Name: preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with dna plasmids encoding rna aptamers and riboswitches
Uploaded: 2021-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch das LRIR 16RH3003J-Stipendium des Air Force Office of Scientific Research sowie durch das Programm Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&T Priorities (ARAP) des U.S. Office of the Under Secretary of Defense for Research and Engineering unterstützt.
Die Plasmidvektorsequenz für ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) wurde großzügigerweise von Dr. J. Gallivan zur Verfügung gestellt. Seidenraupenkokons von Bombyx mori wurden großzügig von Dr. D.L. Kaplan von der Tufts University, MA, gespendet.

1. Konstruktion des Plasmidvektors.
<ol><li>Konstruieren eines Plasmidvektors (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) durch Amplifikation der kodierenden Sequenz eines Theophyllin-Riboschalters (ThyRS) gekoppelt mit GFPa1 aus pJ201:23976-RS-GFPa1-Vektor (entworfen und erzeugt von DNA2.0) und Insertion in den E . coli-Expressionsvektor pSAL13. Verwenden Sie vorwärts (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') und umgekehrt (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') Primer, um die kodierende Sequenz von ThyRS ge...

<ol>
	<li>Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology+devices+for+in+vitro+and+in+vivo+diagnostics.">Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).</li><li>Harbaugh, S. V., Goodson, M. 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W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+compartmentalized+protein+synthesis+inside+double+emulsion+templated+liposomes+with+in+vitro+synthesized+and+assembled+ribosomes.">Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes.</a> Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).</li><li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells.">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027 (2018).</li><li>Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+and+structural+comparison+between+bright+and+dim+green+fluorescent+proteins+in+Amphioxus.">Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus.</a> Scientific Reports. 4, 5469 (2014).</li><li>Frey, B., Reischl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+Genomic+DNA+by+PCR.">Amplification of Genomic DNA by PCR.</a> Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. 13, 143-156 (1998).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin.">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).</li><li>Drachuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+macromolecules+with+amino+acid-Poly(Ethylene+Glycol)+grafts+for+controlling+layer-by-layer+encapsulation+and+aggregation+of+recombinant+bacterial+cells.">Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells.</a> ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).</li><li>Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyelectrolyte+multilayer+capsules+as+vehicles+with+tunable+permeability.">Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).</li><li>Drachuk, I., Harbaugh, S., Ch&#225;vez, J. L., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+activity+of+DNA-encoded+sensing+elements+through+confinement+in+silk+microcapsules.">Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).</li><li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+inhibition+of+the+eukaryotic+ribosome.">Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+layer-by-layer+assembly:+A+tribute+to+ACS+Nano+associate+editor+Helmuth+M&#246;hwald.">The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth M&#246;hwald.</a> ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).</li><li>Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy-A+tool+for+structural+and+translational+DNA+research.">Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research.</a> APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).</li><li>Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borr&#243;s, S., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+DNA+complexation+state+of+pBAE+polyplexes+in+cells+with+super+resolution+microscopy.">Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy.</a> Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).</li><li>Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+of+nucleosome+core+particle+interactions+in+trans.">Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans.</a> Scientific Reports. 8, 7046 (2018).</li><li>Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+aspects+of+stabilization+of+compounds+in+silk.">Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk.</a> Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).</li><li>Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+macromolecular+crowding+and+reducing+conditions+for+in+vitro+ribosome+construction.">Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction.</a> Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).</li><li>Ge, X., Luo, D., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+expression+under+macromolecular+crowding+conditions.">Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions.</a> PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).</li><li>Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+single+RNA+molecules+with+fluorogenic+mango+II+arrays.">Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays.</a> Nature Communications. 11, 1283 (2020).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+RNA+dynamics+in+live+cells+with+bright+and+stable+fluorescent+RNAs.">Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).</li></ol>

Selektiv permeable Hydrogel-Mikrokapseln, die mit verschiedenen Arten von DNA-kodierten Sensordesigns beladen sind, können nach diesem Protokoll hergestellt werden. Eine der Besonderheiten des LbL-Ansatzes ist die Fähigkeit, die Komplexität von Mikrokapseln während der Bottom-up-Assemblierung maßzuschneidern, die in der Regel mit der Adsorption molekularer Spezies an Opfervorlagen beginnt. Durch sorgfältige Anpassung der Konzentrationen der Ausgangskomponenten, der pH-Bedingungen und der Anzahl der Schichten könne...

Das Gebiet der synthetischen Biologie bietet einzigartige Möglichkeiten, Sensorfähigkeiten zu entwickeln, indem natürliche Mechanismen genutzt werden, die von Mikroorganismen entwickelt wurden, um ihre Umwelt und potenzielle Bedrohungen zu überwachen. Wichtig ist, dass diese Sensormechanismen in der Regel mit einer Reaktion verbunden sind, die diese Mikroorganismen vor schädlicher Exposition schützt und die Genexpression reguliert, um negative Auswirkungen zu mildern oder die Aufnahme giftiger Materialien zu verhindern. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um diese Mikroorganismen so zu verändern, dass sie Ganzzellsensoren herstellen, die diese natürlichen Reaktionen nutzen, sie aber umleiten, um neue Ziele zu erkennen und/oder ein messbares Signal zu erzeugen, das zu Quantifizierungszwecken gemessen werden kann (typischerweise Fluoreszenz)1,2. Gegenwärtig deuten Bedenken hinsichtlich der Verwendung genetisch veränderter Mikroorganismen (GVO), insbesondere bei der Freisetzung in der Umwelt oder im menschlichen Körper, aufgrund des Austritts ganzer Zellen oder eines Teils ihres genetischen Materials, selbst wenn es in einer Polymermatrix eingekapselt ist, darauf hin, dass alternative Wege zur Nutzung dieser Sensoransätze erforderlich sind3.
Ein wirksamer Ansatz, um die Vorteile der mikroorganismenbasierten Sensorik zu nutzen, ohne sich Gedanken über den Einsatz von GVO machen zu müssen, ist die Verwendung von In-vitro-Transkriptions-/Translationssystemen (IVTT). Aus praktischer Sicht bestehen IVTT-Systeme aus einer Mischung, die die meisten Zellbestandteile in einem aktiven Zustand enthält, die auf unterschiedliche Weise aus den Zellen "extrahiert" wurden,z. B. durch Beschallung, Perlenschlagen oder andere 4. Das Endprodukt dieses Prozesses ist ein biochemisches Reaktionsgemisch, das bereits für die Transkription und Translation optimiert ist und zum Testen verschiedener Sensoren in einem "offenen Gefäß"-Format verwendet werden kann, ohne die Einschränkungen, die mit der Verwendung ganzer Zellen verbunden sind (Membrandiffusion, Transformationseffizienz, Zelltoxizität usw.). Wichtig ist, dass verschiedene Sensorkomponenten quantitativ hinzugefügt und ihre Wirkung durch verschiedene optische und spektrometrische Techniken untersucht werden können, wie wir gezeigt haben5. Es wurde festgestellt, dass die Leistung von IVTT-Systemen inkonsistent sein kann. Neuere Studien haben jedoch Ansätze zur Standardisierung ihrer Präparation und Charakterisierung gezeigt, was bei der Untersuchung ihrer Leistung im Sensordesign eine große Hilfe ist6. In jüngster Zeit wurden viele Beispiele für IVTT-Systeme demonstriert, die zur Herstellung papierbasierter Assays durch die Gefriertrocknung ihrer Komponenten in Papiermatrizes verwendet werden, einschließlich der Detektion von Schwermetallionen, Drogen, Quorum-Sensorelementen und anderen 7,8,9. Ein spannender Anwendungsbereich für IVTT-basierte Sensoren ist ihr Einsatz in Sensoranwendungen in verschiedenen Arten von Umgebungen, einschließlich Boden, Wasser und dem menschlichen Körper. Um diese IVTT-Systeme in diesen anspruchsvollen Umgebungen einsetzen zu können, muss ein Kapselungsansatz implementiert werden, um die IVTT-Komponenten einzudämmen und sie vor Verschlechterung zu schützen.
Die gebräuchlichsten Verkapselungsansätze für IVTT-Systeme umfassen die Verwendung von Lipidkapseln, Mizellen, Polymersomen und anderen dicht geschlossenen Mikrobehältern10,11,12. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist die Notwendigkeit, entweder passive oder aktive Mechanismen für den Transport von Materialien in und aus den Behältern zu integrieren, um die Kommunikation mit der externen Umgebung zu ermöglichen und Sensorfunktionen bereitzustellen. Um einige dieser Probleme zu überwinden, berichtet die Studie hier über eine Methode, die einen einfachen, aber effektiven Ansatz zur Verkapselung der Kodierungsmaterialien für verschiedene Sensordesigns bietet, die in IVTT-Systemen ausgedrückt werden sollen. Dieser Ansatz basiert auf der Verwendung der Layer-by-Layer (LbL)-Abscheidung eines Biopolymers in Gegenwart der interessierenden Plasmide, um hohle Mikrokapseln mit hoher Porosität herzustellen, die es dem geschützten genetischen Material ermöglichen, mit den verschiedenen Komponenten des IVTT der Wahl zu interagieren. Die Studie zeigte, dass verkapselte Plasmide die Transkription und Translation steuern können, wenn sie innerhalb dieser polymeren Matrix aktiviert werden, wie die Reaktion eines Plasmid-kodierten Aptamers und eines Riboschalters auf ihre entsprechenden Ziele zeigt. Zusätzlich schützt diese LbL-Beschichtung die Plasmide monatelang ohne besondere Lagerbedingungen.

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		<tr>
			<td>(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T)</td>
			<td>Lucerna</td>
			<td>DFHBI-1T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x T4 DNA Ligase Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>46300-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x Blue Gel Loading Dye</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, black circular</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>BioReagent, for molecular biology, low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlpI restriction enzymes</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0585S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>09-761-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt.</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #66788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>84530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli S30 extract system for circular DNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td></td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrofluoric acid, HF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695068</td>
			<td>ACS reagent, 48%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI restriction enzymes</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar plate supplemented with 100 &#181;g/mL ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5667</td>
			<td>pre-poured agar plates with 100 &#181;g/mL ampicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar plate supplemented with 50 &#181;g/mL kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0543</td>
			<td>pre-poured agar plates with 50 &#181;g/mL kanamycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox grade)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium bromide, LiBr</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>213225</td>
			<td>ReagentPlus, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max Efficiency DH5-&#945; competent E. coli strain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>322415</td>
			<td>anhydrous, 99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ-water</td>
			<td>EMD MilliPore</td>
			<td></td>
			<td>Milli-Q Reference Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1x PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td>average Mw ~25,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0469S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiO&#8322; silica microspheres, 4.0 &#181;m</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>24331-15</td>
			<td>10% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate, Na&#8322;CO&#8323;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>222321</td>
			<td>ACS reagent, anhydrous, &#8805;99.5%, powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>08-607-008</td>
			<td>Spectrum G235058</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase (5 U/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theophylline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1633</td>
			<td>anhydrous, &#8805;99%, powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6025</td>
			<td>Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>10-977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit</td>
			<td>ZymoResearch</td>
			<td>D4202</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with dna plasmids encoding rna aptamers and riboswitches

Wir stellen ein Protokoll für die Herstellung von DNA-beladenen Seidenfibroin-Mikrokapseln über die Layer-by-Layer (LbL) Assemblierungsmethode auf sphärischen Opferkernen vor. Nach Adsorption einer Hauptschicht und DNA-Plasmiden wurde die Bildung robuster Mikrokapseln durch die Induktion von β-Blättern in der Seidensekundärstruktur während der akuten Dehydratisierung einer einzelnen Seidenschicht erleichtert. Daher erfolgte die Schichtung über mehrfache Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen. Nach der Adsorption von mehrschichtigen Hüllen können die Kern-Schale-Strukturen mit Goldnanopartikeln (AuNPs) und/oder Antikörpern (IgG) weiter funktionalisiert werden, um sie für die Fernerkundung und/oder den gezielten Transport zu verwenden. Die Einstellung mehrerer Schlüsselparameter während der sequentiellen Abscheidung von wichtigen Makromolekülen auf Siliziumdioxidkernen, wie z. B. das Vorhandensein eines Polymerprimers, die Konzentration von DNA und Seidenprotein sowie eine Reihe von adsorbierten Schichten, führte zu biokompatiblen, DNA-beladenen Mikrokapseln mit variabler Permeabilität und DNA-Beladung. Nach der Auflösung von Siliziumdioxidkernen zeigte das Protokoll die Bildung von hohlen und robusten Mikrokapseln mit DNA-Plasmiden, die an der Innenfläche der Kapselmembran immobilisiert waren. Durch die Schaffung einer selektiv permeablen biokompatiblen Membran zwischen den DNA-Plasmiden und der äußeren Umgebung blieb die DNA während der Langzeitlagerung erhalten und spielte eine wichtige Rolle bei der verbesserten Output-Antwort von räumlich begrenzten Plasmiden. Die Aktivität von DNA-Templates und ihre Zugänglichkeit wurden während in vitro Transkriptions- und Translationsreaktionen (zellfreie Systeme) getestet. DNA-Plasmide, die für RNA-Light-up-Aptamere und Riboschalter kodieren, wurden erfolgreich mit entsprechenden Analyten aktiviert, wie bei der Lokalisierung von fluoreszenzmarkierten RNA-Transkripten oder GFPa1-Proteinen in den Schalenmembranen sichtbar wurde.

Hier befasst sich die Studie mit der Funktionalität von DNA-Templates, die nach der Verkapselung in Seidenproteinkapseln für verschiedene Sensordesigns (zwei Arten von RNA-regulierten Transkriptions-/Translationselementen) kodieren. Mikrokapseln wurden durch Schicht-für-Schicht-Montage (LbL) der Schlüsselkomponenten hergestellt: Eine Hauptschicht, DNA-Plasmide, die für Sensordesigns kodieren, und Seidenfibroin-Biopolymer (Abbildung 2). Die schichtweise Abscheidung von Makromolekülen er...

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Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches

Das Protokoll beschreibt die Bildung robuster und biokompatibler DNA-beladener Mikrokapseln als gemultiplexte In-vitro-Biosensoren , die in der Lage sind, mehrere Liganden zu verfolgen.

Herstellung von multifunktionalen Mikrokapseln auf Seidenbasis, die mit DNA-Plasmiden beladen sind, die für RNA, Aptamere und Riboschalter kodieren

We introduce a protocol for the preparation of DNA-laden silk fibroin microcapsules via the Layer-by-Layer (LbL) assembly method on sacrificial spherical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Forschung

Biologie

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Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

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Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

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In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

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