Name: direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers at JoVE.com

MK bekräftar ekonomiskt stöd från det spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft genom plan Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), Severo Ochoa-programmet för kompetenscentrum inom R&D (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), från Fundació Privada Cellex, Fundació Mir-Puig och från Generalitat de Catalunya genom CERCA och forskningsprogrammet (2017 SGR 1012), utöver finansiering genom ERC (MechanoSystems) och HFSP (CDA00023/2018). V.R. bekräftar stöd från det spanska ministeriet för vetenskap och innovation till EMBL-partnerskapet, Centro de Excelencia Severo Ochoa, MINECO:s plan Nacional (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) och Generalitat de Catalunya (CERCA). V.V. bekräftar stöd från ICFOstepstones doktorandprogram som finansieras av EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtal 665884. Vi tackar Arnau Farré för kritisk läsning av manuskriptet; Maria Marsal för hjälp med avbildning och montering av 24 hpf embryot och; Senda Jiménez-Delgado för stöd med zebrafiskmikronjektioner.

Författarna har inget att avslöja.

I detta protokoll beskriver vi en unik metod för att förhöra de mekaniska egenskaperna hos cellkärnan inuti de levande cellerna. Till skillnad från andra kraftspektroskopitekniker, icke-invasiv optisk fångst tillät oss att frikoppla bidraget från cellmembranet och cytoskeleton från cellens kärnstelhet. Viktigt är att optisk mikromanipulering är kompatibel med multimodal mikroskopi, vilket gör det möjligt för experimenteraren att studera olika processer som är involverade i cellkärnmekanobiologi. Som ett representativt resultat använde vi DNA-Hoechst färgning för att mäta kärnan deformation vid indrag utförs av krafter i ordningen av flera hundra picoNewton.
Potentiella tillämpningar av vår metod utöver de exempel som beskrivs i detta protokoll Möjligheten att extrahera kvantitativ mekanisk information från mätningar inuti levande celler utan yttre störtdyningar möjliggör en mängd oöverträffade möjligheter som just har börjat utforskas. Således kan det presenterade protokollet för vår optiska mikromanipulationsplattform utvidgas till mer komplexa experiment med stor mångsidighet. Acoustooptiska deflektorer (AOD) kan generera flera optiska fällor för synkron kraftmätningar på olika cellplatser, samt kan användas för aktiv mikrorheologi i ett brett frekvensområde51,61. Som nämnts kan kraftresponsen vid indrag övervinna den maximala fångstkraften, vilket leder till att pärlan flyr från den optiska fällan. I det här fallet kan en kraftåterkoppling konfigureras med AOD för att klämma fast den optiska kraften. Sammantaget kan flera mikrorheologiska metoder, såsom stressavslappningen som beskrivs i detta protokoll, men också aktiv mikrorheologi eller krypefterlevnad, experimentellt erhållas med denna plattform och noggrant analyseras av nya programvarupaket61,62,63,64,65 . Dessutom är användningen av krafter inte begränsad till kärnan utan skulle i princip kunna utföras för att mäta olika intracellulära strukturer och i komplexa vävnader, vilket visats för att fånga strömmande röda blodkroppar inuti intakta blodkärl66,67 eller fånga och deformera kloroplaster och mitokondrier68 . Ljus-momentum kalibrering är oberoende av formen och storleken på det fångade objektet, vilket möjliggör direkta kraftmätningar på alla kraftsonder med godtycklig form38,39. Användningen av injicerade mikrosfärer gjorde det möjligt för oss att applicera höga krafter på kärnan med relativt låg lasereffekt jämfört med direkt manipulering av cellulära strukturer69,70,71. Men med tanke på en tillräckligt hög brytningsindexskillnad är ingen externt applicerad kraftsond nödvändig och intracellulära organeller kan manipuleras direkt utan injicerade pärlor (opublicerade observationer och referens70).
Potentiella ändringar av vår metod för att utöka applikationerna Olika storlekar av mikrober kan injiceras beroende på experimentet, men de relativa kontrollerna måste göras. Till exempel, för att studera celler i senare skeden kan mindre pärlor injiceras. Detta minskar den maximala kraft som kan utövas av den optiska fällan (t.ex. visas i referens55). Större pärlor kan injiceras för att utöva högre krafter, men dessa kan påverka embryoutvecklingen beroende på deras storlek eller intressestadium. I experiment där mikrobadinjektion inte är ett alternativ kan olika organeller som uppvisar brytningsindexskillnader jämfört med cytoplasmans fortfarande manipuleras optiskt, vilket ger upphov till optiska krafter som kan mätas från ljusmomentumförändringar42. Som nämnts ovan har dessa metoder använts av Bambardekar m.fl. för att deformera cellcellskorsningar i Drosophila embryo70. På samma sätt har cellens kärna ett lägre brytningsindex än det omgivande medium44, vilket möjliggör pärlfri indrag (opublicerade observationer och referens72) även om den har en lägre fångststyrka. Således kan kärnan inte fångas lätt och flyr fällan.
Den spinnbelagda PDMS-distansen tillverkas via en bekväm och snabb metod men kan vara utom räckhåll för laboratorier utan tillgång till en mikro-/nanotillverkningsanläggning eller tekniska laboratorier. Således kan distansen enkelt monteras från labbband eller parafilm (steg 4). Protokollet kan också anpassas genom tillverkning av mikrofluidiska kanaler som automatiserar leveransen av enstaka celler till fördefinierade mätbrunnar eller in i en kammare med en definierad höjd för att uppskatta inneslutningseffekten inom samma prov. Sådana mikrofluidiska anordningar måste dock vara konstruerade så att de passar utrymmet mellan mikroskopmålet och den optiska kraftsensorns uppsamlingslins på cirka 2 mm (se steg 3). Observera att den optiska kraftsensorn måste placeras på lämplig höjd så att inga optiska avvikelser från defokusering påverkar fotonmomentummätningen.
Andra ändringar kan vara byte av biologiska reportrar. Vi fann att Hoechst fluorescens spektralblöder in i GFP-kanalen och vi föredrar därmed kombinationen med mCherry-taggad histon som en kärnmarkör för samtidig mätning i två fluorescerande kanaler. Alternativt kan kärndeformation enkelt spåras med en etikett riktad mot det inre kärnmembranet som Lap2b-GFP (figur 2).
Indentering på cellkärnan var i storleksordningen 2-3 mikron, som vi exakt kunde mäta genom bildanalys av diffraktion-begränsad spinning-disk confocal mikroskopi. När det gäller styvare kärnor eller mindre krafter kommer indraget knappt att vara mätbart med detta tillvägagångssätt. De absoluta kraftkalibrerade optiska pincetterna kan dock också kalibreras för positionsmätningar av den fångade pärlan på plats med hjälp av BFP-interferometri med nanometernoggrannhet51. Med denna metod kan spänningssignalen och den optiska kraftsensorn översättas till den fångade sondens position genom parametern β [nm/V], medan den invarianta parametern α [pN/V] ger kraftvärden genom ovannämnda ljus-momentumkalibrering41 (se nedan för detaljer).
Felsökning Vi fann att följande utmaningar kunde uppstå under experimentet:
Ingen stabil fälla bildas och mikrosfären flyr lätt Smuts på mikroskopmålet eller en felriktad korrigeringskrage kan leda till att en stabil fälla misslyckas. Om en omedelbar lösning inte hittas, mät objektivets punktspridningsfunktion. Om provexemplaret är djupt inne i en optiskt tät vävnad kan laserfokus uppleva allvarliga optiska avvikelser som leder till instabil fångst (denna effekt är vanligtvis försumbar i isolerade celler men blir tydligare i tjockare vävnader). För hög styvhet kan kärnans återställande kraft överstiga fällans utrymningskraft, så att mikrosfären går förlorad och indragsrutinen misslyckas. Inledningsvis blir kärnmembrankanten proximal till den optiska fällan knappt indragen (figur S2A). När detta inträffar påverkas inte heller svällningslasern av kraft och brownsk rörelse, vilket leder till en kraftfall till noll och en minskning av signalbruset (figur S2B). Om detta händer kan lasereffekten ökas för att ha en starkare fälla, amplituden hos trapetsformad bana som trycker pärlan i kärnan kan minskas, eller den fångade mikrobadens ursprungliga position kan ställas längre bort från kärnan.
Cellen rör sig under stimuleringen Om cellerna inte är tillräckligt fästa, kommer den optiska gradientfällan att flytta cellerna medan de utför den intracellulära indragsrutinen, så att kärnans krafter och underliggande mekanik är artefaktuella. För att förhindra förskjutning av hela cellen rekommenderar vi att koncentrationen av cell vidhäftning molekyler på ytan, t.ex. ConA.
Initial momentumkompensation Om en inledande momentumkompensationsrutin inte är tillgänglig i OTs-plattformen (steg 6.5) måste en artificiell, kraftoberoende baslinjesignal korrigeras för. Detta är synligt som en lutning på kraftkurvan även utan att pärlan är instängd (figur S1E). För att göra korrigeringen måste samma bana utföras utan en pärla, utanför cellen på exakt samma position. För detta flyttar du cellen bort från fällan med hjälp av scenkontrollen. Som referens ändras kraftförskjutningen 5 pN över FOV vid 200 mW i vårt system; således blir det försumbart för korta banor. Alternativt kan ett piezo-skanningsstadium användas för att flytta cellerna på provet och lämna laserpositionen konstant.
Kritiska steg i det presenterade protokollet Mikrosfärer ska injiceras i rätt 1-cellsstadium för att säkerställa maximal fördelning över embryot. Pärlor bör inte vara fluorescerande så att inget ljus läcker in i de fluorescerande kanaler som används för avbildning. Till exempel är även typiska röd-fluorescerande pärlor tydligt synliga i den blå kanalen som används för att avbilda cellkärnan efter Hoechst-färgning på grund av deras ljusstyrka (excitation: 405 nm; emission: 445 nm). Stabil fastsättning av cellen på substratet är avgörande för att förhindra lateral förskjutning under indragningsrutinen. Om cellen rör sig under rutinen underskattas krafterna. Om detta skulle hända ofta optimerar du protokollet för bifogade filer. För vävnadsodlingsceller leder andra cell vidhäftningsproteiner, såsom fibroktin, kollagen eller poly-L-lysin, till tillfredsställande fastsättning (opublicerade observationer). Under inneslutningen utsätts cellerna för en plötslig och allvarlig mekanisk stress. Detta kan orsaka skador på cellerna och ofta kommer experimenteraren att stöta på spruckna celler om proceduren inte utförs noggrant. Om inneslutningshöjden är för liten kommer alla celler att drabbas av nukleär omslutningsbrott eller irreversibel skada. För att mildra dessa sänker du det övre täcket långsammare och/eller ökar avståndet mellan täckslipet.
Begränsningar av tekniken och förslag för att övervinna dem En tydlig begränsning av tekniken är laserljusets penetration i djupa delar av vävnaden, vilket leder till avvikelser och instabil fångst. Således beror en lägre gräns för penetrationsdjupet på provets klarhet, avvikelsekorrigeringen som kan användas73 och den applicerade lasereffekten. Det bör beaktas att en högre lasereffekt leder till termisk excitation av provet i närheten av mikrosfären. Uppvärmningen av provet som härrör från laserpunkten på 1064 nm minimeras dock för att undvika rimlig värmerelaterad stress på våra biologiska prover74.
En annan begränsning är den maximala kraft som kan mätas. Även om direkt ljus-momentumdetektering möjliggör kraftmätningar långt bortom den optiska trapets linjära responsregim40,41, är den maximala applicerade kraften i en ordning av några hundra picoNewtons. Detta begränsas av lasereffekt och följdskadetröskeln för mjukt biologiskt material och brytningsindexskillnaderna, som normalt inte är större än 0,1 eller 0,344. Flera metoder har föreslagits för att öka kraftdetekteringsgränsen, t.ex. med hjälp av strukturerat ljus75, antireflekterande belagda mikrosfärer76, högreaktiva indexpartiklar77 eller mycket dopade kvantprickar78.
OTs kan användas för nanometerskalans positionsmätningar genom BFP-interferometri, så att pärlans position i fällan är Δx = β Sx, där Sx är sensorns spänningssignal, och β [μm/V] kan kalibreras i farten enligt olika protokoll35,54. För en optisk kraftsensor kan det bevisas att spänning-till-kraft-invariant omvandlingsfaktorn α [pN/V] direkt relaterar till β och fällans styvhet, k [pN/μm], genom α = kβ 37) I experiment med pärlförskjutningar som är för små för att detekteras från optisk avbildning kan denna strategi användas för att komplettera kraftmätningar med liten positionsdetektering. Ett exempel är tillämpningen av de experimentella rutiner som presenteras här på mycket styva kärnor, för vilka krafter vid rimliga laserkrafter (200-500 mW) inte är tillräckliga för att inducera indenteringsvärden som är tillräckligt stora. I så fall måste pärlan komma i kontakt med kärnan och svällningsstelheten måste kalibreras före mätningen (steg 8.6). Kärnans indrag d som en funktion av kraft kan indirekt bestämmas som:
d = xtrap - F/k
där xtrap är fällans position. Till skillnad från den invarianta ljus-momentumfaktorn α [pN/V], måste faktorn β [μm/V] kalibreras före varje experiment eftersom den beror på många lokala variabler som bestämmer svällningsdynamiken, såsom partikelstorlek, optisk trap spot-storlek och relativa brytningsindex.

Vävnadsmorfogenes är en komplex process där biokemiska signaler och fysiska krafter samordnas spatiotemporally. I det framväxande embryot dikterar gradienter av biokemiska signalfaktorer ödesspecifikationen och säkerställer korrekt vävnadsmönster1,2. Samtidigt spelar inneboende och extrinsiska krafter en roll i uppbyggnaden av embryots arkitektur3,4. Cellbarkens påverkan i detta sammanhang har studerats utförligt5,6. Den täta sammankopplingen mellan mekanokemiska processer under morfogenes förlitar sig på egenskaperna hos enskilda celler för att känna av och reagera på mekaniska krafter i deras vävnadsmikromiljön. Celler avkodar därmed mekaniska signaler via närvaron av kraftkänsliga subcellulära och molekylära element som omvandlar mekanisk information till specifika signalvägar som styr cellbeteende, cellöde och cellmekanik.
Ett kännetecken för utvecklingsprocesser är att celler organiserar sig som grupper för att bygga multicellulära strukturer. Som sådan omorganiserar och rör sig enstaka celler sällan ensamma men är associerade i en snäv sociotop där de visar kollektivt beteende som supracellulär migration7, (un)jamming övergångar8,9 eller blastocyst komprimering10. Mekaniska krafter som genereras inom och mellan celler fungerar som viktiga ledtrådar för att instruera kollektiv celldynamik7,11. Men även när celler rör sig ensamma, såsom stamceller som klämmer sig mellan vävnadsark eller smala vävnadsnischer, upplever de omfattande anisotropa mekaniska krafter när de navigerar i en tredimensionell miljö. Dessa mekaniska påfrestningar på celler har djupgående konsekvenser för cellulärt beteende12,13. Flera mekanismer har undersökts som konvergerar på kärnan som ett stort mekanotransduktionselement14,15, som passivt eller aktivt mekaniskt element under migrering inom en tät 3D-vävnadsmiljö15,16.
Vi föreslog nyligen en mekanism som utrustar celler för att mäta formdeformationer med kärnan som en elastisk intracellulär mekano-gauge12. Kärnan, som är den största organellen i en cell, genomgår stora deformationer när celler polariserar, migrerar eller ändrar sin form under mekanisk sträckning, inneslutning eller osmotisk stress16,17,18,19. Vi fann att nukleära kuvert sträcker sig tillsammans med den intracellulära positionering av kärnan ger cellerna information om omfattningen och typen av cell deformation (såsom cell komprimering kontra cell svullnad). Sträckning av kärnan är associerad med en utfällning av det inre kärnmembranet (INM), som främjar kalciumberoende cPLA2 (cytosolic phospholipase A2) lipas aktivitet vid INM följt av frisättning av Arakidonsyra (AA) och snabb aktivering av myosin II vid cellbarken. Detta leder till ökad cellkontraktilitet och amöboid cellmigrering över en tröskel för när contractility6. Det mekanosensitiva svaret på cell deformation uppstår på mindre än en minut och är reversibel vid inneslutning release, vilket tyder på att kärnan fungerar som en stammätare för cellulära proprioception som reglerar adaptiva cell beteende under mekaniska stressförhållanden. Denna mekanosensitiva väg har visat sig vara aktiv i stamceller från zebrafiskembryon, både i pluripotenta och härstamningsbegångna celler12 och bevaras i olika arter och cellinjer20.
Förutom de nukleära egenskaperna som cell-mekanosensor regleras kärnarkitektur och mekanik i sig under utvecklingen och som svar på cell fate specification21, vilket gör cellulär mekanokänslighet22,23. Konsekvensen kan bli en förändring av kärnefterlevnaden som möjliggör morfologiska förändringar och övergångar från en premiär till en migrationsstat och vice versa8.
Flera tekniker för att mäta cellkärnmekanik har tillämpats, såsom atomkraftmikroskopi24,25, mikropipette aspiration26,27, mikrofluidisk teknik28 och mikroneedles29. Många av dessa tekniker är dock invasiva i den meningen att hela cellen måste deformeras, vilket begränsar mätningen av mekaniska egenskaper och kraftberoende svar från själva kärnan. För att kringgå samtidig deformation av cellytan och dess mekanosensitiva cell cortex30 studerades isolerade kärnor i olika sammanhang31,32. Det kan dock inte uteslutas att kärnisolering är förknippat med en förändring av mekaniska kärnegenskaper och deras reglering (referens24 och egna opublicerade observationer).
Optisk pincett (OTs) är en mångsidig teknik som har tillåtit en mängd experiment inom cellmekanobiologi och har varit avgörande för vår förståelse av hur molekylära maskiner omvandlar kemiska till mekanisk energi33,34. Optiska pincett använder en tätt fokuserad laserstråle för att utöva optiska krafter på dielektriska partiklar som har ett brytningsindex högre än det omgivande mediet33. Sådana krafter kan vara i storleksordningen hundratals pico-Newtons och resultera i effektiv inneslutning av partikeln inom laserfällans fokus, vilket möjliggör manipulering av den fångade partikeln i tre dimensioner. Användningen av ljus har en viktig fördel genom att mätningen kan utföras icke-invasivt inuti levande celler. Optiska manipuleringar är ytterligare begränsade till laserstrålens fallfokus. Därför kan manipuleringen utföras utan att stimulera de omgivande cellmembranen och stör inte aktinbarken eller mekanosensitiva processer vid plasmamembranet, såsom tvångsberoende aktivering av jonkanaler.
Svårigheten med den optiska pincettmetoden är att exakt bestämma de krafter som appliceras på mikrosfären med hjälp av klassiska metoder som förlitar sig på indirekt kraftkalibrering baserad på equipartition-satsen eller användningen av definierade Stokes-dragkrafter för att mäta en lasereffektberoende flyktkraft35. Medan dessa metoder är enkla att genomföra i ett in vitro-experiment, kan de vanligtvis inte översättas till en cellulär miljö. Flera strategier har införts i fältet som bygger på en direkt kraftkalibrering, som härrör från de första principerna för momentumbevarande36,37. Till skillnad från andra kraftspektroskopimetoder härleds kraftmätningar från ett lokalt utbyte av ljusmomentum med den godtyckligt formade fångade partikeln38,39. I vår experimentella uppsättning mäts förändringar i ljusmomentum som uppstår från optiska krafter direkt utan behov av in situ trap kalibrering40,41,42,43. Således blir mätningarna möjliga i en trögflytt miljö som cellens inre eller till och med inom en vävnad, och krafter kan lätt kvantifieras ner till pN-nivån.
I detta protokoll beskriver vi en analys för att mekaniskt manipulera intracellulära organeller eller strukturer och kvantitativt bedöma deras mekaniska egenskaper genom en optisk pincettuppsättning. Denna uppsättning är integrerad i ett snurrande disk fluorescerande mikroskop som möjliggör parallell avbildning av cellulärt beteende eller intracellulär dynamik. Analysen möjliggör karakterisering av de mekaniska egenskaperna hos specifika cellulära fack, såsom kärnan, samtidigt som man studerar möjliga mekanorespons och aktivering av molekylära signalvägar som ett resultat av själva deformationen. Dessutom möjliggör optisk fångst av injicerade mikrober i celler en ökning av indragskraften tack vare ett betydligt högre brytningsindex för polystyrenpärlor (n = 1,59) jämfört med kärnans inneboende brytningskontrast44 (n ~ 1,35) jämfört med cytoplasma (n ~ 1,38). Den presenterade strategin kan enkelt anpassas till studier av andra intracellulära strukturer och organeller, liksom andra metoder som involverar aktiv mikrorheologi, användning av flera optiska fällor för att undersöka samma/ olika subcellulära strukturer samtidigt och mätningar riktade mot cellmekanobiologi i det levande embryot.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 22 mm cover glasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5 22x60 mm Coverglasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5H glass bottom dishes</td>
			<td>Willco</td>
			<td>GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-um beads</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>72986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mm glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020 GC100F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um polystyrene microbeads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um red-fluorescent beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqcuisition cameras sCMOS</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Sona-4BV11-UNI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary camera (Figure 3, AUX)</td>
			<td>Blackfly, FLIR</td>
			<td>BFS-U3-200S6M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbryte 520</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>520 AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double scotch tape</td>
			<td>Biesse Adesivi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPI-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2A-mCh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Fusion-Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>Type B: 16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR protection googles</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lap2b-eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro loader pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>GELoader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroManager 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromiter slide</td>
			<td>ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tweezers platform</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td>Sensocell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OTs software (LightAce)</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing agent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post processing software (Matlab)</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-950/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>Spincoat G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DragonFly 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangular microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UNB 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers

Under utvecklingen av en multicellulär organism delar en enda befruktad cell och ger upphov till flera vävnader med olika funktioner. Vävnadsmorfogenes går i hand med molekylära och strukturella förändringar på encellsnivå som resulterar i variationer av subcellulära mekaniska egenskaper. Som en följd av detta, även inom samma cell, motstår olika organeller och fack annorlunda än mekaniska påfrestningar; och mekanotransduktionsvägar kan aktivt reglera sina mekaniska egenskaper. En cells förmåga att anpassa sig till mikromiljön av vävnadsnisch beror således delvis på förmågan att känna och reagera på mekaniska påfrestningar. Vi föreslog nyligen ett nytt mekanosensationsparadigm där nukleär deformation och positionering gör det möjligt för en cell att mäta den fysiska 3D-miljön och ger cellen en känsla av proprioception för att avkoda förändringar i cellform. I den här artikeln beskriver vi en ny metod för att mäta de krafter och materialegenskaper som formar cellkärnan inuti levande celler, exemplifierade på vidhäftande celler och mekaniskt begränsade celler. Mätningarna kan utföras icke-invasivt med optiska fällor inuti celler, och krafterna är direkt tillgängliga genom kalibreringsfri detektering av ljusmomentum. Detta gör det möjligt att mäta kärnans mekanik oberoende av cellytans deformationer och möjliggöra dissekering av exteroceptiva och interoceptiva mekanotransduktionsvägar. Viktigt är att fångstexperimentet kan kombineras med optisk mikroskopi för att undersöka cellulär respons och subcellulär dynamik med hjälp av fluorescensavbildning av cytoskeletonen, kalciumjoner eller nukleär morfologi. Den presenterade metoden är enkel att tillämpa, kompatibel med kommersiella lösningar för kraftmätningar, och kan enkelt utökas för att undersöka mekaniken hos andra subcellulära fack, t.ex. mitokondrier, stressfibrer och endosomer.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers at JoVE.com

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka de intracellulära mekaniska egenskaperna hos isolerade embryonala zebrafiskceller i tredimensionell inneslutning med direkt kraftmätning av en optisk fälla.

Direkta kraftmätningar av subcellulär mekanik i inneslutning med optiska pincett

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Detta protokoll dissekerar de enskilda mekaniska egenskaperna hos cellkärnan som gör det till en mekanisk mätare för cellpolarisering, differentiering och migrering. Den största fördelen med denna teknik är att den kan mäta mekaniska egenskaper och applicera krafter på subcellulära fack utan yttre störning av membranet eller när cytoskeleton. Protokollet kan enkelt anpassas för att manipulera pärlor inuti andra celler i andra organismer för att studera kärnmekanik i olika cellinjer eller djurmodeller.Justering av den direkta kraftsensorn är avgörande för att fånga allt ljus som skapar och lämnar de optiska fällorna. Detta säkerställer exakta ljusmomentummätningar i viskoelastiskt medium i en cell. Börja encellsberedningen genom att placera sfärstegsembryon fyra timmar efter befruktningen i en glasfat som innehåller E3-media med hjälp av en pasteurpipeett av plast.Välj sedan embryon som är positiva till pärlorna och uttrycka det fluorescerande proteinet vid mRNA-injektion. Använd tång för att manuellt decurionera embryona och överföra cirka 10 till 15 dekurionerade embryon till en reaktionsbehållare på 1,5 milliliter med hjälp av en pasteurpipeett av glas. Ta bort E3-mediet från röret och tillsätt 500 mikroliter förvärmt koldioxidoberoende vävnadskulturmedium.Skaka försiktigt röret för att undvika bubbelbildning och se till att innehållet i röret blir grumligt när cellerna separerar utan några stora bitar synliga för ögat. Centrifugera sedan röret vid 200 gånger G i tre minuter. Efter centrifugering, ta bort supernatanten och samla pelleten för att fortsätta med cellfärgning.För att märka kärnan, återanvänd cellerna genom att tillsätta 500 mikroliter av den nyberedda DNA Hoechst-färgfärgningslösningen till röret. Inkubera de färgade cellerna i sju minuter i mörkret. Centrifugera sedan cellerna enligt beskrivningen tidigare och återanvända pelleten i antingen 50 mikroliter DMEM för prover i suspension eller 20 mikroliter DMEM för celler i inneslutning.För beredning av de optiska fällorna eller OT-kammaren för experimenten med cellerna i suspension, skär en bit dubbelsidig scotch tejp med ett cirka 10 millimeter x 10 millimeter kvadratiskt hål i mitten. Skala av ett av tejpens skyddande lager och placera tejpens oskyddade sida i mitten av en bottenskål med nummer 1,5 H. Tryck försiktigt på tejpen för att få hela tejpens yta att fästa på glaset samtidigt som du undviker luftbubblor och skalar av tejpens återstående skyddande lager.Inkubera ytan med 100 mikroliter Concanavalin A vid 0,5 milligram per milliliter i 30 minuter. Ta sedan bort droppen av Concanavalin A och skölj ytan med DMEM. Tillsätt 30 mikroliter av lösningen som innehåller cellerna på hålighetsytan.Stäng sedan kammaren mycket försiktigt med ett 22 x 22 millimeters täckglas. Använd en skalpell eller tång om det behövs. Fortsätt sedan med optisk pincettstart genom att slå på lasern med betydligt hög effekt i minst 30 minuter före experimentet för att optimera uteffektens stabilitet.När du är klar slår du på elektronikmodulen för de optiska mikromanipulerings- och kraftmätningsenheterna. Innan du justerar den optiska kraftsensorn, sätt en droppe vatten på 60X 1.2 vattensänkningsmålet och placera kammaren som innehåller cellerna på scenen. Fokusera på den nedre ytan av kammaren där cellproverna kommer att placeras.Efter att ha lagt till en droppe nedsänkningsolja ovanpå täckglasglaset som täcker provet, sänk kraftsensorenhetens uppsamlingslins tills den kommer i kontakt med oljedroppen. Enligt standardproceduren för den optiska kraftsensorns inriktning, titta på provplanets bild på hjälpkameran som ska användas för att placera OTs och sänk sedan den optiska kraftsensorn tills dess fältstopp verkar konjugerat på provplanet. För att kontrollera om det finns luftbubblor med Bertrand-objektivet, observera bildvägen genom hjälpkameran.Om smuts eller luftbubblor är synliga, rengör linsen och kammaren med dammfri linsvävnad innan du upprepar proceduren enligt beskrivningen och tillsätt mer nedsänkningsolja. Med hjälp av sidoskruvarna som placeras på hållaren på den optiska kraftsensorn centrerar du fältstoppet i synfältet. För noggrannhet öppnar du fältstoppet nästan för att uppta det synfält som är synligt på hjälpkameran.När provet har placerats i mikroskopet och justerat den optiska kraftsensorn, använd den roterande halvvågsplattan för att ställa in den ursprungliga svällningseffekten på 200 milliwatt om kärnans styvhet eller den undersökta intercellulära strukturen inte är känd. När du är klar, använd mikroskopstegets programvarustyrenhet för att leta efter en cell med en eller två pärlor genom överförd Brightfield-mikroskopi. Skriv förskjutningen och tiden för varje efterföljande bansteg i det numeriska bladet.Alternativt kan du ladda tabell S1 från tilläggsmaterialet. För ett stress- / avslappningsexperiment, programmera de trapetsformade belastningar som ska appliceras. Aktivera de optiska fällorna i OT-programvaran.För att fånga en mikrosfär ställer du in bildplan något ovanför pärlan med en mikroskopstegprogramkontroll. Klicka på polystyrenmikrobern i det kalibrerade hjälpkamerafönstret. Framgångsrik inneslutning av pärlan av den optiska fällan kommer starkt att minska pärlans rörelse.Klicka och dra pärlan över cytoplasman och placera den på ett avstånd av cirka två mikron från kärnhöljet. Se till att banan är inställd så att pärlan är vinkelrät mot kärnmembranet. När installationen är klar går du till bildprogrammet och klickar på anskaffningsknappen för att starta bildförvärv.Öppna realtidsfönstret för kraftläsning, klicka på data och spara i realtidskraftavläsningsfönstret för att spara. Starta svällningsposition och tvinga mätdata. Initiera den tidigare inlästa banan genom att högerklicka på pärlan och välja startbana.Vänta tills banan är klar och systemet stabiliseras innan du avslutar registreringen av mätdata för trapkraft. Stoppa bildförvärvet och rita resultaten i efterbehandlingsprogrammet. I den representativa analysen visas en isolerad zebrafisk stamcell med en enda mikrosfär nära kärnan.Distribution av polystyren mikrosfär fem timmar efter injektion inuti ett embryo övervakades. Brightfield och fluorescensbilden visar pärlor sprids över embryovävnaden. Maximal projektion av den konfokala fluorescerande Z-stacken och en maximal projektion av en delstack i samma region bekräftar att en stor del av djupa celler innehöll en till två pärlor.Vid 24 timmar efter befruktning distribuerades pärlorna över hela embryots kropp. Brightfield mikrografer av suspension cellerna på de begränsade cellerna med en eller två injicerade pärlor erhölls. Dessutom underlättade flera fluorescerande etiketter undersökningen av olika aspekter av cellerna, såsom internukleära membran, plasmamembran, DNA och transgen linje.Representativa ögonblicksbilder beskrev Hoechst-märkta kärnor fem sekunder före/under och fem sekunder efter indrag med en optiskt fångad mikrosfär. Intensitet profiler längs indentering segmentet för tre olika ramar och banor av de distala och proximal gränserna för kärnan under ett indentering experiment av suspenderade och begränsade celler studerades. Fångad bana och kraft som upplevs av den optiskt fångade mikrosfären under ett upprepat nukleärt indenteringsexperiment mättes.Kärnans mekanik i cellerna i suspension och under inneslutning bekräftade att inneslutningen resulterade i en utvidgning av det projicerade området och en obetydlig förändring i kärnstelhet. Om pärlor injiceras i embryot i ett cellsteg, kommer de sannolikt jämnt att distribueras i de senare stadierna. Kom ihåg att pärlan måste vara stabilt instängd.Om pärlan flyr från den optiska fällan, omdefiniera banan eller öka lasereffekten. Dessa experiment kan enkelt utföras på flera mikrober inuti en cell och utökas till aktiva mikrorheologimätningar.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Direkt Induktion av Hemogenic endotelet och Blood av Uttryck av transkriptionsfaktorer i Human pluripotenta stamceller

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Använda Isolerad Mitokondrier från minimala kvantiteter av mus skelettmuskulatur för hög genomströmning Mikroandnings Mätningar

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulära strukturer i vardagsZebraFish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analys av zebrafisk njure utveckling med Time-lapse avbildning med ett dissektionsmikroskop Utrustad för optisk Sektione

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Protokoll för direkt omvandling av Murina embryonala fibroblaster i trofoblaster stamceller

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Subkutan neurotropin 4-infusion med hjälp av osmotiska pumpar eller direkt muskelsprutning förbättrar åldrande råtta larynxmuskler

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Sondera Cell mekanik med pärla-fri optisk pincett i Drosophila embryot

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direkt härstamning omprogrammering av vuxen mus Fibroblast till erytroid stamfäder

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk Ljusplåt Mikroskopi och automatiserad cell Lineage analyser till katalogen Caenorhabditis elegans Embryogenesis med subcellulär upplösning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...