Name: direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers at JoVE.com

تعترف MK بالدعم المالي المقدم من وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية الإسبانية من خلال الخطة الوطنية (PGC2018-097882-A-I00) ، FEDER (EQC2018-005048-P) ، برنامج سيفيرو أوتشوا لمراكز التميز في البحث والتطوير (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062) ، من مؤسسة Privada Cellex ، و Fundació Mir-Puig ، ومن Generalitat de Catalunya من خلال CERCA وبرنامج الأبحاث (2017 SGR 1012) ، بالإضافة إلى التمويل من خلال ERC (MechanoSystems) و HFSP (CDA00023/2018). تعترف V.R. بالدعم المقدم من وزارة العلوم والابتكار الإسبانية لشراكة EMBL ، ومركز Excelencia Severo Ochoa ، وخطة MINECO الوطنية (BFU2017-86296-P ، PID2020-117011GB-I00) و Generalitat de Catalunya (CERCA). تعترف V.V. بالدعم المقدم من برنامج الدكتوراه ICFOstepstone الممول من برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie 665884. نشكر أرناو فاري على قراءته النقدية للمخطوطة. ماريا مارسال للمساعدة في تصوير وتركيب الجنين 24 hpf و ؛ سيندا خيمينيز-ديلغادو للحصول على الدعم مع الحقن المجهري لسمك الزرد.

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

تشكل الأنسجة هو عملية معقدة يتم فيها تنسيق الإشارات الكيميائية الحيوية والقوى الفيزيائية مكانيا وزمانيا. في الجنين النامي ، تملي تدرجات عوامل الإشارات الكيميائية الحيوية مواصفات المصير وتضمن نمط الأنسجة الصحيح1,2. في الوقت نفسه ، تلعب القوى الجوهرية والخارجية دورا في بناء بنية الجنين3,4. تمت دراسة تأثير ميكانيكا قشرة الخلية في هذا السياق على نطاق واسع5,6. يعتمد الترابط الوثيق بين العمليات الميكانيكية والكيميائية أثناء التشكل على خصائص الخلايا المفردة لاستشعار القوى الميكانيكية في بيئتها الدقيقة للأنسجة والاستجابة لها. الخلايا، وبالتالي فك تشفير الإشارات الميكانيكية من خلال وجود عناصر دون خلوية وجزيئية حساسة للقوة التي تنقل المعلومات الميكانيكية إلى مسارات إشارات محددة تتحكم في سلوك الخلية، ومصير الخلية، وميكانيكا الخلايا.
السمة المميزة للعمليات التنموية هي أن الخلايا تنظم كمجموعات لبناء هياكل متعددة الخلايا. وعلى هذا النحو، نادرا ما تعيد الخلايا المفردة ترتيبها وتتحرك بمفردها ولكنها ترتبط ببيئة اجتماعية ضيقة تظهر فيها سلوكا جماعيا مثل الهجرة فوق الخلوية7 أو انتقالات التشويش8,9 أو ضغط الكيسة الأريمية10. تعمل القوى الميكانيكية المتولدة داخل الخلايا وفيما بينها كإشارات مهمة لتوجيه ديناميكيات الخلايا الجماعية7،11. ولكن حتى عندما تتحرك الخلايا بمفردها، مثل الخلايا السلفية التي تشق طريقها بين صفائح الأنسجة أو منافذ الأنسجة الضيقة، فإنها تواجه قوى ميكانيكية متباينة الخواص واسعة النطاق عند التنقل في بيئة ثلاثية الأبعاد. هذه الضغوط الميكانيكية على الخلايا لها عواقب وخيمة على السلوك الخلوي12,13. تم التحقيق في العديد من الآليات التي تتلاقى على النواة كعنصر نقل ميكانيكي رئيسي14,15 ، كعنصر ميكانيكي سلبي أو نشط أثناء الهجرة داخل بيئة نسيجية ثلاثية الأبعاد كثيفة15,16.
اقترحنا مؤخرا آلية تزود الخلايا بقياس تشوهات الشكل باستخدام النواة كمقياس ميكانيكي مرن داخل الخلايا12. تخضع النواة ، كونها أكبر عضية في الخلية ، لتشوهات كبيرة عندما تستقطب الخلايا أو تهاجر أو تغير شكلها تحت التمدد الميكانيكي أو الحبس أو الإجهاد الأسموزي 16،17،18،19. وجدنا أن تمدد الغلاف النووي جنبا إلى جنب مع تحديد المواقع داخل الخلايا للنواة يزود الخلايا بمعلومات عن حجم ونوع تشوه الخلية (مثل ضغط الخلايا مقابل تورم الخلايا). يرتبط تمدد النواة بتكشف الغشاء النووي الداخلي (INM) ، الذي يعزز نشاط الليباز cPLA2 المعتمد على الكالسيوم (الفوسفوليباز الخلوي A2) في INM متبوعا بإطلاق حمض الأراكيدونيك (AA) والتنشيط السريع للميوسين الثاني في قشرة الخلية. وهذا يؤدي إلى زيادة انقباض الخلايا وهجرة الخلايا الأميبية فوق عتبة الانقباض القشري6. تحدث الاستجابة الحساسة الميكانيكية لتشوه الخلايا في أقل من دقيقة ويمكن عكسها عند إطلاق الحبس ، مما يشير إلى أن النواة تعمل كمقياس إجهاد للاستحسان الخلوي الذي ينظم سلوك الخلية التكيفي في ظل ظروف الإجهاد الميكانيكي. ويظهر أن هذا المسار الحساس للميكانيكية نشط في الخلايا الجذعية السلفية المشتقة من أجنة الزرد، سواء في الخلايا متعددة القدرات أو الملتزمة بالنسب12 ويتم حفظه في أنواع وخطوط خلايا مختلفة20.
بالإضافة إلى الخصائص النووية كمحن ميكانيكي للخلايا، يتم تنظيم البنية النووية والميكانيكا بشكل جوهري أثناء التطوير واستجابة لمواصفات مصير الخلية21، وبالتالي ضبط الحساسية الميكانيكية الخلوية22,23. وقد تكون النتيجة تغيرا في الامتثال النووي يسمح بالتغيرات والتحولات المورفولوجية من حالة ما قبل الهجرة إلى حالة الهجرة والعكس بالعكس8.
تم تطبيق العديد من التقنيات لقياس ميكانيكا نواة الخلية، مثل مجهر القوة الذرية24,25، وشفط الأنابيب الدقيقة26،27، وتكنولوجيا الموائع الدقيقة28، والوخز بالإبر الدقيقة29. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه التقنيات غازية بمعنى أنه يجب تشويه الخلية بأكملها ، مما يحد من قياس الخصائص الميكانيكية والاستجابات المعتمدة على القوة للنواة نفسها. للتحايل على التشوه المتزامن لسطح الخلية وقشرة الخلايا الحساسة ميكانيكيا30 ، تمت دراسة النوى المعزولة في سياقات مختلفة31,32. ومع ذلك، لا يمكن استبعاد أن العزل النووي يرتبط بتغير في خصائص النواة الميكانيكية وتنظيمها (المرجع 24 والملاحظات الخاصة غير المنشورة).
الملقط البصري (OTs) هي تقنية متعددة الاستخدامات سمحت بمجموعة كبيرة من التجارب في علم الأحياء الميكانيكية الخلوية وكان لها دور فعال في فهمنا لكيفية تحويل الآلات الجزيئية للطاقة الكيميائية إلى طاقة ميكانيكية33,34. تستخدم الملقط البصري شعاع ليزر مركز بإحكام لممارسة قوى بصرية على الجسيمات العازلة التي لها معامل انكسار أعلى من الوسط المحيط33. يمكن أن تكون هذه القوى في حدود مئات البيكو نيوتن وتؤدي إلى حبس فعال للجسيم داخل تركيز مصيدة الليزر ، مما يتيح التلاعب بالجسيم المحاصر في ثلاثة أبعاد. استخدام الضوء له ميزة مهمة في أنه يمكن إجراء القياس بشكل غير جراحي داخل الخلايا الحية. تقتصر التلاعبات البصرية أيضا على تركيز المصيدة لشعاع الليزر. وبالتالي ، يمكن إجراء التلاعب دون تحفيز الأغشية الخلوية المحيطة ولا يزعج قشرة الأكتين أو العمليات الحساسة الميكانيكية في الغشاء البلازمي ، مثل التنشيط المعتمد على القوة للقنوات الأيونية.
تكمن صعوبة نهج الملقط البصري في التحديد الدقيق للقوى المطبقة على المجهر باستخدام الأساليب الكلاسيكية التي تعتمد على معايرة القوة غير المباشرة استنادا إلى نظرية التقسيم المتساوي أو استخدام قوى سحب ستوكس المحددة لقياس قوة هروب تعتمد على طاقة الليزر35. في حين أن هذه الطرق سهلة التنفيذ في تجربة في المختبر ، إلا أنه لا يمكن ترجمتها عادة إلى بيئة خلوية. تم إدخال العديد من الاستراتيجيات في هذا المجال التي تعتمد على معايرة القوة المباشرة، المستمدة من المبادئ الأولى للحفاظ على الزخم36,37. على عكس أساليب التحليل الطيفي للقوة الأخرى، يتم استنتاج قياسات القوة من تبادل محلي لزخم الضوء مع الجسيم المحاصر على شكل تعسفي38,39. في إعدادنا التجريبي، يتم قياس التغيرات في زخم الضوء الناشئة عن القوى البصرية مباشرة دون الحاجة إلى معايرة المصيدة في الموقع40،41،42،43. وبالتالي ، تصبح القياسات ممكنة في بيئة لزجة مثل الجزء الداخلي من الخلية أو حتى داخل الأنسجة ، ويمكن قياس القوى بسهولة إلى مستوى pN.
في هذا البروتوكول ، نصف فحصا لمعالجة العضيات أو الهياكل داخل الخلايا ميكانيكيا وتقييم خصائصها الميكانيكية كميا بواسطة إعداد ملاقط بصري. تم دمج هذا الإعداد في مجهر الفلورسنت القرص الدوار الذي يتيح التصوير المتوازي للسلوك الخلوي أو الديناميكيات داخل الخلايا. يسمح الفحص بتوصيف الخواص الميكانيكية لمقصورات خلوية محددة ، مثل النواة ، مع دراسة الميكانوريسبونس المحتمل وتنشيط مسارات الإشارات الجزيئية في نفس الوقت نتيجة للتشوه نفسه. وعلاوة على ذلك، فإن الاصطياد البصري للميكروبات المحقونة داخل الخلايا يسمح بزيادة قوة المسافة البادئة بفضل معامل انكسار أعلى بكثير من حبة البوليسترين (n = 1.59) مقارنة بالتباين الانكساري الداخلي44 للنواة (n ~ 1.35) مقابل السيتوبلازم (n ~ 1.38). يمكن تكييف الاستراتيجية المقدمة بسهولة مع دراسة الهياكل والعضيات الأخرى داخل الخلايا ، بالإضافة إلى النهج الأخرى التي تنطوي على علم الأحياء الدقيقة النشط ، واستخدام مصائد بصرية متعددة لفحص نفس الهياكل دون الخلوية / المختلفة في وقت واحد ، والقياسات التي تستهدف علم الأحياء الميكانيكية للخلايا في الجنين الحي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 22 mm cover glasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5 22x60 mm Coverglasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5H glass bottom dishes</td>
			<td>Willco</td>
			<td>GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-um beads</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>72986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mm glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020 GC100F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um polystyrene microbeads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um red-fluorescent beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqcuisition cameras sCMOS</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Sona-4BV11-UNI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary camera (Figure 3, AUX)</td>
			<td>Blackfly, FLIR</td>
			<td>BFS-U3-200S6M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbryte 520</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>520 AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double scotch tape</td>
			<td>Biesse Adesivi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPI-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2A-mCh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Fusion-Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>Type B: 16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR protection googles</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lap2b-eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro loader pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>GELoader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroManager 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromiter slide</td>
			<td>ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tweezers platform</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td>Sensocell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OTs software (LightAce)</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing agent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post processing software (Matlab)</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-950/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>Spincoat G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DragonFly 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangular microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UNB 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers

أثناء تطور كائن حي متعدد الخلايا ، تنقسم خلية مخصبة واحدة وتؤدي إلى أنسجة متعددة ذات وظائف متنوعة. يسير مورفوجين الأنسجة جنبا إلى جنب مع التغيرات الجزيئية والهيكلية على مستوى الخلية الواحدة التي تؤدي إلى اختلافات في الخواص الميكانيكية دون الخلوية. ونتيجة لذلك ، حتى داخل نفس الخلية ، تقاوم العضيات والمقصورات المختلفة بشكل مختلف الضغوط الميكانيكية. ويمكن لمسارات النقل الميكانيكي أن تنظم بنشاط خصائصها الميكانيكية. وبالتالي فإن قدرة الخلية على التكيف مع البيئة الدقيقة لمكانة الأنسجة ترجع جزئيا إلى القدرة على الشعور بالضغوط الميكانيكية والاستجابة لها. لقد اقترحنا مؤخرا نموذجا جديدا للإحساس الميكانيكي حيث يمكن التشوه النووي وتحديد المواقع الخلية من قياس بيئة 3D المادية ويمنح الخلية إحساسا بالاستقبال العميق لفك تشفير التغيرات في شكل الخلية. في هذه المقالة ، نصف طريقة جديدة لقياس القوى وخصائص المواد التي تشكل نواة الخلية داخل الخلايا الحية ، والتي تتمثل في الخلايا الملتصقة والخلايا المحصورة ميكانيكيا. يمكن إجراء القياسات بشكل غير جراحي باستخدام مصائد بصرية داخل الخلايا ، ويمكن الوصول إلى القوى مباشرة من خلال الكشف الخالي من المعايرة عن زخم الضوء. وهذا يسمح بقياس ميكانيكا النواة بشكل مستقل عن تشوهات سطح الخلية والسماح بتشريح مسارات النقل الميكانيكي الخافتة والمتقبلة. الأهم من ذلك ، يمكن دمج تجربة الاصطياد مع المجهر الضوئي للتحقيق في الاستجابة الخلوية والديناميكيات دون الخلوية باستخدام التصوير الفلوري للهيكل الخلوي أو أيونات الكالسيوم أو المورفولوجيا النووية. الطريقة المقدمة سهلة التطبيق ، ومتوافقة مع الحلول التجارية لقياسات القوة ، ويمكن توسيعها بسهولة للتحقيق في ميكانيكا المقصورات تحت الخلوية الأخرى ، على سبيل المثال ، الميتوكوندريا ، وألياف الإجهاد ، والاندوسومات.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers at JoVE.com

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

هنا ، نقدم بروتوكولا للتحقيق في الخواص الميكانيكية داخل الخلايا لخلايا الزرد الجنينية المعزولة في الحبس ثلاثي الأبعاد مع قياس القوة المباشرة بواسطة مصيدة بصرية.

قياسات القوة المباشرة للميكانيكا دون الخلوية في الحبس باستخدام ملاقط بصرية

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

يقوم هذا البروتوكول بتشريح الخواص الميكانيكية الفردية لنواة الخلية التي تجعلها مقياسا ميكانيكيا لاستقطاب الخلايا وتمايزها وهجرتها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تقيس الخواص الميكانيكية وتطبق القوى على المقصورات تحت الخلوية دون اضطراب خارجي في الغشاء أو الهيكل الخلوي القشري. يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لمعالجة الخرز داخل الخلايا الأخرى للكائنات الحية الأخرى من أجل دراسة الميكانيكا النووية في خطوط الخلايا المختلفة أو النماذج الحيوانية.تعد محاذاة مستشعر القوة المباشرة أمرا بالغ الأهمية لالتقاط كل الضوء الذي يخلق ويخرج من الفخاخ البصرية. سيضمن ذلك قياسات دقيقة لزخم الضوء في الوسط اللزج المرن للخلية. ابدأ التحضير للخلية الواحدة عن طريق وضع أجنة المرحلة الكروية بعد أربع ساعات من الإخصاب في طبق زجاجي يحتوي على وسائط E3 باستخدام ماصة باستور بلاستيكية.ثم حدد الأجنة الإيجابية للخرز وعبر عن بروتين الفلورسنت في حالة حقن الحمض النووي الريبوزي المرسال. استخدم الملقط لنزع الأجنة يدويا ونقل ما يقرب من 10 إلى 15 جنينا ممزقا إلى حاوية تفاعل 1.5 ملليلتر بمساعدة ماصة باستور زجاجية. قم بإزالة وسائط E3 من الأنبوب وأضف 500 ميكرولتر من وسط زراعة الأنسجة المستقل عن ثاني أكسيد الكربون الذي تم تسخينه مسبقا.هز الأنبوب بلطف لتجنب تكوين الفقاعة وتأكد من أن محتويات الأنبوب تصبح عكرة حيث تنفصل الخلايا دون وجود أجزاء كبيرة مرئية من العين. ثم طرد مركزي الأنبوب عند 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة supernatant وجمع الكريات للمضي قدما في تلطيخ الخلايا.لتسمية النواة ، أعد تعليق الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر من محلول تلطيخ صبغة الحمض النووي Hoechst الطازج إلى الأنبوب. احتضن الخلايا الملطخة لمدة سبع دقائق في الظلام. بعد ذلك ، قم بطرد الخلايا مركزيا كما هو موضح سابقا وأعد تعليق الكريات إما في 50 ميكرولتر من DMEM للعينات المعلقة أو 20 ميكرولتر من DMEM للخلايا في الحبس.لإعداد الزخارف البصرية أو غرفة OT للتجارب مع الخلايا المعلقة ، قم بقطع قطعة من الشريط الاسكتلندي على الوجهين بثقب مربع يبلغ حوالي 10 ملليمترات × 10 ملم في الوسط. قشر إحدى الطبقات الواقية من الشريط وضع الجانب المكشوف من الشريط في وسط طبق سفلي زجاجي رقم 1.5 H. اضغط على الشريط بلطف لجعل كل سطح الشريط يلتصق بالزجاج مع تجنب فقاعات الهواء وتقشير الطبقة الواقية المتبقية من الشريط.احتضن السطح ب 100 ميكرولتر من Concanavalin A بمعدل 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر لمدة 30 دقيقة. ثم قم بإزالة قطرة Concanavalin A واشطف السطح باستخدام DMEM. أضف 30 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على الخلايا على سطح التجويف.ثم أغلق الغرفة بلطف شديد باستخدام زجاج غطاء 22 × 22 ملم. استخدم مشرط أو ملقط إذا لزم الأمر. بعد ذلك ، تابع بدء تشغيل الملقط البصري عن طريق تشغيل الليزر بطاقة عالية إلى حد كبير لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التجربة لتحسين استقرار طاقة الإخراج.عند الانتهاء ، قم بتشغيل وحدة الإلكترونيات الخاصة بوحدات المعالجة الدقيقة البصرية وقياس القوة. قبل محاذاة مستشعر القوة البصرية ، ضع قطرة من الماء على هدف الغمر بالماء 60X 1.2 ووضع الغرفة التي تحتوي على الخلايا على المسرح. ركز على السطح السفلي للغرفة حيث سيتم وضع عينات الخلية.بعد إضافة قطرة من زيت الغمر أعلى شريحة الغطاء الزجاجية التي تغطي العينة، اخفض عدسة التجميع الخاصة بوحدة مستشعر القوة حتى تتلامس مع قطرة الزيت. باتباع الإجراء القياسي لمحاذاة مستشعر القوة البصرية، انظر إلى صورة مستوى العينة على الكاميرا الإضافية لاستخدامها في وضع OTs، ثم اخفض مستشعر القوة البصرية حتى يظهر توقفه الميداني مقترنا بمستوى العينة. للتحقق من وجود فقاعات هواء باستخدام عدسة برتراند، راقب مسار التصوير من خلال الكاميرا الإضافية.إذا كانت هناك أي أوساخ أو فقاعات هواء مرئية، فقم بتنظيف العدسة والغرفة باستخدام أنسجة عدسة خالية من الغبار قبل تكرار الإجراء كما هو موضح، مع إضافة المزيد من زيت الغمر. باستخدام البراغي الجانبية الموضوعة على حامل مستشعر القوة البصرية ، قم بتوسيط توقف المجال في مجال الرؤية. للحصول على الدقة، افتح نقطة التوقف الميدانية تقريبا لشغل مجال الرؤية المرئي على الكاميرا الإضافية.بعد وضع العينة في المجهر ومحاذاة مستشعر القوة البصرية ، استخدم لوحة نصف الموجة الدوارة لتعيين قوة المصيدة الأولية إلى 200 مللي واط إذا لم تكن صلابة النواة أو البنية بين الخلايا التي تم فحصها معروفة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، استخدم وحدة التحكم في برنامج مرحلة المجهر للبحث عن خلية بها حبة واحدة أو حبتان من خلال الفحص المجهري Brightfield المنقول. في الورقة العددية ، اكتب الإزاحة ووقت كل خطوة مسار لاحقة.بدلا من ذلك ، قم بتحميل الجدول S1 من المواد التكميلية. لتجربة الإجهاد / الاسترخاء ، قم ببرمجة الأحمال شبه المنحرفة ليتم تطبيقها. في برنامج OT ، قم بتنشيط الفخاخ البصرية.لمحاصرة المجهر ، اضبط مستويات الصورة فوق الخرزة قليلا باستخدام وحدة تحكم في برنامج مرحلة المجهر. انقر على ميكروبيد البوليسترين في نافذة تصوير الكاميرا الإضافية المعايرة. الحبس الناجح للحبة بواسطة المصيدة البصرية سيقلل بشدة من حركة الخرزة.انقر واسحب الخرزة عبر السيتوبلازم وضعها على مسافة ميكرون تقريبا من الغلاف النووي. تأكد من تعيين المسار بحيث تكون المسافة البادئة للحبة عمودية على الغشاء النووي. عندما يكون الإعداد جاهزا ، انتقل إلى برنامج التصوير وانقر فوق زر الاكتساب لبدء الحصول على الصورة.افتح نافذة القراءة القسرية في الوقت الفعلي ، وانقر فوق البيانات ، واحفظ في نافذة قراءة القوة في الوقت الفعلي للحفظ. بدء بيانات موضع الملائمة وقياس القوة. ابدأ المسار الذي تم تحميله مسبقا بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق الخرزة وتحديد مسار البدء.انتظر حتى يتم الانتهاء من المسار ويستقر النظام قبل الانتهاء من تسجيل بيانات قياس قوة المصيدة. توقف عن الحصول على الصور وقم برسم النتائج في برنامج ما بعد المعالجة. في التحليل التمثيلي ، يتم عرض خلية جذعية سلف الزرد المعزولة مع ميكروسفير واحد بالقرب من النواة.تم رصد توزيع المجهر البوليسترين بعد خمس ساعات من الحقن داخل الجنين. تظهر صورة برايتفيلد والتألق أن الخرز منتشر عبر أنسجة الجنين. يؤكد الإسقاط الأقصى لمكدس Z الفلوري البؤري والحد الأقصى لإسقاط مكدس فرعي في نفس المنطقة أن جزءا كبيرا من الخلايا العميقة يحتوي على حبة واحدة إلى خرزتين.في 24 ساعة بعد الإخصاب ، تم توزيع الخرز على كامل جسم الجنين. تم الحصول على الصور المجهرية برايتفيلد للخلايا المعلقة على الخلايا المحصورة مع واحد أو اثنين من الخرز المحقون. علاوة على ذلك ، سهلت العديد من الملصقات الفلورية التحقيق في جوانب مختلفة من الخلايا ، مثل الغشاء بين النواة ، وغشاء البلازما ، والحمض النووي ، والخط المعدل وراثيا.وصفت اللقطات التمثيلية النوى التي تحمل علامة Hoechst قبل خمس ثوان / أثناء وخمس ثوان بعد المسافة البادئة باستخدام ميكروسفير محاصر بصريا. تمت دراسة ملامح الكثافة على طول جزء المسافة البادئة لثلاثة إطارات ومسارات مختلفة للحدود البعيدة والقريبة للنواة أثناء تجربة المسافة البادئة للخلايا المعلقة والمحصورة. تم قياس المسار المحاصر والقوة التي شهدها المجهر المحاصر بصريا خلال تجربة المسافة البادئة النووية المتكررة.وأكدت ميكانيكا النواة في الزنازين المعلقة وتحت الحبس أن الحبس أدى إلى توسع في المساحة المتوقعة وتغير ضئيل في الصلابة النووية. إذا تم حقن الخرز في جنين مرحلة الخلية الواحدة ، فمن المرجح أن يتم توزيعه بالتساوي في المراحل اللاحقة. تذكر أن الخرزة يجب أن تكون محاصرة بثبات.إذا هربت الخرزة من المصيدة البصرية ، فأعد تعريف المسار أو قم بزيادة طاقة الليزر. يمكن إجراء هذه التجارب بسهولة على حبيبات دقيقة متعددة داخل خلية واحدة وتمتد إلى قياسات ميكرورولوجيا نشطة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

الحث المباشر للمكون للدم البطانة Endothelium والدم عن طريق overexpression من العوامل المحفزة النسخ في الإنسان الخلايا الجذعية

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

عن طريق عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية لارتفاع صفيحة ميكروسكوبية الإنتاجية قياسات الجهاز التنفسي

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

بروتوكول التحويل المباشر من الفئران الجنينية الخلايا الليفية إلى الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

تحت الجلد نيوروتروفين 4 التسريب باستخدام مضخات التناضحي أو الحقن العضلي المباشر يعزز الشيخوخة الجرذ العضلات الحنجرة

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

ميكانيكا خلية السبر مع ملاقط خالية من حبة الضوئية في الجنين المورفولوجية

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

توجيه نسب إعادة برمجة الماوس الكبار تنتجها الخلايا الليفية لموروث محمر

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...