Name: direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers at JoVE.com

MK anerkjenner økonomisk støtte fra det spanske økonomi- og konkurransedepartementet gjennom Plan Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), Severo Ochoa-programmet for sentre for fremragende forskning i FoU (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), fra Fundació Privada Cellex, Fundació Mir-Puig, og fra Generalitat de Catalunya gjennom CERCA and Research program (2017 SGR 1012), i tillegg til finansiering gjennom ERC (MechanoSystems) og HFSP (CDA00023/2018). V.R. anerkjenner støtte fra det spanske vitenskaps- og innovasjonsdepartementet til EMBL-partnerskapet, Centro de Excelencia Severo Ochoa, MINECO's Plan Nacional (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) og Generalitat de Catalunya (CERCA). V.V. anerkjenner støtte fra ICFOstepstone PhD Program finansiert av EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under Marie Skłodowska-Curie grant agreement 665884. Vi takker Arnau Farré for kritisk lesning av manuskriptet; Maria Marsal for hjelp med avbildning og montering av 24 HPF embryo og; Senda Jiménez-Delgado for støtte med sebrafiskmikronjeksjoner.

Forfatterne har ingenting å avsløre.

I denne protokollen beskriver vi en unik metode for å forhøre de mekaniske egenskapene til cellekjernen inne i levende celler. Forskjellig fra andre kraftspektroskopiteknikker, tillot ikke-invasiv optisk fangst oss å koble fra bidraget fra cellemembranen og cytoskjelettet fra cellens kjernefysiske stivhet. Det er viktig at optisk mikromanipulering er kompatibel med multimodal mikroskopi, noe som gjør at eksperimentet kan studere forskjellige prosesser involvert i celle kjernefysisk mekanobiologi. Som et representativt resultat brukte vi DNA-Hoechst-farging for å måle kjernedeformasjonen ved innrykk utført av krefter i rekkefølgen til flere hundre picoNewton.
Potensielle anvendelser av vår metode utover eksemplene som er skissert i denne protokollen Muligheten til å trekke ut kvantitativ mekanisk informasjon fra målinger inne i levende celler uten eksterne perturbasjoner muliggjør en mengde enestående muligheter som bare begynner å bli utforsket. Dermed kan den presenterte protokollen til vår optiske mikromanipuleringsplattform utvides til mer komplekse eksperimenter med stor allsidighet. Acousto-optiske deflektorer (AOD) kan generere flere optiske feller for synkrone kraftmålinger på tvers av forskjellige celleplasseringer, samt kan brukes til aktiv mikroheologi i et bredt frekvensområde51,61. Som nevnt kan kraftresponsen ved innrykk overvinne den maksimale fangstkraften, noe som fører til en flukt av perlen fra den optiske fellen. I dette tilfellet kan en krafttilbakemelding konfigureres med AOD for å klemme den optiske kraften. Alt i alt kan flere mikroheologiske tilnærminger, for eksempel stressavslapning beskrevet i denne protokollen, men også aktiv mikroheologi eller krypsamsvar, eksperimentelt oppnås med denne plattformen og grundig analysert av nye programvarepakker61,62,63,64,65 . Videre er anvendelsen av krefter ikke begrenset til kjernen, men kan i prinsippet utføres for å måle ulike intracellulære strukturer og i komplekse vev som demonstrert for fangst av flytende røde blodlegemer inne i intakte blodkar66,67 eller fangst og deformerende kloroplaster og mitokondrier68 . Lys-momentum kalibrering er uavhengig av formen og størrelsen på det fangede objektet, og muliggjør dermed direkte kraftmålinger på enhver kraftsonde med vilkårlig form38,39. Bruken av injiserte mikrosfærer tillot oss å bruke høye krefter på kjernen med relativt lav laserkraft sammenlignet med direkte manipulering av cellulære strukturer69,70,71. Men gitt en høy nok brytningsindeksforskjell, er det ikke nødvendig med ekstern anvendt kraftsonde, og intracellulære organeller kan manipuleres direkte uten injiserte perler (upubliserte observasjoner og referanse70).
Potensielle modifikasjoner av vår metode for å utvide applikasjonene Ulike størrelser av mikrober kan injiseres avhengig av eksperimentet, men de relative kontrollene må gjøres. For eksempel, for å studere celler på senere stadier kan mindre perler injiseres. Dette vil redusere den maksimale kraften som kan utøves av den optiske fellen (for eksempel vist i referanse55). Større perler kan injiseres for å utøve høyere krefter, men disse kan påvirke embryoutviklingen avhengig av størrelse eller interessestadium. I eksperimenter der mikrobeadinjeksjon ikke er et alternativ, kan ulike organeller som viser brytningsindeksforskjeller sammenlignet med cytoplasma fortsatt manipuleres optisk, noe som gir opphav til optiske krefter målbare fra lysmomentendringer42. Som nevnt ovenfor har disse metodene blitt brukt av Bambardekar et al. for å deformere cellecellekryss i Drosophila-embryoet70. På samme måte har cellens kjerne en lavere brytningsindeks enn det omkringliggende mediet44, noe som gir mulighet for perlefri innrykk (upubliserte observasjoner og referanse72) selv om den har lavere overlappingsstyrke. Dermed kan kjernen ikke fanges lett og unnslipper fellen.
Den spin-belagte PDMS-avstandsstykken er fremstilt via en praktisk og rask metode, men kan være utenfor rekkevidde for laboratorier uten tilgang til et mikro-/nanofabrikasjonsanlegg eller ingeniørlaboratorier. Dermed kan avstandsstykken enkelt monteres fra laboratoriebånd eller parafilm (trinn 4). Protokollen kan også tilpasses ved å produsere mikrofluidiske kanaler som automatiserer levering av enkeltceller til forhåndsdefinerte målebrønner eller inn i et kammer med en definert høyde for å estimere innesperringseffekten innenfor samme prøve. Imidlertid må slike mikrofluidiske enheter utformes slik at de passer til rommet mellom mikroskopmålet og oppsamlingslinsen til den optiske kraftsensoren, på rundt 2 mm (se trinn 3). Vær oppmerksom på at den optiske kraftsensoren må plasseres i riktig høyde, slik at ingen optiske avvik fra defokusering påvirker målingen av fotonmomentet.
Andre modifikasjoner kan omfatte endring av biologiske reportere. Vi fant ut at Hoechst fluorescens blør spektralt inn i GFP-kanalen, og vi favoriserer dermed kombinasjonen med mCherry-merket histone som en kjernefysisk markør for samtidig måling i to fluorescerende kanaler. Alternativt kan kjernefysisk deformasjon enkelt spores med en etikett rettet mot den indre atommembranen som Lap2b-GFP (figur 2).
Innrykk på cellekjernen var i rekkefølgen 2-3 mikron, som vi nøyaktig kunne måle ved bildeanalyse av diffraksjonsbegrenset spinnende disk konfektmikroskopi. For tilfelle av stivere kjerner eller mindre krefter, vil innrykk være knapt målbar ved hjelp av denne tilnærmingen. Imidlertid kan de absolutte kraftkalibrerte optiske pinsettene også kalibreres for posisjonsmålinger av den fangede perlen in situ ved hjelp av BFP-interferometri med nanometernøyaktighet51. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan spenningssignalet og den optiske kraftsensoren oversettes til posisjonen til den fangede sonden gjennom parameteren β [nm/V], mens den konstante parameteren α [pN/V] gir kraftverdier gjennom den nevnte lysmomentkalibreringen41 (se nedenfor for detaljer).
Feilsøking Vi fant ut at følgende utfordringer kunne oppstå under eksperimentet:
Ingen stabil felle dannes og mikrosfæren unnslipper lett Eventuelt smuss på mikroskopmålet eller en feiljustert korreksjonskrage kan føre til svikt i en stabil felle. Hvis en umiddelbar løsning ikke blir funnet, måler du punktspredningsfunksjonen til objektivlinsen. Hvis prøven av interesse er dypt inne i et optisk tett vev, kan laserfokuset oppleve alvorlige optiske avvik som fører til ustabil fangst (denne effekten er vanligvis ubetydelig i isolerte celler, men blir tydeligere i tykkere vev). For høy stivhet kan gjenopprettekraften til kjernen overstige rømningskraften til fellen, slik at mikrosfæren går tapt og innrykksrutinen svikter. I utgangspunktet blir den kjernefysiske membrankanten proksimal til den optiske fellen knapt rykket inn (figur S2A). Når dette skjer, påvirkes ikke overlappingslaseren lenger av kraft og brownsk bevegelse, noe som fører til et kraftfall til null og en reduksjon av signalstøyen (figur S2B). I tilfelle dette skjer, kan laserkraften økes for å ha en sterkere felle, amplituden til trapesformet bane som skyver perlen inn i kjernen, kan reduseres, eller den opprinnelige posisjonen til den fanget mikrobeaden kan settes lenger av kjernen.
Cellen beveger seg under stimuleringen Hvis cellene ikke er tilstrekkelig festet, vil den optiske gradientfellen flytte cellene mens du utfører den intracellulære innrykksrutinen, slik at kreftene og underliggende mekanikken til kjernen er gjenstand. For å forhindre forskyvning av hele cellen, anbefaler vi å øke konsentrasjonen av celleadhesjonsmolekyler på overflaten, for eksempel ConA.
Innledende momentumkompensasjon Hvis en innledende momentumkompensasjonsrutine ikke er tilgjengelig i OTs-plattformen (trinn 6.5), må et kunstig, kraftuavhengig basislinjesignal korrigeres for. Dette er synlig som en skråning på kraftkurven selv uten perle fanget (figur S1E). For å gjøre korreksjonen må den samme banen utføres uten perle, utenfor cellen i nøyaktig samme posisjon. For dette flytter du cellen bort fra overlappingen ved hjelp av fasekontrollen. Som referanse endres kraftforskyvningen 5 pN over FOV ved 200 mW i systemet vårt; Dermed blir det ubetydelig for korte baner. Alternativt kan et piezo-skannestadium brukes til å flytte cellene på prøven, slik at laserposisjonen er konstant.
Kritiske trinn i den presenterte protokollen Mikrosfærer bør injiseres til høyre, 1-cellers stadium for å sikre maksimal fordeling over embryoet. Perler bør ikke være fluorescerende slik at det ikke lekker lys inn i fluorescerende kanaler som brukes til avbildning. For eksempel er selv typiske rød-fluorescerende perler tydelig synlige i den blå kanalen som brukes til å avbilde cellekjernen etter Hoechst-farging på grunn av lysstyrken (eksitasjon: 405 nm; utslipp: 445 nm). Stabil tilknytning av cellen til substratet er avgjørende for å forhindre lateral forskyvning under innrykksrutinen. Hvis cellen beveger seg under rutinen, blir krefter undervurdert. Hvis dette skjer ofte, optimaliserer du vedleggsprotokollen. For vevskulturceller fører andre celleadhesjonsproteiner, for eksempel fibronectin, kollagen eller poly-L-lysin, til tilfredsstillende vedlegg (upubliserte observasjoner). Under innesperringen blir celler utsatt for et plutselig og alvorlig mekanisk stress. Dette kan forårsake skade på cellene, og ofte vil eksperimentet støte på sprengte celler hvis prosedyren ikke utføres nøye. Også, hvis innesperringshøyden er for liten, vil alle cellene lide av kjernefysisk innhylling brudd eller irreversibel skade. For å redusere disse, senk de øvre dekslene langsommere og/eller øk avstanden mellom dekslene.
Begrensninger i teknikken og forslag for å overvinne dem En klar begrensning av teknikken er penetrasjonen av laserlyset i dype deler av vevet, noe som fører til avvik og ustabil fangst. Dermed avhenger en lavere grense for penetrasjonsdybde av klarheten i prøven, avvikskorreksjonen som kan brukes73 og den påførte laserkraften. Det bør tas i betraktning at en høyere lasereffekt fører til termisk eksitasjon av prøven i nærheten av mikrosfæren. Oppvarming av prøven stammer imidlertid fra 1064 nm bølgelengde laser flekk er minimert for å unngå plausibel varmerelatert stress på våre biologiske prøver74.
En annen begrensning er den maksimale kraften som kan måles. Selv om direkte lys-momentum deteksjon muliggjør kraftmålinger langt utover det lineære responsregimet til den optiske fellen40,41, er den maksimale anvendte kraften i størrelsesorden noen få hundre picoNewtons. Dette begrenses av laserkraft og følgeskadeterskelen for mykt biologisk materiale og brytningsindeksforskjellene, som normalt ikke er større enn 0,1 eller 0,344. Det er foreslått flere metoder for å øke kraftdeteksjonsgrensen, for eksempel ved hjelp av strukturerte lys75, antirefleksbelagte mikrosfærer76, høyrefleksindekspartikler77 eller svært dopede kvanteprikker78.
OTer kan brukes til nanometer-skala posisjonsmålinger gjennom BFP interferometri, slik at posisjonen til perlen i fellen er Δx = β Sx, hvor Sx er sensorens spenningssignal, og β [μm / V] kan kalibreres underveis etter forskjellige protokoller35,54. For en optisk kraftsensor kan det bevises at spenning-til-kraft invariant konverteringsfaktor α [pN / V] direkte er relatert til β og fellestivheten, k [pN / μm], gjennom α = kβ 37) I eksperimenter med perleforskyvninger som er for små til å bli oppdaget fra optisk avbildning, kan denne strategien brukes til å utfylle kraftmålinger med små posisjonsdeteksjon. Et eksempel er anvendelsen av de eksperimentelle rutinene som presenteres her på svært stive kjerner, for hvilke krefter med rimelige laserkrefter (200-500 mW) ikke er tilstrekkelige til å indusere innrykksverdier store nok. I så fall må perlen bringes i kontakt med kjernen, og fangststivheten må kalibreres før målingen (trinn 8.6). Innrykk d av kjernen som en funksjon av kraft kan indirekte bestemmes som:
d = xtrap - F/k
der xtrap er overlappingsposisjonen. Forskjellig fra den konstante lysmomentfaktoren α [pN/V], må faktor β [μm/V] kalibreres før hvert eksperiment, siden det avhenger av mange lokale variabler som bestemmer overlappingsdynamikken, for eksempel partikkelstørrelse, optisk fellepunktstørrelse og relative brytningsindekser.

Vevsmorfogenese er en kompleks prosess der biokjemiske signaler og fysiske krefter er romlig koordinert. I det utviklende embryoet dikterer gradienter av biokjemiske signalfaktorer skjebnespesifikasjon og sikrer riktig vevsmønster1,2. Samtidig spiller iboende og ekstrinsiske krefter en rolle i å bygge arkitekturen til embryoet3,4. Påvirkningen av cellebarkmekanikk i denne sammenhengen har blitt studert mye5,6. Den tette forbindelsen mellom mekanokjemiske prosesser under morfogenese er avhengig av egenskapene til enkeltceller for å føle og reagere på mekaniske krefter i vevsmikromiljøet. Celler dekoder dermed mekaniske signaler via tilstedeværelsen av kraftfølsomme subcellulære og molekylære elementer som transduserer mekanisk informasjon til spesifikke signalveier som kontrollerer celleadferd, celle skjebne og cellemekanikk.
Et kjennetegn ved utviklingsprosesser er at celler organiseres som grupper for å bygge multicellulære strukturer. Som sådan omorganiserer og beveger enkeltceller seg sjelden alene, men er forbundet i en tett sosiotop der de viser kollektiv oppførsel som supracellulær migrasjon7, (un)jamming overganger8,9 eller blastocyst komprimering10. Mekaniske krefter generert i og mellom celler tjener som viktige signaler for å instruere kollektiv celledynamikk7,11. Men selv når celler beveger seg alene, for eksempel stamceller som klemmer seg mellom vevsark eller smale vevsnisjer, opplever de omfattende anisotrope mekaniske krefter når de navigerer i et tredimensjonalt miljø. Disse mekaniske påkjenningene på celler har dype konsekvenser for cellulær atferd12,13. Flere mekanismer har blitt undersøkt som konvergerer på kjernen som et stort mekanotransduksjonselement14,15, som passivt eller aktivt mekanisk element under migrasjon i et tett 3D-vevsmiljø15,16.
Vi foreslo nylig en mekanisme som utstyrer celler til å måle formdeformasjoner ved hjelp av kjernen som en elastisk intracellulær mekano-gauge12. Kjernen, som er den største organellen i en celle, gjennomgår store deformasjoner når celler polariserer, migrerer eller endrer form under mekanisk strekk, innesperring eller osmotisk stress16,17,18,19. Vi fant at kjernefysisk konvolutt strekker seg sammen med den intracellulære plasseringen av kjernen gir celler informasjon om størrelsen og typen celledeformasjon (for eksempel cellekompresjon versus celle hevelse). Strekking av kjernen er forbundet med en utfoldelse av den indre kjernefysiske membranen (INM), som fremmer kalsiumavhengig cPLA2 (cytosomisk fosfolipase A2) lipaseaktivitet ved INM etterfulgt av frigjøring av arakidonsyre (AA) og rask aktivering av myosin II ved cellebarken. Dette fører til økt cellekontraktilitet og amoeboid cellemigrering over en terskel for kortikale kontraktilitet6. Den mekanosensitive responsen på celledeformasjon skjer på mindre enn ett minutt og er reversibel ved frigjøring av innesperring, noe som tyder på at kjernen fungerer som en strekkmåler for cellulær proprioception som regulerer adaptiv celleadferd under mekaniske stressforhold. Denne mekanosensitive banen er vist å være aktiv i stamceller av stamceller avledet fra sebrafiskembryoer, både i pluripotente og avstamningsbesatte celler12 og er bevart i forskjellige arter og cellelinjer20.
I tillegg til de kjernefysiske egenskapene som celle-mekanosensor, er kjernefysisk arkitektur og mekanikk iboende regulert under utvikling og som svar på celle skjebne spesifikasjon21, derav tuning cellulær mekano-følsomhet22,23. Konsekvensen kan være en endring i kjernefysisk etterlevelse som åpner for morfologiske endringer og overganger fra en forvandrer til en trekkstat og omvendt8.
Flere teknikker for å måle cellekjernemekanikk har blitt brukt, for eksempel atomkraftmikroskopi24,25, mikropipetteaspirasjon26,27, mikrofluidisk teknologi28 og mikroneedler29. Imidlertid er mange av disse teknikkene invasive i den forstand at hele cellen må deformeres, noe som begrenser målingen av mekaniske egenskaper og kraftavhengige responser av kjernen selv. For å omgå samtidig deformasjon av celleoverflaten og dens mekanosensitive celle cortex30, ble isolerte kjerner studert i ulike sammenhenger31,32. Det kan imidlertid ikke utelukkes at kjernefysisk isolasjon er forbundet med en endring i mekaniske kjerneegenskaper og deres regulering (referanse24 og egne upubliserte observasjoner).
Optisk pinsett (OT) er en allsidig teknologi som har tillatt en mengde eksperimenter i cellemekanobiologi og har vært medvirkende i vår forståelse av hvordan molekylære maskiner omdanner kjemisk til mekanisk energi33,34. Optisk pinsett bruker en tett fokusert laserstråle for å utøve optiske krefter på dielektriske partikler som har en brytningsindeks høyere enn det omkringliggende mediet33. Slike krefter kan være i størrelsesorden hundrevis av pico-Newtons og resultere i effektiv innesperring av partikkelen i laserfellefokuset, noe som muliggjør manipulering av den fangede partikkelen i tre dimensjoner. Bruk av lys har en viktig fordel ved at målingen kan utføres ikke-invasivt inne i levende celler. Optiske manipulasjoner er ytterligere begrenset til laserstrålens fellefokus. Derfor kan manipulasjonen utføres uten å stimulere de omkringliggende cellulære membranene og perturberer ikke aktinbarken eller mekanosensitive prosesser ved plasmamembranen, for eksempel den kraftavhengige aktiveringen av ionkanaler.
Vanskeligheten med den optiske pinsetttilnærmingen er å nøyaktig bestemme kreftene som brukes på mikrosfæren ved hjelp av klassiske tilnærminger som er avhengige av indirekte kraftkalibrering basert på utstyrsteoremet eller bruken av definerte Stokes-drag-krefter for å måle en lasereffektavhengig rømningskrafteffekt35. Mens disse metodene er enkle å implementere i et in vitro-eksperiment, kan de vanligvis ikke oversettes til et mobilmiljø. Flere strategier er innført i feltet som er avhengige av en direkte kraftkalibrering, avledet fra de første prinsippene for momentumbevaring36,37. I motsetning til andre kraftspektroskopitilnærminger, utledes kraftmålinger fra en lokal utveksling av lysmoment med den vilkårlig formede fanget partikkelen38,39. I vårt eksperimentelle oppsett måles endringer i lysmoment som oppstår fra optiske krefter direkte uten behov for in situ trap calibration40,41,42,43. Dermed blir målingene mulig i et viskøs miljø som det indre av cellen eller til og med i et vev, og krefter kan lett kvantifiseres ned til pN-nivået.
I denne protokollen beskriver vi en analyse for å mekanisk manipulere intracellulære organeller eller strukturer og kvantitativt vurdere deres mekaniske egenskaper ved et optisk pinsettoppsett. Dette oppsettet er integrert i et roterende diskfluorescerende mikroskop som muliggjør parallell avbildning av cellulær oppførsel eller intracellulær dynamikk. Analysen gjør det mulig å karakterisere de mekaniske egenskapene til bestemte cellulære rom, for eksempel kjernen, samtidig som den studerer mulig mekanorespons og aktivering av molekylære signalveier som følge av selve deformasjonen. Videre tillater optisk fangst av injiserte mikrober i celler en økning i innrykkskraften takket være en betydelig høyere brytningsindeks for polystyrenperlen (n = 1,59) sammenlignet med den iboende brytningskontrasten44 av kjernen (n ~ 1,35) versus cytoplasma (n ~ 1,38). Den presenterte strategien kan enkelt tilpasses studiet av andre intracellulære strukturer og organeller, samt andre tilnærminger som involverer aktiv mikroheologi, bruk av flere optiske feller for å sondere de samme / forskjellige subcellulære strukturer samtidig, og målinger rettet mot cellemekanobiologi i det levende embryoet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 22 mm cover glasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5 22x60 mm Coverglasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5H glass bottom dishes</td>
			<td>Willco</td>
			<td>GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-um beads</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>72986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mm glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020 GC100F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um polystyrene microbeads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um red-fluorescent beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqcuisition cameras sCMOS</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Sona-4BV11-UNI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary camera (Figure 3, AUX)</td>
			<td>Blackfly, FLIR</td>
			<td>BFS-U3-200S6M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbryte 520</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>520 AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double scotch tape</td>
			<td>Biesse Adesivi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPI-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2A-mCh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Fusion-Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>Type B: 16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR protection googles</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lap2b-eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro loader pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>GELoader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroManager 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromiter slide</td>
			<td>ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tweezers platform</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td>Sensocell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OTs software (LightAce)</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing agent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post processing software (Matlab)</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-950/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>Spincoat G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DragonFly 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangular microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UNB 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers

Under utviklingen av en multicellulær organisme deler en enkelt befruktet celle og gir opphav til flere vev med forskjellige funksjoner. Vevsmorfogenese går i hånd med molekylære og strukturelle endringer på enkeltcellenivå som resulterer i variasjoner av subcellulære mekaniske egenskaper. Som en konsekvens, selv innenfor samme celle, motstår forskjellige organeller og rom annerledes enn mekaniske påkjenninger; og mekanaltransduksjonsveier kan aktivt regulere sine mekaniske egenskaper. Evnen til en celle til å tilpasse seg mikromiljøet i vevsnisjen skyldes dermed delvis evnen til å føle og reagere på mekaniske påkjenninger. Vi foreslo nylig et nytt mekanosenasjonsparadigme der kjernefysisk deformasjon og posisjonering gjør det mulig for en celle å måle det fysiske 3D-miljøet og gir cellen en følelse av proprioception for å dekode endringer i celleform. I denne artikkelen beskriver vi en ny metode for å måle kreftene og materialegenskapene som former cellekjernen inne i levende celler, eksemplifisert på tilhengerceller og mekanisk begrensede celler. Målingene kan utføres ikke-invasivt med optiske feller inne i celler, og kreftene er direkte tilgjengelige gjennom kalibreringsfri deteksjon av lysmoment. Dette gjør det mulig å måle mekanikken til kjernen uavhengig av celleoverflatedeformasjoner og tillate disseksjon av eksteroceptive og interoceptive mekanotransduksjonsveier. Det er viktig at fangsteksperimentet kombineres med optisk mikroskopi for å undersøke cellulær respons og subcellulær dynamikk ved hjelp av fluorescensavbildning av cytoskjelett, kalsiumioner eller kjernemorfologi. Den presenterte metoden er enkel å bruke, kompatibel med kommersielle løsninger for kraftmålinger, og kan enkelt utvides for å undersøke mekanikken til andre subcellulære rom, for eksempel mitokondrier, stressfibre og endosomer.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers at JoVE.com

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

Her presenterer vi en protokoll for å undersøke de intracellulære mekaniske egenskapene til isolerte embryonale sebrafiskceller i tredimensjonal innesperring med direkte kraftmåling ved en optisk felle.

Direkte kraftmålinger av subcellulær mekanikk i innesperring ved bruk av optiske pinsett

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Denne protokollen dissekerer de individuelle mekaniske egenskapene til cellekjernen som gjør den til en mekanisk måler for cellepolarisering, differensiering og migrasjon. Den største fordelen med denne teknikken er at den kan måle mekaniske egenskaper og bruke krefter på subcellulære rom uten ekstern perturbasjon av membranen eller kortikale cytoskjelett. Protokollen kan enkelt tilpasses for å manipulere perler inne i andre celler av annen organisme for å studere kjernemekanikk i forskjellige cellelinjer eller dyremodeller.Justering av sensoren for direkte kraft er avgjørende for å fange opp alt lyset som skaper og forlater de optiske fellene. Dette vil sikre nøyaktige lysmomentmålinger i det viskoelastiske mediet til en celle. Begynn enkeltcelleforberedelsen ved å plassere sfæren trinn embryoer fire timer etter befruktning i en glassfat som inneholder E3-medier ved hjelp av en plast Pasteur pipette.Velg deretter embryoene som er positive til perlene og uttrykk fluorescerende protein i tilfelle mRNA-injeksjon. Bruk tang til å dekurere embryoene manuelt og overføre ca. 10 til 15 dekursjonerte embryoer til en 1,5 milliliter reaksjonsbeholder ved hjelp av en pasteurpipette i glass. Fjern E3-mediet fra røret og tilsett 500 mikroliter forforvarmet karbondioksiduavhengig vevskulturmedium.Rist forsiktig røret for å unngå bobledannelse og sørg for at innholdet i røret blir uklart når cellene løsner uten store biter som er synlige for øyet. Sentrifuger deretter røret ved 200 ganger G i tre minutter. Etter sentrifugering, fjern supernatanten og samle pellet for å fortsette med cellefarging.For å merke kjernen, resuspender cellene ved å legge til 500 mikroliter av det nylagde DNA Hoechst fargestofffargingsløsningen til røret. Inkuber de fargede cellene i syv minutter i mørket. Deretter sentrifugerer du cellene som beskrevet tidligere, og bruker pelletsen på nytt i enten 50 mikroliter DMEM for prøver i suspensjon eller 20 mikroliter DMEM for celler i innesperring.For fremstilling av optiske fangster eller OT-kammer for forsøkene med cellene i suspensjon, kutt et stykke dobbeltsidig scotch tape med et omtrent 10 millimeter x 10 millimeter kvadratisk hull i midten. Skrell av et av de beskyttende lagene på båndet og plasser den avdekkede siden av båndet i midten av en bunnfat nummer 1,5 H glass. Trykk tapen forsiktig for å få all overflaten av båndet til å feste seg til glasset, samtidig som du unngår luftbobler og skreller av det gjenværende beskyttende laget av båndet.Inkuber overflaten med 100 mikroliter Concanavalin A ved 0,5 milligram per milliliter i 30 minutter. Fjern deretter dråpen av Concanavalin A og skyll overflaten med DMEM. Tilsett 30 mikroliter av løsningen som inneholder cellene på hulromsoverflaten.Lukk deretter kammeret veldig forsiktig med et 22 x 22 millimeter dekselglass. Bruk en skalpell eller tang om nødvendig. Deretter fortsetter du for oppstart av optisk pinsett ved å slå på laseren med betydelig høy effekt i minst 30 minutter før eksperimentet for å optimalisere utgangseffektstabiliteten.Når du er ferdig, slår du på elektronikkmodulen til de optiske mikromanipulerings- og kraftmålingsenhetene. Før du justerer den optiske kraftsensoren, legg en vanndråpe på 60X 1.2 vanninnlevelsesmål og plasser kammeret som inneholder cellene på scenen. Fokuser på den nedre overflaten av kammeret der celleprøvene skal plasseres.Etter å ha tilsagt en dråpe nedsenkningsolje på toppen av glasssklie som dekker prøven, senk oppsamlingslinsen til kraftsensorenheten til den kommer i kontakt med oljedråpen. Etter standardprosedyren for justering av optisk kraftsensor, se på prøveplanbildet på hjelpekameraet som skal brukes til å plassere OTene, og senk deretter den optiske kraftsensoren til feltstoppet vises konjugert på prøveplanet. Hvis du vil se etter luftbobler med Bertrand-objektivet, må du observere bildebanen gjennom hjelpekameraet.Hvis det er synlige smuss- eller luftbobler, rengjør linsen og kammeret med støvfritt linsevev før du gjentar prosedyren som beskrevet, og tilsett mer nedsenkningsolje. Bruk sideskruene som er plassert på holderen på den optiske kraftsensoren, og sentrer feltstoppet inn i synsfeltet. For nøyaktighet, åpne feltstoppet nesten for å okkupere synsfeltet som er synlig på hjelpekameraet.Etter å ha plassert prøven i mikroskopet og justert den optiske kraftsensoren, bruk den roterende halvbølgeplaten til å sette den første felleeffekten til 200 milliwatt hvis stivheten til kjernen eller den intercellulære strukturen som undersøkes ikke er kjent. Når du er ferdig, bruker du programvarekontrolleren for mikroskopstadiet til å se etter en celle med en eller to perler gjennom overført Brightfield-mikroskopi. I det numeriske arket skriver du forskyvningen og tiden for hvert etterfølgende banetrinn.Alternativt lastebord S1 fra tilleggsmaterialet. For et stress/ avslapningseksperiment, programmer trapesformede belastninger som skal påføres. I OT-programvaren aktiverer du de optiske fellene.For å fange en mikrosfære, sett bildeplanene litt over perlen med en programvarekontroller for mikroskopstadium. Klikk på polystyrenmikrobeaden i det kalibrerte hjelpekameraavbildningsvinduet. Vellykket innesperring av perlen ved den optiske fellen vil sterkt redusere beadens bevegelse.Klikk og dra perlen over cytoplasma og plasser den i en avstand på omtrent to mikron fra atomkonvolutten. Påse at banen er stilt inn slik at perleinnrykk er vinkelrett på atommembranen. Når oppsettet er klart, går du til bildeprogramvaren og klikker på anskaffelsesknappen for å starte bildeanskaffelse.Åpne sanntids kraftlesevinduet, klikk på data og lagre i sanntids kraftlesevinduet for å lagre. Start overlappingsposisjon og tving måledata. Start den tidligere belastede banen ved å høyreklikke på perlen og velge startbane.Vent til banen er ferdig og systemet stabiliserer seg før du fullfører registreringen av måledataene for fellekraften. Stopp bildeanskaffelse og plott resultatene i etterbehandlingsprogramvaren. I den representative analysen vises en isolert sebrafisk stamcelle med en enkelt mikrosfære nær kjernen.Distribusjon av polystyrenmikrosfære fem timer etter injeksjon inne i et embryo ble overvåket. Brightfield og fluorescens bilde viser perlene er spredt over embryo vev. Maksimal projeksjon av den konfokale fluorescerende Z-stabelen og en maksimal projeksjon av en understabel i samme region bekrefter at en stor brøkdel av dype celler inneholdt en til to perler.Ved 24 timer etter befruktning ble perlene fordelt over hele embryoets kropp. Brightfield-mikrografene til suspensjonscellene på de begrensede cellene med en eller to injiserte perler ble oppnådd. Videre forenklet flere fluorescerende etiketter undersøkelsen av forskjellige aspekter av cellene, for eksempel internukleær membran, plasmamembran, DNA og transgen linje.Representative øyeblikksbilder beskrev Hoechst-merkede kjerner fem sekunder før/under og fem sekunder etter innrykk med en optisk fanget mikrosfære. Intensitetsprofiler langs innrykkssegmentet for tre forskjellige rammer og baner av kjernens distale og proksimale grenser under et innrykkseksperiment av suspenderte og begrensede celler ble studert. Fanget bane og kraft opplevd av den optisk fanget mikrosfæren under et gjentatt kjernefysisk innrykkseksperiment ble målt.Nukleusmekanikk i cellene i suspensjon og under innesperring bekreftet at innesperringen resulterte i en utvidelse av det projiserte området og en ubetydelig endring i kjernefysisk stivhet. Hvis perler injiseres i det ene celletrinnet embryo, vil de mest sannsynlig jevnt distribuere i de senere stadiene. Husk at perlen må være stabilt fanget.Hvis perlen unnslipper den optiske fellen, omdefinerer du banen eller øker laserkraften. Disse eksperimentene kan enkelt utføres på flere mikrober inne i en celle og utvides til aktive mikroheologimålinger.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Direkte Induksjon av Hemogenic endotelet og Blood av Overekspresjon av transkripsjonsfaktorer i Human Pluripotent stamceller

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Bruke Isolert Mitokondrier fra minimale mengder av Mouse Skeletal Muscle for høy gjennomstrømming Mikro respirasjonsmålinger

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulære strukturer i Living Sebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse av Sebrafisk Nyre Development med Time-lapse Imaging Ved hjelp av en dissekere mikroskop Utstyrt for Optical Seksjonering

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Protokoll for direkte konvertering av Murine embryonale Fibroblaster i trophoblast stamceller

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Subkutan Neurotropin 4 infusjon ved bruk av osmotiske pumper eller direkte muskelsprøyting forbedrer aldring rotte larynx muskler

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Prøvende celle mekanikk med perle-fri optisk pinsett i Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direkte avstamning omprogrammering av voksen mus Fibroblast å Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropic lys-ark mikroskopi og automatisert Cell Lineage analyser til katalog Caenorhabditis elegans embryogenesis med Subcellulære oppløsning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...