Name: preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with dna plasmids encoding rna aptamers and riboswitches
Uploaded: 2021-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منحة LRIR 16RH3003J من مكتب البحث العلمي التابع للقوات الجوية ، بالإضافة إلى برنامج البيولوجيا التركيبية للبحوث التطبيقية للبيئات العسكرية للنهوض بأولويات العلوم والتكنولوجيا (ARAP) التابع لمكتب وكيل وزارة الدفاع الأمريكي للبحوث والهندسة.
تم توفير تسلسل ناقل البلازميد ل ThyRS (pSALv-RS-GFPa1 ، 3.4 كيلو بايت) بسخاء من قبل الدكتور ج. جاليفان. تم التبرع بشرانق دودة القز من Bombyx mori بسخاء من قبل الدكتور D.L. كابلان من جامعة تافتس ، ماساتشوستس.

1. بناء ناقلات البلازميد.
<ol><li>بناء متجه بلازميد (pSALv-RS-GFPa1، 3.4 كيلو بايت) عن طريق تضخيم تسلسل الترميز لريبوسويتش الثيوفيلين (ThyRS) مقترنا ب GFPa1 من ناقل pJ201: 23976-RS-GFPa1 (تم تصميمه وإنشاؤه بواسطة DNA2.0) وإدخاله في متجه تعبير الإشريكية القولونية ، pSAL13. استخدم البادئات الأمامية (5'-CGTGGTACCG...

<ol>
	<li>Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology+devices+for+in+vitro+and+in+vivo+diagnostics.">Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).</li><li>Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riboswitch-based+reversible+dual-color+sensor.">Riboswitch-based reversible dual-color sensor.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).</li><li>K&#246;nig, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+genomics+and+synthetic+biology+applications+between+hopes+and+concerns.">Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns.</a> Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).</li><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene+expression:+An+expanded+repertoire+of+applications.">Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).</li><li>Chushak, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+synthetic+riboswitch+in+cell-free+protein+expression+systems.">Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems.</a> RNA Biology. , 1-12 (2021).</li><li>Cole, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+interlaboratory+cell-free+protein+synthesis+variability.">Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).</li><li>Thavarajah, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-use+detection+of+environmental+fluoride+via+a+cell-free+riboswitch-based+biosensor.">Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).</li><li>Gr&#1235;we, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paper-based,+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs.">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable+environment-signal+detection+biosensors+with+cell-free+synthetic+biosystems.">Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems.</a> RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).</li><li>Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+compartmentalized+protein+synthesis+inside+double+emulsion+templated+liposomes+with+in+vitro+synthesized+and+assembled+ribosomes.">Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes.</a> Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).</li><li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells.">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027 (2018).</li><li>Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layer+microcapsules:+Fresh+insights+and+new+applications.">Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).</li><li>Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+and+structural+comparison+between+bright+and+dim+green+fluorescent+proteins+in+Amphioxus.">Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus.</a> Scientific Reports. 4, 5469 (2014).</li><li>Frey, B., Reischl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+Genomic+DNA+by+PCR.">Amplification of Genomic DNA by PCR.</a> Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. 13, 143-156 (1998).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+regeneration+and+reuse+of+silica+columns+from+PCR+purification+and+gel+extraction+kits.">Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits.</a> Scientific Reports. 8, 12870 (2018).</li><li>Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+should+be+simple:+Escherichia+coli+DH5&#945;-mediated+assembly+of+multiple+DNA+fragments+with+short+end+homologies.">Cloning should be simple: Escherichia coli DH5&#945;-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies.</a> PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).</li><li>Rockwood, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin.">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).</li><li>Drachuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+macromolecules+with+amino+acid-Poly(Ethylene+Glycol)+grafts+for+controlling+layer-by-layer+encapsulation+and+aggregation+of+recombinant+bacterial+cells.">Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells.</a> ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).</li><li>Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyelectrolyte+multilayer+capsules+as+vehicles+with+tunable+permeability.">Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).</li><li>Drachuk, I., Harbaugh, S., Ch&#225;vez, J. L., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+activity+of+DNA-encoded+sensing+elements+through+confinement+in+silk+microcapsules.">Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).</li><li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+inhibition+of+the+eukaryotic+ribosome.">Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+layer-by-layer+assembly:+A+tribute+to+ACS+Nano+associate+editor+Helmuth+M&#246;hwald.">The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth M&#246;hwald.</a> ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).</li><li>Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy-A+tool+for+structural+and+translational+DNA+research.">Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research.</a> APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).</li><li>Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borr&#243;s, S., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+DNA+complexation+state+of+pBAE+polyplexes+in+cells+with+super+resolution+microscopy.">Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy.</a> Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).</li><li>Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+of+nucleosome+core+particle+interactions+in+trans.">Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans.</a> Scientific Reports. 8, 7046 (2018).</li><li>Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+aspects+of+stabilization+of+compounds+in+silk.">Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk.</a> Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).</li><li>Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+macromolecular+crowding+and+reducing+conditions+for+in+vitro+ribosome+construction.">Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction.</a> Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).</li><li>Ge, X., Luo, D., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+expression+under+macromolecular+crowding+conditions.">Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions.</a> PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).</li><li>Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+single+RNA+molecules+with+fluorogenic+mango+II+arrays.">Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays.</a> Nature Communications. 11, 1283 (2020).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+RNA+dynamics+in+live+cells+with+bright+and+stable+fluorescent+RNAs.">Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).</li></ol>

يمكن تحضير كبسولات هيدروجيل دقيقة قابلة للنفاذ بشكل انتقائي محملة بأنواع مختلفة من تصميمات أجهزة الاستشعار المشفرة بالحمض النووي باتباع هذا البروتوكول. تتمثل إحدى السمات المميزة لنهج LbL في القدرة على تكييف تعقيد الكبسولات الدقيقة أثناء التجميع من أسفل إلى أعلى ، والذي يبدأ عادة بامتصاص ...

يوفر مجال البيولوجيا التركيبية فرصا فريدة لتطوير قدرات الاستشعار من خلال استغلال الآليات الطبيعية التي تطورها الكائنات الحية الدقيقة لرصد بيئتها والتهديدات المحتملة. الأهم من ذلك ، ترتبط آليات الاستشعار هذه عادة باستجابة تحمي هذه الكائنات الحية الدقيقة من التعرض الضار ، وتنظم التعبير الجيني للتخفيف من الآثار السلبية أو منع تناول المواد السامة. كانت هناك جهود كبيرة لهندسة هذه الكائنات الحية الدقيقة لإنشاء أجهزة استشعار خلية كاملة تستفيد من هذه الاستجابات الطبيعية ولكن إعادة توجيهها للتعرف على أهداف جديدة و / أو لإنتاج إشارة قابلة للقياس يمكن قياسها لأغراض القياس الكمي (عادة مضان)1,2. في الوقت الحالي ، تشير المخاوف المتعلقة باستخدام الكائنات الحية الدقيقة المعدلة وراثيا (GMOs) ، خاصة عند إطلاقها في البيئة أو جسم الإنسان ، بسبب تسرب خلايا كاملة أو بعض موادها الوراثية ، حتى لو كانت مغلفة في مصفوفة بوليمر ، إلى أن هناك حاجة إلى طرق بديلة لاستغلال أساليب الاستشعار هذه3.
نهج قوي لاستغلال فوائد الاستشعار القائم على الكائنات الحية الدقيقة دون القلق بشأن نشر الكائنات المعدلة وراثيا هو استخدام أنظمة النسخ / الترجمة في المختبر (IVTT). من منظور عملي ، تتكون أنظمة IVTT من خليط يحتوي على معظم مكونات الخلية في حالة نشطة تم "استخراجها" من الخلايا بوسائل مختلفة ، بما في ذلك صوتنة ، ضرب حبة ، أو غيرها4. المنتج النهائي لهذه العملية هو خليط تفاعل كيميائي حيوي تم تحسينه بالفعل لإجراء النسخ والترجمة التي يمكن استخدامها لاختبار أجهزة استشعار مختلفة بتنسيق "وعاء مفتوح" ، دون القيود المرتبطة باستخدام خلايا كاملة (انتشار الغشاء ، كفاءة التحويل ، سمية الخلية ، إلخ). الأهم من ذلك ، يمكن إضافة مكونات استشعار مختلفة كميا ، ودراسة تأثيرها بواسطة تقنيات بصرية ومطيفية مختلفة ، كما أوضحنا5. وقد لوحظ أن أداء أنظمة IVTT يمكن أن يكون غير متسق. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات الحديثة مناهج لتوحيد إعدادها وتوصيفها ، وهو أمر مفيد للغاية عند دراسة أدائها في تصميم أجهزة الاستشعار6. في الآونة الأخيرة ، تم عرض العديد من الأمثلة على أنظمة IVTT المستخدمة لإنشاء مقايسات ورقية من خلال التجفيد لمكوناتها في مصفوفات الورق ، بما في ذلك الكشف عن أيونات المعادن الثقيلة والأدوية وعناصر استشعار النصاب وغيرها7،8،9. مساحة تطبيق مثيرة لأجهزة الاستشعار المستندة إلى IVTT هي استخدامها في تطبيقات الاستشعار في أنواع مختلفة من البيئات ، بما في ذلك التربة والمياه وجسم الإنسان. من أجل نشر أنظمة IVTT هذه في هذه البيئات الصعبة ، يجب تنفيذ نهج تغليف لاحتواء مكونات IVTT وحمايتها من التدهور.
تشمل طرق التغليف الأكثر شيوعا لأنظمة IVTT استخدام كبسولات الدهون والمذيلات والبوليميرات وغيرها من الحاويات الدقيقة المغلقةبإحكام 10،11،12. ويتمثل أحد عيوب هذا النهج في الحاجة إلى إدماج آليات سلبية أو إيجابية لنقل المواد داخل الحاويات وخارجها للسماح بالاتصال بالبيئة الخارجية وتوفير قدرات الاستشعار. للتغلب على بعض هذه المشكلات ، تشير الدراسة هنا إلى طريقة توفر نهجا بسيطا ولكنه فعال لتغليف مواد التشفير لتصميمات أجهزة الاستشعار المختلفة التي سيتم التعبير عنها في أنظمة IVTT. يعتمد هذا النهج على استخدام ترسب طبقة تلو الأخرى (LbL) للبوليمر الحيوي في وجود البلازميدات ذات الأهمية لإنشاء كبسولات دقيقة مجوفة ذات مسامية عالية ، مما يسمح للمادة الوراثية المحمية بالتفاعل مع المكونات المختلفة ل IVTT المختار. أظهرت الدراسة أن البلازميدات المغلفة يمكن أن توجه النسخ والترجمة عند تنشيطها داخل هذه المصفوفة البوليمرية ، كما هو موضح مع استجابة الأبتامير المشفر بالبلازميد والريبوسويتش إلى أهدافهما المقابلة. بالإضافة إلى ذلك ، يحمي طلاء LbL هذا البلازميدات لعدة أشهر دون أي ظروف تخزين خاصة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T)</td>
			<td>Lucerna</td>
			<td>DFHBI-1T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x T4 DNA Ligase Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>46300-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x Blue Gel Loading Dye</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, black circular</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>BioReagent, for molecular biology, low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlpI restriction enzymes</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0585S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>09-761-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt.</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #66788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>84530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli S30 extract system for circular DNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td></td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrofluoric acid, HF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695068</td>
			<td>ACS reagent, 48%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI restriction enzymes</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar plate supplemented with 100 &#181;g/mL ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5667</td>
			<td>pre-poured agar plates with 100 &#181;g/mL ampicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar plate supplemented with 50 &#181;g/mL kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0543</td>
			<td>pre-poured agar plates with 50 &#181;g/mL kanamycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox grade)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium bromide, LiBr</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>213225</td>
			<td>ReagentPlus, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH5-&#945; competent E. coli strain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>322415</td>
			<td>anhydrous, 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ-water</td>
			<td>EMD MilliPore</td>
			<td></td>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1x PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td>average Mw ~25,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0469S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiO&#8322; silica microspheres, 4.0 &#181;m</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>24331-15</td>
			<td>10% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate, Na&#8322;CO&#8323;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>222321</td>
			<td>ACS reagent, anhydrous, &#8805;99.5%, powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>08-607-008</td>
			<td>Spectrum G235058</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase (5 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theophylline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1633</td>
			<td>anhydrous, &#8805;99%, powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6025</td>
			<td>Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>10-977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit</td>
			<td>ZymoResearch</td>
			<td>D4202</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with dna plasmids encoding rna aptamers and riboswitches

نقدم بروتوكولا لإعداد كبسولات فيبروين الحريرية المحملة بالحمض النووي عبر طريقة التجميع طبقة تلو الأخرى (LbL) على النوى الكروية القربانية. بعد امتصاص الطبقة الأولية وبلازميدات الحمض النووي ، تم تسهيل تكوين كبسولات دقيقة قوية عن طريق تحفيز صفائح β في بنية ثانوية من الحرير أثناء الجفاف الحاد لطبقة حرير واحدة. ومن ثم ، حدثت الطبقات عن طريق روابط هيدروجينية متعددة وتفاعلات كارهة للماء. عند امتزاز الأصداف متعددة الطبقات ، يمكن زيادة تشغيل هياكل القشرة الأساسية باستخدام جسيمات الذهب النانوية (AuNPs) و / أو الأجسام المضادة (IgG) لاستخدامها في الاستشعار عن بعد و / أو التسليم المستهدف. أدى ضبط العديد من المعلمات الرئيسية أثناء الترسيب المتسلسل للجزيئات الرئيسية على نوى السيليكا مثل وجود برايمر بوليمر ، وتركيز الحمض النووي وبروتين الحرير ، بالإضافة إلى عدد من الطبقات الممتصة إلى كبسولات دقيقة متوافقة حيويا ومحملة بالحمض النووي مع نفاذية متغيرة وتحميل الحمض النووي. عند انحلال نوى السيليكا ، أظهر البروتوكول تكوين كبسولات دقيقة مجوفة وقوية مع بلازميدات الحمض النووي يجمد على السطح الداخلي لغشاء الكبسولة. أدى إنشاء غشاء متوافق حيويا قابل للنفاذ بشكل انتقائي بين بلازميدات الحمض النووي والبيئة الخارجية إلى الحفاظ على الحمض النووي أثناء التخزين طويل الأجل ولعب دورا مهما في تحسين استجابة الإخراج من البلازميدات المحصورة مكانيا. تم اختبار نشاط قوالب الحمض النووي وإمكانية الوصول إليها أثناء تفاعلات النسخ والترجمة في المختبر (الأنظمة الخالية من الخلايا). تم تنشيط بلازميدات الحمض النووي التي تشفر أبتامير إضاءة الحمض النووي الريبي ومفاتيح الريبوسويتشات بنجاح مع التحليلات المقابلة ، كما تم تصوره أثناء توطين نسخ الحمض النووي الريبي المسمى بالفلورسنت أو بروتين GFPa1 في أغشية القشرة.

هنا ، تتناول الدراسة وظائف قوالب الحمض النووي التي تشفر تصميمات أجهزة استشعار مختلفة (نوعان من عناصر النسخ / الترجمة التي ينظمها الحمض النووي الريبي) بعد التغليف في كبسولات بروتين الحرير. تم تحضير الكبسولات الدقيقة من خلال تجميع نموذجي طبقة تلو الأخرى (LbL) للمكونات الرئيسية: طبقة أولية ، وت...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches at JoVE.com

Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches

يصف البروتوكول تكوين كبسولات دقيقة قوية ومتوافقة حيويا محملة بالحمض النووي على أنها أجهزة استشعار حيوية متعددة الإرسال في المختبر قادرة على تتبع العديد من الروابط.

تحضير كبسولات دقيقة متعددة الوظائف تعتمد على الحرير محملة ببلازميدات الحمض النووي المشفرة ل RNA Aptamers و Riboswitches

We introduce a protocol for the preparation of DNA-laden silk fibroin microcapsules via the Layer-by-Layer (LbL) assembly method on sacrificial spherical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

الموقع محلية الصنع تطفير موجه من البلازميدات الجامعة

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

جيل من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي DNA في الجينوم الهجائن التي تحول باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على [أليغنوكليوتيد]

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iCLIP -- Transcriptome على صعيد رسم الخرائط من البروتين RNA التفاعلات مع القرار الفردي النكليوتيد

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

في المختبر، والسد النسخ من مرنا luciferase المراسل Gaussia تلاه ترنسفكأيشن الخلية هيلا

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

إعداد crosslinked-DNA بولي أكريلاميد الهلاميات المائية

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

التصور-المربوطة السطحية الكبيرة جزيئات الحمض النووي مع الحمض النووي البروتين الفلوري ملزم الببتيد

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

إعداد النوى الأنسجة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين لكلا RNA واستخراج الحمض النووي

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...