Name: direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers at JoVE.com

MK erkent financiële steun van het Spaanse ministerie van Economie en Concurrentievermogen via het Plan Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), Severo Ochoa-programma voor Centres of Excellence in R&D (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), van Fundació Privada Cellex, Fundació Mir-Puig, en van Generalitat de Catalunya via het CERCA en onderzoeksprogramma (2017 SGR 1012), naast financiering via ERC (MechanoSystems) en HFSP (CDA00023/2018). V.R. erkent de steun van het Spaanse ministerie van Wetenschap en Innovatie aan het EMBL-partnerschap, het Centro de Excelencia Severo Ochoa, MINECO's Plan Nacional (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) en Generalitat de Catalunya (CERCA). V.V. erkent de steun van het ICFOstepstone PhD-programma dat wordt gefinancierd door het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst 665884. Wij danken Arnau Farré voor het kritisch lezen van het manuscript; Maria Marsal voor de hulp bij het in beeld brengen en monteren van het 24 hpf embryo en; Senda Jiménez-Delgado voor ondersteuning met zebravis micronjecties.

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit protocol beschrijven we een unieke methode om de mechanische eigenschappen van de celkern in de levende cellen te ondervragen. Anders dan andere krachtspectroscopietechnieken, stelde niet-invasieve optische trapping ons in staat om de bijdrage van het celmembraan en cytoskelet los te koppelen van de celkernstijfheid. Belangrijk is dat optische micromanipulatie compatibel is met multimodale microscopie, waardoor de experimentator verschillende processen kan bestuderen die betrokken zijn bij de celkernmechanobiologie. Als representatief resultaat gebruikten we DNA-Hoechst-kleuring om de kernvervorming bij inkeping te meten, uitgevoerd door krachten in de orde van enkele honderden picoNewton.
Mogelijke toepassingen van onze methode die verder gaan dan de voorbeelden die in dit protocol worden beschreven De mogelijkheid om kwantitatieve mechanische informatie te extraheren uit metingen in levende cellen zonder externe verstoringen maakt een overvloed aan ongekende mogelijkheden mogelijk die net beginnen te worden verkend. Zo kan het gepresenteerde protocol van ons optische micromanipulatieplatform worden uitgebreid naar complexere experimenten met een grote veelzijdigheid. Acousto-optische deflectoren (AOD) kunnen meerdere optische vallen genereren voor synchrone krachtmetingen op verschillende cellocaties, en kunnen worden gebruikt voor actieve microrheologie in een breed frequentiebereik51,61. Zoals gezegd kan de krachtrespons bij inspringing de maximale vangkracht overwinnen, wat leidt tot een ontsnapping van de kraal uit de optische val. In dit geval kan een force feedback worden geconfigureerd met de AOD om de optische kracht te klemmen. Al met al kunnen meerdere microrheologische benaderingen, zoals de stressontspanning beschreven in dit protocol, maar ook actieve microrheologie of kruipcompliance, experimenteel worden verkregen met dit platform en grondig worden geanalyseerd door nieuwe softwarepakketten61,62,63,64,65 . Bovendien is de toepassing van krachten niet beperkt tot de kern, maar zou deze in principe kunnen worden uitgevoerd om diverse intracellulaire structuren en in complexe weefsels te meten, zoals aangetoond voor het vangen van stromende rode bloedcellen in intacte bloedvaten66,67 of het vangen en vervormen van chloroplasten en mitochondriën68 . De kalibratie van het lichtmoment is onafhankelijk van de vorm en grootte van het ingesloten object, waardoor directe krachtmetingen mogelijk zijn op elke krachtsonde met willekeurige vorm38,39. Het gebruik van geïnjecteerde microsferen stelde ons in staat om hoge krachten op de kern uit te oefenen met een relatief laag laservermogen in vergelijking met directe manipulatie van cellulaire structuren69,70,71. Bij een voldoende hoog brekingsindexverschil is echter geen extern toegepaste krachtsonde nodig en kunnen intracellulaire organellen direct worden gemanipuleerd zonder geïnjecteerde kralen (ongepubliceerde waarnemingen en referentie70).
Mogelijke aanpassingen van onze methode om de toepassingen uit te breiden Verschillende groottes van microbeads kunnen worden geïnjecteerd, afhankelijk van het experiment, maar de relatieve controles moeten worden uitgevoerd. Om cellen in latere stadia te bestuderen, kunnen bijvoorbeeld kleinere kralen worden geïnjecteerd. Dit vermindert de maximale kracht die kan worden uitgeoefend door de optische val (zoals weergegeven in referentie55). Grotere kralen kunnen worden geïnjecteerd om hogere krachten uit te oefenen, maar deze kunnen de ontwikkeling van het embryo beïnvloeden, afhankelijk van hun grootte of interessegebied. In experimenten waar microbead-injectie geen optie is, kunnen verschillende organellen die refractieve indices vertonen verschillen ten opzichte van die van het cytoplasma nog steeds optisch worden gemanipuleerd, wat aanleiding geeft tot optische krachten die meetbaar zijn uit lichtmomentveranderingen42. Zoals hierboven vermeld, zijn deze methoden gebruikt door Bambardekar et al. om cel-cel juncties in het Drosophila-embryo te vervormen70. Evenzo heeft de celkern een lagere brekingsindex dan het omringende medium44, wat parelvrije inkeping mogelijk maakt (ongepubliceerde waarnemingen en referentie72), hoewel met een lagere vangsterkte. De kern kan dus niet gemakkelijk worden gevangen en ontsnapt aan de val.
De spin-gecoate PDMS-afstandhouder wordt vervaardigd via een handige en snelle methode, maar is mogelijk buiten bereik voor laboratoria zonder toegang tot een micro- / nanofabricagefaciliteit of technische laboratoria. Zo kan de afstandhouder eenvoudig worden gemonteerd uit laboratoriumtape of parafilm (stap 4). Het protocol kan ook worden aangepast door microfluïdische kanalen te produceren die de levering van afzonderlijke cellen in vooraf gedefinieerde meetputten of in een kamer met een gedefinieerde hoogte automatiseren om het opsluitingseffect binnen hetzelfde monster te schatten. Dergelijke microfluïdische apparaten moeten echter zo zijn ontworpen dat zij passen in de ruimte tussen het microscoopobjectief en de opvanglens van de optische krachtsensor van ongeveer 2 mm (zie stap 3). Merk op dat de optische krachtsensor op de juiste hoogte moet worden geplaatst, zodat geen optische aberraties door onscherpte de meting van het fotonmoment beïnvloeden.
Andere wijzigingen kunnen de verandering van biologische verslaggevers zijn. We ontdekten dat Hoechst fluorescentie spectraal in het GFP-kanaal bloedt en we geven dus de voorkeur aan de combinatie met mCherry-gelabelde histon als een nucleaire marker voor gelijktijdige meting in twee fluorescerende kanalen. Als alternatief kan nucleaire vervorming eenvoudig worden gevolgd met een label gericht op het binnenste kernmembraan, zoals Lap2b-GFP (figuur 2).
De inkeping op de celkern was in de orde van grootte van 2-3 micron, die we nauwkeurig konden meten door beeldanalyse van diffractie-beperkte draaiende schijf confocale microscopie. Voor het geval van stijvere kernen of kleinere krachten zal de inkeping met deze benadering nauwelijks meetbaar zijn. Het absolute krachtgekalibreerde optische pincet kan echter ook worden gekalibreerd voor positiemetingen van de gevangen kraal in situ met behulp van BFP-interferometrie met nanometernauwkeurigheid51. Met behulp van deze benadering kunnen het spanningssignaal en de optische krachtsensor worden vertaald in de positie van de gevangen sonde door middel van parameter β [nm / V], terwijl de invariante parameter α [pN / V] krachtwaarden oplevert door de bovengenoemde lichtmomentkalibratie41 (zie hieronder voor details).
Probleemoplossing We ontdekten dat de volgende uitdagingen zich tijdens het experiment konden voordoen:
Er wordt geen stabiele val gevormd en de microsfeer ontsnapt gemakkelijk Vuil op het microscoopobjectief of een verkeerd uitgelijnde correctiekraag kan leiden tot het falen van een stabiele val. Als er geen onmiddellijke oplossing wordt gevonden, meet dan de puntspreidingsfunctie van de objectieflens. Als het monster van belang zich diep in een optisch dicht weefsel bevindt, kan de laserfocus ernstige optische aberraties ervaren die leiden tot onstabiele beknelling (dit effect is meestal verwaarloosbaar in geïsoleerde cellen, maar wordt duidelijker in dikkere weefsels). Bij hoge stijfheid kan de herstellende kracht van de kern de ontsnappingskracht van de val overschrijden, zodat de microsfeer verloren gaat en de inkepingsroutine faalt. Aanvankelijk wordt de kernmembraanrand proximaal aan de optische val nauwelijks ingesprongen (figuur S2A). Wanneer dit gebeurt, wordt de vanglaser niet langer beïnvloed door kracht en Brownse beweging, wat leidt tot een krachtdaling tot nul en een afname van de signaalruis (figuur S2B). In het geval dat dit gebeurt, kan het laservermogen worden verhoogd om een sterkere val te hebben, kan de amplitude van het trapeziumvormige traject dat de kraal in de kern duwt worden verminderd, of kan de beginpositie van de gevangen microbead verder van de kern worden ingesteld.
De cel beweegt tijdens de stimulatie Als cellen niet voldoende zijn bevestigd, zal de optische gradiëntval de cellen verplaatsen tijdens het uitvoeren van de intracellulaire inkepingsroutine, zodat de krachten en onderliggende mechanica van de kern artefactueel zijn. Om verplaatsing van de hele cel te voorkomen, raden we aan om de concentratie van celadhesiemoleculen op het oppervlak te verhogen, bijvoorbeeld ConA.
Initiële momentumcompensatie Als er geen initiële momentumcompensatieroutine beschikbaar is in het OT-platform (stap 6.5), moet een kunstmatig, krachtonafhankelijk basislijnsignaal worden gecorrigeerd. Dit is zichtbaar als een helling op de krachtcurve, zelfs zonder kraal gevangen (figuur S1E). Om de correctie uit te voeren, moet hetzelfde traject worden uitgevoerd zonder een kraal, buiten de cel op precies dezelfde positie. Verplaats hiervoor de cel uit de buurt van de val met behulp van de fasebesturing. Ter referentie, de kracht offset verandert 5 pN over de FOV bij 200 mW in ons systeem; zo wordt het verwaarloosbaar voor korte trajecten. Als alternatief kan een piëzo-scanfase worden gebruikt om de cellen op het monster te verplaatsen, waardoor de laserpositie constant blijft.
Kritieke stappen van het gepresenteerde protocol Microsferen moeten worden geïnjecteerd in het juiste, 1-celstadium om een maximale verdeling over het embryo te garanderen. Kralen mogen niet fluorescerend zijn, zodat er geen licht lekt in de fluorescerende kanalen die worden gebruikt voor beeldvorming. Zelfs typische rood-fluorescerende kralen zijn bijvoorbeeld duidelijk zichtbaar in het blauwe kanaal dat wordt gebruikt voor het afbeelden van de celkern na Hoechst-kleuring vanwege hun helderheid (excitatie: 405 nm; emissie: 445 nm). Stabiele bevestiging van de cel aan het substraat is van cruciaal belang om laterale verplaatsing tijdens de inkepingsroutine te voorkomen. Als de cel tijdens de routine beweegt, worden de krachten onderschat. Mocht dit vaak gebeuren, optimaliseer dan het bevestigingsprotocol. Voor weefselkweekcellen leiden andere celadhesie-eiwitten, zoals fibronectine, collageen of poly-L-lysine tot bevredigende hechting (ongepubliceerde waarnemingen). Tijdens de opsluiting worden cellen blootgesteld aan een plotselinge en ernstige mechanische belasting. Dit kan schade aan de cellen veroorzaken en vaak zal de experimentator gebarsten cellen tegenkomen als de procedure niet zorgvuldig wordt uitgevoerd. Ook als de opsluitingshoogte te klein is, zullen alle cellen last hebben van nucleaire envelopbreuk of onomkeerbare schade. Om deze te verminderen, verlaagt u de bovenste coverslip langzamer en/of vergroot u de afstand tussen de coverslip.
Beperkingen van de techniek en suggesties om ze te overwinnen Een duidelijke beperking van de techniek is de penetratie van het laserlicht in diepe delen van het weefsel, wat leidt tot aberraties en onstabiele vallen. Een ondergrens van de penetratiediepte hangt dus af van de helderheid van het monster, de aberratiecorrectie die kan worden toegepast73 en het toegepaste laservermogen. Er moet rekening mee worden gehouden dat een hoger laservermogen leidt tot thermische excitatie van het monster in de buurt van de microsfeer. De verwarming van het monster afkomstig van de 1064 nm golflengtelaserspot wordt echter geminimaliseerd om plausibele hittegerelateerde stress op onze biologische monsters te voorkomen74.
Een andere beperking is de maximale kracht die gemeten kan worden. Hoewel directe lichtmomentdetectie krachtmetingen mogelijk maakt die veel verder gaan dan het lineaire responsregime van de optische val40,41, ligt de maximaal uitgeoefende kracht in de orde van grootte van enkele honderden picoNewtons. Dit wordt beperkt door laservermogen en de gevolgschadedrempel van zacht biologisch materiaal en de brekingsindexverschillen, die normaal gesproken niet groter zijn dan 0,1 of 0,344. Er zijn verschillende methoden voorgesteld om de krachtdetectielimiet te verhogen, bijvoorbeeld met behulp van gestructureerd licht75, antireflectiecoating microsferen76, deeltjes met een hoge brekingsindex77 of sterk gedopeerde quantum dots78.
OT's kunnen worden gebruikt voor positiemetingen op nanometerschaal door middel van BFP-interferometrie, zodat de positie van de kraal in de val Δx = β Sx is, waarbij Sx het spanningssignaal van de sensor is en β [μm / V] on-the-fly kan worden gekalibreerd volgens verschillende protocollen35,54. Voor een optische krachtsensor kan worden aangetoond dat de spanning-naar-kracht invariante conversiefactor α [pN/V] rechtstreeks verband houdt met β en de valstijfheid, k [pN/μm], door middel van α = kβ 37) In experimenten met parelverplaatsingen die te klein zijn om te worden gedetecteerd uit optische beeldvorming, kan deze strategie worden gebruikt om krachtmetingen aan te vullen met detectie van kleine posities. Een voorbeeld is de toepassing van de hier gepresenteerde experimentele routines op zeer stijve kernen, waarvoor krachten met redelijke laservermogens (200-500 mW) niet voldoende zijn om inkepingswaarden te induceren die groot genoeg zijn. In dat geval moet de kraal in contact worden gebracht met de kern en moet de vangstijfheid voorafgaand aan de meting worden gekalibreerd (stap 8.6). De inkeping d van de kern als functie van de kracht kan indirect worden bepaald als:
d = xtrap - F/k
waarbij xtrap de trappositie is. Anders dan de invariante lichtmomentfactor α [pN/V], moet factor β [μm/V] voorafgaand aan elk experiment worden gekalibreerd, omdat deze afhankelijk is van vele lokale variabelen die de vangdynamiek bepalen, zoals de deeltjesgrootte, optische vangpuntgrootte en relatieve brekingsindices.

Weefselmorfogenese is een complex proces waarbij biochemische signalen en fysische krachten spatiotemporaal op elkaar worden afgestemd. In het zich ontwikkelende embryo dicteren gradiënten van biochemische signaleringsfactoren de lotspecificatie en zorgen ze voor een correct weefselpatroon1,2. Tegelijkertijd spelen intrinsieke en extrinsieke krachten een rol bij het bouwen van de architectuur van het embryo3,4. De invloed van de celcortexmechanica in deze context is uitgebreid bestudeerd5,6. De nauwe interconnectie tussen mechano-chemische processen tijdens morfogenese is afhankelijk van de eigenschappen van afzonderlijke cellen om mechanische krachten in hun weefselmicro-omgeving te detecteren en erop te reageren. Cellen decoderen daarbij mechanische signalen via de aanwezigheid van krachtgevoelige subcellulaire en moleculaire elementen die mechanische informatie omzetten in specifieke signaalroutes die het celgedrag, het lot van cellen en celmechanica regelen.
Een kenmerk van ontwikkelingsprocessen is dat cellen zich organiseren als groepen om meercellige structuren te bouwen. Als zodanig herschikken en bewegen afzonderlijke cellen zelden alleen, maar worden ze geassocieerd in een strakke sociotoop waarin ze collectief gedrag vertonen zoals supracellulaire migratie7, (on)jamming overgangen8,9 of blastocystverdichting10. Mechanische krachten die in en tussen cellen worden gegenereerd, dienen als belangrijke aanwijzingen om collectieve celdynamica te instrueren7,11. Maar zelfs wanneer cellen alleen bewegen, zoals voorlopercellen die zich een weg banen tussen weefselbladen of smalle weefselniches, ervaren ze uitgebreide anisotrope mechanische krachten bij het navigeren door een driedimensionale omgeving. Deze mechanische spanningen op cellen hebben ingrijpende gevolgen voor het cellulaire gedrag12,13. Er zijn verschillende mechanismen onderzocht die convergeren op de kern als een belangrijk mechanotransductie-element14,15, als passief of actief mechanisch element tijdens migratie binnen een dichte 3D-weefselomgeving15,16.
We hebben onlangs een mechanisme voorgesteld dat cellen uitrust om vormvervormingen te meten met behulp van de kern als een elastische intracellulaire mechano-gauge12. De kern, het grootste organel in een cel, ondergaat grote vervormingen wanneer cellen polariseren, migreren of hun vorm veranderen onder mechanische rek, opsluiting of osmotische stress16,17,18,19. We ontdekten dat nucleaire enveloppen samen met de intracellulaire positionering van de kern cellen informatie geven over de grootte en het type celvervorming (zoals celcompressie versus celzwelling). Het uitrekken van de kern wordt geassocieerd met een ontplooiing van het binnenste nucleaire membraan (INM), dat calciumafhankelijke cPLA2 (cytosolische fosfolipase A2) lipaseactiviteit bij het INM bevordert, gevolgd door de afgifte van arachidonzuur (AA) en snelle activering van myosine II in de celcortex. Dit leidt tot verhoogde celcontractiliteit en amoeboïde celmigratie boven een drempel van corticale contractiliteit6. De mechanosensieve respons op celvervorming treedt op in minder dan een minuut en is omkeerbaar bij het loslaten van de opsluiting, wat suggereert dat de kern fungeert als een rekstrook voor cellulaire proprioceptie die adaptief celgedrag onder mechanische stressomstandigheden reguleert. Deze mechanosensitieve route blijkt actief te zijn in voorloperstamcellen afgeleid van zebravisembryo's, zowel in pluripotente als afstammingsgebonden cellen12 en wordt geconserveerd in verschillende soorten en cellijnen20.
Naast de nucleaire eigenschappen als celmechanosensor, worden nucleaire architectuur en mechanica intrinsiek gereguleerd tijdens de ontwikkeling en in reactie op celbestemmingsspecificatie21, waardoor cellulaire mechano-gevoeligheid22,23 wordt afgestemd. Het gevolg kan een verandering in nucleaire naleving zijn die morfologische veranderingen en overgangen van een premigratory naar een migrerende staat mogelijk maakt en vice versa8.
Verschillende technieken om celkernmechanica te meten zijn toegepast, zoals atoomkrachtmicroscopie24,25, micropipette-aspiratie26,27, microfluïdische technologie28 en micronaalden29. Veel van deze technieken zijn echter invasief in de zin dat de hele cel moet worden vervormd, waardoor de meting van mechanische kenmerken en krachtafhankelijke reacties van de kern zelf wordt beperkt. Om de gelijktijdige vervorming van het celoppervlak en zijn mechanosensitieve celcortex30 te omzeilen, werden geïsoleerde kernen bestudeerd in verschillende contexten31,32. Het kan echter niet worden uitgesloten dat nucleaire isolatie geassocieerd is met een verandering in mechanische kerneigenschappen en hun regulatie (referentie24 en eigen ongepubliceerde waarnemingen).
Optische pincetten (OT's) zijn een veelzijdige technologie die een overvloed aan experimenten in celmechanobiologie mogelijk heeft gemaakt en een belangrijke rol heeft gespeeld in ons begrip van hoe moleculaire machines chemische energie omzetten in mechanische energie33,34. Een optisch pincet gebruikt een strak gerichte laserstraal om optische krachten uit te oefenen op diëlektrische deeltjes met een brekingsindex die hoger is dan het omringende medium33. Dergelijke krachten kunnen in de orde van grootte van honderden pico-Newtons zijn en resulteren in een effectieve opsluiting van het deeltje binnen de laservalfocus, waardoor manipulatie van het gevangen deeltje in drie dimensies mogelijk is. Het gebruik van licht heeft als belangrijk voordeel dat de meting niet-invasief kan worden uitgevoerd in levende cellen. Optische manipulaties zijn verder beperkt tot de valfocus van de laserstraal. Daarom kan de manipulatie worden uitgevoerd zonder de omliggende celmembranen te stimuleren en verstoort het de actinecortex of mechanosensitieve processen bij het plasmamembraan niet, zoals de krachtafhankelijke activering van ionkanalen.
De moeilijkheid van de optische pincetbenadering is om de krachten die op de microsfeer worden uitgeoefend nauwkeurig te bepalen met behulp van klassieke benaderingen die afhankelijk zijn van indirecte krachtkalibratie op basis van de equipartitiestelling of het gebruik van gedefinieerde Stokes-sleepkrachten om een laservermogensafhankelijke ontsnappingskracht te meten35. Hoewel deze methoden eenvoudig te implementeren zijn in een in vitro experiment, kunnen ze meestal niet worden vertaald naar een cellulaire omgeving. Er zijn verschillende strategieën in het veld geïntroduceerd die afhankelijk zijn van een directe krachtkalibratie, afgeleid van de eerste principes van momentumbehoud36,37. In tegenstelling tot andere krachtspectroscopiebenaderingen worden krachtmetingen afgeleid uit een lokale uitwisseling van lichtmoment met het willekeurig gevormde gevangen deeltje38,39. In onze experimentele opstelling worden veranderingen in lichtmoment als gevolg van optische krachten direct gemeten zonder dat in situ valkalibratie40,41,42,43 nodig is. Zo worden de metingen mogelijk in een viskeuze omgeving zoals het binnenste van de cel of zelfs in een weefsel, en kunnen krachten gemakkelijk worden gekwantificeerd tot op pN-niveau.
In dit protocol beschrijven we een test om intracellulaire organellen of structuren mechanisch te manipuleren en hun mechanische eigenschappen kwantitatief te beoordelen door middel van een optische pincetopstelling. Deze opstelling is geïntegreerd in een fluorescerende microscoop met draaiende schijf die parallelle beeldvorming van cellulair gedrag of intracellulaire dynamica mogelijk maakt. De test maakt de karakterisering van de mechanische eigenschappen van specifieke cellulaire compartimenten, zoals de kern, mogelijk, terwijl tegelijkertijd de mogelijke mechanorespons en activering van moleculaire signaalroutes als gevolg van de vervorming zelf worden bestudeerd. Bovendien zorgt optische vangst van geïnjecteerde microbeads in cellen voor een toename van de inkepingskracht dankzij een aanzienlijk hogere brekingsindex van de polystyreenkraal (n = 1,59) in vergelijking met het intrinsieke brekingscontrast44 van de kern (n ~ 1,35) versus cytoplasma (n ~ 1,38). De gepresenteerde strategie kan gemakkelijk worden aangepast aan de studie van andere intracellulaire structuren en organellen, evenals andere benaderingen met actieve microrheologie, het gebruik van meerdere optische vallen om dezelfde / verschillende subcellulaire structuren tegelijkertijd te onderzoeken, en metingen gericht op celmechanobiologie in het levende embryo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 22 mm cover glasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5 22x60 mm Coverglasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5H glass bottom dishes</td>
			<td>Willco</td>
			<td>GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-um beads</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>72986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mm glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020 GC100F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um polystyrene microbeads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um red-fluorescent beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqcuisition cameras sCMOS</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Sona-4BV11-UNI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary camera (Figure 3, AUX)</td>
			<td>Blackfly, FLIR</td>
			<td>BFS-U3-200S6M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbryte 520</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>520 AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double scotch tape</td>
			<td>Biesse Adesivi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPI-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2A-mCh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Fusion-Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>Type B: 16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR protection googles</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lap2b-eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro loader pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>GELoader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroManager 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromiter slide</td>
			<td>ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tweezers platform</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td>Sensocell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OTs software (LightAce)</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing agent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post processing software (Matlab)</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-950/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>Spincoat G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DragonFly 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangular microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UNB 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers

Tijdens de ontwikkeling van een meercellig organisme deelt een enkele bevruchte cel zich en geeft aanleiding tot meerdere weefsels met verschillende functies. Weefselmorfogenese gaat hand in hand met moleculaire en structurele veranderingen op het niveau van één cel die resulteren in variaties van subcellulaire mechanische eigenschappen. Als gevolg hiervan, zelfs binnen dezelfde cel, verzetten verschillende organellen en compartimenten zich anders tegen mechanische spanningen; en mechanotransductiepaden kunnen hun mechanische eigenschappen actief reguleren. Het vermogen van een cel om zich aan te passen aan de micro-omgeving van de weefselniche is dus deels te wijten aan het vermogen om mechanische spanningen te detecteren en erop te reageren. We hebben onlangs een nieuw mechanosensatieparadigma voorgesteld waarin nucleaire vervorming en positionering een cel in staat stelt om de fysieke 3D-omgeving te meten en de cel een gevoel van proprioceptie geeft om veranderingen in celvorm te decoderen. In dit artikel beschrijven we een nieuwe methode om de krachten en materiaaleigenschappen te meten die de celkern in levende cellen vormen, geïllustreerd op aanhangende cellen en mechanisch opgesloten cellen. De metingen kunnen niet-invasief worden uitgevoerd met optische vallen in cellen en de krachten zijn direct toegankelijk door kalibratievrije detectie van lichtmoment. Dit maakt het mogelijk om de mechanica van de kern onafhankelijk van celoppervlakvervormingen te meten en dissectie van exteroceptieve en interoceptieve mechanotransductieroutes mogelijk te maken. Belangrijk is dat het vangexperiment kan worden gecombineerd met optische microscopie om de cellulaire respons en subcellulaire dynamiek te onderzoeken met behulp van fluorescentiebeeldvorming van het cytoskelet, calciumionen of nucleaire morfologie. De gepresenteerde methode is eenvoudig toe te passen, compatibel met commerciële oplossingen voor krachtmetingen en kan gemakkelijk worden uitgebreid om de mechanica van andere subcellulaire compartimenten te onderzoeken, bijvoorbeeld mitochondriën, stressvezels en endosomen.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers at JoVE.com

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Dit protocol ontleedt de individuele mechanische eigenschappen van de celkern die het een mechanische graadmeter maken voor celpolarisatie, differentiatie en migratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mechanische eigenschappen kan meten en krachten kan uitoefenen op subcellulaire compartimenten zonder externe verstoring van het membraan of corticale cytoskelet. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast om kralen in andere cellen van andere organismen te manipuleren om nucleaire mechanica in verschillende cellijnen of diermodellen te bestuderen.Uitlijning van de directe krachtsensor is van cruciaal belang om al het licht op te vangen dat de optische vallen creëert en verlaat. Dit zorgt voor nauwkeurige lichtmomentmetingen in visco-elastisch medium van een cel. Begin de eencellige bereiding door de embryo's van het bolstadium vier uur na de bevruchting in een glazen schaal met E3-media te plaatsen met behulp van een plastic Pasteur-pipet.Selecteer vervolgens de embryo's die positief zijn voor de kralen en breng het fluorescerende eiwit tot expressie in geval van mRNA-injectie. Gebruik een tang om de embryo's handmatig te decurioneren en breng ongeveer 10 tot 15 gedenudeerde embryo's over naar een reactiecontainer van 1,5 milliliter met behulp van een glazen Pasteur-pipet. Verwijder de E3-media uit de buis en voeg 500 microliter voorverwarmd kooldioxide-onafhankelijk weefselkweekmedium toe.Schud de buis voorzichtig om bubbelvorming te voorkomen en zorg ervoor dat de inhoud van de buis troebel wordt als de cellen dissociëren zonder grote brokken zichtbaar voor het oog. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende drie minuten op 200 maal G. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en verzamel de pellet om door te gaan met celkleuring.Om de kern te labelen, resuspendeert u de cellen door 500 microliter van de vers bereide DNA Hoechst kleurstofkleuringsoplossing aan de buis toe te voegen. Incubeer de bevlekte cellen gedurende zeven minuten in het donker. Centrifugeer vervolgens de cellen zoals eerder beschreven en resuspend de pellet in 50 microliter DMEM voor monsters in suspensie of 20 microliter DMEM voor cellen in opsluiting.Voor de voorbereiding van de optische attributen of OT-kamer voor de experimenten met de cellen in suspensie, snijd een stuk dubbelzijdige scotch tape met een ongeveer 10 millimeter bij 10 millimeter vierkant gat in het midden. Verwijder een van de beschermende lagen van de tape en plaats de onbedekte kant van de tape in het midden van een glazen bodemschaal van nummer 1,5 H. Druk de tape voorzichtig aan om het hele oppervlak van de tape aan het glas te laten hechten, terwijl luchtbellen worden vermeden en de resterende beschermende laag van de tape wordt afgepeld.Incubeer het oppervlak met 100 microliter Concanavalin A bij 0,5 milligram per milliliter gedurende 30 minuten. Verwijder vervolgens de druppel Concanavalin A en spoel het oppervlak af met DMEM. Voeg 30 microliter van de oplossing die de cellen bevat toe aan het holteoppervlak.Sluit vervolgens de kamer heel voorzichtig af met een afdekglas van 22 bij 22 millimeter. Gebruik indien nodig een scalpel of tang. Ga vervolgens verder met het opstarten van een optisch pincet door de laser gedurende ten minste 30 minuten vóór het experiment op een aanzienlijk hoog vermogen in te schakelen om de stabiliteit van het uitgangsvermogen te optimaliseren.Als u klaar bent, schakelt u de elektronicamodule van de optische micromanipulatie- en krachtmeeteenheden in. Voordat u de optische krachtsensor uitlijnt, plaatst u een druppel water op het 60X 1.2 waterdompelingsobjectief en plaatst u de kamer met de cellen op het podium. Focus op het onderste oppervlak van de kamer waar de celmonsters worden geplaatst.Na het toevoegen van een druppel dompelolie bovenop de afdekglasplaat die het monster bedekt, laat u de opvanglens van de krachtsensoreenheid zakken totdat deze in contact komt met de oliedruppel. Volg de standaardprocedure voor de uitlijning van de optische krachtsensor naar het voorbeeldvlakbeeld op de hulpcamera die moet worden gebruikt om de OT's te positioneren en laat vervolgens de optische krachtsensor zakken totdat de veldstop geconjugeerd op het monstervlak verschijnt. Om te controleren op luchtbellen met de Bertrand-lens, observeert u het beeldpad door de hulpcamera.Als er vuil of luchtbellen zichtbaar zijn, reinigt u de lens en kamer met stofvrij lensweefsel voordat u de procedure herhaalt zoals beschreven, en voeg meer dompelolie toe. Met behulp van de laterale schroeven die op de houder van de optische krachtsensor zijn geplaatst, centreert u de veldstop in het gezichtsveld. Voor de nauwkeurigheid opent u de veldstop bijna om het gezichtsveld te bezetten dat zichtbaar is op de hulpcamera.Nadat u het monster in de microscoop hebt geplaatst en de optische krachtsensor hebt uitgelijnd, gebruikt u de roterende halvegolfplaat om het initiële valvermogen in te stellen op 200 milliwatt als de stijfheid van de kern of de onderzochte intercellulaire structuur niet bekend is. Als u klaar bent, gebruikt u de microscoopfase-softwarecontroller om te zoeken naar een cel met een of twee kralen via verzonden Brightfield-microscopie. Schrijf in het numerieke blad de verplaatsing en de tijd van elke volgende trajectstap.U kunt ook tabel S1 uit het aanvullende materiaal laden. Voor een stress/ontspanningsexperiment programmeer je de trapeziumbelastingen die moeten worden toegepast. Activeer in de OT-software de optische vallen.Voor het vangen van een microsfeer plaatst u de beeldvlakken iets boven de kraal met een microscooptrapsoftwarecontroller. Klik op de polystyreen microbead in het gekalibreerde beeldvenster van de hulpcamera. Succesvolle opsluiting van de kraal door de optische val zal de beweging van de kraal sterk verminderen.Klik en sleep de kraal over het cytoplasma en plaats deze op een afstand van ongeveer twee micron van de nucleaire envelop. Zorg ervoor dat het traject zo is ingesteld dat de inkeping van de kraal loodrecht op het kernmembraan staat. Wanneer de installatie klaar is, gaat u naar de beeldvormingssoftware en klikt u op de acquisitieknop om de beeldacquisitie te starten.Open het real-time force reading-venster, klik op gegevens en sla op in het real-time force reading-venster om op te slaan. Start trappositie en kracht meetgegevens. Start het eerder geladen traject door met de rechtermuisknop op de kraal te klikken en starttraject te selecteren.Wacht tot het traject is voltooid en het systeem stabiliseert voordat u de registratie van de meetgegevens van de valkracht voltooit. Stop de beeldacquisitie en plot de resultaten in de nabewerkingssoftware. In de representatieve analyse wordt een geïsoleerde zebravisvoorloperstamcel weergegeven met een enkele microsfeer dicht bij de kern.De verdeling van de polystyreenmicrosfeer vijf uur na injectie in een embryo werd gecontroleerd. Brightfield- en fluorescentiebeeld toont de kralen zijn verspreid over het embryoweefsel. Maximale projectie van de confocale fluorescerende Z-stack en een maximale projectie van een sub-stack in hetzelfde gebied bevestigt dat een groot deel van de diepe cellen één tot twee kralen bevatte.24 uur na de bevruchting werden de kralen verdeeld over het hele lichaam van het embryo. De Brightfield-microfoto's van de suspensiecellen op de opgesloten cellen met een of twee geïnjecteerde kralen werden verkregen. Bovendien vergemakkelijkten meerdere fluorescerende labels het onderzoek van verschillende aspecten van de cellen, zoals internucleair membraan, plasmamembraan, DNA en transgene lijn.Representatieve snapshots beschreven Hoechst-gelabelde kernen vijf seconden voor/tijdens en vijf seconden na inspringing met een optisch gevangen microsfeer. Intensiteitsprofielen langs het inkepingssegment voor drie verschillende frames en trajecten van de distale en proximale grenzen van de kern tijdens een inspringingsexperiment van gesuspendeerde en opgesloten cellen werden bestudeerd. Gevangen traject en kracht ervaren door de optisch gevangen microsfeer tijdens een herhaald nucleair inkepingsexperiment werden gemeten.Kernmechanica in de cellen in suspensie en onder opsluiting bevestigde dat de opsluiting resulteerde in een uitbreiding van het geprojecteerde gebied en een onbeduidende verandering in nucleaire stijfheid. Als kralen worden geïnjecteerd in het embryo van het eencellige stadium, zullen ze zich hoogstwaarschijnlijk gelijkmatig verdelen in de latere stadia. Vergeet niet dat de kraal stabiel moet worden gevangen.Als de kraal aan de optische val ontsnapt, herdefinieert u het traject of verhoogt u het laservermogen. Deze experimenten kunnen gemakkelijk worden uitgevoerd op meerdere microbeads in één cel en worden uitgebreid tot actieve microrheology-metingen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Subcutane Neurotrofine 4 Infusie Met Osmotische Pompen Of Directe Spierinjectie Verbetert Veroudering Rat Larynx Spieren

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Indringende cel mechanica met kraal-vrije optisch pincet in de Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Directe bloedlijn herprogrammering van volwassen muis Fibroblast te Erythroid voorlopercellen

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...