Name: direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers at JoVE.com

MK anerkender finansiel støtte fra det spanske økonomi- og konkurrenceministerium gennem Plan Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), Severo Ochoa-programmet for ekspertisecentre inden for forskning og udvikling (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), fra Fundació Privada Cellex, Fundació Mir-Puig og fra Generalitat de Catalunya gennem CERCA- og forskningsprogrammet (2017 SGR 1012) ud over finansiering gennem ERC (MechanoSystems) og HFSP (CDA00023/2018). V.R. anerkender støtte fra det spanske ministerium for videnskab og innovation til EMBL-partnerskabet, Centro de Excelencia Severo Ochoa, MINECO's Plan Nacional (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) og Generalitat de Catalunya (CERCA). V.V. anerkender støtte fra ICFOstepstone PhD-programmet finansieret af EU's Horisont 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen 665884. Vi takker Arnau Farré for kritisk læsning af manuskriptet. Maria Marsal for at få hjælp til billeddannelse og montering af 24 hkf embryo og; Senda Jiménez-Delgado for støtte med zebrafisk mikronjections.

Forfatterne har intet at afsløre.

I denne protokol beskriver vi en unik metode til at afhøre cellekernekernes mekaniske egenskaber inde i de levende celler. I modsætning til andre kraftspektroskopiteknikker gav ikke-invasiv optisk fældefangst os mulighed for at afkoble cellemembranens og cytoskeletonets bidrag fra cellekernes stivhed. Vigtigere er optisk mikromanipulation kompatibel med multimodal mikroskopi, som vil gøre det muligt for eksperimentatoren at studere forskellige processer, der er involveret i celle nuklear mekanobiologi. Som et repræsentativt resultat brugte vi DNA-Hoechst farvning til at måle kernen deformation ved indrykning udført af kræfter i størrelsesordenen flere hundrede picoNewton.
Potentielle anvendelser af vores metode ud over de eksempler, der er skitseret i denne protokol Muligheden for at udtrække kvantitative mekaniske oplysninger fra målinger inde i levende celler uden eksterne forstyrrelser muliggør en overflod af hidtil usete muligheder, der lige er begyndt at blive undersøgt. Således kan den præsenterede protokol for vores optiske mikromanipulationsplatform udvides til mere komplekse eksperimenter med stor alsidighed. Acousto-optiske deflektorer (AOD) kan generere flere optiske fælder til synkrone kraftmålinger på tværs af forskellige celleplaceringer samt kan bruges til aktiv mikrorheologi i et bredt frekvensområde51,61. Som det er blevet nævnt, kan kraftresponset ved indrykning overvinde den maksimale fældefangstkraft, hvilket fører til en flugt af perlen fra den optiske fælde. I dette tilfælde kan der konfigureres en kraftfeedback med AOD for at klemme den optiske kraft. Alt i alt kan flere mikrorheologiske tilgange, såsom stressafspænding, der er beskrevet i denne protokol, men også aktiv mikrorheologi eller krybeoverensstemmelse, eksperimentelt opnås med denne platform og grundigt analyseres af nye softwarepakker61,62,63,64,65 . Desuden er anvendelsen af kræfter ikke begrænset til kernen, men kan i princippet udføres for at måle forskellige intracellulære strukturer og i komplekse væv som påvist til fældefangst flydende røde blodlegemer inde i intakte blodkar66,67 eller fældefangst og deforme chloroplaster og mitokondrier68 . Lys-momentum kalibrering er uafhængig af formen og størrelsen af den indespærrede objekt, hvilket muliggør direkte kraft målinger på enhver kraft sonde med vilkårlig form38,39. Brugen af injicerede mikrosfærer gjorde det muligt for os at anvende høje kræfter på kernen med relativt lav laserkraft sammenlignet med direkte manipulation af cellulære strukturer69,70,71. Men i betragtning af en høj nok brydningsindeksforskel er det ikke nødvendigt med nogen eksternt anvendt kraftsonde, og intracellulære organeller kan manipuleres direkte uden injicerede perler (ikke-offentliggjorte observationer og reference70).
Potentielle ændringer af vores metode til at udvide applikationerne Forskellige størrelser af mikroperler kan injiceres afhængigt af eksperimentet, men de relative kontroller skal udføres. For eksempel kan mindre perler injiceres for at studere celler på senere stadier. Dette vil reducere den maksimale kraft, der kan udøves af den optiske fælde (som vist i reference55). Større perler kan injiceres for at udøve højere kræfter, men disse kan påvirke embryo udvikling afhængigt af deres størrelse eller fase af interesse. I forsøg, hvor mikroperle injektion ikke er en mulighed, forskellige organeller viser brydningsindeks forskelle i forhold til cytoplasmaet kan stadig optisk manipuleres, hvilket giver anledning til optiske kræfter målbare fra lys momentum ændringer42. Som nævnt ovenfor, disse metoder er blevet anvendt af Bambardekar et al. at deformere celle-celle vejkryds i Drosophila embryo70. Ligeledes har cellens kerne et lavere brydningsindeks end det omgivende medium44, hvilket giver mulighed for perlefri indrykning (ikke-offentliggjorte observationer og reference72), selvom det er med en lavere fældefangststyrke. Kernen kan således ikke fanges let og undslipper fælden.
Den spin-coatede PDMS spacer er fremstillet via en bekvem og hurtig metode, men kan være uden for rækkevidde for laboratorier uden adgang til en mikro-/ nanofabrication facilitet eller engineering labs. Således kan afstandsrummet nemt samles fra laboratorietape eller parafilm (trin 4). Protokollen kan også tilpasses ved fremstilling af mikrofluidiske kanaler, der automatiserer leveringen af enkelte celler i foruddefinerede målebjerne eller ind i et kammer med en defineret højde for at estimere indespærringseffekten i samme prøve. Sådanne mikrofluidiske anordninger skal dog være konstrueret således, at de passer til mellemrummet mellem mikroskopmålet og opsamlingslinsen på den optiske kraftsensor på ca. 2 mm (se trin 3). Bemærk, at den optiske kraftsensor skal placeres i den passende højde, så ingen optiske afvigelser fra defokusering påvirker fotonmomentummålingen.
Andre ændringer kunne omfatte ændring af biologiske journalister. Vi fandt ud af, at Hoechst fluorescens spektralt bløder ind i GFP-kanalen, og vi favoriserer derfor kombinationen med mCherry-mærket histone som en nuklear markør til samtidig måling i to fluorescerende kanaler. Alternativt kan nuklear deformation nemt spores med en etiket rettet mod den indre nukleare membran som Lap2b-GFP (Figur 2).
Indrykning på cellekernen var i størrelsesordenen 2-3 mikron, som vi præcist kunne måle ved billedanalyse af diffraktions-begrænset spinning-disk konfokal mikroskopi. For de stivere kerner eller mindre kræfter vil indrykning næppe kunne måles ved hjælp af denne fremgangsmåde. Den absolutte kraftkalibrerede optiske pincet kan dog også kalibreres til positionsmålinger af den indespærrede perle på stedet ved hjælp af BFP interferometri med nanometerpræcished51. Ved hjælp af denne tilgang kan spændingssignalet og den optiske kraftsensor oversættes til den indespærrede sondes position gennem parameter β [nm/V], mens den invariante parameter α [pN/V] giver kraftværdier gennem ovennævnte lys-momentum kalibrering41 (se nedenfor for detaljer).
Fejlfinding Vi konstaterede, at følgende udfordringer kunne opstå under eksperimentet:
Der dannes ingen stabil fælde, og mikrosfæren undslipper let Snavs på mikroskopmålet eller en forkert justeret korrektionskrave kan føre til en fejl i en stabil fælde. Hvis der ikke findes en umiddelbar løsning, skal du måle punktspredningsfunktionen for objektivobjektivet. Hvis prøven af interesse er dybt inde i et optisk tæt væv, kan laserfokus opleve alvorlige optiske afvigelser, der fører til ustabil fældefangst (denne effekt er normalt ubetydelig i isolerede celler, men bliver mere tydelig i tykkere væv). For høj stivhed kan kernens genoprettende kraft overstige fældens flugtkraft, således at mikrosfæren går tabt, og indrykningsrutinen mislykkes. I første omgang bliver den nukleare membrankant, der er proksimale for den optiske fælde, næppe indrykket (figur S2A). Når dette sker, er diffuseringslaseren ikke længere påvirket af kraft og Brownian bevægelse, hvilket fører til et kraftfald til nul og et fald i signalstøjen (Figur S2B). Hvis dette sker, kan laserkraft øges for at have en stærkere fælde, amplituden af trapezformet bane, der skubber perlen ind i kernen, kan reduceres, eller den første position af den indespærrede mikroperle kan sættes længere væk fra kernen.
Cellen bevæger sig under stimuleringen Hvis cellerne ikke er tilstrækkeligt fastgjort, vil den optiske gradientfælde flytte cellerne, mens de udfører den intracellulære indrykningsrutine, således at kernens kræfter og underliggende mekanik er artefaktiske. For at forhindre forskydning af hele cellen anbefaler vi at øge koncentrationen af celle vedhæsionsmolekyler på overfladen, f.eks.
Indledende momentum kompensation Hvis der ikke er en indledende momentumkompensationsrutine tilgængelig på OTs-platformen (trin 6.5), skal der korrigeres et kunstigt, kraftuafhængigt basissignal. Dette er synligt som en hældning på kraftkurven, selv uden perle fanget (Figur S1E). For at udføre korrektionen skal den samme bane udføres uden en perle uden for cellen på nøjagtig samme position. Til dette skal du flytte cellen væk fra fælden ved hjælp af scenekontrolelementet. Som reference ændres kraftforskydningen 5 pN på tværs af FOV ved 200 mW i vores system; således bliver det ubetydeligt for korte baner. Alternativt kan en piezoscanningsfase bruges til at flytte cellerne på prøven, så laserpositionen er konstant.
Kritiske trin i den præsenterede protokol Mikrosfærer bør injiceres i højre, 1-celle fase for at sikre maksimal fordeling over embryoet. Perler bør ikke være fluorescerende, således at der ikke udslip af lys i de fluorescerende kanaler, der anvendes til billeddannelse. For eksempel er selv typiske rød-fluorescerende perler tydeligt synlige i den blå kanal, der bruges til billeddannelse af cellekernen efter Hoechst farvning på grund af deres lysstyrke (excitation: 405 nm; emission: 445 nm). Stabil fastgørelse af cellen til substratet er afgørende for at forhindre sideforskydning under indrykningsrutinen. Hvis cellen bevæger sig under rutinen, undervurderes kræfterne. Hvis dette sker ofte, skal du optimere protokollen for vedhæftede filer. For vævskulturceller fører andre celle vedhæhæftningsproteiner, såsom fibronectin, kollagen eller poly-L-lysin, til tilfredsstillende vedhæftet fil (ikke-offentliggjorte observationer). Under indespærringen udsættes cellerne for en pludselig og alvorlig mekanisk stress. Dette kan forårsage skade på cellerne, og ofte vil eksperimentatoren støde på bristede celler, hvis proceduren ikke udføres omhyggeligt. Også, hvis indespærring højden er for lille, vil alle cellerne lider af nukleare omsluttelse brud eller uoprettelig skade. For at afbøde disse skal du sænke den øverste dæksel langsommere og/eller øge afstanden mellem dæksleren.
Begrænsninger af teknikken og forslag til at overvinde dem En klar begrænsning af teknikken er laserlysets indtrængning i dybe dele af vævet, hvilket fører til afvigelser og ustabil fældefangst. En lavere grænse for penetrationsdybde afhænger således af prøvens klarhed, den afvigelseskorrektion, der kan anvendes73 , og den anvendte lasereffekt. Det skal tages i betragtning, at en højere lasereffekt fører til termisk excitation af prøven i nærheden af mikrosfæren. Opvarmningen af prøven, der stammer fra 1064 nm bølgelængde laser stedet er minimeret for at undgå plausibel varme-relaterede stress på vores biologiske prøver74.
En anden begrænsning er den maksimale kraft, der kan måles. Selv om direkte lys-momentum detektion muliggør kraftmålinger langt ud over den optiske trap40,41' lineære responsregime, er den maksimale anvendte kraft i størrelsesordenen et par hundrede picoNewtons. Dette er begrænset af laserkraft og den deraf følgende skadestærskel for blødt biologisk materiale og brydningsindeksforskellene, som normalt ikke er større end 0,1 eller 0,344. Flere metoder er blevet foreslået at øge kraftdetekteringsgrænsen, f.eks. ved hjælp af struktureret lys75, antireflekterende belagt mikrosfærer76, højbrydningsindekspartikler77 eller meget dopede kvanteprikker78.
OT'er kan anvendes til nanometerskalapositionsmålinger gennem BFP-interferometri, således at perlens position i fælden er Δx = β Sx, hvor Sx er sensorens spændingssignal, og β [μm/V] kan kalibreres on-the-fly efter forskellige protokoller35,54. For en optisk kraftsensor kan det bevises, at spændings-til-kraft-omregningsfaktoren α [pN/V] direkte vedrører β og fældestivheden, k [pN/μm], gennem α = kβ 37) I forsøg med perleforskydninger, der er for små til at blive opdaget fra optisk billeddannelse, kan denne strategi bruges til at supplere kraftmålinger med lille positionsdetektering. Et eksempel er anvendelsen af de eksperimentelle rutiner, der præsenteres her på meget stive kerner, for hvilke kræfter ved rimelige laserkræfter (200-500 mW) ikke er tilstrækkelige til at fremkalde indrykningsværdier, der er store nok. I så fald skal perlen bringes i kontakt med kernen, og fældefangststivheden skal kalibreres før målingen (trin 8.6). Indrykning d af kernen som en funktion af kraft kan indirekte bestemmes som:
d = xtrap - F/k
hvor xtrap er diffuseringspositionen. Forskellig fra den invariante lys-momentum faktor α [pN/V], faktor β [μm/V] skal kalibreres forud for hvert eksperiment, da det afhænger af mange lokale variabler bestemme fældefangst dynamik, såsom partikelstørrelse, optisk fælde spot size, og relative brydningsindekser.

Vævmorphogenese er en kompleks proces, hvor biokemiske signaler og fysiske kræfter er spatiotemporally koordineret. I det udviklende embryo dikterer gradienter af biokemiske signalfaktorer skæbnespecifikation og sikrer korrekt vævsmønster1,2. Samtidig spiller iboende og ydre kræfter en rolle i opbygningen af embryoets arkitektur3,4. Indflydelsen af celle cortex mekanik i denne sammenhæng er blevet undersøgt grundigt5,6. Den tætte sammenkobling mellem mechano-kemiske processer under morfogenese afhænger af enkelte cellers egenskaber til at sanse og reagere på mekaniske kræfter i deres vævsmikromiljø. Celler, derved afkode mekaniske signaler via tilstedeværelsen af kraftfølsomme subcellulære og molekylære elementer, der transduce mekaniske oplysninger i specifikke signalering veje kontrollere celle adfærd, celle skæbne, og celle mekanik.
Et kendetegn for udviklingsprocesser er, at celler organiserer sig som grupper for at opbygge flercellede strukturer. Som sådan, enkelte celler sjældent omarrangere og bevæge sig alene, men er forbundet i en stram sociotop, hvor de viser kollektiv adfærd såsom supracellular migration7, (un)jamming overgange8,9 eller blastocyst komprimering10. Mekaniske kræfter genereret i og mellem celler tjener som vigtige signaler til at instruere kollektiv celle dynamik7,11. Men selv når celler bevæger sig alene, såsom stamfaderceller, der klemmer sig vej mellem vævsplader eller smalle vævsnicher, oplever de omfattende anisotropiske mekaniske kræfter, når de navigerer i et tredimensionelt miljø. Disse mekaniske belastninger på celler har dybtgående konsekvenser for cellulær adfærd12,13. Flere mekanismer er blevet undersøgt, der konvergerer på kernen som et stort mechanotransduktionselement14,15, som passivt eller aktivt mekanisk element under migration inden for et tæt 3D-vævsmiljø15,16.
Vi har for nylig foreslået en mekanisme, der udstyrer celler til at måle form deformationer ved hjælp af kernen som en elastisk intracellulær mechano-gauge12. Kernen, der er den største organelle i en celle, gennemgår store deformationer, når cellerne polariserer, migrerer eller ændrer deres form under mekanisk strækning, indespærring eller osmotisk stress16,17,18,19. Vi fandt, at nukleare kuvert strække sammen med intracellulære positionering af kernen giver celler med oplysninger om omfanget og typen af celle deformation (såsom celle kompression versus celle hævelse). Strækning af kernen er forbundet med en udfoldning af den indre nukleare membran (INM), som fremmer calciumafhængig cPLA2 (cytosolic fosfolipase A2) lipaseaktivitet ved INM efterfulgt af frigivelse af arachidonsyre (AA) og hurtig aktivering af myosin II ved cellebarken. Dette fører til øget cellesammentrækning og amoeboid celle migration over en tærskel for kortikal sammentrækning6. Den mechanosensitive reaktion på celle deformation sker på mindre end et minut og er reversibel ved indespærring frigivelse, tyder på, at kernen fungerer som en stammemåler for cellulære proprioception regulere adaptive celle adfærd under mekaniske stress betingelser. Denne mechanosensitive vej har vist sig at være aktiv i stamfader stamceller stammer fra zebrafisk embryoner, både i pluripotente og afstamning-engagerede celler12 og er bevaret i forskellige arter og celle linjer20.
Ud over de nukleare egenskaber som en celle-mechanosensor, nukleare arkitektur og mekanik er iboende reguleret under udvikling og som reaktion på celle skæbne specifikation21, dermed tuning cellulære mechano-følsomhed22,23. Konsekvensen kan være en ændring i nuklear overholdelse, der giver mulighed for morfologiske ændringer og overgange fra en præmigratorisk til en migrerende stat og omvendt8.
Flere teknikker til at måle cellekernemekanik er blevet anvendt, såsom atomprøvesprængningsmikroskopi24,25, mikropipet aspiration26,27, mikrofluidisk teknologi28 og mikroneedles29. Men mange af disse teknikker er invasive i den forstand, at hele cellen skal deformeres, hvilket begrænser målingen af mekaniske egenskaber og kraftafhængige reaktioner i selve kernen. For at omgå den samtidige deformation af celleoverfladen og dens mechanosensitive celle cortex30 blev isolerede kerner undersøgt i forskellige sammenhænge31,32. Det kan imidlertid ikke udelukkes, at nuklear isolation er forbundet med en ændring i mekaniske kerneegenskaber og deres regulering (reference24 og egne ikke-offentliggjorte observationer).
Optiske pincet (OT'er) er en alsidig teknologi, der har tilladt en overflod af eksperimenter i cellemekanobiologi og har været medvirkende til vores forståelse af, hvordan molekylære maskiner omdanner kemisk til mekanisk energi33,34. Optiske pincet bruge en stramt fokuseret laserstråle til at udøve optiske kræfter på dielektriske partikler, der har en brydning indeks højere end de omkringliggende medium33. Sådanne kræfter kan være i størrelsesordenen hundredvis af pico-Newtons og resultere i effektiv indespærring af partiklen i laserfælde fokus, muliggør manipulation af den fangede partikel i tre dimensioner. Brugen af lys har en vigtig fordel ved, at målingen kan udføres ikke-invasivt inde i levende celler. Optiske manipulationer er yderligere begrænset til fælden fokus laserstrålen. Derfor kan manipulationen udføres uden at stimulere de omgivende cellulære membraner og forstyrrer ikke actin cortex eller mechanosensitive processer ved plasmamembranen, såsom den kraftafhængige aktivering af ionkanaler.
Vanskeligheden ved den optiske pincet tilgang er præcist at bestemme de kræfter, der anvendes til mikrosfæren ved hjælp af klassiske tilgange, der er afhængige af indirekte kraft kalibrering baseret på equipartition sætning eller brugen af definerede Stokes-drag kræfter til at måle en laser-power afhængige flugt kraft35. Mens disse metoder er ligetil at implementere i et in vitro-eksperiment, kan de normalt ikke oversættes til et cellulært miljø. Flere strategier er blevet indført i marken, der er afhængige af en direkte kraft kalibrering, der stammer fra de første principper for momentum bevarelse36,37. I modsætning til andre kraftspektroskopimetoder udledes kraftmålinger fra en lokal lyskryds af lysmomentum med den vilkårligt formede fanget partikel38,39. I vores eksperimentelle set-up måles ændringer i lysmomentum som følge af optiske kræfter direkte uden behov for kalibrering af in situ trap40,41,42,43. Således bliver målingerne mulige i et tyktflydende miljø som cellens indre eller endda inden for et væv, og kræfter kan let kvantificeres ned til pN-niveauet.
I denne protokol beskriver vi en analyse for mekanisk at manipulere intracellulære organeller eller strukturer og kvantitativt vurdere deres mekaniske egenskaber ved en optisk pincet set-up. Denne opsætning er integreret i et roterende disklysstofrør, der muliggør parallel billeddannelse af cellulær adfærd eller intracellulær dynamik. Analysen giver mulighed for karakterisering af de mekaniske egenskaber af specifikke cellulære rum, såsom kernen, samtidig med at studere den mulige mechanoresponse og aktivering af molekylære signalering veje som følge af deformation selv. Desuden giver optisk staffage af injicerede mikroperler i cellerne mulighed for en stigning i indrykningskraften takket være et betydeligt højere brydningsindeks for polystyrenperen (n = 1,59) sammenlignet med den iboende brydningskontrast4 i kernen (n ~ 1,35) versus cytoplasma (n ~ 1,38). Den præsenterede strategi kan let tilpasses til studiet af andre intracellulære strukturer og organeller samt andre tilgange, der involverer aktiv mikrorheologi, brug af flere optiske fælder til at sondere de samme / forskellige subcellulære strukturer samtidigt og målinger rettet mod cellemekanobiologi i det levende embryo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 22 mm cover glasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5 22x60 mm Coverglasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5H glass bottom dishes</td>
			<td>Willco</td>
			<td>GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-um beads</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>72986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mm glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020 GC100F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um polystyrene microbeads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um red-fluorescent beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqcuisition cameras sCMOS</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Sona-4BV11-UNI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary camera (Figure 3, AUX)</td>
			<td>Blackfly, FLIR</td>
			<td>BFS-U3-200S6M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbryte 520</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>520 AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double scotch tape</td>
			<td>Biesse Adesivi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPI-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2A-mCh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Fusion-Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>Type B: 16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR protection googles</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lap2b-eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro loader pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>GELoader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroManager 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromiter slide</td>
			<td>ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tweezers platform</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td>Sensocell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OTs software (LightAce)</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing agent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post processing software (Matlab)</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-950/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>Spincoat G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DragonFly 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangular microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UNB 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers

Under udviklingen af en flercellet organisme deler en enkelt befrugtet celle sig og giver anledning til flere væv med forskellige funktioner. Vævmorphogenese går i hånd med molekylære og strukturelle ændringer på enkeltcelleniveau, der resulterer i variationer af subcellulære mekaniske egenskaber. Som følge heraf modstår forskellige organeller og rum forskelligt i samme celle end mekaniske belastninger; og mechanotransduktionsveje kan aktivt regulere deres mekaniske egenskaber. En celles evne til at tilpasse sig mikromiljøet i vævsnicheren skyldes således til dels evnen til at sanse og reagere på mekaniske belastninger. Vi har for nylig foreslået en ny mekanosensation paradigme, hvor nuklear deformation og positionering gør det muligt for en celle at måle den fysiske 3D-miljø og udstyrer cellen med en følelse af proprioception at afkode ændringer i celleform. I denne artikel beskriver vi en ny metode til at måle de kræfter og materielle egenskaber, der former cellekernen inde i levende celler, eksemplificeret på klæbende celler og mekanisk lukkede celler. Målingerne kan udføres ikke-invasivt med optiske fælder inde i celler, og kræfterne er direkte tilgængelige gennem kalibreringsfri påvisning af lysmomentum. Dette gør det muligt at måle kernens mekanik uafhængigt af celleoverfladedeformationer og tillade dissektion af exteroceptive og interoceptive mechanotransduktionsveje. Vigtigere, fældefangst eksperiment kan kombineres med optisk mikroskopi til at undersøge cellulære respons og subcellulære dynamik ved hjælp af fluorescens billeddannelse af cytoskeleton, calciumioner, eller nuklear morfologi. Den præsenterede metode er ligetil at anvende, kompatibel med kommercielle løsninger til kraftmålinger og kan nemt udvides til at undersøge mekanikken i andre subcellulære rum, f.eks. mitokondrier, stressfibre og endosomes.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers at JoVE.com

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

Her præsenterer vi en protokol til at undersøge de intracellulære mekaniske egenskaber af isolerede embryonale zebrafiskceller i tredimensionel indespærring med direkte kraftmåling ved en optisk fælde.

Direkte kraftmålinger af subcellulære mekanikker i indespærring ved hjælp af optisk pincet

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Denne protokol dissekerer de individuelle mekaniske egenskaber af cellekernen, der gør den til en mekanisk måler til cellepolarisering, differentiering og migration. Den største fordel ved denne teknik er, at den kan måle mekaniske egenskaber og anvende kræfter på subcellulære rum uden ekstern forstyrrelse af membranen eller kortikale kytoskeleton. Protokollen kan let tilpasses til at manipulere perler inde i andre celler i andre organismer for at studere nukleare mekanik i forskellige cellelinjer eller dyremodeller.Justering af sensoren med direkte kraft er afgørende for at fange alt det lys, der skaber og forlader de optiske fælder. Dette vil sikre nøjagtige lys momentum målinger i viskoelastic medium af en celle. Begynd enkeltcellepræparatet ved at placere sfærestadiet embryoner fire timer efter befrugtning i en glasskål indeholdende E3-medier ved hjælp af en plast Pasteur pipette.Vælg derefter de embryoner, der er positive for perlerne, og udtryk fluorescerende protein i tilfælde af mRNA-injektion. Brug sammenklik til manuelt at decurionere embryonerne og overføre ca. 10 til 15 decurionerede embryoner til en 1,5 milliliter reaktionsbeholder ved hjælp af en glas pasteur pipette. Fjern E3-mediet fra røret og tilsæt 500 mikroliter af forvarmet kuldioxid-uafhængigt vævskulturmedie.Ryst forsigtigt røret undgå boble dannelse og sikre, at indholdet af røret bliver uklart som cellerne dissociere med ingen store bidder synlige af øjet. Derefter centrifugere røret på 200 gange G i tre minutter. Efter centrifugering skal du fjerne supernatanten og opsamle pelleten for at fortsætte med cellefarvning.For at mærke kernen skal cellerne genbruges ved at tilføje 500 mikroliter af den frisklavede DNA Hoechst farvefarvningsopløsning til røret. Inkuber de farvede celler i syv minutter i mørket. Dernæst centrifugere cellerne som beskrevet tidligere og genbruge pellet i enten 50 mikroliter af DMEM for prøver i suspension eller 20 mikroliter af DMEM for celler i indeslutning.Til fremstilling af de optiske staffage eller OT kammer til eksperimenter med cellerne i suspension, skære et stykke dobbeltsidet scotch tape med en ca 10 millimeter med 10 millimeter firkantet hul i midten. Skræl et af de beskyttende lag af båndet og læg den udækkede side af båndet i midten af en nummer 1,5 H glasbundsfad. Tryk forsigtigt på båndet for at få hele overfladen af båndet til at klæbe til glasset, samtidig med at du undgår luftbobler og skræl det resterende beskyttende lag af båndet.Inkuber overfladen med 100 mikroliter af Concanavalin A ved 0,5 milligram pr. milliliter i 30 minutter. Fjern derefter dråben af Concanavalin A og skyl overfladen med DMEM. Tilsæt 30 mikroliter af opløsningen, der indeholder cellerne, på hulrumsoverfladen.Luk derefter kammeret meget forsigtigt med et 22 med 22 millimeter dækglas. Brug en skalpel eller sammentævd, hvis det er nødvendigt. Fortsæt derefter til optisk pincetstart ved at tænde laseren ved betydeligt høj effekt i mindst 30 minutter før eksperimentet for at optimere udgangseffektstabiliteten.Når du er færdig, skal du tænde elektronikmodulet i de optiske mikromanipulations- og kraftmålingsenheder. Før du justerer den optiske kraftsensor, skal du sætte en dråbe vand på 60X 1,2 vand nedsænkningsmålet og placere kammeret, der indeholder cellerne, på scenen. Fokuser på den nederste overflade af kammeret, hvor celleprøverne vil blive placeret.Når du har tilføjet en dråbe nedsænkningsolie oven på dækglasslidsliden, der dækker prøven, skal du sænke kraftsensorenhedens opsamlingslinse, indtil den kommer i kontakt med oliedråben. Efter standardproceduren for justeringen af den optiske kraftsensor skal du se på prøveplanbilledet på det hjælpekamera, der skal bruges til at placere OT'erne, og derefter sænke den optiske kraftsensor, indtil dets feltstop vises konjugeret på prøveplanet. Hvis du vil kontrollere, om der er luftbobler med Bertrand-objektivet, skal du observere billedstien gennem hjælpekameraet.Hvis snavs eller luftbobler er synlige, skal du rengøre linsen og kammeret med støvfrit linsevæv, før proceduren gentages som beskrevet, og tilsæt mere nedsænkningsolie. Ved hjælp af sideskruerne placeret på holderen af den optiske kraftsensor skal du centrere feltstoppet ind i synsfeltet. For nøjagtighed skal du åbne feltstoppet næsten for at optage det synsfelt, der er synligt på hjælpekameraet.Når prøven er placeret i mikroskopet og justeret den optiske kraftsensor, skal du bruge den roterende halvbølgeplade til at indstille den oprindelige fældeeffekt til 200 milliwatt, hvis kernens stivhed eller den undersøgte intercellulære struktur ikke er kendt. Når det er gjort, skal du bruge mikroskopstadiet software controller til at lede efter en celle med en eller to perler gennem transmitteret Brightfield mikroskopi. Skriv forskydningen og tidspunktet for hvert efterfølgende banetrin i det numeriske ark.Alternativt kan du indlæse tabel S1 fra det supplerende materiale. For en stress / afslapning eksperiment, program trapezformede belastninger, der skal anvendes. I OT-softwaren skal du aktivere de optiske fælder.For at fange en mikrosfære, indstille billedet planer lidt over perlen med et mikroskop fase software controller. Klik på polystyren mikroperle i den kalibrerede ekstra kamera billedbehandling vindue. Vellykket indespærring af perlen ved den optiske fælde vil kraftigt reducere perlens bevægelse.Klik og træk perlen hen over cytoplasmaet og læg den i en afstand af ca. to mikron fra atomkonvoluten. Sørg for, at banen er indstillet, så perleindrykningen er vinkelret på atommembranen. Når opsætningen er klar, skal du gå til billedsoftwaren og klikke på anskaffelsesknappen for at starte billedopsamlingen.Åbn realtidsaflæsningsvinduet, klik på data, og gem i realtidsaflæsningsvinduet for at gemme. Start diffuseringspositionen, og tving måledata. Start den tidligere indlæste bane ved at højreklikke på perlen og vælge startbane.Vent, indtil banen er færdig, og systemet stabiliserer sig, før du afslutter registreringen af fældestyrkemålingsdataene. Stop billedopsamlingen, og plot resultaterne i efterbehandlingssoftwaren. I den repræsentative analyse vises en isoleret zebrafisk stamcelle med en enkelt mikrosfære tæt på kernen.Fordelingen af polystyrenmikrosfæren fem timer efter injektion inde i et embryo blev overvåget. Brightfield og fluorescens billede viser perlerne er spredt over embryon væv. Maksimal projektion af den konfokale fluorescerende Z-stak og en maksimal projektion af en understak i samme region bekræfter, at en stor brøkdel af dybe celler indeholdt en til to perler.På 24 timer efter befrugtning blev perlerne fordelt over hele embryoets krop. Brightfield mikrografer af suspension celler på de indespærrede celler med en eller to injicerede perler blev opnået. Desuden lettede flere fluorescerende etiketter undersøgelsen af forskellige aspekter af cellerne, såsom internuclearmembran, plasmamembran, DNA og transgen linje.Repræsentative snapshots beskrev Hoechst-mærket kerner fem sekunder før / under og fem sekunder efter indrykning med en optisk fanget mikrosfære. Intensitetsprofiler langs indrykningssegmentet for tre forskellige rammer og baner af kernens distale og proksimale grænser under et indrykningseksperiment af suspenderede og begrænsede celler blev undersøgt. Fanget bane og kraft opleves af optisk fanget mikrosfæren under en gentagen nuklear indrykning eksperiment blev målt.Nucleus mekanik i cellerne i suspension og under indespærring bekræftet, at indespærring resulterede i en udvidelse af det forventede område og en ubetydelig ændring i nukleare stivhed. Hvis perler injiceres i embryoet på et cellestadium, vil de sandsynligvis fordeles jævnt i de senere faser. Husk, at perlen skal være fastklemt.Hvis perlen undslipper den optiske fælde, omdefinere bane eller øge laser magt. Disse eksperimenter kan nemt udføres på flere mikroperler inde i en celle og udvides til aktive mikrorheologimålinger.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Direkte Induktion af Hemogenic Endothelium og Blood af Overekspression af transkriptionsfaktorer i Human pluripotente stamceller

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Brug af Isoleret Mitokondrier fra minimale mængder af Mouse Skeletmuskel for High throughput Mikropladekrav Respiratory Målinger

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging Subcellulære Strukturer i Living Zebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse af zebrafisk Kidney Udvikling med Time-lapse Imaging Ved hjælp af en dissektionsmikroskop Udstyret til Optical Sektionsinddeling

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Protokol til direkte omdannelse af murine embryonale fibroblaster i trofoblasten Stamceller

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Subkutan neurotrofin 4 infusion ved hjælp af osmotiske pumper eller direkte muskelsprøjtning forbedrer aldring rotte larynx muskler

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Sondering celle mekanik med perle-fri Optisk pincet i Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direkte afstamning omprogrammering af voksne mus Fibroblast til Erythroid ophav

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk lys-Sheet mikroskopi og automatiseret celle Lineage analyser til kataloget Caenorhabditis elegans Embryogenesis med Subcellular opløsning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...