Name: assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-07-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Dr. A. Tzagoloff'a (Columbia Üniversitesi) boyunokondriyal belirteç proteinleri Cyt'e karşı yetiştirilen antikorları sağladığı için teşekkür ederiz. b2, αKGD ve Sco1. Ayrıca, bu protokolün oluşturulması sırasında yararlı tartışmalar ve yorumlar için Dr. Mario Henrique de Barros'a (Universidade de São Paulo) teşekkür ederiz.
Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) araştırma hibeleri ile desteklendi (grant 2013/07937-8).
Fernando Gomes ve Helena Turano da SıRASıYLA 2017/09443-3 ve 2017/23839-7 hibeleri olan FAPESP tarafından desteklenmektedir. Angélica Ramos ayrıca Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) tarafından desteklenmektedir.

1. Maya hücrelerinin büyümesi
<ol><li>Hücrelerin küçük bir kısmını -80 °C gliserol stoğundan bir YPD (%1 maya özü, %2 pepton, %2 glikoz) agar plakasına seri yaparak ilgi suşunun tek kolonilerini izole edin. Plakayı 2-3 gün boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: Bu protokolde kullanılan S. cerevisiae suşu BY4741'den türetilmiştir (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Auxotrophic marker genleri...

<ol>
	<li>Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proteins:+from+biogenesis+to+functional+networks.">Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).</li><li>Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondria:+An+overview+of+mitochondrial+biology+and+the+potential+of+mitochondrial+systems+biology.">Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).</li><li>Wiedemann, N., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+machineries+for+protein+import+and+assembly.">Mitochondrial machineries for protein import and assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).</li><li>Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importing+mitochondrial+proteins:+machineries+and+mechanisms.">Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms.</a> Cell. 138 (4), 628-644 (2009).</li><li>Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+import:+from+proteomics+to+functional+mechanisms.">Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).</li><li>Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+mitochondrial+and+cytosolic+translation+programs.">Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs.</a> Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).</li><li>Richter-Dennerlein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+synthesis+adapts+to+influx+of+nuclear-encoded+protein.">Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein.</a> Cell. 167 (2), 471-483 (2016).</li><li>Suomalainen, A., Battersby, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+The+contribution+of+organelle+stress+responses+to+pathology.">Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).</li><li>Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+genetic+variation+in+human+mitochondrial+protein+import.">Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).</li><li>Calvo, S. E., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+proteome+and+human+disease.">The mitochondrial proteome and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).</li><li>Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+complete+yeast+mitochondrial+proteome:+Multidimensional+separation+techniques+for+mitochondrial+proteomics.">Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).</li><li>Sickmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteome+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria.">The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).</li><li>V&#246;gtle, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+submitochondrial+protein+distribution.">Landscape of submitochondrial protein distribution.</a> Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).</li><li>Morgenstern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+a+high-confidence+mitochondrial+proteome+at+quantitative+scale.">Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale.</a> Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).</li><li>Zahedi, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+yeast+mitochondrial+outer+membrane+reveals+accumulation+of+a+subclass+of+preproteins.">Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).</li><li>V&#246;gtle, F. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermembrane+space+proteome+of+yeast+mitochondria.">Intermembrane space proteome of yeast mitochondria.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).</li><li>Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mitochondria+from+yeast+cells.">Purification of mitochondria from yeast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).</li><li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).</li><li>Gomes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+by+the+inner+membrane+peptidase+(IMP)+complex+or+Oct1+peptidase+controls+the+localization+of+the+yeast+peroxiredoxin+Prx1+to+distinct+mitochondrial+compartments.">Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).</li><li>Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+membranes+by+means+of+sodium+carbonate+treatment:+Application+to+endoplasmic+reticulum.">Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).</li><li>Glick, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+c1+and+b2+are+sorted+to+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria+by+a+stop-transfer+mechanism.">Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism.</a> Cell. 69 (5), 809-822 (1992).</li><li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).</li><li>Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+energetics+of+mitochondrial+protein+import+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).</li><li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations.">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).</li><li>Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+yeast+mitochondria.">Isolation of yeast mitochondria.</a> Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).</li><li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim29+is+a+novel+subunit+of+the+human+TIM22+translocase+and+is+involved+in+complex+assembly+and+stability.">Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability.</a> eLife. 5, 17463 (2016).</li><li>Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+disulfide+bonds+reveals+an+evolutionarily+conserved+mechanism+involved+in+mitochondrial+protein+translocase+assembly.">The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly.</a> Scientific Reports. 6, 27484 (2016).</li><li>Callegari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIM29+is+a+subunit+of+the+human+carrier+translocase+required+for+protein+transport.">TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport.</a> FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).</li><li>Neupert, W., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+into+mitochondria.">Translocation of proteins into mitochondria.</a> Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).</li><li>Meineke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outer+membrane+form+of+the+mitochondrial+protein+Mcr1+follows+a+TOM-independent+membrane+insertion+pathway.">The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway.</a> FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).</li></ol>

Burada sunulan protokol, submitochondrial bölmelerdeki protein lokalizasyonunu belirlemek için uzun süredir başarıyla kullanılmış ve sürekli olarak optimize edilmiştir13,14,18,21,22,23. Bu protokolün güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği, mitokondriyal preparatların saflığına ve bütünlüğüne güçlü bir ...

Mitokondriler, biyoenergetik, hücresel metabolizma ve sinyal yollarında önemli roller oynayan ökaryotik hücrelerin temel organelleridir1. Bu görevleri düzgün bir şekilde yürütmek için mitokondri, yapılarından ve işlevlerinden sorumlu benzersiz bir protein ve lipit kümesine güvenir. Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae, mitokondriyal süreçler üzerindeki araştırmalar ve diğer organeller için bir model sistemi olarak yaygın olarak kullanılmaktadır2. Mayadaki sadece sekiz protein için mitokondriyal genom kodları; mitokondriyal proteinlerin büyük çoğunluğu (~%99), sitosolik ribozomlar üzerine çevrilen nükleer genler tarafından kodlanır ve daha sonra sofistike protein ithalat makineleri tarafından doğru boyunkopondriyal bölmelerine ithal edilir3,4,5. Bu nedenle, mitokondriyal biyogenez hem nükleer hem de mitokondriyal genomların koordineli ifadesine bağlıdır6,7. Mitokondriyal biyogenezde kusurlara neden olan genetik mutasyonlar insan hastalıkları ile ilişkilidir8,9,10.
Son yirmi yılda, yüksek saflaştırılmış mitokondrileri hedefleyen yüksek verimli proteomik çalışmalar, en az 900 proteinden oluştuğu tahmin edilen maya mitokondriyal proteomunun kapsamlı bir şekilde nitelendirilmesiyle sonuçlandı11,12,13,14. Bu çalışmalar değerli bilgiler sağlasa da, dört mitokondriyal alt şirketteki her proteinin, yani dış zarın (OM), intermembran alanının (IMS), iç zarın (IM) ve matrisin suborganeller lokalizasyonu hala gereklidir. Bu soru, iki küçük mitokondriyal alt bileşenin (OM ve IMS)15,16'nın proteomik geniş çalışmaları ile kısmen ele alındı. Daha yakın zamanda, Vögtle ve işbirlikçileri mayada yüksek kaliteli bir küresel sekonondriyal protein dağılımı haritası oluşturarak ileriye doğru büyük bir adım attı. SILAC tabanlı nicel kütle spektrometresi, farklı boyunkondriyal fraksiyon protokolleri ve OM ve IMS proteomlarından elde edilen verileri birleştiren entegre bir yaklaşım kullanan yazarlar, dört mitokondriyal alt bölüme 818 protein atadı13.
Bu yüksek verimli proteomik çalışmaların elde ettiği gelişmelere rağmen, submitochondrial proteome bileşimi hakkındaki bilgimiz tamamlanmaktan çok uzaktır. Gerçekten de, Vögtle ve işbirlikçileri tarafından maya mitokondrilerine lokalize olduğu bildirilen 986 protein arasında, dört boyunluk bölmeden hiçbirine 168 atanamadı13. Ayrıca, yazarlar mitokondriyal membranların çevresine periferik olarak bağlı olduğu tahmin edilen proteinlerin membran topolojisi hakkında bilgi vermediler. Örneğin, iç zara periferik olarak atanan bir proteinin matrise mi yoksa intermembran uzaya mı dönük olduğunu bilmek mümkün değildir. Proteome çapındaki çalışmalardan elde edilen bu eksik verilerin yanı sıra, önemli sayıda mitokondriyal proteinin suborganeller lokalizasyonu hakkında çelişkili bilgiler vardır. Saccharomyces Genom Veritabanı (SGD) ve Uniprot gibi ortak veritabanlarında intermembran uzay proteini olarak atanan proteaz Prd1 buna bir örnektir. Şaşırtıcı bir şekilde, burada açıklanana benzer bir alt ihlal protokolü kullanarak, Vögtle ve işbirlikçileri Prd1'in gerçek bir matris proteini olduğunu açıkça gösterdi13. Yukarıda belirtildiği gibi, birçok mitokondriyal proteinin submitochondrial lokalizasyonunun aydınlatılması veya yeniden değerlendirilmesi gerekir. Burada, maya mitokondriyal proteinlerin suborganeller lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir protokol sunuyoruz. Bu protokol çeşitli araştırma grupları tarafından geliştirilmiş ve optimize edilmiştir ve birçok mitokondriyal proteinin membran topolojisinin yanı sıra boyunkondriyal lokalizasyonu belirlemek için rutin olarak kullanılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Component of Homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>Component of DDT buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used to inactivate proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus</td>
			<td>MP Biomedicals, Irvine, CA</td>
			<td>320921</td>
			<td>Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae

Maya mitokondriyal proteomunun karakterizasyonundaki son gelişmelere rağmen, önemli sayıda proteinin boyunkondriyal lokalizasyonu zor olmaya devam etmektedir. Burada, mitokondriyal protein fonksiyonu elucidation sırasında temel bir adım olarak kabul edilen maya mitokondriyal proteinlerin suborganeller lokalizasyonunu belirlemek için sağlam ve etkili bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, son derece saf bozulmamış mitokondri elde etmekten oluşan bir ilk adımı içerir. Bu mitokondriyal preparatlar daha sonra hipotonik şok (şişlik) ve proteinaz K (proteaz) ile inkübasyondan oluşan bir subfraksiyon protokolüne tabi tutulur. Şişlik sırasında, dış mitokondriyal membran seçici olarak bozulur ve proteinaz K'nin intermembran uzay bölmesinin proteinlerini sindirmesine izin verir. Buna paralel olarak, membran proteinlerinin topolojisi hakkında bilgi edinmek için, mitokondriyal preparatlar başlangıçta sonikasyona tabi tutulur ve daha sonra sodyum karbonat ile alkali ekstraksiyona tabi tutulur. Son olarak, santrifüjlemeden sonra, bu farklı tedavilerden elde edilen pelet ve süpernatant fraksiyonları SDS-PAGE ve batı lekesi tarafından analiz edilir. Submitochondrial lokalizasyon ve ilgi proteininin membran topolojisi, batı leke profili bilinen standartlarla karşılaştırılarak elde edilir.

Submitochondrial fraksiyonasyon protokolünün başarısı, son derece saflaştırılmış bozulmamış mitokondri elde edilmesine bağlıdır. Bunun için, maya hücresi lizisi sırasında, organellerin sağlamlığının neredeyse tamamen korunması esastır. Bu, hücre duvarının enzimatik sindirimini birleştiren bir hücre liziz protokolü ve ardından bir Dounce homojenizatör kullanarak plazma zarının fiziksel bozulması ile elde edilir. Mitokondriyal içerikler daha sonra diferansiyel santrifüjleme ile toplan...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Son gelişmelere rağmen, birçok maya mitokondriyal protein hala işlevleri tamamen bilinmemektedir. Bu protokol, moleküler işlevlerinin aydınlatılması için temel olan proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Bu protokol, mitokondriyal protein fonksiyonu elucidation sırasında temel bir adım olarak kabul edilen maya mitokondriyal proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için tasarlanmıştır. Protokol, farklı büyüme koşullarında tutulan maya suşlarımız için uygundur. Mitokondriyi incelemek olarak araştırma için güçlü bir aracı temsil ediyor.Başlangıç olarak, 80 C'de depolanan gliserol stoğundan, tek kolonileri ilgi gerginliğinden izole etmek için bir YPD agar plakasına hücreleri çizgiler. Ve plakayı 2 ila 3 gün boyunca 30 C'de kuluçkaya yatırın. 10 ila 30 ml YPGal ortamı içeren 100 ml Erlenmeyer şişesinde YPD agar plakasından 2 ila 3 ayrı koloni aşılayarak bir başlangıç kültürü hazırlayın.Matarayı 30 C'de 24 saat boyunca 180 ila 200 rpm'de kuvvetli sallanarak kuluçkaya yatırın. Başlangıç kültürünü 1 L taze YPGal ortamına seyrelterek 600 nm'de 0,1'den daha az optik yoğunluğa dönüştürün. Optik yoğunluk 1 ila 1,5'e ulaşana kadar hücreleri 30 C'de yaklaşık 12 saat boyunca 180 ila 200 rpm'de kuvvetli sallama ile yetiştirin.Metinde açıklandığı gibi yüksek oranda saflaştırılmış mitokondrilerin yalıtımını gerçekleştirin. Ve üreticinin talimatlarını izleyerek Bradford testini kullanarak yüksek oranda saflaştırılmış mitokondriyal preparatın protein konsantrasyonunun belirlenmesi. Buz gibi SEM tamponu ile protein konsantrasyonu 10 mg/ml olarak ayarlayın.40 l yüksek saflaştırılmış mitokondriyi dört 1,5 ml önceden soğutulmuş ve etiketli mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Birinci ve ikinci tüplere 360 l SEM tampon ekleyin. Ve üçüncü ve dördüncü tüplerde 360 l EM tamponu.Pipet şemasını kullanarak, metne göre, ikinci ve dördüncü tüpe 4 L taze hazırlanmış proteinaz K ekleyin. Tüm tüpleri nazikçe karıştırdıktan sonra, ara sıra karıştırarak 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Proteinaz K aktivitesini durdurmak için dört tüpe de 4 L 200 mM PMSF ekleyin.Tüpleri 20.000 x g'da 4 C'de 30 dakika santrifüjleyin ve peleti bozmadan süpernatantı 1,5 ml önceden soğutulmuş yeni bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Daha sonra, peletin 400 l buz gibi SEM tamponunda yeniden depolansın. Proteinaz K'nin olası izlerini inaktive etmek için, toplanan süpernatantı çökeltin ve peleti trikloroasetik asitle 10 dakika boyunca buz üzerindeki tüpleri 10 dakika boyunca son bir konsantrasyona yeniden biriktirin.Trikloroasetik asitle işlenmiş örnekleri 12.000 x g'da 4 C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı çıkardıktan sonra peletiği 200 l numune tamponuna yeniden sunun. Bromofenol mavisi sararırsa, maviye dönene kadar 1 M Tris tabanının 1 ila 5 l'ini ekleyin. Tüm tüplere 4 l 200 mM PMSF ekleyin.SDS-PAGE ve western blot tarafından daha fazla analiz edilene kadar örnekleri 80 C'de saklayın. 200 l yüksek saflaştırılmış mitokondriyi 1,5 ml önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Mitokondrileri buz gibi SEM tamponu ile bir kat seyreltin.Küçük hacimlerle uyumlu bir sonicator kullanarak, buz üzerinde 30 saniye boyunca 3 kez sonicate mitokondri. Numuneyi 4 C'de 100.000 x g'da 30 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı 1,5 ml önceden soğutulmuş yeni bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Çözünür protein fraksiyonu için tüpü S" olarak etiket ettikten sonra, tüpü buzda tutun.400 l buz gibi SEM tamponunda bir önceki adımdaki peletin yeniden depolansın. Yeniden 100 l'lik peleti yeni bir 1,5 ml önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Submitochondrial parçacık fraksiyonu için tüpü SMP olarak etiketleyin ve tüpü buzda tutun.Kalan 300 l resüspended peletini taze hazırlanmış 200 mM sodyum karbonatla bir kat seyreltin. Ve seyreltilmiş numuneyi 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatır. Daha sonra, numuneyi 4 C'de 100.000 x g'da 30 dakika santrifüjleyin.Süpernatantı yeni bir 1,5 ml önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne toplayın.Karbonat süpernatant fraksiyonu için numuneyi CS olarak etiketleyin ve tüpü buzda tutun. 400 l buz gibi SEM tamponunda bir önceki adımdaki peletin yeniden depolansın. Ve karbonat çökelmiş fraksiyon için numuneyi CP olarak adlandırın.Tüm örnekleri trikloroasetik asitle% 10'luk son konsantrasyona çökeltin ve tüpleri 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya bırakın. Daha sonra, numuneleri 12.000 x g'da 4 C'de 10 dakika santrifüjleyin.Süpernatantı çıkardıktan sonra, her peleteri numune tamponunda yeniden çıkarın. Örnek arabellek sarı olursa, maviye dönene kadar 1 M Tris tabanının 1 ila 5 l'ini ekleyin.Tüm tüplere 1 l 200 mM PMSF ekleyin ve SDS-PAGE ve batı blot tarafından daha fazla analiz edilene kadar 80 C'de saklayın. Ham mitokondriyal fraksiyon sakkaroz yoğunluğu gradyan santrifüjasyonunda saflaştırılmış ve diğer hücresel kirleticilerde azalma gözlenmiştir. Mitokondriden mitoplast dönüşümüne, peletteki intermembran uzay proteini sitokrom b2'nin kaybolmasıyla izlendi.Üstteki eşlik eden görünümle. Intermembran proteinI Sco1'in proteinaz K aracılı bozulması, ozmotik şok nedeniyle dış zar bozulmasına bağlı olarak gözlendi. Dış mitokondriyal membran bütünlüğü, sitokrom b2 ve Sco1'in pelet fraksiyonunda proteinaz K bozulmasına karşı korunması ile doğrulandı.Benzer şekilde, matris çözünür protein KGD'nin korunması iç mitokondriyal membran bütünlüğünü doğruladı. Prx1 batı blot profili, intermembran uzayında ve matrisinde çift mitokondriyal lokalizasyon önerdi. Mitokondri, membran proteinlerinin topolojisini araştırmak için sonikasyon ve karbonat ekstraksiyona tabi tutuldu.İntegral membran proteini dökülmesi pelet fraksiyonlarında kaldı. KGD'nin süpernatan fraksiyonunda tespit edildi. Peletteki KGD proteininin tespiti, SMP'lerin oluşumunu etkileyen sonication parametre varyasyonlarından kaynaklandı.Sodyum karbonat tedavisinden sonra KGD ve SMP fraksiyonu çözünerek süpernatan fraksiyonda bulundu. Prx1 batı leke profili membran çevresi ile bir ilişki önerdi. Boyunokondriyal fraksiyonasyon protokolünün başarısı için, örneklere PMSF eklenerek hipotonik şişmeden sonra proteinaz K aktivitesinin durdurulması önemlidir.Siteler, submitochondrial protein lokalizasyonu hakkında bilgi sağlar. Bu protokol, mitokondriyal alt bileşenlerin proteomik çalışmaları sırasında temel olan mitokondriyal preparatların bütünlüğünü kontrol etmek için de kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Protein toplama Maya hücresel oksidatif stres üzerinde etkisi değerlendirilmesi

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes Geçici Interactors Tespiti için Grafix kullanımı

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...