Name: direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00
Duration: 9 min 56 s
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MKは、計画ナシオナル(PGC2018-097882-A-I00)、FEDER(EQC2018-005048-P)、セベロ・オチョア・オブ・エクセレンス・オブ・R&D(CEX2019-000910-S)を通じて、スペイン経済競争力省からの財政支援を認めます。RYC-2016-21062)、フンダシオ・プリヴァダ・セレックス、フンダシオ・ミル・プイグ、ジェネラリタット・デ・カタルーニャからCERCAと研究プログラム(2017 SGR 1012)、ERC(メカノシステムズ)とHFSP(CDA0023/2018)を通じた資金調達に加えて。V.R.は、スペイン科学イノベーション省からEMBLパートナーシップ、セントロ・デ・エクセチェンシア・セベロ・オチョア、ミネコのプラン・ナシオナル(BFU2017-86296-P、PID2020-117011GB-I00)、ジェネラリタット・デ・カタルーニャ(CERCA)への支援を認めています。V.V.は、665884マリー・スクウォドフスカ・キュリー交付契約に基づく欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムが資金を提供するICFOstepstone PhDプログラムからの支援を認めています。原稿を批判的に読んでくださったアルナウ・ファレに感謝します。マリア・マルサルは、24 hpf胚のイメージングと取り付けの助けと;ゼンダ・ヒメネス=デルガド、ゼブラフィッシュ・ミクロンジェクションのサポート

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルでは、生細胞内の細胞核の機械的特性を問い合う独自の方法を説明する。他の力分光法とは異なり、非侵襲的な光学トラップは、細胞膜および細胞骨格の寄与を細胞核硬直から切り離すことを可能にした。重要なことに、光学顕微鏡操作はマルチモーダル顕微鏡と互換性があり、実験者は細胞核メカノバイオロジーに関与する異なるプロセスを研究することができます。代表的な結果として、数百個のピコニュートンの程度の力によって行われたインデント時の核変形を測定するためにDNA-Hoechst染色を使用した。
このプロトコルで概説されている例を超えた、当社のメソッドの潜在的な用途 外部の摂動なしに生体細胞内の測定から定量的な機械的情報を抽出する可能性は、探求され始めたばかりの前例のない機会の多くを可能にします。したがって、当社の光学マイクロマニピュレーションプラットフォームの提示プロトコルは、非常に多用途性を備えたより複雑な実験に拡張することができます。アクロスオプティカルディフレクター(AOD)は、異なるセルの位置をまたがって同期力を測定するための複数の光トラップを生成でき、また広い周波数範囲51,61の活動的なマイクロロジーにも使用できます。前述のように、インデント時の力の応答は最大の捕捉力を克服し、光トラップからのビードの脱出につながる。この場合、光力をクランプするために、フォースフィードバックをAODで構成することができる。全体として、このプロトコルで説明されている応力緩和のような複数のミクロレオロジーアプローチだけでなく、アクティブなマイクロレオロジーまたはクリープコンプライアンスも、このプラットフォームで実験的に取得し、新しいソフトウェアパッケージ61,62,63,64,65で徹底的に分析することができます。.さらに、力の適用は核に限定されるものではなく、原発性血管内で流れる赤血球を捕捉したり、葉芽細胞やミトコンドリア68を捕捉して変形させたりするために示されているように、多様な細胞内構造や複雑な組織を測定するために原則的に行うことができる。.光運動量キャリブレーションは、閉じ込められた物体の形状とサイズに依存しないため、任意の形状38,39を有する任意の力プローブで直接力測定を可能にします。注入された微小球を用いることが、細胞構造の直接操作と比較して比較的低いレーザーパワーを有する核に高い力を加えることを可能にした69,70,71。しかし、十分に高い屈折率差を考えると、外部に適用される力プローブは必要なく、細胞内小器官はビーズを注入することなく直接操作することができます(未発表の観察と参照70)。
アプリケーションを拡張するためのメソッドの潜在的な変更 マイクロビーズの異なるサイズは、実験に応じて注入することができますが、相対的な制御を行う必要があります。例えば、後の段階で細胞を研究するには、より小さいビーズを注入することができる。これにより、光トラップ(参考55に示すなど)によって発揮できる最大の力が減少します。より大きなビーズは、より高い力を発揮するために注入することができますが、これらは、そのサイズや関心の段階に応じて胚の発達に影響を与える可能性があります。マイクロビーズ注入が選択肢ではない実験では、屈折率の違いを示す様々なオルガネラは、細胞質と比較して依然として光学的に操作することができ、光運動量変化から測定可能な光学力を生じさせる42。上述したように、これらの方法は、ショウジョウバエ胚70における細胞細胞接合部を変形させるためにバンバルデカールらによって採用されている。同様に、細胞の核は周囲の媒体44よりも屈折率が低く、捕捉強度が低いにもかかわらずビーズを含まないインデント(未発表の観測と参照72)を可能にする。したがって、核は簡単に閉じ込めることができず、トラップをエスケープします。
スピンコーティングされたPDMSスペーサは便利で速い方法 で 製造されますが、マイクロ/ナノファシリテーション施設やエンジニアリングラボにアクセスできないラボでは手の届かないところにある可能性があります。これにより、スペーサは、ラボテープまたはパラフィルムから容易に組み立てることができる(ステップ4)。このプロトコルは、事前定義された測定井戸への単一細胞の送達を自動化するマイクロ流体チャネルを製造したり、同じ標本内の閉じ込め効果を推定するために定義された高さのチャンバーに入ることによっても適応することができる。しかし、このようなマイクロ流体デバイスは、顕微鏡目的と光学力センサの集水レンズとの間の空間に合わせて、2mm程度(ステップ3参照)を設計しなければならない。光力センサは、焦点がずれる光収差がフォトン運動量測定に影響を与えないように、適切な高さに配置する必要があります。
その他の変更には、生物学的記者の変更が含まれる可能性があります。Hoechst蛍光スペクトルがGFPチャンネルにスペクトル的に出血することを発見し、2つの蛍光チャネルで同時測定のための核マーカーとしてmCherryタグ付きヒストンとの組み合わせを好むことがわかりました。あるいは、核変形は、Lap2b-GFPのような内部核膜を対象とする標識で容易に追跡することができる(図2)。
細胞核へのインデントは2~3ミクロンのオーダーで、回折限定回転円盤共焦点顕微鏡の画像解析により正確に測定することができました。硬い核またはより小さな力の場合、インデントは、このアプローチを使用してほとんど測定可能です。しかし、絶対力較正された光ピンセットは、ナノメートル精度のBFP干渉法を用いて 、その場で 閉じ込められたビーズの位置測定のために較正することもできる51。このアプローチを使用すると、電圧信号と光力センサはパラメータ β[ nm/V]を介してトラップされたプローブの位置に変換することができ、インバリアントパラメータα [pN/V]は前述の光運動量キャリブレーション41 (詳細については下記参照)を通じて力の値を得ることができます。
トラブルシューティング 実験中に次の課題が発生することがわかりました。
安定したトラップが形成されず、微小球が容易に脱出する 顕微鏡の目的または不整列の修正首輪の汚れは安定したトラップの失敗につながる可能性がある。直ちに解決策が見つからない場合は、対物レンズの点広がり関数を測定します。目的の標本が光学的に密な組織の奥深くにある場合、レーザーフォーカスは不安定なトラッピングにつながる重度の光学収差を経験する可能性があります(この効果は通常、単離された細胞ではごくわずかですが、より厚い組織でより明らかになります)。高剛性の場合、核の復元力はトラップのエスケープフォースを超える可能性があり、微小球が失われ、インデントルーチンが失敗します。当初、光学トラップに近い核膜縁がほとんどインデントされなくなる(図S2A)。この現象が発生すると、トラッピングレーザーは力やブラウン運動の影響を受けなくなり、力がゼロに低下し、信号ノイズが減少します(図S2B)。これが起こる場合には、レーザーパワーはより強いトラップを有するように増加させることができる、ビーズを核に押し込む台形軌道の振幅を減少させることができる、または閉じ込められたマイクロビーズの初期位置をさらに核から離して設定することができる。
細胞は刺激の間に動いている 細胞が十分に結合していない場合、光学勾配トラップは細胞内の細胞を移動させ、核の力および基礎的な力学が実際的であるような細胞内のインデントルーチンを行う。細胞全体の変位を防ぐために、表面上の細胞接着分子の濃度を高める、例えば、ConA。
初期運動量補償 最初の運動量補正ルーチンがATプラットフォーム(ステップ6.5)で利用できない場合、人工的で力に依存しないベースライン信号を修正する必要があります。これは、ビーズが閉じ込められていなくても力曲線上の傾斜として見える(図S1E)。補正を行うには、まったく同じ位置で細胞の外側にビーズなしで同じ軌道を実行する必要があります。このためには、ステージ コントロールを使用して、トラップからセルを離します。参考として、フォースオフセットは、システム内の200 mWでFOV全体で5pNを変更します。したがって、短い軌道では無視できる。あるいは、ピエゾスキャンステージを使用して、レーザー位置を一定に残して、サンプル上の細胞を移動させることができます。
提示されたプロトコルの重要なステップ 微小球は、胚の上に最大の分布を確保するために、右の1細胞段階で注入する必要があります。ビーズは、イメージングに使用される蛍光チャネルに光が漏れないように蛍光であってはなりません。例えば、典型的な赤蛍光ビーズでさえ、その明るさによるHoechst染色後の細胞核のイメージングに使用される青色チャネルではっきりと見える(励起:405 nm;放出:445nm)。細胞を基板に安定的に取り付け、インデントルーチン中の横変位を防ぐために重要です。ルーチン中にセルが移動すると、力は過小評価されます。このようなことが頻繁に発生する場合は、接続プロトコルを最適化します。組織培養細胞の場合、フィブロネクチン、コラーゲン、ポリL-リジンなどの他の細胞接着タンパク質は、満足のいく付着(未発表の観察)につながります。閉じ込めの間、細胞は突然、激しい機械的ストレスを受ける。これは細胞に損傷を与える可能性があり、手順が慎重に行われない場合、実験者は頻繁に破裂した細胞に遭遇します。また、閉じ込めの高さが小さすぎると、すべての細胞が核の包絡破壊または不可逆的な損傷に苦しむことになります。これらを軽減するには、上部カバースリップをよりゆっくりと下げるか、カバースリップ間の間隔を大きくします。
テクニックの限界とそれらを克服するための提案 技術の明確な制限は、組織の深いセクションにレーザー光の浸透であり、収差および不安定なトラッピングにつながる。したがって、浸透深さの下限は、試料の透明度、採用することができる収差補正73 および適用されたレーザーパワーに依存する。レーザーパワーが高いほど、微小球付近の試料の熱励起につながることを考慮する必要があります。しかし、1064 nm波長レーザースポットによって発生したサンプルの加熱は、当社の生物学的サンプルに対する妥当な熱関連応力を避けるために最小限に抑えられます74。
もう一つの制限は、測定できる最大力です。直接光運動量検出は、光トラップ40,41の線形応答のレジームをはるかに超える力の測定を可能にするが、最大適用力は数百ピコニュートンの順序である。これは、レーザーパワーと軟質生物学的材料の結果的損傷閾値と屈折率の違いによって制限され、通常は0.1または0.344以下です。力検出限界を大きくする方法がいくつか提案されているが、例えば、構造化されたlight75、反射防止被覆微小球76、高屈折率particle77または高度にドープされた量子ドット78を用いる。
OTは、トラップ内のビードの位置がΔx = β Sx、Sxがセンサの電圧信号である、およびβ[μm/V]が異なるプロトコルに従ってオンザフライで較正されるように、BFP干渉測定を通じてナノメートルスケールの位置測定に使用できます35,54。光力センサの場合、電圧対力不変性変換係数α[pN/V]がβとトラップの剛性k[pN/μm]に直接関係していることが証明され、α= kβ 37)を通じて、光イメージングから検出するには小さすぎるビーズ変位の実験では、この戦略を使用して小さな位置検出で測定を補完することができます。例えば、ここで提示される実験ルーチンを非常に硬い核に適用し、合理的なレーザーパワー(200〜500 mW)の力は十分に大きなインデント値を誘導するのに十分ではない。その場合、ビードは核に接触する必要があり、トラッピング剛性は測定前に較正されなければならない(ステップ8.6)。力の関数としての核のインデントdは間接的に次のように決定することができる:
d = xtrap - F/k
ここで、xtrap はトラップ位置です。[pN/V]α不変光運動率係数とは異なり、各実験の前に因子β[μm/V]は、粒子サイズ、光トラップサイズ、相対屈折率指数などのトラップダイナミクスを決定する多くの局所変数に依存するため、各実験の前に較正する必要があります。

組織形態形成は、生化学的シグナルと物理的な力が時間的に調整される複雑なプロセスです。現像胚では、生化学的シグナル伝達因子の勾配が運命の指定を決定し、正しい組織パターニングを確実に行う1,2。同時に、内因性および外因性の力は、胚のアーキテクチャを構築する役割を果たす3,4。この文脈における細胞皮質力学の影響は、広範囲に研究されてきた5,6。形態形成中のメカノ化学プロセス間の緊密な相互接続は、単一細胞の特性に依存して、組織微小環境における機械的な力を感知し、応答する。細胞は、それによって、細胞挙動、細胞運命、および細胞力学を制御する特定のシグナル伝達経路に機械的情報を伝達する力感受性細胞および分子要素の存在を介して機械的信号を解読する。
発達過程の特徴は、細胞がグループとして組織され、多細胞構造を構築することです。したがって、単一の細胞はめったに再配置して単独で動かないが、彼らは上細胞移行7、(un)妨害遷移8,9または胚盤胞圧縮10のような集団行動を示すタイトな社会トープに関連している。細胞内および細胞間で生成された機械的な力は、集合的な細胞ダイナミクス7,11を指示するための重要な手掛かりとして機能します。しかし、組織シートや狭い組織ニッチの間を圧迫する前駆細胞など、細胞が単独で移動しても、3次元環境をナビゲートする際に広範な異方性機械的力が発生します。細胞上のこれらの機械的なストレスは、細胞の挙動に深い影響を及ぼす12,13。高密度3D組織環境15,16内の移動中に受動的または活動的な機械的要素として、主要なメカノ転写素子14,15として核上に収束するいくつかのメカニズムが検討されている。
我々は最近、弾性細胞内メカノゲージ12として核を用いて形状変形を測定するために細胞を装備するメカニズムを提案した。細胞内で最大の小器官である核は、細胞が機械的なストレッチ、閉じ込め、または浸透応力16,17,18,19の下で細胞の形状を偏光、移動、または変化させると大きな変形を起こします。核エンベロープは、核の細胞内位置と共に、細胞の大きさと細胞の変形の種類(細胞圧縮と細胞の腫脹など)に関する情報を細胞に提供することを発見した。核の伸張は、内核膜(INM)の展開に関連しており、INMでのカルシウム依存性cPLA2(細胞質ホスホリパーゼA2)リパーゼ活性を促進し、続いてアラキドン酸(AA)の放出と細胞皮質でのミオシンIIの急速な活性化を促進する。これは、皮質収縮性6の閾値を超える細胞収縮性およびアメーブイド細胞の移動を増加させる。細胞の変形に対するメカノイア応答は1分未満で起こり、閉じ込め解放時に可逆的であり、核が機械的ストレス条件下での適応細胞挙動を調節する細胞のプロプリオセプションの歪みゲージとして機能することを示唆している。このメカノイアセンブル経路は、ゼブラフィッシュ胚由来の前駆幹細胞において活性であることが示されており、多能性および系統性細胞12の両方において、異なる種および細胞株20において保存されている。
核特性は、細胞メカノセンサとして加え、核アーキテクチャと力学は、開発中および細胞運命仕様21に応答して本質的に調節され、細胞メカノ感受性22,23を調整する。その結果、形態学的な変化と移行前から回遊状態への移行、およびその逆8を可能にする核適合の変化が起こるかもしれません。
原子間力顕微鏡24,25、マイクロピペット吸引26,27、マイクロ流体技術28、マイクロニードル29など、細胞核力学を測定するためのいくつかの技術が応用されている。しかし、これらの技術の多くは、細胞全体が変形しなければならないという意味で侵襲的であり、核自体の機械的特性および力依存応答の測定を制限する。細胞表面とそのメカノセンシティブ細胞の同時変形を回避するため、分離核は様々な文脈31,32で研究された。しかし、核の単離は、機械的核特性の変化とその調節(reference24および独自の未発表の観測)に関連していることは否定できない。
光ピンセット(T)は、細胞メカノバイオロジーにおける多くの実験を可能にし、分子機械が化学薬品を機械エネルギーに変換する方法についての理解に役立つ多目的技術です33,34。光ピンセットは、しっかりと集結したレーザービームを使用して、周囲の媒体33よりも屈折率が高い誘電体粒子に光学力を加えます。このような力は、ピコニュートンの数百の順序であり、レーザートラップフォーカス内の粒子の効果的な閉じ込めをもたらし、3次元で閉じ込められた粒子の操作を可能にする。光の使用は、測定が生細胞の内部で非侵襲的に行うことができるという点で重要な利点を有する。光学操作は、さらにレーザー光のトラップフォーカスに限定される。したがって、この操作は周囲の細胞膜を刺激することなく行われ、イオンチャネルの力依存的活性化などの形質膜におけるアクチン皮質またはメカノイ感受性プロセスを摂動させない。
光トゥイザーアプローチの難しさは、等分割定理に基づく間接力較正に依存する古典的なアプローチを用いて、マイクロスフィアに適用される力を正確に決定すること、またはレーザーパワー依存的な脱出力を測定するために定義されたストークス・ドラッグ力の使用である35。これらの方法はインビトロ実験で簡単に実装できますが、通常は細胞環境に翻訳することはできません。運動量の保全の第一原理から導出された直接力の口径測定に依存する分野にはいくつかの戦略が導入された36,37。他の力分光法とは異なり、力の測定は任意の形の閉じ込められた粒子38,39と光運動量の局所的な交換から推測される。我々の実験セットアップでは、光力から生じる光運動量の変化は、インシチュトラップキャリブレーション40、41、42、43で必要なく直接測定されます。これにより、細胞内部や組織内などの粘性環境下での測定が可能となり、かつ、pNレベルまで容易に力を定量することができる。
本プロトコルでは、細胞内小器官や構造を機械的に操作するアッセイを記述し、光ツイーザーのセットアップによってそれらの機械的特性を定量的に評価する。このセットアップは、細胞行動または細胞内ダイナミクスの並列イメージングを可能にする回転ディスク蛍光顕微鏡に統合されています。このアッセイは、核などの特定の細胞区画の機械的特性の特性を特徴付け、同時に変形自体の結果として可能なメカノ応答と分子シグナル伝達経路の活性化を研究することを可能にする。さらに、細胞内に注入されたマイクロビーズの光学トラップは、核(n~1.35)対細胞質(n~1.38)の固有屈折コントラスト44 と比較して、ポリスチレンビーズの屈折率がかなり高いおかげで、インデント力の増加を可能にする。提示された戦略は、他の細胞内構造やオルガネラの研究、およびアクティブなマイクロ理ロジー、同じ/異なる細胞下構造を同時に探査するための複数の光学トラップの使用、および生きた胚における細胞メカノバイオロジーを標的とする測定に容易に適応することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 22 mm cover glasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5 22x60 mm Coverglasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5H glass bottom dishes</td>
			<td>Willco</td>
			<td>GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-um beads</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>72986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mm glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020 GC100F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um polystyrene microbeads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um red-fluorescent beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqcuisition cameras sCMOS</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Sona-4BV11-UNI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary camera (Figure 3, AUX)</td>
			<td>Blackfly, FLIR</td>
			<td>BFS-U3-200S6M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbryte 520</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>520 AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double scotch tape</td>
			<td>Biesse Adesivi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPI-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2A-mCh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Fusion-Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>Type B: 16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR protection googles</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lap2b-eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro loader pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>GELoader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroManager 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromiter slide</td>
			<td>ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tweezers platform</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td>Sensocell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OTs software (LightAce)</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing agent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post processing software (Matlab)</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-950/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>Spincoat G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DragonFly 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangular microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UNB 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers

多細胞生物の開発中に、単一の受精細胞が分裂し、多様な機能を持つ複数の組織を生み出します。組織形態形成は、細胞内の機械的特性の変動をもたらす単一細胞レベルでの分子および構造変化と手をつないで行く。結果として、同じ細胞内であっても、異なるオルガネラとコンパートメントは機械的応力に対して異なる抵抗をします。メカノトランスダクション経路は、その機械的特性を積極的に調節することができます。このように組織ニッチの微小環境に適応する細胞の能力は、機械的ストレスを感知し、それに応答する能力の一部である。我々は最近、核の変形と位置決めが細胞が物理的な3D環境を測定し、細胞形状の変化を解読するプロプリオセプションの感覚を細胞に与えることを可能にする新しいメカノセンセーションパラダイムを提案した。この記事では、接着細胞や機械的に閉じ込められた細胞に例示した、生体細胞内の細胞核を形成する力と材料特性を測定する新しい方法について述べた。測定は細胞内の光学トラップで非侵襲的に行われ、力は光の勢いをキャリブレーションフリーで検出することで直接アクセスできます。これにより、細胞表面の変形とは無関係に核の力学を測定し、外発性および知覚的メカノ伝達経路の解剖を可能にする。重要なことに、トラッピング実験は、細胞骨格、カルシウムイオン、または核形態の蛍光イメージングを用いて細胞応答および細胞下ダイナミクスを調べる光学顕微鏡と組み合わせることができる。提示された方法は適用が簡単で、力の測定のための商業的解決と互換性があり、他の細胞下のコンパートメント、例えばミトコンドリア、ストレスファイバー、およびendosomesの力学を調査するために容易に拡張することができる。

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Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

ここでは、光学トラップによる直接力測定を用いて、3次元閉じ込めで単離した胚ゼブラフィッシュ細胞の細胞内の機械的特性を調べるプロトコルを提示する。

光ピンセットを用いた閉じ込めにおける細胞下力学の直接力測定

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

このプロトコルは、細胞核の個々の機械的特性を解剖し、細胞の偏光、分化、および移動のための機械的ゲージにします。この技術の主な利点は、機械的特性を測定し、膜または皮質細胞骨格の外部摂動なしに細胞下コンパートメントに力を加えることができるということです。このプロトコルは、異なる細胞株や動物モデルの核力学を研究するために、他の生物の他の細胞内のビーズを操作するために容易に適応することができる。直接力センサーの位置合わせは、光トラップを作成し、残すすべての光をキャプチャするために重要です。これは、細胞の粘弾性媒体で正確な光運動量測定を保証します。プラスチック製のパスツールピペットを使用してE3培地を含むガラス皿に球ステージ胚を受精後4時間置くことによって、単細胞調製を開始する。次に、ビーズに陽性である胚を選択し、mRNA注射の場合には蛍光タンパク質を発現する。鉗子を使用して手動で胚を減色させ、ガラス製のパスツールピペットの助けを借りて約10〜15個のデクリオン化胚を1.5ミリリットルの反応容器に移します。チューブからE3培地を取り出し、500マイクロリットルの事前温め付き二酸化炭素非依存組織培養培地を添加します。気泡の形成を避けてチューブを穏やかに振り、細胞が目に見える大きな塊を持たない解離するので、チューブの内容物が濁るようにします。その後、チューブを200倍Gで3分間遠心する。遠心分離後、上清を取り除き、ペレットを採取して細胞染色を進める。核にラベルを付けるには、作製したDNAHoechst色素染色液をチューブに500マイクロリットル加えて細胞を再懸濁させる。暗い中で7分間、染色した細胞をインキュベートします。次に、先に述べたように細胞を遠心分離し、懸濁液中のサンプルの場合は50マイクロリットルのDMEMまたは20マイクロリットルのDMEMでペレットを再懸濁させる。懸濁液中の細胞を用いた実験のための光学トラップまたはOTチャンバーの調製のために、中央に約10ミリメートルで10ミリメートルの正方形の穴を持つ両面スコッチテープの一部を切断する。テープの保護層の1つを剥がし、テープの覆い隠された側を1.5Hガラス底皿の中央に置きます。テープを軽く押して、気泡を避けながらテープの表面をすべてガラスに貼り付け、テープの残りの保護層を剥がします。1ミリリットルあたり0.5ミリグラムで100マイクロリットルのコンカナリアニンAで表面を30分間インキュベートします。その後、コンカナリンAのドロップを削除し、DMEMで表面をすすいでください。細胞を含む溶液の30マイクロリットルをキャビティ表面に加えます。その後、22 22ミリメートルのカバーガラスで非常に穏やかにチャンバーを閉じます。必要に応じてメスや鉗子を使用してください。次に、光ピンセットの起動に向けて、出力電力の安定性を最適化するために、実験の前に少なくとも30分間、レーザーをかなり高い電力でオンにします。完了したら、光学マイクロ操作と力測定ユニットの電子モジュールをオンにします。光学力センサーを位置合わせする前に、60X 1.2の水浸し目的に水滴を置き、細胞を含むチャンバーをステージ上に置きます。細胞サンプルが置かれるチャンバの下面に焦点を合わせます。カバーガラススライドの上に液浸油の液滴をサンプルを覆う後、オイル液滴に接触するまで力センサユニットの集水レンズを下げる。光学力センサーの位置合わせの標準的な手順に従って、AT の位置を決めるために使用される補助カメラのサンプルプレーン画像を見てから、そのフィールド停止がサンプル平面に結合されて表示されるまで光学力センサーを下げます。ベルトランレンズで気泡を確認するには、補助カメラを通して撮像経路を観察します。汚れや気泡が見える場合は、説明したように手順を繰り返す前に、レンズとチャンバーをダストフリーレンズ組織で洗浄し、浸漬油を追加します。光学力センサーのホルダーに置かれた横ねじを使用して、視野停止を視野の中に中央に配置します。精度を高めるには、ほぼフィールドストップを開いて、補助カメラに表示される視野を占有します。試料を顕微鏡に配置し、光学力センサを位置合わせした後、核の剛性や細胞間構造が不明な場合は、回転半波板を使用して初期トラップパワーを200ミリワットに設定する。完了したら、顕微鏡ステージソフトウェアコントローラを使用して、送信されたBrightfield顕微鏡を介して1つまたは2つのビーズを持つセルを探します。数値シートに、その後の軌道ステップの変位と時間を書き込みます。あるいは、補助材料からテーブルS1をロードする。応力/緩和実験では、台形荷重を適用するようにプログラムします。OTソフトウェアで、光トラップをアクティブにします。マイクロスフィアをトラップするには、イメージプレーンを顕微鏡ステージソフトウェアコントローラでビーズの少し上に設定します。校正された補助カメライメージングウィンドウでポリスチレンマイクロビーズをクリックします。オプティカルトラップによるビードの閉じ込めに成功すると、ビーズの動きが強く低下します。ビーズをクリックして細胞質を横切ってドラッグし、核エンベロープから約2ミクロンの距離に置きます。ビードのインデントが核膜に対して垂直になるように、軌跡が設定されていることを確認します。セットアップの準備ができたら、イメージングソフトウェアに移動し、取得ボタンをクリックして画像取得を開始します。リアルタイムの強制読み取りウィンドウを開き、データをクリックして、リアルタイムの強制読み取りウィンドウで保存して保存します。トラップ位置を開始し、測定データを強制します。ビードを右クリックし、開始軌道を選択して、以前にロードされた軌道を開始します。軌道が終了し、システムが安定するまで待ってから、トラップフォース測定データの記録を終了します。画像取得を停止し、後処理ソフトウェアで結果をプロットします。代表的な分析では、核に近い単一の微小球を有する単一のゼブラフィッシュ前駆細胞が表示される。胚内部の注射後5時間のポリスチレン微小球の分布をモニタリングした。ブライトフィールドと蛍光画像は、ビーズが胚組織全体に分散していることを示しています。同じ領域における共焦点蛍光Z-スタックの最大投影とサブスタックの最大投影は、深部の細胞の大部分が1~2個のビーズを含んでいたことを確認します。受精後24時間で、ビーズは胚の全身に分布した。1つまたは2つの注入ビーズを有する閉じ込められた細胞上の懸濁細胞のブライトフィールド顕微鏡写真が得られた。さらに、複数の蛍光標識により、核間膜、原形質膜、DNA、トランスジェニックラインなどの細胞のさまざまな側面の調査が容易に行なわれています。代表的なスナップショットは、光学的に閉じ込められた微小球でインデントの5秒前/中および5秒後にHoechst標識核を記述した。浮遊細胞および閉じ込められた細胞のインデント実験の間に核の遠位および近位の境界の3つの異なるフレームおよび軌道のためのインデントセグメントに沿った強度プロファイルを研究した。繰り返し核のインデント実験の間に光学的に閉じ込められた微小球によって経験された閉じ込められた軌道および力を測定した。懸濁液および閉じ込め中の細胞の核力学は、閉じ込めが予想面積の拡大と核剛性の有意な変化をもたらしたことを確認した。ビーズが1つの細胞段階の胚に注入された場合、それらはおそらく後の段階で均等に分配される。ビーズは安定して閉じ込められなければならないことを覚えておいてください。ビードがオプティカルトラップをエスケープする場合は、軌道を再定義するか、レーザーパワーを増加させます。これらの実験は、1つの細胞内の複数のマイクロビーズに簡単に行われ、アクティブなマイクロロジー測定まで拡張することができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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