate metabolizmasını manipüle ederken akı metabolit için değişiklikleri emmek için gereklidir. Burada, E. coli S30 lisatlarında metabolit üretimini ve akısını karakterize etmek için optik veya kütle spektrometrik tespiti ile birlikte yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak metabolit analizleri uygulandı. Özellikle, bu rapor, düşük maliyetli substratların (yani glikozun) çeşitli yüksek değerli ürünlere dönüştürülmesinde merkezi metabolik ara ve yan ürünlerin neslini ölçmek için kırma indeks tespiti (RID) kullanılarak HPLC analizleri için CFME lysates'ten örneklerin hazırlanmasını açıklar. Cfme reaksiyonlarında metabolit dönüşümünün analizi, 13C etiketli glikoz ile ters fazlı sıvı kromatografisi ile birlikte, spesifik metabolit verimlerini ve başlangıç malzemelerinden gelen lysate metabolik akıyı karakterize etmek için güçlü bir araç olan tandem kütle spektrometresine (MS / MS) bağlı olarak sunulmaktadır. Tamamen, bu analitik yöntemleri CFME lysate metabolizmasına uygulamak, bu sistemlerin daha hızlı veya yeni metabolik mühendislik görevlerini yürütmek için alternatif platformlar olarak ilerlemesini sağlar.

Glikozdan yaygın fermantasyon ürünlerinin lizat bazlı hücre içermeyen sentezini ölçmek için, 2xYPTG ortamlarında yetişen suşlardan elde edilen lizatlar birincil karbon kaynağı olarak 100 μM glikoz ile beslendi8. Reaksiyonlar protein asitlenmesi ile 24 saat boyunca durduruldu. Glikoz katabolizmasından üretilen piruvat, süksinit, laktat, format, asetat ve etanol içeren filtrelenmiş süpernatantlar, RID modülü ile donatılmış bir HPLC sisteminin otomatik örnekleyici modülüne yüklendi. 1.17 μM'de fermentatif son ürünler ve glikoz filtrelenmiş karışımları ile şişeler, S30 tamponunda 2,34 μM, 4,69 μM, 9,38 μM, 18,75 μM, 37,50 μM, 75 μM ve 150 μM konsantrasyonlar standart olarak cihaza yüklendi. Analizler bir HPLC sütunundan RID'ye isokratik olarak elde edildi. 1 ila 150 μM aralığında glikoz, süksinat, laktat, format, asetat ve etanol için tepeler RID ile çözülebilir. Glikoz için tepe alanları, zaman seyri ve standart eğri örnekleri için RID verilerinden manuel entegrasyon ile türetilmiştir. Succinate, laktat, format, asetat ve etanol için çıkarılan tepe alanları otomatik olarak entegre sinyallerden alınmıştır. Tüm standart eğriler (tepe alanı ve bilinen konsantrasyon) R2 değerlerine sahipti >0.99 ve burada kullanılan konsantrasyon aralığı boyunca doğrusaldı.
Tüm hedef analizler için molar konsantrasyonları kendi standart eğrilerinden hesaplanmıştır. Glikoz reaksiyonun ilk 3 h'sine kadar tüketildi ve esas olarak laktata fermente edildi (Şekil 2A,B). Etanol birikimi de reaksiyonun ilk 3 h'sinde önemli ölçüde meydana geldi ve daha sonra durdu (Şekil 2C). 3 saat sonra önemli glikoz tüketimi ile anlamlı laktat ve etanol üretiminin gözlemlenmesi, laktat ve etanol üretim yollarının glikoliz yoluyla sürekli glikoz tüketimi için gerekli olan glikolitik NADH'dan 1 net mol NAD+ yenilenmesine izin verinden daha önce görülmemiş bir şey değildi(Şekil 1). Laktat ve etanol böylece lysate bazlı hücre içermeyen glikoz metabolizmasında başlıca fermantasyon son ürünleri olarak düşünülebilir. Asetat başlangıçta S30 tamponunun bir bileşeni olarak reaksiyonlarda mevcuttu ve beklenmedik bir şekilde sadece glikoz tüketimi yavaşladığında 6 saat sonra metabolizma nedeniyle birikti (Şekil 2D). Bu sonuç, asetat fermantasyonunun daha önceki zaman noktalarında hızlı glikolitik akıyı mutlaka etkinleştirmediğini göstermektedir. Bu arada, format ve succinate küçük fermantasyon ürünleri olarak sentezlendi (Şekil 2E,F). Yöntem, E. coli S30 lisatlarında şeker substrat tükenmesinin ve fermentatif ürün oluşumunun mutlak nicelemesini sağladı.
Özellikle lysate glikoz metabolizmasını profillamak için MS tespiti burada uygulandı. 2xYPTG ortamlarında yetişen suşlardan elde edilen lysates karbon kaynağı olarak 13C6-glikoz ile beslendi. CFME reaksiyonları üç taraflı olarak 0 saat, 1 saat, 2 saat ve 3 saat boyunca çalıştırıldı. Her zaman noktasından alınan numuneler, ters fazlı bir sütunla donatılmış bir LC sistemine yüklendi ve Fourier dönüşümü ve iyon kapanı kütle spektrometreleriyle birleştirilmişti. Organik asitler, şeker fosfatlar ve amino asitleri analiz etmek için negatif iyon modu spektrumları elde edildi ve işlendi. Merkezi karbon metabolizmasına ait 13C etiketli türün hesaplanan teorik kütleleri, özellikle glikoz türevi bileşikleri tanımlamak için arandı. E. coli CFME'deki kullanılan kaynak gerinim ekim koşullarına ve önceki aktif yol raporlarına dayanarak, burada lysate proteomunun glikolitik fermantasyona, pentoz fosfat yoluna ve muhtemelen amino asit anabolizması 5 , 6,7,8,14 ' e (Şekil 1)glikoz besleyen metabolik bir ağdan oluştuğu varsayılmıştır. Bu nedenle, arama, glikoz türevi 13C etiketlerini içeren 16 metabolitin açıkça açıklama eklendiğini gösteren bu yolların üyelerine daraltıldı (Ek Tablo 1).
13 C6-glikoz, glikolitik ara bolluklardaki dalgalanmaların kanıt ettiği gibi glikoliz yoluyla gözle görülür şekilde tüketildi (Şekil 3A-E). HPLC-RID verileriyle tutarlı olarak, glikoz 13C3-laktata birikti ve reaksiyonun ilk 3 h'si içinde 13C3-succinate fermente edildi(Şekil 4A, B). 13C3-succinate izotopologue oluşumu, süksitin 2 karbonlu asetil-CoA molekülünün TCA döngüsüne girişinden değil, 3 karbon fosfolinolün (PEP) molekülünün karboksilasyonu ile üretilmesi muhtemel olduğu lysate glikoz metabolizmasının önerilen modelini destekler (Şekil 1). TCA döngüsünün aktivasyonu önceki CFME çalışmalarında varsayılmıştır, ancak TCA'nın diğer 13C etiketli ara malı burada tespit edilmiştir8,19,21. 13 C3-aspartat sentezi ancak ilk h içinde meydana geldi ve PEP'in doğrudan oksaloasetat'a dönüştürüldüğü fikrini güçlendirerek tüketildi (Şekil 1, Şekil 6C). Veriler, glikoz bakımından zengin medyada (2xYPTG) fermentatif büyüme sırasında toplanan kaynak suşlarından elde edilen bir lysate proteomunu yansıtır. Bu, süksinit üretimine katılmayan TCA enzimlerinin geri kalanının oksidatif bir TCA dalı oluşturduğu anlamına da neden olacaktır (Şekil 1). Bununla birlikte, bu yoldaki metabolitlerin hiçbiri tespit edildi, muhtemelen CFME reaksiyonuna tuz karşıtlığı olarak eklenen yüksek glutamat konsantrasyonları bu dalın ilerlemesini önler. 
HPLC-RID verileri ayrıca 3 saat reaksiyon süresi içinde 13C2-asetat algılamasının olmaması ile tamamlanır ve glikozdan 3 h'ye kadar asetat birikmesi olmadığını gösterir(Şekil 2B). Bununla birlikte, asetatın doğrudan öncüsü olan asetil-fosfat (asetil-P), asetil-CoA'dan asetat sentezi için Pta-AckA yolunun Pta kolunun aktif olduğunu düşündürmektedir (Şekil 4C,D). AckA katalizörlü defosforilasyonu 13C2-asetil-P ila 13C2-asetat, asetat reaksiyonlarda kullanılan S30 tamponunun önemli bir bileşeni olduğu için muhtemelen bu zaman dilimi içinde oluşmaz (Şekil 1, Şekil 2B).
Şeker fosfatları 6-fosfooğluconolactone (6PGL), 6-fosfogluconat (6PG), ribüloz-5-fosfat (Ru5P) ve sedoheptulose-7-fosfat (S7P) için 13C6-glikoz türevi karbonların birleştirilmesi de gözlenmiştir (Şekil 5). Bu sonuçlar pentoz fosfat yolunun lizat glikoz metabolizmasına katılımını doğrular ve muhtemelen daha önce proteomik bir çalışma tarafından önerilen 13C9-tirozin sentezini besler, aynı zamanda 13C5-histidin üretimi için bir öncü sağlar (Şekil 6A,B)7. Etiketli fenilalanin ve triptofan burada gözlenmemiştir ve esansiyel amino asitlerin çoğu da gözlenmemiştir. Bununla birlikte, amino asit anabolizminin besin açlığı çeken koşullarda veya sabit faz7,22'deyetişen hücrelerden elde edilen lysatlarda zenginleştirilmesi muhtemel olduğundan, bu tamamen şaşırtıcı değildir. Ayrıca, şimdiye kadarki veriler, glikoliz ve fermantasyon ara maddelerinin kofaktör rejenere edici uç reaksiyonlara doğru hunilendiğini göstermektedir, gliseraldehit-3-fosfat, piruvat ve asetil-CoA'dan (örneğin glisin, sistein, serine, alanin, valine, leucine ve lizin) elde edilen birçok amino asidin sentezini engellemelidir (Şekil 1). Belirtildiği gibi, ilk bir saat içinde 13C3-aspartat üretilirken, aspartat 13C içeren amino asit (yani, threonine, isoleucine, methionine ve asparagine) türetilmiştir, çünkü glikoz türevi aspartat fermantasyona katılır (Şekil 1, Şekil 6C). Son olarak, glutamattan elde edilen etiketli glutamat ve amino asitlere doğru akı reaksiyon ortamında yüksek glutamat seviyeleri tarafından engellenmiş olabilir (Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig01.jpg"> Şekil 1: Yüksek glikoz konsantrasyonlarında katlanarak büyüyen E. coli BL21DE3-Star'dan elde edilen putatif metabolik bir lysates modeli. Glikoliz (yeşil), pentoz fosfat yolu (koyu turuncu) ve asetil-CoA'dan fermentatif yolların (mavi) ara ve son ürünleri lizat bazlı CFME'de bildirilmiştir. Süksinit fermantasyonunun varlığı, oksidatif TCA dalının (gri) aktivasyonunu ima eder. Lysates amino asit anabolizması (altın) iyi tanımlanmamıştır ve burada araştırılmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig02.jpg"> Şekil 2: E. coli ham özleri ile hazırlanan CFME reaksiyonlarında glikoz tüketimi ve fermentatif son ürün sentezi için HPLC-RID verileri. (A) Glikoz tüketimi ve (B) laktat, (C) etanol, (D) asetat, (E) formate ve (F) CFME reaksiyonlarında süksinit üretimi 24 saat boyunca izlendi. Standart eğrilerle ölçülen ortalama mM konsantrasyonları ve hata çubukları (n = 3) sunulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig03.jpg"> Şekil 3: E. coli lysate CFME'de 13 C6-glikoz ve 13C etiketli glikolitik ara malı zaman seyri eğilimleri. (A) 13C6-glikoz, (B) 13C6-glikoz-6-fosfat/ fruktoz-6-fosfat, (C ) 13C6-fruktoz-1,6-bifosfat, (D) 13C3-gliseraldehit-3-fosfat/dihidroksiyaceton fosfat ve (E) 13C6 -CFME reaksiyonlarında 3 saatin üzerindeki piruvat. MzMINE yazılımı tarafından çıkarılan ham tepe alanları, pozitif ek açıklamalar için ortalamaları ve hata çubuklarını (SE) hesaplamak için kullanılmıştır (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig04.jpg"> Şekil 4: E. coli lysate CFME'de 13C6-glikoz fermantasyonunda ara ve son ürünlerin zaman seyri eğilimleri. 3 saat üzerindeki CFME reaksiyonlarında (A) 13C3-laktat, (B) 13C3-süksinit, (C) 13C2-asetil-fosfat ve (D) 13C2-asetil-CoA'nın bağıl bollukları. MzMINE yazılımı tarafından çıkarılan ham tepe alanları, pozitif ek açıklamalar için ortalamaları ve hata çubuklarını (SE) hesaplamak için kullanılmıştır (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig05.jpg"> Şekil 5: E. coli lysate CFME'de 13C6-glikoz türevi pentoz fosfat yolu aralarının zaman seyri eğilimleri. (A) 13C6-6-fosphogluconolactone, (B) 13C6-6-fosfolikonat, (C) 13C5-ribulose-5-fosfat ve (D) 13C7-sedoheptulose-7-fosfat 3 saatin üzerinde. MzMINE yazılımı tarafından çıkarılan ham tepe alanları, pozitif ek açıklamalar için ortalamaları ve hata çubuklarını (SE) hesaplamak için kullanılmıştır (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig06.jpg"> Şekil 6: E. coli lysate CFME'de saptanan 13C6-glikoz türevli amino asitlerin zaman seyri eğilimleri. (A) 13C9 -tirozin,(B) 13C5-histidin ve (C) 13C3-aspartate 3 saat üzerinde göreceli bolluk. MzMINE yazılımı tarafından çıkarılan ham tepe alanları, pozitif ek açıklamalar için ortalamaları ve hata çubuklarını (SE) hesaplamak için kullanılmıştır (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: 24 saat boyunca 37 °C'de inkübe edilmiş bir CFME reaksiyonunda majör fermentatif ürünler için zirveleri gösteren temsili HPLC-RID kromatogramı. Glikoz, süksinit, laktat, format, asetat ve etanol zirveleri, 5 mM sülfürik asit çözücü ile izokratik elüasyon sırasında bir HPLC sütununda tutma süreleri ile yeterince ayırt edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-Suppfig1.eps" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 2: 13C etiketli metabolitler için temsili kütle spektrumu, özellikle (A) laktat,(B) glikoz ve (C) 6-fosfoogluconat (6PG) 1 saat boyunca 37 °C'de <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-SuppFig2.eps" target="_blank">inkübe</a> edilmiş bir CFME reaksiyonunda.
Ek Tablo 1: Algılanan 13C etiketli metabolit listesi, saklama süreleri (MZmine kullanan örnekler arasında hizalanmış), teorik olarak tam 13C etiketli negatif mod m/z değerleri, algılanan özelliklerin m/z değerleri ve hesaplanan kütle hataları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/Supplemental%20Table%201.docx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems at JoVE.com

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

Bu protokol, lysate tabanlı, hücresiz sistemlerde yaygın olarak biriken karbon metabolizmasının yan ürünlerini ölçmek için kırılma indisi algılamasını kullanır. Ayrıca metabolik olarak aktif lisatlarda üretilen daha geniş bir merkezi metabolit panelini tespit etmek için kütle spektrometresini kullanır. Bu protokolde kullanılan iki teknik, lisat tabanlı, hücresiz bir sistemde meydana gelen kimyasal reaksiyonları nicel olarak tanımlama yeteneği sağlar ve karmaşık lisat arka planında düşük konsantrasyonlarda bulunanlar da dahil olmak üzere daha geniş bir metabolit yelpazesini tespit etmeyi mümkün kılır.Prosedürleri gösteren jaime Lorenzo Dinglasan ve David Reeves, Biosciences Bölümü'nden yüksek lisans araştırmacıları olacak. Toplam lysat proteininin mililitresi başına 4,5 miligram ile nihai reaksiyonları hazırlamak için farklı bileşenleri 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde birleştirerek başlayın. Zaman noktası başına üç taraflı olarak 50 mikrolitrelik son hacimli hücresiz metabolik mühendislik veya CFME reaksiyonları hazırlayın.Her numunenin son reaksiyon hacmine eşit hacimde %5 trikloroasetik asit ekleyerek triplikat reaksiyonları uygun zaman noktalarında derhal sonlandırın. Daha sonra her reaksiyon karışımına iki kat daha fazla steril su ekleyerek her numuneyi seyreltin. Sıfır süresini yeniden yakalamak için, reaksiyon bileşenlerinin geri kalanını eklemeden önce toplam son reaksiyon hacmiyle aynı hacimde %5 trikloroasetik asiti lisatla karıştırın.Bu asitleşme adımı, glikozu önemli ölçüde metabolize etmeden önce lysate enzimlerini çökeltir. Örnekleri ve santrifüjleri 11,600 kez g'da bir tezgah üstü mikrosantrifüj üzerinde beş dakika boyunca girdaplayın ve organik analizleri içeren süpernatantları temiz tüplere aktarın. HPLC analizleri daha sonra yapılacaksa numuneleri eksi 20 santigrat derecede saklayın.Bir sonraki adıma geçmeden önce depolanan numuneleri buz üzerinde çözdüğünüzden emin olun. Her bir süpernatant'ı 0,22 mikrometre gözenek filtresiyle filtreleyin. Santrifüjden sonra, her bir filtratı temiz bir HPLC cam şişesine aktarın.Şişeleri, analiz için önceden ayarlanmış olan HPLC sisteminin otomatik örnekleyici tepsisine yükleyin. Menü çubuğundan Sıra, Yeni Sıra Şablonu'nü seçin. Sıra'yı seçin.Sıra şablon şablon adını S.Sıra seç, Sıra tablosu olarak sıra şablon kaydedin. N şişelerine karşılık gelen N satırlarını ekle. Daha sonra otomatik örnekleme tepsislerindeki düzenlemelerine göre sırasıyla Şişe ve Örnek Adı altına şişe konumlarını ve örnek adları girin.Yöntem Adı açılır menüsünden yazıda açıklandığı gibi oluşturulan yöntemi seçin ve her satır için şişe başına enjeksiyon olarak 50 mikrolitre girin. Uygula'yı tıklatın ve Sıra, Sıra Şablonlarını Kaydet'i seçerek sıra şablonını kaydedin. Sıralı şablonun Sıra, Yükleme Sırası Şablonu, sıra şablonu adı S.Online çizimde kararlı bir taban çizgisi elde ettikten sonra, SOLVENT akışını RID dedektöründen atıklara yönlendirmek için panel RID Modülü, Kontrol, Kapalı Geri Dönüşüm Vanası'nı sağ tıklatın.Veri alımını başlatmak için menü çubuğundan Sırala'yı seçin ve sonra Sıra tablosu, Çalıştır'ı seçin. Görünüm menüsünden Veri Analizi görünümünü seçin. Sıralı dosya adını ekranın sol tarafındaki dosya listesinden bulun.Ekrandaki orta panelde, örnek kromatogramları görüntülemek için Sinyal Görünümü Seçimi, RID Sinyali'ne gidin. Ekrandaki üst panelden örneklerden herhangi birine karşılık gelen bir satır seçin. Hedef analitlere karşılık gelen tepeler, tüm bu metabolitlerin bulunduğu örneklerde glikoz, süksinit, laktat, format, asetat ve etanol olarak tutma süresi ekseni boyunca düzenlenecektir.İlginin zirvelerinin yazılım tarafından iyi entegre edilip edilmediğini ayırt edin. Her tepenin tabanı olarak otomatik olarak kırmızı bir çizgi çizilmelidir. Kırmızı çizgi askew ise, otomatik tümleştirme başarısız olmuştur.Ardından, Tümleştirme Araç Kümesi'nden El ile Tümleştirme düğmesini seçin ve tepe alanını tümleştirmek için el ile bir tepe tabanı çizin. Düzgün tümleşik tepelere tıklamak için Ortak Araç Kümesi'nden İmleç aracını seçin. Tepe alanı ve seçilen tepenin karşılık gelen reaksiyon süresi, ekranın altındaki alt panelde bir tablo satırı olarak vurgulanır.Tepe alanlarını dışa vermek için Dosya, Dışarı Aktar, Tümleştirme Sonuçları'nı seçin. Bir elektronik tablodaki bilinen numune konsantrasyonlarına karşı tepe alanı değerlerini çizin. Çizilen verileri sağ tıklatın ve Eğilim Çizgisi Ekle, Eğilim Çizgisini Biçimlendir, Denklemi Grafikte Görüntüle'yi seçin.Ayrı bir elektronik tabloda, tepe alanı değerlerini her örnekteki her analiz için konsantrasyonlara dönüştürmek için standart eğri eğilim çizgilerinin denklemlerini kullanın. Veri görselleştirmesi için üç taraflı ortalama tepe alanlarını ve standart hata değerlerini hesaplayın. El yazmasında açıklandığı gibi buz üzerinde sıfır zamanı hariç, zaman noktası başına üç taraflı reaksiyonlar ayarlayın.Glikoz yerine, reaksiyonlarda 100 milimoler glikoz-13C6 son konsantrasyonu kullanın. Reaksiyonları 37 santigrat derecede bir, iki ve üç saat kuluçkaya yatır. Analizle başlamak için pipet, her numuneye ekstraksiyon çözücüsunun eşdeğer bir hacmini pipetler.Numuneler dondurulduysa, glikoz metabolizmasının yeniden etkinleştirildiğini önlemek için numuneler tamamen çözülmeden önce ekstraksiyon çözücüsüyü ekleyin. Tüm numune işleme adımlarını buz üzerinde gerçekleştirin. Sıfır süresini yeniden yakalamak için, 50 mikrolitre reaksiyon hacminde mililitre başına 4,5 miligram istenen son konsantrasyon için son ekstraksiyon çözücü hacmini uygun bir lysate hacmine pipet.Reaksiyon bileşenlerinin geri kalanını daha önce açıklandığı gibi ekleyin. Bu asitleşme adımı, glikozu önemli ölçüde metabolize etmeden önce lysate enzimlerini çökeltir. Numuneleri buz üzerinde ekstraksiyon çözücüslerinde hafifçe sallanarak 30 dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra örnekleri 21.000 kez g'da 15 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjle santrifüj ederek süpernatantı çökük proteinden ayırın. Süpernatantın 50 mikrolitresini otomatik örnekleyici şişelere aktarın ve şişeleri dört santigrat derece otomatik örnekleyici içinde tepsiye yükleyin. Cihazı analize hazırladıktan sonra, LC-MS/MS sisteminin veri toplama ve yorumlama yazılımını kullanarak bir çalışma dizisi ayarlayın.Yol Haritası, Sıralı Kurulum'da, örnek kadar satır eklemek için tabloyu sağ tıklatın. Her satır için enjeksiyon hacmini beş mikrolitreye ve şişenin otomatik örnekleme tepsisinde ilgili konumuna ayarlayın. Dosya adlarını örnek adlar olarak girin ve çalıştırma sonuçları için istediğiniz dosya yolunu ayarlayın.Çalıştırmayı başlatmak için, sıradaki tüm dosya adlarını vurgulayın. Menü çubuğunda Eylemler, Sırayı Çalıştır'ı seçin. MZmine'yi açın ve daha önce elde edilen ham çıktı dosyalarını alın.Menü çubuğundan Ham Veri Yöntemleri, Ham Veri alma'yı seçin ve örneklere karşılık gelen dosyaları seçin. MZmine analizini tamamlamak için makalenin içinde açıklanan adımları izleyin. MZmine analizinin sonundaki ham tepe alanlarını CSV dosyası olarak dışa aktarın.Hedeflenen arama için glikoz metabolizmasından 13C etiketli metabolit kütlelerini hesaplamak için bir elektronik tablo açın. MZmine sonuçlarından kütleden şarja özellikleri aramak ve açıklama eklemek için 13C etiketli metabolitlerden oluşan hesaplanan kütleleri kullanın. Ek açıklamaları onaylamak için kaliteli bir tarayıcıda putatif ek açıklamaların spektrumunu el ile kontrol edin.Yol Haritası, Qual Browser'ı açın. Araç çubuğundan, her örneğin ham MS verilerini almak için ham dosyayı açın. Kütle spektrumunu görüntülemek için toplam iyon kromatogramındaki putatif ek açıklamaya karşılık gelen istenen saklama süresi aralığının altına bir çizgi çizin.HPLC-RID deneylerinde, glikoz reaksiyondan sonraki ilk üç saat içinde tüketildi ve esas olarak laktat için fermente edildi. Etanol birikimi de reaksiyonun ilk üç saati içinde önemli ölçüde meydana geldi ve daha sonra durdu. Asetat başlangıçta S30 tamponunun bir bileşeni olarak reaksiyonlarda mevcuttu ve sadece glikoz tüketiminin yavaşladığında altı saat sonra metabolizma nedeniyle birikti.Laktat ve etanol böylece lysate bazlı, hücresiz glikoz metabolizmasında başlıca fermantasyon son ürünleri olarak düşünülebilir. Hem format hem de süksinitinin küçük fermantasyon ürünleri olarak sentezlendiği gözlendi. Glikoz-13C6, glikolitik ara ürünlerdeki dalgalanmalarda belirgin olduğu gibi glikoliz yoluyla gözle görülür şekilde tüketildi.HPLC kırma indeks algılama verileri ile tutarlı olarak, glikoz laktat-13C3'e birikti ve reaksiyondan sonraki ilk üç saat içinde succinate-13C3 için fermente edildi. Glikoz-13C6 türevi karbonların şeker fosfatları 6-fosfooğluconolactone, 6-fosfosatkonat, ribüloz-5-fosfat ve sedoheptüloz-7-fosfata dahil olduğu da gözlendi ve pentoz fosfat yolunun glisate glikoz metabolizmasına katılımını doğruladı. Lizat glikoz metabolizmasının tirozin-13C9 sentezini beslediği ve aynı zamanda histidin-13C5 üretimi için bir öncü sağladığı bulunmuştur.Denetim örneklerinin sıfır zamanını tam olarak temsil ettiği önemlidir. Bu nedenle, enerji kaynaklarını içeren çözeltide karıştırmadan önce lysate'deki proteinlerin inaktive olduğundan emin olun. Ayrıca, çıkarılan tepe alanlarının karşılaştırılabilir olması için test örneklerinden, kontrol örneklerinden ve standartlardan tepelerin otomatik entegrasyonunun da tutarlı olduğundan emin olun.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

A Coupled Experiment-finite Element Modeling Methodology for Assessing High Strain Rate Mechanical Response of Soft Biomaterials

Yumuşak Biyomalzeme Yüksek Deformasyon Hızı Mekanik Tepki değerlendirilmesi için Coupled Deney-sonlu Eleman Modelleme Metodolojisi

This study offers a combined experimental and finite element (FE) simulation approach for examining the mechanical behavior of soft biomaterials (e.g. ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Hücre-serbest Biyoloji yapışmalı femtoliter Odası Diziler

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

3D Mekansal Hücre Kültürleri için hücre yapı iskeleleri olarak biyo-uyumlu sıvı kristal Elastomer Köpüklerin sentezi

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Fotoakustik Akış Sitometri kullanarak Yumurtalık Kanseri Algılama

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Kanser Hücre Kültürlerinden Toplanan Ortamda Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Analiz Edilen Seçilmiş Kynureninlerin Eşzamanlı Nicelemesi

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...