Name: direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers at JoVE.com

МК признает финансовую поддержку со стороны Министерства экономики и конкурентоспособности Испании в рамках программы Plan Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), Severo Ochoa для центров передового опыта в области исследований и разработок (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), от Fundació Privada Cellex, Fundació Mir-Puig и от Generalitat de Catalunya через CERCA и исследовательскую программу (2017 SGR 1012), в дополнение к финансированию через ERC (MechanoSystems) и HFSP (CDA00023/2018). V.R. признает поддержку со стороны Министерства науки и инноваций Испании партнерству EMBL, Centro de Excelencia Severo Ochoa, Plan Nacional MINECO (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) и Женералитату Каталонии (CERCA). V.V. признает поддержку со стороны программы ICFOstepstone PhD, финансируемой исследовательской и инновационной программой Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри 665884. Мы благодарим Арнау Фарре за критическое прочтение рукописи; Марии Марсал за помощь в визуализации и монтаже эмбриона мощностью 24 л.с.л.с.; Сенда Хименес-Дельгадо за поддержку микроинъекций рыбок данио.

Авторам нечего раскрывать.

Тканевый морфогенез представляет собой сложный процесс, при котором биохимические сигналы и физические силы пространственно-временно координируются. У развивающегося эмбриона градиенты биохимических сигнальных факторов диктуют специфику судьбы и обеспечивают правильную структуру тканей1,2. В то же время внутренние и внешние силы играют определенную роль в построении архитектуры эмбриона3,4. Влияние механики клеточной коры в этом контексте было широко изучено5,6. Тесная взаимосвязь между механохимическими процессами во время морфогенеза зависит от свойств отдельных клеток ощущать и реагировать на механические силы в микроокружении их тканей. Клетки, таким образом, декодируют механические сигналы через присутствие чувствительных к силе субклеточных и молекулярных элементов, которые преобразуют механическую информацию в конкретные сигнальные пути, контролирующие поведение клеток, судьбу клеток и клеточную механику.
Отличительной чертой процессов развития является то, что клетки организуются в группы для построения многоклеточных структур. Таким образом, одиночные клетки редко перестраиваются и движутся в одиночку, но связаны в плотном социотопе, в котором они демонстрируют коллективное поведение, такое как надклеточная миграция7, (не)глушащие переходы8,9 или уплотнение бластоцисты10. Механические силы, генерируемые внутри и между клетками, служат важными сигналами для управления коллективной динамикой клеток7,11. Но даже когда клетки движутся в одиночку, такие как клетки-предшественники, которые протискиваются между тканевыми листами или узкими тканевыми нишами, они испытывают обширные анизотропные механические силы при навигации по трехмерной среде. Эти механические нагрузки на клетки оказывают глубокое воздействие на поведение клеток12,13. Было исследовано несколько механизмов, которые сходятся на ядре как основной элемент механотрансдукции14,15, как пассивный или активный механический элемент во время миграции в плотной среде 3D-ткани15,16.
Недавно мы предложили механизм, который оснащает клетки для измерения деформаций формы с использованием ядра в качестве эластичного внутриклеточного механо-калибра12. Ядро, будучи самой большой органеллой в клетке, подвергается большим деформациям, когда клетки поляризуются, мигрируют или изменяют свою форму при механическом растяжении, ограничении или осмотическом напряжении16,17,18,19. Мы обнаружили, что растяжение ядерной оболочки вместе с внутриклеточным позиционированием ядра предоставляет клеткам информацию о величине и типе клеточной деформации (например, сжатие клеток против клеточного набухания). Растяжение ядра связано с развертыванием внутренней ядерной мембраны (INM), что способствует кальций-зависимой активности cPLA2 (цитозольная фосфолипаза A2) липазы в INM с последующим высвобождением арахидоновой кислоты (AA) и быстрой активацией миозина II в клеточной коре. Это приводит к повышенной сократимости клеток и миграции амебоидных клеток выше порога сократимости коры6. Механочувствительная реакция на деформацию клеток происходит менее чем за минуту и обратима при высвобождении удержания, предполагая, что ядро действует как тензорезистор клеточной проприоцепции, регулирующий адаптивное поведение клеток в условиях механического стресса. Показано, что этот механочувствительный путь активен в стволовых клетках-предшественниках, полученных из эмбрионов рыбок данио, как в плюрипотентных, так и в линейных клетках12 и сохраняется у различных видов и клеточных линий20.
В дополнение к ядерным свойствам в качестве клеточного механосенсора, ядерная архитектура и механика внутренне регулируются во время разработки и в ответ на спецификацию клеточной судьбы21, следовательно, настраивая клеточную механочувствительность22,23. Следствием этого может стать изменение в ядерном соответствии, которое допускает морфологические изменения и переходы из преимущественного в миграционное состояние и наоборот8.
Было применено несколько методов измерения механики клеточного ядра, таких как атомно-силовая микроскопия24,25, аспирация микропипетки26,27, микрофлюидная технология28 и микроиглы29. Однако многие из этих методов являются инвазивными в том смысле, что вся клетка должна быть деформирована, ограничивая измерение механических характеристик и силозависимых реакций самого ядра. Для обхода одновременной деформации поверхности клетки и ее механочувствительной клеточной коры30 изучали изолированные ядра в различных контекстах31,32. Однако нельзя исключать, что ядерная изоляция связана с изменением свойств механических ядер и их регуляции (ссылка24 и собственные неопубликованные наблюдения).
Оптический пинцет (OT) является универсальной технологией, которая позволила провести множество экспериментов в клеточной механобиологии и сыграла важную роль в нашем понимании того, как молекулярные машины преобразуют химическую энергию в механическую33,34. Оптический пинцет использует плотно сфокусированный лазерный луч для воздействия оптических сил на диэлектрические частицы, которые имеют показатель преломления выше, чем окружающая среда33. Такие силы могут составлять порядка сотен пиконьютонов и приводить к эффективному удержанию частицы в фокусе лазерной ловушки, что позволяет манипулировать захваченной частицей в трех измерениях. Использование света имеет важное преимущество в том, что измерение может быть выполнено неинвазивно внутри живых клеток. Оптические манипуляции дополнительно ограничиваются фокусом ловушки лазерного луча. Следовательно, манипуляция может быть выполнена без стимуляции окружающих клеточных мембран и не нарушает актиновую кору или механочувствительные процессы на плазматической мембране, такие как силозависимая активация ионных каналов.
Сложность подхода оптического пинцета заключается в точном определении сил, приложенных к микросфере, с использованием классических подходов, которые полагаются на калибровку косвенной силы на основе теоремы о равнораспределении или использование определенных сил сопротивления Стокса для измерения лазерной силы убегания35. Хотя эти методы легко реализовать в эксперименте in vitro, они обычно не могут быть переведены в клеточную среду. В этой области было введено несколько стратегий, основанных на калибровке прямой силы, полученной из первых принципов сохранения импульса36,37. В отличие от других подходов силовой спектроскопии, измерения силы выводятся из локального обмена световым импульсом с захваченной частицей произвольной формы38,39. В нашей экспериментальной установке изменения светового импульса, возникающие в результате оптических сил, непосредственно измеряются без необходимости калибровки ловушки in situ40,41,42,43. Таким образом, измерения становятся возможными в вязкой среде, такой как внутренняя часть клетки или даже внутри ткани, и силы могут быть легко количественно оценены вплоть до уровня pN.
В этом протоколе мы описываем анализ для механического манипулирования внутриклеточными органеллами или структурами и количественной оценки их механических свойств с помощью оптической установки пинцета. Эта установка интегрирована во вращающийся дисковый флуоресцентный микроскоп, позволяющий параллельно визуализировать поведение клеток или внутриклеточную динамику. Анализ позволяет охарактеризовать механические свойства конкретных клеточных компартментов, таких как ядро, одновременно изучая возможный механореспонгс и активацию молекулярных сигнальных путей в результате самой деформации. Кроме того, оптическое улавливание введенных микрошариков внутри клеток позволяет увеличить силу углубления благодаря значительно более высокому показателю преломления полистирольной бусины (n = 1,59) по сравнению с внутренним преломляющим контрастом44 ядра (n ~ 1,35) по сравнению с цитоплазмой (n ~ 1,38). Представленная стратегия может быть легко адаптирована к изучению других внутриклеточных структур и органелл, а также других подходов, включающих активную микрореологию, использование нескольких оптических ловушек для одновременного зондирования одних и тех же/разных субклеточных структур и измерения, нацеленные на клеточную механобиологию у живого эмбриона.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 22 mm cover glasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5 22x60 mm Coverglasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5H glass bottom dishes</td>
			<td>Willco</td>
			<td>GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-um beads</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>72986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mm glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020 GC100F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um polystyrene microbeads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um red-fluorescent beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqcuisition cameras sCMOS</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Sona-4BV11-UNI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary camera (Figure 3, AUX)</td>
			<td>Blackfly, FLIR</td>
			<td>BFS-U3-200S6M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbryte 520</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>520 AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double scotch tape</td>
			<td>Biesse Adesivi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPI-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2A-mCh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Fusion-Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>Type B: 16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR protection googles</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lap2b-eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro loader pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>GELoader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroManager 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromiter slide</td>
			<td>ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tweezers platform</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td>Sensocell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OTs software (LightAce)</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing agent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post processing software (Matlab)</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-950/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>Spincoat G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DragonFly 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangular microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UNB 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers

Во время развития многоклеточного организма одна оплодотворенная клетка делится и дает начало множественным тканям с разнообразными функциями. Тканевый морфогенез идет рука об руку с молекулярными и структурными изменениями на уровне одной клетки, которые приводят к изменениям субклеточных механических свойств. Как следствие, даже внутри одной клетки разные органеллы и компартменты по-разному противостоят механическим воздействиям; и пути механотрансдукции могут активно регулировать свои механические свойства. Таким образом, способность клетки адаптироваться к микроокружению тканевой ниши частично обусловлена способностью ощущать и реагировать на механические напряжения. Недавно мы предложили новую парадигму механосенсации, в которой ядерная деформация и позиционирование позволяют клетке измерять физическую 3D-среду и наделяют клетку чувством проприоцепции для декодирования изменений в форме клеток. В этой статье мы опишем новый метод измерения сил и свойств материала, которые формируют ядро клетки внутри живых клеток, на примере адгезивных клеток и механически ограниченных клеток. Измерения могут быть выполнены неинвазивно с оптическими ловушками внутри клеток, а силы напрямую доступны через безкалибровочное обнаружение светового импульса. Это позволяет измерять механику ядра независимо от деформаций клеточной поверхности и позволяет рассеивать пути экстероцептивной и интероцептивной механотрансдукции. Важно отметить, что эксперимент по улавливанию может быть объединен с оптической микроскопией для исследования клеточного ответа и субклеточной динамики с использованием флуоресцентной визуализации цитоскелета, ионов кальция или ядерной морфологии. Представленный метод прост в применении, совместим с коммерческими решениями для измерения силы и может быть легко расширен для исследования механики других субклеточных компартментов, например, митохондрий, стресс-волокон и эндосом.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers at JoVE.com

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

Здесь мы представляем протокол исследования внутриклеточных механических свойств изолированных эмбриональных клеток рыбок данио в трехмерном заключении с прямым измерением силы оптической ловушкой.

Измерения прямой силы субклеточной механики в конфайнменте с помощью оптического пинцета

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Этот протокол препарирует отдельные механические свойства клеточного ядра, которые делают его механическим датчиком поляризации, дифференцировки и миграции клеток. Основным преимуществом этой методики является то, что она может измерять механические свойства и прикладывать силы к субклеточным компартментам без внешнего возмущения мембраны или кортикального цитоскелета. Протокол может быть легко адаптирован для манипулирования шариками внутри других клеток другого организма с целью изучения ядерной механики в различных клеточных линиях или животных моделях.Выравнивание датчика прямой силы имеет решающее значение для захвата всего света, создающего и покидающего оптические ловушки. Это обеспечит точные измерения светового импульса в вязкоупругой среде ячейки. Начните одноклеточную подготовку, поместив эмбрионы сферической стадии через четыре часа после оплодотворения в стеклянную посуду, содержащую среду Е3, с помощью пластиковой пипетки Пастера.Затем выберите эмбрионы, которые являются положительными для шариков и экспрессируйте флуоресцентный белок в случае инъекции мРНК. Используйте щипцы, чтобы вручную декурионировать эмбрионы и перенести примерно от 10 до 15 декурионированных эмбрионов в 1,5-миллилитровый реакционный контейнер с помощью стеклянной пипетки Пастера. Извлеките среду E3 из пробирки и добавьте 500 микролитров предварительно нагретой питательной среды, независимой от диоксида углерода.Осторожно встряхните трубку, избегая образования пузырьков, и убедитесь, что содержимое трубки становится мутным, поскольку клетки диссоциируют без больших кусков, видимых глазом. Затем центрифугируют трубку в 200 раз G в течение трех минут. После центрифугирования удалите супернатант и соберите гранулу, чтобы продолжить окрашивание клеток.Чтобы пометить ядро, повторно суспендируйте клетки, добавив в трубку 500 микролитров свежеприготовленного раствора для окрашивания красителя ДНК Hoechst. Инкубируйте окрашенные клетки в течение семи минут в темноте. Затем центрифугируют клетки, как описано ранее, и повторно суспендируют гранулу либо в 50 микролитрах DMEM для образцов в суспензии, либо в 20 микролитрах DMEM для клеток в конфайнменте.Для приготовления оптических траппингов или от-камеры для экспериментов с ячейками в суспензии вырежьте кусок двусторонней скотча с квадратным отверстием примерно 10 мм на 10 миллиметров в центре. Снимите один из защитных слоев ленты и поместите непокрытую сторону ленты в центр стеклянной нижней тарелки No 1,5 H. Осторожно прижмите ленту, чтобы вся поверхность ленты прилипла к стеклу, избегая при этом пузырьков воздуха и отслаивания оставшегося защитного слоя ленты.Инкубируйте поверхность со 100 микролитрами конканавалина А по 0,5 миллиграмма на миллилитр в течение 30 минут. Затем удалите каплю Конканавалина А и промойте поверхность DMEM. Добавьте 30 микролитров раствора, содержащего клетки, на поверхность полости.Затем очень осторожно закройте камеру с помощью покровного стекла размером 22 на 22 миллиметра. При необходимости используйте скальпель или щипцы. Затем приступайте к запуску оптического пинцета, включив лазер на значительно высокой мощности не менее чем за 30 минут до начала эксперимента, чтобы оптимизировать стабильность выходной мощности.Когда это будет сделано, включите электронный модуль оптических микроманипуляторов и единиц измерения силы. Перед выравниванием датчика оптической силы поместите каплю воды на объектив погружения в воду 60X 1.2 и поместите камеру, содержащую ячейки, на сцену. Сосредоточьтесь на нижней поверхности камеры, где будут размещены образцы клеток.После добавления капли погружного масла поверх стеклянного слайда крышки, покрывающего образец, опустите собирающую линзу блока датчика силы до тех пор, пока она не соприкоснется с каплей масла. Следуя стандартной процедуре выравнивания оптического датчика силы, посмотрите на изображение плоскости образца на вспомогательной камере, которая будет использоваться для позиционирования ОТ, затем опустите датчик оптической силы до тех пор, пока его полевая остановка не появится сопряженной с плоскостью образца. Чтобы проверить наличие пузырьков воздуха с помощью объектива Бертрана, наблюдайте за траекторией изображения через вспомогательную камеру.Если видны какие-либо пузырьки грязи или воздуха, очистите линзу и камеру безпылевой тканью хрусталика, прежде чем повторить процедуру, как описано, добавив больше погружного масла. С помощью боковых винтов, размещенных на держателе оптического датчика силы, центрируйте поле остановки в поле зрения. Для точности откройте поле остановки почти до того, чтобы занять поле зрения, видимое на вспомогательной камере.После помещения образца в микроскоп и выравнивания датчика оптической силы используйте вращающуюся полуволновую пластину, чтобы установить начальную мощность ловушки на 200 милливатт, если жесткость исследуемого ядра или исследуемой межклеточной структуры неизвестна. После этого используйте программный контроллер ступени микроскопа для поиска ячейки с одной или двумя шариками через передаваемую микроскопию Brightfield. В числовом листе запишите смещение и время каждого последующего шага траектории.В качестве альтернативы можно загрузить таблицу S1 из дополнительного материала. Для эксперимента со стрессом/релаксацией запрограммируйте трапециевидные нагрузки, которые будут применяться. В программном обеспечении OT активируйте оптические ловушки.Для захвата микросферы установите плоскости изображения немного выше бусины с помощью программного контроллера ступени микроскопа. Нажмите на полистирольную микрогранулу в откалиброванном вспомогательном окне изображения камеры. Успешное удержание шарика оптической ловушкой сильно уменьшит движение шарика.Нажмите и перетащите шарик через цитоплазму и поместите его на расстояние примерно двух микрон от ядерной оболочки. Убедитесь, что траектория установлена таким образом, чтобы углубление шарика было перпендикулярно ядерной мембране. Когда настройка будет готова, перейдите к программному обеспечению для обработки изображений и нажмите кнопку получения, чтобы начать получение изображения.Откройте окно принудительного чтения в режиме реального времени, нажмите на данные и сохраните в окне принудительного чтения в режиме реального времени, чтобы сохранить. Данные о положении пусковой ловушки и измерении силы. Инициируйте ранее загруженную траекторию, щелкнув правой кнопкой мыши по бусине и выбрав стартовую траекторию.Подождите, пока траектория не будет завершена, и система стабилизируется, прежде чем закончить запись данных измерения силы ловушки. Остановите получение изображений и отобразите результаты в программном обеспечении для постобработки. В репрезентативном анализе отображается изолированная стволовая клетка-предшественник рыбки данио с одной микросферой, близкой к ядру.Контролировалось распределение микросферы полистирола через пять часов после инъекции внутри эмбриона. Яркое и флуоресцентное изображение показывает, что шарики диспергированы по ткани эмбриона. Максимальная проекция конфокального флуоресцентного Z-стека и максимальная проекция подстека в той же области подтверждают, что большая доля глубоких ячеек содержала от одного до двух шариков.Через 24 часа после оплодотворения шарики были распределены по всему телу эмбриона. Получены микрофотографии Суспензионных ячеек Брайтфилда на замкнутых клетках с одной или двумя введенными шариками. Кроме того, множественные флуоресцентные метки облегчили исследование различных аспектов клеток, таких как межядерная мембрана, плазматическая мембрана, ДНК и трансгенная линия.Репрезентативные снимки описывали меченые Хёхстом ядра за пять секунд до/во время и через пять секунд после отступа с оптически захваченной микросферой. Изучены профили интенсивности вдоль сегмента отступа для трех различных рамок и траекторий дистальных и проксимальных границ ядра в ходе эксперимента по углублению взвешенных и замкнутых клеток. Была измерена захваченная траектория и сила, испытываемая оптически захваченной микросферой во время повторного эксперимента по ядерному углублению.Механика ядра в камерах в суспензии и под удержанием подтвердила, что удержание привело к расширению прогнозируемой площади и незначительному изменению ядерной жесткости. Если шарики вводят в эмбрион одной клеточной стадии, они, скорее всего, равномерно распределятся на более поздних стадиях. Помните, что бусина должна быть стабильно поймана в ловушку.Если шарик выходит из оптической ловушки, переопределите траекторию или увеличьте мощность лазера. Эти эксперименты могут быть легко выполнены на нескольких микрошариках внутри одной клетки и расширены до активных микрореологических измерений.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Прямая индукция гемогенного эндотелия и крови сверхэкспрессией факторов транскрипции в человека плюрипотентные стволовые клетки

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Использование изолированными митохондриями из минимальных количествах мыши скелетных мышц для Высокая пропускная MICROPLATE респираторных измерений

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Визуализация субклеточных структур в эмбрионе данио Living

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Анализ развития данио почки с течением времени покадровой визуализации Использование рассекает микроскопа, оборудованного для оптического секционирования

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Протокол для прямого преобразования мышиных эмбриональных фибробластов в трофобласт стволовых клеток

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Подкожный нейротрофин 4 Вливание с использованием осмотических насосов или прямой мышечной инъекции Усиление боли в горле гортани

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Проверка ячейки механики с шарик бесплатно Оптический пинцет в зародыша дрозофилы

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Прямые, Lineage перепрограммирование взрослых мыши фибробластов в эритроидные предшественники

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Изотропная световая микроскопия и автоматизированный анализ линии клеток для каталога Caenorhabditis elegans Embryogenesis с подклеточным разрешением

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...