Name: direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00
Duration: 9 min 56 s
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MK通过国家计划（PGC2018-097882-A-I00），FEDER（EQC2018-005048-P），Severo Ochoa研发卓越中心计划（CEX2019-000910-S;RYC-2016-21062），来自Fundació Privada Cellex，Fundació Mir-Puig，以及通过CERCA和研究计划（2017 SGR 1012）从加泰罗尼亚政府获得的资金，以及通过ERC（MechanoSystems）和HFSP（CDA00023 / 2018）提供资金。V.R.感谢西班牙科学与创新部对EMBL合作伙伴关系，EXCELENCIA Severo Ochoa中心，MINECO的国家计划（BFU2017-86296-P，PID2020-117011GB-I00）和加泰罗尼亚政府（CERCA）的支持。V.V.感谢ICFOstepstone博士计划的支持，该计划由欧盟的Horizon 2020研究和创新计划资助，该计划由Marie Skłodowska-Curie资助协议665884。我们感谢阿尔诺·法雷对手稿的批判性阅读;Maria Marsal帮助24 hpf胚胎的成像和安装;Senda Jiménez-Delgado支持斑马鱼微量注射。

作者没有什么可透露的。

在该协议中，我们描述了一种独特的方法来询问活细胞内细胞核的机械性能。与其他力光谱技术不同，非侵入性光学捕获使我们能够将细胞膜和细胞骨架的贡献与细胞核刚度分离。重要的是，光学显微操作与多模态显微镜兼容，这将使实验者能够研究细胞核力学生物学中涉及的不同过程。作为代表性的结果，我们使用DNA-Hoechst染色来测量由数百皮牛顿的力执行的压痕时的细胞核变形。
除本协议中概述的示例外，我们的方法的潜在应用 从活细胞内的测量中提取定量机械信息而不受外部扰动的可能性使得许多前所未有的机会刚刚开始被探索。因此，我们光学显微操作平台的方案可以扩展到更复杂的实验，具有很大的多功能性。声光导流板（AOD）可以生成多个光学陷阱，用于不同单元位置的同步力测量，并可用于宽频率范围内的主动微流变学51，61。如前所述，压痕时的力响应可以克服最大的捕获力，从而导致磁珠从光学陷阱中逸出。在这种情况下，可以使用AOD配置力反馈，以钳位光学力。总而言之，可以使用该平台通过实验获得多种微流变学方法，例如本协议中描述的应力松弛，以及主动微流变学或蠕变顺应性，并通过新颖的软件包进行彻底分析61，62，63，64，65.此外，力的应用不仅限于细胞核，原则上可以进行测量不同的细胞内结构和复杂组织中的复杂组织，如将流动的红细胞捕获在完整血管内66，67 或捕获和变形叶绿体和线粒体68.光动量校准与被困物体的形状和大小无关，因此可以对任何形状任意的力探头进行直接力测量38，39。与直接操纵细胞结构相比，注入微球的使用使我们能够以相对较低的激光功率将高力施加到细胞核上69，70，71。然而，给定足够高的折射率差异，不需要外部施加的力探针，并且无需注射珠子即可直接操纵细胞内细胞器（未发表的观察结果和参考70）。
我们的方法可能修改以扩展应用程序 根据实验的不同，可以注射不同大小的微珠，但必须进行相对对照。例如，为了在后期阶段研究细胞，可以注射较小的磁珠。这将降低光学陷阱可以施加的最大力（如参考55所示）。可以注射较大的珠子以施加更高的力，但这些可能会影响胚胎发育，具体取决于它们的大小或感兴趣的阶段。在微珠注射不是一种选择的实验中，与细胞质相比，显示出折射率差异的各种细胞器仍然可以进行光学操作，从而产生可通过光动量变化测量的光学力42。如上所述，Bambardekar等人已经使用这些方法来变形果蝇胚胎中的细胞 - 细胞连接70。同样，细胞核的折射率低于周围的介质44，即使捕获强度较低，也允许无珠压痕（未发表的观察结果和参考72）。因此，原子核不能轻易被困住并逃脱陷阱。
旋转涂层的PDMS垫片 通过 方便快捷的方法制造，但对于无法获得微/纳米制造设施或工程实验室的实验室来说，这可能是遥不可及的。因此，垫片可以很容易地从实验室胶带或parafilm组装（步骤4）。该协议还可以通过制造微流体通道来适应，这些通道自动将单个细胞输送到预定义的测量孔或具有定义高度的腔室中，以估计同一样品内的限制效应。然而，这种微流体装置的设计必须使它们适合显微镜物镜和光学力传感器的收集透镜之间的空间，约为2毫米（见步骤3）。请注意，光学力传感器必须放置在适当的高度，以便散焦引起的光学像差不会影响光子动量测量。
其他修改可能包括生物报告者的改变。我们发现Hoechst荧光光谱渗入GFP通道，因此我们倾向于与mCherry标记的组蛋白组合作为核标记物，以便在两个荧光通道中同时测量。或者，可以使用靶向内核膜的标签（例如Lap2b-GFP）轻松跟踪核变形（图2）。
细胞核上的压痕量级为2-3微米，我们可以通过衍射极限旋转盘共聚焦显微镜的图像分析来精确测量。对于更硬的原子核或更小的力，使用这种方法几乎无法测量压痕。但是，绝对力校准光学镊子也可以使用具有纳米精度的 BFP 干涉仪进行 原位 测量，以对捕获的磁珠进行原位测量51。使用这种方法，电压信号和光学力传感器可以通过参数β [nm/V]转换为被捕获探头的位置，而不变参数α [pN/V]通过上述光动量校准产生力值41 （有关详细信息，请参见下文）。
故障 排除 我们发现在实验过程中可能会出现以下挑战：
没有形成稳定的捕集器，微球很容易逸出 显微镜物镜上的任何污垢或校正环错位都可能导致稳定疏水阀失效。如果未立即找到解决方案，则测量物镜的点扩散功能。如果感兴趣的标本位于光学致密组织深处，激光聚焦可能会经历严重的光学像差，导致不稳定的捕获（这种效应在分离的细胞中通常可以忽略不计，但在较厚的组织中变得更加明显）。对于高刚度，原子核的恢复力可能超过陷阱的逃逸力，使得微球丢失并且压痕例程失败。最初，光学陷阱附近的核膜边缘几乎不会缩进（图S2A）。发生这种情况时，捕获激光不再受力和布朗运动的影响，这导致力降至零并降低信号噪声（图S2B）。如果发生这种情况，激光功率可以增加以具有更强的陷阱，可以将磁珠推入原子核的梯形轨迹的振幅减小，或者可以进一步设置被捕获的微珠的初始位置。
细胞在刺激期间移动 如果细胞没有充分附着，光学梯度陷阱将在执行细胞内压痕程序时移动细胞，使得细胞核的力和潜在力学是人为的。为了防止整个细胞的置换，我们建议增加细胞粘附分子在表面上的浓度，例如ConA。
初始动量补偿 如果OT平台中没有初始动量补偿例程（步骤6.5），则需要校正人为的、与力无关的基线信号。这可见于力曲线上的斜率，即使没有夹住磁珠（图S1E）。要进行校正，需要在没有磁珠的情况下在细胞外部以完全相同的位置执行相同的轨迹。为此，请使用载物台控件将单元移离陷阱。作为参考，在我们的系统中，在200 mW时，力偏移在整个FOV上变化5 pN;因此，对于短轨迹，它可以忽略不计。或者，可以使用压电扫描台来移动样品上的细胞，使激光位置保持不变。
所提出方案的关键步骤 微球应在正确的1细胞阶段注射，以确保胚胎的最大分布。磁珠不应是荧光的，这样就不会有光泄漏到用于成像的荧光通道中。例如，即使是典型的红色荧光珠子，由于其亮度（激发：405nm;发射：445nm），在Hoechst染色后用于成像细胞核的蓝色通道中也清晰可见。细胞与基质的稳定附着对于防止压痕过程中的横向位移至关重要。如果细胞在例行过程中移动，则力被低估。如果这种情况经常发生，请优化附件协议。对于组织培养细胞，其他细胞粘附蛋白，如纤连蛋白，胶原蛋白或聚L-赖氨酸导致令人满意的附着（未发表的观察结果）。在禁闭期间，细胞会受到突然而严重的机械应力。这可能会对细胞造成损害，如果不仔细进行该过程，实验者经常会遇到细胞破裂。此外，如果限制高度太小，所有细胞都将遭受核信封破损或不可逆转的损坏。为了减轻这些影响，请更慢地降低上盖玻片和/或增加盖玻片之间的间距。
技术的局限性和克服它们的建议 该技术的一个明显局限性是激光穿透到组织的深部，这导致像差和不稳定的捕获。因此，穿透深度的下限取决于样品的清晰度、可采用的像差校正73 和施加的激光功率。应该考虑到，较高的激光功率会导致微球附近样品的热激发。然而，由1064 nm波长激光光斑产生的样品加热被最小化，以避免对我们的生物样品产生合理的热相关应力74。
另一个限制是可以测量的最大力。尽管直接光动量检测可以实现远远超出光学陷阱40，41的线性响应状态的力测量，但最大施加的力约为几百皮牛顿。这受到激光功率和软生物材料的间接损伤阈值以及折射率差异的限制，折射率差异通常不大于0.1或0.344。已经提出了几种提高力检测限的方法，例如，使用结构光75，抗反射涂层微球76，高折射率粒子77 或高掺杂量子点78。
OT可用于通过BFP干涉测量的纳米级位置测量，使得陷阱内磁珠的位置为Δx = β Sx，其中Sx是传感器的电压信号，β[μm/V]可以按照不同的协议进行动态校准35，54。对于光学力传感器，可以证明电压-力不变转换因子α[pN/V]与β和陷阱刚度k [pN/μm]直接相关，通过α = kβ 37）在磁珠位移太小而无法从光学成像中检测到的实验中，该策略可用于通过小位置检测来补充力测量。一个例子是将这里介绍的实验例程应用于非常僵硬的原子核，对于这些原子核，在合理的激光功率（200-500 mW）下，力不足以诱导足够大的压痕值。在这种情况下，需要使磁珠与原子核接触，并且在测量之前必须校准捕获刚度（步骤8.6）。原子核的缩进d作为力的函数可以间接地确定为：
d = xtrap - F/k
其中 xtrap 是陷阱位置。与不变光动量因子 α[pN/V]不同，在每次实验之前需要校准因子β[μm/V]，因为它取决于许多确定捕获动力学的局部变量，例如粒径、光学阱斑尺寸和相对折射率。

组织形态发生是一个复杂的过程，其中生化信号和物理力在时空协调。在发育中的胚胎中，生化信号传导因子的梯度决定了命运规范并确保正确的组织模式1，2。同时，内在和外在力在构建胚胎结构中发挥作用3，4。在这种情况下，细胞皮层力学的影响已被广泛研究5，6。形态发生过程中机械化学过程之间的紧密互连依赖于单个细胞的特性来感知和响应其组织微环境中的机械力。因此，细胞 通过 力敏感的亚细胞和分子元素的存在来解码机械信号，这些元素将机械信息转换为控制细胞行为，细胞命运和细胞力学的特定信号通路。
发育过程的一个标志是细胞组织成组以构建多细胞结构。因此，单个细胞很少重新排列和单独移动，而是在紧密的社会拓扑中相关，其中它们表现出集体行为，例如细胞上迁移7，（不）干扰过渡8，9 或囊胚压实10。细胞内和细胞之间产生的机械力是指导集体细胞动力学的重要线索7，11。但是，即使细胞单独移动，例如在组织膜或狭窄的组织生态位之间挤压的祖细胞，它们在三维环境中导航时也会经历广泛的各向异性机械力。这些对细胞的机械应力对细胞行为有深远的影响12，13。已经研究了几种机制，这些机制收敛于细胞核作为主要的机械转导元件14，15，在致密的3D组织环境中迁移过程中作为被动或主动机械元件15，16。
我们最近提出了一种机制，使细胞能够使用细胞核作为弹性细胞内机械仪表来测量形状变形12。细胞核是细胞中最大的细胞器，当细胞在机械拉伸、限制或渗透应力下极化、迁移或改变形状时，细胞核会经历大变形16，17，18，19。我们发现，核包膜的拉伸以及细胞核的细胞内定位为细胞提供了有关细胞变形的大小和类型（例如细胞压缩与细胞肿胀）的信息。细胞核的拉伸与内核膜（INM）的展开有关，INM促进INM处的钙依赖性cPLA2（胞质磷脂酶A2）脂肪酶活性，随后释放花生四烯酸（AA）和细胞皮层处肌球蛋白II的快速激活。这导致细胞收缩力增加，变形杆菌细胞迁移超过皮质收缩力阈值6。对细胞变形的机械敏反应发生在不到一分钟的时间内，并且在限制释放时是可逆的，这表明细胞核充当细胞本体感觉的应变片，调节机械应激条件下的适应性细胞行为。这种机械敏感性途径在源自斑马鱼胚胎的祖干细胞中具有活性，无论是在多能细胞还是谱系细胞12 中，并且在不同的物种和细胞系中都是保守的20。
除了作为细胞力学传感器的核特性外，核结构和力学在发育过程中以及响应细胞命运规范21时受到内在调节，因此调整了细胞机械灵敏度22，23。其后果可能是核遵守情况发生变化，从而允许形态变化和从迁移前状态过渡到迁移状态，反之亦然8。
已经应用了几种测量细胞核力学的技术，例如原子力显微镜24，25，微量移液管抽吸26，27，微流体技术28和微针29。然而，这些技术中的许多技术都是侵入性的，因为整个细胞必须变形，限制了细胞核本身的机械特性和力依赖性反应的测量。为了规避细胞表面及其机械敏感细胞皮层30的同时变形，在各种背景下研究了分离的细胞核31，32。然而，不能排除核隔离与机械核性质及其调节的变化有关（参考文献24 和自己未发表的观测结果）。
光学镊子（OT）是一种多功能技术，允许在细胞机械生物学上进行大量实验，并有助于我们理解分子机器如何将化学转化为机械能33，34。光学镊子使用紧密聚焦的激光束将光学力施加到折射率高于周围介质的介电粒子上33。这种力可以是数百皮牛顿的数量级，并导致粒子在激光陷阱焦点内的有效限制，从而能够在三维空间中操纵被捕获的粒子。光的使用具有重要的优势，因为测量可以在活细胞内非侵入性地进行。光学操作进一步限制为激光束的陷阱焦点。因此，可以在不刺激周围细胞膜的情况下进行操作，并且不会扰动肌动蛋白皮层或质膜上的机械敏感过程，例如离子通道的力依赖性激活。
光学镊子方法的难点在于使用经典方法精确确定施加到微球上的力，这些方法依赖于基于均分定理的间接力校准或使用定义的斯托克斯阻力来测量激光功率相关的逃逸力35。虽然这些方法在 体外实验中 很容易实现，但它们通常不能被翻译成细胞环境。该领域已经引入了几种依赖于直接力校准的策略，这些策略源自动量守恒的第一原理36，37。与其他力光谱方法不同，力测量是从光动量与任意形状的捕获粒子的局部交换中推导出来的38，39。在我们的实验设置中，直接测量由光学力产生的光动量变化，而无需 原位 陷阱校准40，41，42，43。因此，在粘性环境中（例如细胞内部甚至组织内部）中测量成为可能，并且可以很容易地将力量化到pN水平。
在该协议中，我们描述了一种测定，用于机械地操纵细胞内细胞器或结构，并通过光学镊子设置定量评估其机械性能。该装置被集成到旋转盘荧光显微镜中，可以对细胞行为或细胞内动力学进行平行成像。该测定允许表征特定细胞区室（如细胞核）的机械性能，同时研究由于变形本身而导致的分子信号通路的可能机制反应和激活。此外，与细胞核（n~1.35）与细胞质（n~1.38）的内在折射对比44 相比，聚苯乙烯珠的折射率（n = 1.59）要高得多，因此细胞内注射的微珠的光学捕获允许增加压痕力。所提出的策略可以很容易地适应其他细胞内结构和细胞器的研究，以及其他涉及主动微流变学的方法，使用多个光学陷阱同时探测相同/不同的亚细胞结构，以及针对活胚胎中细胞力学生物学的测量。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 22 mm cover glasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5 22x60 mm Coverglasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5H glass bottom dishes</td>
			<td>Willco</td>
			<td>GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-um beads</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>72986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mm glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020 GC100F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um polystyrene microbeads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um red-fluorescent beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqcuisition cameras sCMOS</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Sona-4BV11-UNI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary camera (Figure 3, AUX)</td>
			<td>Blackfly, FLIR</td>
			<td>BFS-U3-200S6M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbryte 520</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>520 AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double scotch tape</td>
			<td>Biesse Adesivi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPI-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2A-mCh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Fusion-Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>Type B: 16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR protection googles</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lap2b-eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro loader pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>GELoader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroManager 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromiter slide</td>
			<td>ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tweezers platform</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td>Sensocell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OTs software (LightAce)</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing agent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post processing software (Matlab)</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-950/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>Spincoat G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DragonFly 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangular microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UNB 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers

在多细胞生物体的发育过程中，单个受精细胞分裂并产生具有不同功能的多个组织。组织形态发生与单细胞水平的分子和结构变化密切相关，导致亚细胞力学性质的变化。因此，即使在同一个细胞内，不同的细胞器和隔室对机械应力的抵抗也不同。和机械转导途径可以主动调节其机械性能。因此，细胞适应组织生态位微环境的能力部分是由于感知和响应机械应力的能力。我们最近提出了一种新的机械感觉范式，其中核变形和定位使细胞能够测量物理3D环境，并赋予细胞本体感觉来解码细胞形状的变化。在本文中，我们描述了一种测量塑造活细胞内细胞核的力和材料特性的新方法，例如贴壁细胞和机械限制细胞。测量可以使用细胞内的光学陷阱进行非侵入性测量，并且通过对光动量的免校准检测可以直接获得力。这允许独立于细胞表面变形测量细胞核的力学，并允许解剖外感受和内感受机械转导途径。重要的是，捕获实验可以与光学显微镜相结合，使用细胞骨架，钙离子或核形态的荧光成像来研究细胞反应和亚细胞动力学。所提出的方法易于应用，与用于力测量的商业解决方案兼容，并且可以轻松扩展以研究其他亚细胞区室的机制，例如线粒体，应力纤维和内体。

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Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

在这里，我们提出了一种方案，用于研究分离的胚胎斑马鱼细胞在三维限制下的细胞内力学性质，并通过光学陷阱进行直接力测量。

使用光学镊子测量禁闭中的亚细胞力学的直接力

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

该协议剖析了细胞核的各个机械特性，使其成为细胞极化，分化和迁移的机械仪表。该技术的主要优点是它可以测量机械性能并将力施加到亚细胞区室，而不会对膜或皮质细胞骨架进行外部扰动。该协议可以很容易地适应操纵其他生物体的其他细胞内的珠子，以研究不同细胞系或动物模型中的核力学。直接力传感器的对准对于捕获产生和离开光学陷阱的所有光线至关重要。这将确保在电池的粘弹性介质中进行准确的光动量测量。通过使用塑料巴斯德移液器将受精后四小时的球体阶段胚胎置于含有E3培养基的玻璃皿中，开始单细胞制备。然后选择对珠子呈阳性的胚胎，并在mRNA注射的情况下表达荧光蛋白。使用镊子手动脱脂胚胎，并在玻璃巴斯德移液器的帮助下将大约10至15个脱尿的胚胎转移到1.5毫升的反应容器中。从管中取出E3培养基，加入500微升预热的二氧化碳非依赖性组织培养基。轻轻摇晃管子以避免气泡形成，并确保管内的内容物在细胞解离时变得浑浊，眼睛看不到大块。然后将管以200倍G离心三分钟。离心后，除去上清液并收集沉淀以继续进行细胞染色。为了标记细胞核，通过向管中加入500微升新鲜制备的DNA Hoechst染料染色溶液来重悬细胞。在黑暗中孵育染色的细胞七分钟。接下来，如前所述离心细胞，并将沉淀重悬于50微升DMEM中，用于悬浮样品，或20微升DMEM用于限制细胞。为了制备光学捕获物或OT室，用于悬浮细胞的实验，在中心切下一块双面透明胶带，中间有一个约10毫米×10毫米的方孔。剥离胶带的其中一个保护层，并将胶带的未覆盖面放在1.5 H玻璃底盘的中心。轻轻按压胶带，使胶带的所有表面粘附在玻璃上，同时避免气泡并剥离胶带的剩余保护层。用100微升康卡那瓦林A以每毫升0.5毫克孵育表面30分钟。然后取出康卡那瓦林A的滴剂，并用DMEM冲洗表面。将含有细胞的30微升溶液加入到腔表面。然后用22×22毫米的盖玻片非常轻柔地关闭腔室。如果需要，请使用手术刀或镊子。接下来，在实验前以相当高的功率打开激光器至少30分钟，以优化输出功率稳定性，继续进行光学镊子启动。完成后，打开光学微操作和力测量单元的电子模块。在对准光学力传感器之前，将一滴水滴放在60X 1.2水浸物镜上，并将包含细胞的腔室放在载物台上。聚焦于将放置细胞样品的腔室的下表面。在盖玻片顶部添加一滴浸没油后，放下力传感器单元的收集透镜，直到它接触到油滴。按照光学力传感器对准的标准程序，查看辅助相机上用于定位OT的样品平面图像，然后降低光学力传感器，直到其场停止与样品平面共轭。要使用Bertrand镜头检查气泡，请观察通过辅助相机的成像路径。如果看到任何污垢或气泡，请用无尘镜片组织清洁镜片和腔室，然后重复所述程序，添加更多的浸入油。使用放置在光学力传感器支架上的横向螺钉，将场停止中心置于视野中。为获得精确度，请打开场停止，几乎占据辅助相机上可见的视野。将样品放入显微镜并对齐光学力传感器后，如果原子核的刚度或所研究的细胞间结构未知，则使用旋转的半波板将初始捕获功率设置为200毫瓦。完成后，使用显微镜载物台软件控制器通过透射明场显微镜寻找具有一个或两个微珠的细胞。在数值表中，写下每个后续轨迹步长的位移和时间。或者，从辅助材料加载表S1。对于应力/松弛实验，对要施加的梯形载荷进行编程。在OT软件中，激活光学陷阱。为了捕获微球，使用显微镜载物台软件控制器将图像平面设置在珠子的略上方。单击校准辅助相机成像窗口中的聚苯乙烯微珠。通过光学陷阱成功约束磁珠将大大降低磁珠的运动。单击并拖动磁珠穿过细胞质，并将其放置在距核包络约两微米的距离处。确保设置轨迹，使磁珠压痕垂直于核膜。设置准备就绪后，转到成像软件，然后单击采集按钮开始图像采集。打开实时力读数窗口，点击数据，保存在实时力读取窗口中保存。启动陷阱位置和力测量数据。通过右键单击磁珠并选择起始轨迹来启动先前加载的轨迹。等到轨迹完成并且系统稳定下来，然后才能完成陷阱力测量数据的记录。停止图像采集并在后处理软件中绘制结果。在代表性分析中，显示了一个分离的斑马鱼祖细胞干细胞，其单个微球靠近细胞核。监测注射后五小时在胚胎内聚苯乙烯微球的分布。明场和荧光图像显示珠子分散在胚胎组织中。共聚焦荧光Z-堆栈的最大投影和同一区域中子堆栈的最大投影证实了大部分深层细胞包含一到两个珠子。在受精后24小时，珠子分布在胚胎的整个身体中。获得具有一个或两个注射珠子的受限细胞上悬浮细胞的明场显微照片。此外，多个荧光标记有助于研究细胞的不同方面，例如核间膜，质膜，DNA和转基因系。代表性的快照描述了Hoechst标记的原子核，在用光学捕获的微球压痕前五秒/期间和压痕后五秒。研究了在悬浮和密闭细胞的压痕实验中，沿着三个不同框架的压痕段以及细胞核远端和近端边界的轨迹的强度分布。测量了光学捕获微球在重复核压痕实验中经历的捕获轨迹和力。悬浮和禁闭细胞中的细胞核力学证实，限制导致投影区域的扩大和核刚度的微小变化。如果将珠子注射到一个细胞阶段的胚胎中，它们很可能在后期均匀分布。请记住，珠子必须稳定地被困住。如果磁珠逃逸光学陷阱，请重新定义轨迹或增加激光功率。这些实验可以很容易地在一个细胞内的多个微珠上进行，并扩展到主动微流变学测量。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Hemogenic内皮细胞直接诱导和血液中转录因子在人多能干细胞表达

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

科研

发育生物学

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

使用分离线粒体从小鼠骨骼肌进行高通量微孔板呼吸测量最小数量

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

在活斑马鱼胚胎成像的亚细胞结构

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

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配备了光学切片与成像定时使用解剖显微镜斑马鱼肾脏发展分析

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