Name: direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers at JoVE.com

MK, İspanya Ekonomi ve Rekabetçilik Bakanlığı'nın Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), Severo Ochoa Ar-Ge Mükemmeliyet Merkezleri programı (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), Fundació Privada Cellex, Fundació Mir-Puig ve Generalitat de Catalunya'dan CERCA ve Research programı (2017 SGR 1012) aracılığıyla, ERC (MechanoSystems) ve HFSP (CDA00023/2018) aracılığıyla finansmana ek olarak. V.R., İspanya Bilim ve Yenilik Bakanlığı'nın EMBL ortaklığı Centro de Excelencia Severo Ochoa, MINECO'nun Plan Nacional (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) ve Generalitat de Catalunya'ya (CERCA) desteğini kabul ediyor. V.V., 665884 Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı tarafından finanse edilen ICFOstepstone Doktora Programı'ndan destek kabul ediyor. Arnau Farré'ye makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz; Maria Marsal, 24 hpf embriyonun görüntülenmesi ve montajı için yardım için; Senda Jiménez-Delgado zebra balığı mikronjeksiyonları ile destek için.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokolde, hücre çekirdeğinin canlı hücrelerin içindeki mekanik özelliklerini sorgulamak için benzersiz bir yöntem açıklıyoruz. Diğer kuvvet spektroskopisi tekniklerinden farklı olarak, non-invaziv optik bindirme, hücre zarı ve sitoskeletonun hücre nükleer sertliğinden katkısını ayırmamızı sağladı. Daha da önemlisi, optik mikromanipülasyon multimodal mikroskopi ile uyumludur, bu da deneycinin hücre nükleer mekanobiyolojisinde yer alan farklı süreçleri incelemesine izin verecektir. Temsili bir sonuç olarak, birkaç yüzlerce picoNewton düzenindeki kuvvetler tarafından gerçekleştirilen girinti üzerine çekirdek deformasyonunu ölçmek için DNA-Hoechst lekesini kullandık.
Yöntemimizin bu protokolde belirtilen örneklerin ötesinde potansiyel uygulamaları Canlı hücrelerin içindeki ölçümlerden, dış pertürbasyon olmadan nicel mekanik bilgiler çıkarma imkanı, yeni keşfedilmeye başlanan çok sayıda benzeri görülmemiş fırsat sağlar. Böylece, optik mikromanipülasyon platformumuzun sunulan protokolü, çok yönlülükle daha karmaşık deneylere genişletilebilir. Acousto optik deflektörler (AOD), farklı hücre konumlarında senkron kuvvet ölçümleri için birden fazla optik tuzak üretebilir ve geniş bir frekans aralığında aktif mikrorheoloji için kullanılabilir51,61. Belirtildiği gibi, girinti üzerine kuvvet tepkisi maksimum bindirme kuvvetinin üstesinden gelebilir ve boncukların optik tuzaktan kaçmasına yol açabilir. Bu durumda, optik kuvveti sıkıştırmak için AOD ile bir kuvvet geri bildirimi yapılandırılabilir. Sonuç olarak, bu protokolde açıklanan stres gevşemesi gibi birden fazla mikrorheolojik yaklaşım, aynı zamanda aktif mikrorheoloji veya sürünme uyumluluğu, bu platformla deneysel olarak elde edilebilir ve yeni yazılım paketleri tarafından iyice analiz edilebilir61,62,63,64,65 . Ayrıca, kuvvetlerin uygulanması çekirdekle sınırlı değildir, ancak prensip olarak çeşitli hücre içi yapıları ölçmek için ve bozulmamış kan damarlarının içine akan kırmızı kan hücrelerini hapsetmek için gösterildiği gibi karmaşık dokularda gerçekleştirilebilir66,67 veya kloroplastları ve mitokondrileri hapsetmek ve deforme etmek68 . Işık momentumu kalibrasyonu, sıkışan nesnenin şeklinden ve boyutundan bağımsızdır, bu nedenle rastgele şekle sahip herhangi bir kuvvet probunda doğrudan kuvvet ölçümleri sağlar38,39. Enjekte edilen mikroküreçlerin kullanımı, hücresel yapıların doğrudan manipülasyonuna kıyasla nispeten düşük lazer gücüyle çekirdeğe yüksek kuvvetler uygulamamızı sağladı69,70,71. Bununla birlikte, yeterince yüksek bir kırılma indeksi farkı göz önüne alındığında, dışarıdan uygulanan bir kuvvet probu gerekli değildir ve hücre içi organeller enjekte edilmiş boncuklar (yayınlanmamış gözlemler ve referans70) olmadan doğrudan manipüle edilebilir.
Uygulamaları genişletmek için yöntemimizin olası değişiklikleri Deneye bağlı olarak farklı boyutlarda mikrobead enjekte edilebilir, ancak göreli kontroller yapılmalıdır. Örneğin, hücreleri daha sonraki aşamalarda incelemek için daha küçük boncuklar enjekte edilebilir. Bu, optik tuzak tarafından uygulanabilecek maksimum gücü azaltacaktır (referans55'te gösterildiği gibi). Daha yüksek kuvvetler uygulamak için daha büyük boncuklar enjekte edilebilir, ancak bunlar büyüklüklerine veya ilgi aşamalarına bağlı olarak embriyo gelişimini etkileyebilir. Mikrobead enjeksiyonunun bir seçenek olmadığı deneylerde, sitoplazma ile karşılaştırıldığında kırılma endeksleri farklılıkları gösteren çeşitli organeller hala optik olarak manipüle edilebilir ve ışık momentumu değişikliklerinden ölçülebilir optik kuvvetlere yol açabilir42. Yukarıda belirtildiği gibi, bu yöntemler Bambardekar ve ark. tarafından Drosophila embriyosunda hücre-hücre bağlantılarını deforme etmek için 70'tir. Aynı şekilde, hücrenin çekirdeği çevredeki medium44'ten daha düşük bir kırılma indeksine sahiptir, bu da daha düşük bindirme gücüne sahip olsa bile boncuksuz girintiye (yayınlanmamış gözlemler ve referans72) izin verir. Böylece çekirdek kolayca tuzağa düşürülemez ve tuzaktan kaçar.
Spin kaplı PDMS aralayıcı, kullanışlı ve hızlı bir yöntemle üretilmiştir, ancak mikro/nanofabrikasyon tesisine veya mühendislik laboratuvarlarına erişimi olmayan laboratuvarlar için ulaşılamaz olabilir. Böylece, aralayıcı laboratuvar bandından veya parafilmden kolayca monte edilebilir (adım 4). Protokol ayrıca, tek hücrelerin önceden tanımlanmış ölçüm kuyularına veya aynı numune içindeki hapsetme etkisini tahmin etmek için tanımlanmış yüksekliğe sahip bir odaya teslimini otomatikleştiren mikroakışkan kanallar üretilerek de uyarlanabilir. Bununla birlikte, bu tür mikroakışkan cihazlar, mikroskop hedefi ile optik kuvvet sensörünün toplama lensi arasındaki boşluğu yaklaşık 2 mm'ye sığacak şekilde tasarlanmalıdır (bkz. adım 3). Optik kuvvet sensörünün uygun yüksekliğe yerleştirilmesi gerektiğini unutmayın, böylece odaklamadan kaynaklanan optik sapmalar foton momentum ölçümünü etkilemez.
Diğer değişiklikler arasında biyolojik muhabirlerin değiştirilmesi de yer alabilir. Hoechst floresan'ın GFP kanalına spektral olarak aktığı tespit ettik ve böylece iki floresan kanalda eşzamanlı ölçüm için nükleer bir işaretleyici olarak mCherry etiketli histon ile kombinasyonu tercih ediyoruz. Alternatif olarak, nükleer deformasyon Lap2b-GFP gibi iç nükleer membranı hedefleyen bir etiketle kolayca takip edilebilir (Şekil 2).
Hücre çekirdeğine girinti, kırınım sınırlı iplik diski konfokal mikroskopisinin görüntü analiziyle doğru bir şekilde ölçebildiğimiz 2-3 mikronluk bir sıradaydı. Daha sert çekirdekler veya daha küçük kuvvetler için, girinti bu yaklaşım kullanılarak zar zor ölçülebilir olacaktır. Bununla birlikte, mutlak kuvvet kalibreli optik cımbızlar, nanometre doğruluğunda BFP interferometri kullanılarak sıkışan boncuk in situ'nun konum ölçümleri için de kalibre edilebilir51. Bu yaklaşım kullanılarak, voltaj sinyali ve optik kuvvet sensörü β [nm/V] parametresi aracılığıyla sıkışmış probun konumuna çevrilebilirken, [pN/V] α sabit parametre yukarıda belirtilen ışık momentumu kalibrasyonu41 aracılığıyla kuvvet değerleri verir (ayrıntılar için aşağıya bakın).
Sorun giderme Deney sırasında aşağıdaki zorlukların ortaya çıkabileceğini gördük:
Kararlı bir tuzak oluşmaz ve mikroküre kolayca kaçar Mikroskop hedefteki herhangi bir kir veya yanlış hizalanmış bir düzeltme tasması, kararlı bir tuzağın arızalanmasına neden olabilir. Hemen bir çözüm bulunamazsa, objektif lensin nokta yayma işlevini ölçün. İlgi örneği optik olarak yoğun bir dokunun derinliklerindeyse, lazer odağı kararsız bindirmeye yol açan ciddi optik sapmalarla karşılaşabilir (bu etki genellikle izole hücrelerde ihmal edilebilir, ancak daha kalın dokularda daha belirgin hale gelir). Yüksek sertlik için, çekirdeğin geri yükleme kuvveti tuzağın kaçış kuvvetini aşabilir, böylece mikroküreği kaybolur ve girinti rutini başarısız olur. Başlangıçta, optik kapanın proksimal nükleer membran kenarı neredeyse girintilenir (Şekil S2A). Bu durumda, bindirme lazeri artık kuvvet ve Brownian hareketinden etkilenmez, bu da kuvvetin sıfıra düşmesine ve sinyal gürültüsünün azalmasına neden olur (Şekil S2B). Bunun olması durumunda, lazer gücü daha güçlü bir tuzağa sahip olacak şekilde artırılabilir, boncukları çekirdeğe iten yamuk yörüngesinin genliği azaltılabilir veya sıkışan mikrobun başlangıç konumu çekirdeğin daha uzağına ayarlanabilir.
Hücre uyarılma sırasında hareket ediyor Hücreler yeterince bağlı değilse, optik degrade tuzağı hücre içi girinti rutinini gerçekleştirirken hücreleri hareket ettirir, böylece çekirdeğin kuvvetleri ve altta yatan mekaniği artetseldir. Tüm hücrenin yer değiştirmesini önlemek için, örneğin ConA gibi yüzeydeki hücre yapışma moleküllerinin konsantrasyonunu artırmanızı öneririz.
İlk momentum telafisi OTs platformunda (adım 6.5) ilk momentum dengeleme yordamı mevcut değilse, yapay, kuvvet bağımsız bir taban çizgisi sinyalinin düzeltilmesi gerekir. Bu, boncuk sıkışmamış olsa bile kuvvet eğrisinde bir eğim olarak görülebilir (Şekil S1E). Düzeltmeyi yapmak için, aynı yörüngenin bir boncuk olmadan, hücrenin dışında tam olarak aynı konumda yapılması gerekir. Bunun için, sahne alanı denetimini kullanarak hücreyi tuzaktan uzaklaştırın. Referans olarak, kuvvet uzaklığı sistemimizde 200 mW'ta FOV genelinde 5 pN değişir; böylece, kısa yörüngeler için ihmal edilebilir hale gelir. Alternatif olarak, örnekteki hücreleri hareket ettirmek için lazer konumunu sabit bırakarak bir piezo tarama aşaması kullanılabilir.
Sunulan protokolün kritik adımları Embriyo üzerinde maksimum dağılımı sağlamak için mikroküreçler sağ, 1 hücreli aşamada enjekte edilmelidir. Boncuklar floresan olmamalıdır, böylece görüntüleme için kullanılan floresan kanallara ışık sızmaz. Örneğin, tipik kırmızı floresan boncuklar bile parlaklıkları nedeniyle Hoechst lekelenmesinden sonra hücre çekirdeğini görüntülemek için kullanılan mavi kanalda açıkça görülebilir (heyecan: 405 nm; emisyon: 445 nm). Hücrenin alt tabakaya kararlı bir şekilde bağlanması, girinti rutini sırasında yanal yer değiştirmeyi önlemek için kritik öneme sahiptir. Hücre rutin sırasında hareket ederse, kuvvetler hafife edilir. Bu sık sık gerçekleşirse, ek protokolünü en iyi duruma getirin. Doku kültürü hücreleri için fibronektin, kollajen veya poli-L lizin gibi diğer hücre yapışıklık proteinleri tatmin edici bağlanmaya (yayınlanmamış gözlemler) yol açar. Hapsetme sırasında hücreler ani ve şiddetli mekanik strese maruz kalır. Bu, hücrelere zarar verebilir ve prosedür dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmezse deneyci sık sık patlayan hücrelerle karşılaşır. Ayrıca, hapsetme yüksekliği çok küçükse, tüm hücreler nükleer sarmal kırılma veya geri dönüşü olmayan hasardan muzdarip olacaktır. Bunları azaltmak için üst kapak kapağını daha yavaş küseyin ve/veya kapak arasındaki aralığı artırın.
Tekniğin sınırlamaları ve bunların üstesinden gelmek için öneriler Tekniğin açık bir sınırlaması, lazer ışığının dokunun derin bölümlerine nüfuz etmesidir, bu da sapmalara ve dengesiz bindirmeye yol açar. Bu nedenle, penetrasyon derinliğinin bir alt sınırı, numunenin netliğine,73 kullanılabilen sapma düzeltmeye ve uygulanan lazer gücüne bağlıdır. Daha yüksek bir lazer gücünün mikrokürenin çevresindeki numunenin termal olarak çıkarılmasına yol açtığı dikkate alınmalıdır. Bununla birlikte, 1064 nm dalga boyu lazer noktasının neden olduğu numunenin ısıtılması, biyolojik numunelerimize ısı ile ilgili makul stresi önlemek için en aza indirilmektedir74.
Diğer bir sınırlama, ölçülebilecek maksimum kuvvettir. Doğrudan ışık momentumu algılaması, optik trap40,41'in doğrusal tepki rejiminin çok ötesinde kuvvet ölçümleri sağlasa da, maksimum uygulanan kuvvet birkaç yüz picoNewtons sırasına göredir. Bu, lazer gücü ve buna bağlı olarak yumuşak biyolojik malzemenin hasar eşiği ve normalde 0,1 veya 0,344'ten büyük olmayan kırılma indeksi farklılıkları ile sınırlıdır. Güç algılama sınırını artırmak için çeşitli yöntemler önerilmiştir, örneğin yapılandırılmış light75, yansıma önleyici kaplamalı mikroküreler76, yüksek kırılma indeksi parçacıkları77 veya yüksek doped kuantum noktaları78 kullanılarak.
BFP interferometrisi aracılığıyla nanometre ölçeğinde konum ölçümleri için kullanılabilir, böylece boncukun tuzak içindeki konumu Δx = β Sx'tir, burada Sx sensörün voltaj sinyalidir ve β [μm/V] farklı protokoller35,54'ü izleyerek anında kalibre edilebilir. Optik kuvvet sensörü için, [pN/V] α gerilimden kuvvete sabit dönüştürme faktörünün doğrudan β ve tuzak sertliği ile ilişkili olduğu kanıtlanabilir, k [pN/μm], α = kβ 37) Optik görüntülemeden tespit edilemeyecek kadar küçük boncuk yer değiştirmeleri ile yapılan deneylerde, bu strateji kuvvet ölçümlerini küçük konum tespiti ile tamamlamak için kullanılabilir. Burada sunulan deneysel rutinlerin, makul lazer güçlerindeki (200-500 mW) kuvvetlerin yeterince büyük girinti değerlerini teşvik etmek için yeterli olmadığı çok sert çekirdeklere uygulanması bir örnektir. Bu durumda, boncukun çekirdekle temas etmesi ve bindirme sertliğinin ölçümden önce kalibre edilmesi gerekir (adım 8.6). Çekirdeğin kuvvet fonksiyonu olarak girintisi dolaylı olarak şu şekilde belirlenebilir:
d = xtrap - F/k
burada xtrap tuzak konumudur. [pN/V] α değişmez ışık momentum faktöründen farklı olarak, parçacık boyutu, optik bindirme noktası boyutu ve göreli kırılma indeksleri gibi bindirme dinamiklerini belirleyen birçok yerel değişkene bağlı olduğundan, [pN/V] faktör β [μm/V] her deneyden önce kalibre edilmesi gerekir.

Doku morfogenez, biyokimyasal sinyallerin ve fiziksel kuvvetlerin mekansal olarak koordine olduğu karmaşık bir süreçtir. Gelişmekte olan embriyoda, biyokimyasal sinyal faktörlerinin gradyanları kader spesifikasyonunu belirler ve doğru doku desenini sağlar1,2. Aynı zamanda, içsel ve dışsal kuvvetler embriyonun mimarisinin inşasında rol oynar3,4. Hücre korteksi mekaniğinin bu bağlamdaki etkisi kapsamlı bir şekilde incelenmiştir5,6. Morfogenez sırasında mekano-kimyasal işlemler arasındaki sıkı bağlantı, doku mikroçevrimindeki mekanik kuvvetleri hissetme ve yanıt verme özelliklerine dayanır. Hücreler, böylece mekanik bilgileri hücre davranışını, hücre kaderini ve hücre mekaniğini kontrol eden belirli sinyal yollarına dönüştürücü kuvvete duyarlı hücre altı ve moleküler elementlerin varlığıyla mekanik sinyallerin kodunu çözer.
Gelişimsel süreçlerin ayırt edici özelliği, hücrelerin çok hücreli yapılar oluşturmak için gruplar olarak düzenlenmesidir. Bu nedenle, tek hücreler nadiren yeniden düzenlenir ve tek başına hareket eder, ancak supracellular migration7, (un) jamming transitions8,9 veya blastocyst compaction10 gibi kolektif davranışlar gösterdikleri sıkı bir sosyotopta ilişkilidir. Hücreler içinde ve hücreler arasında üretilen mekanik kuvvetler, kolektif hücre dinamiklerini öğretmek için önemli ipuçları olarak hizmet eder7,11. Ancak hücreler tek başlarına hareket etseler bile, doku tabakaları veya dar doku nişleri arasında yol alan progenitör hücreler gibi, üç boyutlu bir ortamda gezinirken geniş anizotropik mekanik kuvvetler yaşarlar. Hücreler üzerindeki bu mekanik gerilmeler hücresel davranış üzerinde derin sonuçlar doğurur12,13. Yoğun bir 3D doku ortamında göç sırasında pasif veya aktif mekanik eleman olarak ana mekanotransdüksiyon elemanı14,15 olarak çekirdek üzerinde birleşen çeşitli mekanizmalar araştırılmıştır15,16.
Yakın zamanda çekirdekleri elastik hücre içi mekano-ölçer olarak kullanarak şekil deformasyonlarını ölçmek için hücreleri donatan bir mekanizma önerdik12. Bir hücredeki en büyük organel olan çekirdek, hücreler mekanik esneme, hapsetme veya ozmotik stres altında polarize olduğunda, göç ettiğinde veya şekillerini değiştirdiğinde büyük deformasyonlara uğrar16,17,18,19. Çekirdeklerin hücre içi konumlandırılması ile birlikte nükleer zarfın hücrelere hücre deformasyonunun büyüklüğü ve türü (hücre sıkışması ve hücre şişmesi gibi) hakkında bilgi sağladığını bulduk. Çekirdeğin gerilmesi, INM'de kalsiyuma bağımlı cPLA2 (sitozolizik fosfolipaz A2) lipaz aktivitesini destekleyen iç nükleer zarın (INM) açılmasıyla ve ardından Araşidonik Asit (AA) salınımı ve hücre korteksinde miyozin II'nin hızlı aktivasyonu ile ilişkilidir. Bu, hücre kontrtinaklığının artmasına ve amoeboid hücre göçünün kortikal kontrtinaklık eşiğinin üzerine çıkarılmasına neden olur6. Hücre deformasyonuna verilen mekanosensitive yanıt bir dakikadan kısa bir sürede gerçekleşir ve hapsedildikten sonra geri döndürülebilir, bu da çekirdeğin mekanik stres koşullarında adaptif hücre davranışını düzenleyen hücresel propriyosepsiyon için bir gerinim ölçer görevi görür. Bu mekanosensitive yolunun zebra balığı embriyolarından elde edilen progenitör kök hücrelerde, hem pluripotent hem de soyuna bağlı hücrelerde aktif olduğu gösterilmiştir12 ve farklı türlerde ve hücre hatlarında korunur20.
Bir hücre-mekanosensor olarak nükleer özelliklere ek olarak, nükleer mimari ve mekanik, geliştirme sırasında ve hücre kaderi spesifikasyonuna yanıt olarak özünde düzenlenir21, bu nedenle hücresel mekano duyarlılığını ayarlar22,23. Bunun sonucu, morfolojik değişikliklere ve bir önsegratory'den göçmen durumuna geçişlere izin veren nükleer uyumdaki bir değişiklik olabilir ve bunun tersi de olabilir.
Atomik kuvvet mikroskopisi24,25, mikropipette aspirasyonu26,27, mikroakışkan teknoloji28 ve mikroneedles29 gibi hücre çekirdeği mekaniğini ölçmek için çeşitli teknikler uygulanmıştır. Bununla birlikte, bu tekniklerin çoğu, tüm hücrenin deforme olması gerektiği anlamında istilacıdır, mekanik özelliklerin ölçümünü ve çekirdeğin kendisinin kuvvete bağlı yanıtlarını sınırlar. Hücre yüzeyinin ve mekanosensitive hücre korteksinin eşzamanlı deformasyonunu atlatmak için izole çekirdekler çeşitli bağlamlarda çalışılmıştır31,32. Bununla birlikte, nükleer izolasyonun mekanik çekirdek özelliklerindeki bir değişiklik ve bunların düzenlenmesiyle ilişkili olduğu göz ardı edilemez (referans24 ve yayınlanmamış gözlemler).
Optik cımbızlar (OTs), hücre mekanobiyolojisinde çok sayıda deneye izin veren ve moleküler makinelerin kimyasalı mekanik enerjiye nasıl dönüştürdüğünü anlamamızda etkili olan çok yönlü bir teknolojidir33,34. Optik cımbız, çevredeki medium33'ten daha yüksek kırma indeksine sahip dielektrik parçacıklara optik kuvvetler uygulamak için sıkı bir şekilde odaklanmış bir lazer ışını kullanır. Bu tür kuvvetler yüzlerce pico-Newton'un sırasına göre olabilir ve parçacığın lazer tuzak odağı içinde etkili bir şekilde hapsedilmesine neden olarak sıkışan parçacığın üç boyutta manipülasyonu sağlar. Ölçümlerin canlı hücrelerin içinde invaziv olmayan bir şekilde yapılabilmesinde ışık kullanımı önemli bir avantaja sahiptir. Optik manipülasyonlar lazer ışınının tuzak odağı ile daha da sınırlıdır. Bu nedenle, manipülasyon çevredeki hücresel zarları uyarmadan gerçekleştirilebilir ve iyon kanallarının kuvvete bağlı aktivasyonu gibi plazma zarındaki aktisin korteksi veya mekanosensitif süreçleri etkilemez.
Optik cımbız yaklaşımının zorluğu, equipartition teoremine veya lazer gücüne bağımlı bir kaçış kuvvetini ölçmek için tanımlanmış Stokes sürükleme kuvvetlerinin kullanımına dayanan klasik yaklaşımları kullanarak mikrosfere uygulanan kuvvetleri tam olarak belirlemektir35. Bu yöntemlerin bir in vitro deneyde uygulanması kolayken, genellikle hücresel bir ortama çevrilemezler. Momentum korumanın ilk ilkelerinden türetilen doğrudan kuvvet kalibrasyonuna dayanan çeşitli stratejiler sahaya sürünmiştir36,37. Diğer kuvvet spektroskopisi yaklaşımlarının aksine, kuvvet ölçümleri keyfi şekilli sıkışmış parçacık38,39 ile yerel bir ışık momentumu değişiminden elde edilir. Deneysel kurulumumuzda, optik kuvvetlerden kaynaklanan ışık momentumundaki değişiklikler, yerinde tuzak kalibrasyonuna gerek kalmadan doğrudan ölçülür40,41,42,43. Böylece, ölçümler hücrenin içi gibi viskoz bir ortamda veya hatta bir doku içinde mümkün hale gelir ve kuvvetler pN seviyesine kadar kolayca ölçülebilir.
Bu protokolde, hücre içi organelleri veya yapıları mekanik olarak manipüle etmek ve mekanik özelliklerini optik bir cımbız kurulumu ile nicel olarak değerlendirmek için bir test açıklıyoruz. Bu kurulum, hücresel davranışın veya hücre içi dinamiklerin paralel görüntülenmesini sağlayan dönen bir disk floresan mikroskobuna entegre edilmiştir. Test, çekirdek gibi belirli hücresel bölmelerin mekanik özelliklerinin karakterizasyonuna izin verirken, aynı zamanda deformasyonun bir sonucu olarak moleküler sinyal yollarının olası mekanoresponse ve aktivasyonunu inceler. Ayrıca, enjekte edilen mikrobeadların hücreler içinde optik olarak hapsedilmesi, polistiren boncukunun (n = 1.59) çekirdeğin iç kırılma kontrastı44 ile kstoplazma (n ~ 1.38) ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek bir kırılma indeksi sayesinde girinti kuvvetinde bir artışa izin verir. Sunulan strateji, diğer hücre içi yapıların ve organellerin çalışmasına, aktif mikrorheolojiyi içeren diğer yaklaşımlara, aynı/farklı alt hücresel yapıları aynı anda araştırmak için birden fazla optik tuzağın kullanılmasına ve canlı embriyodaki hücre mekanobiyolojisini hedefleyen ölçümlere kolayca uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 22 mm cover glasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5 22x60 mm Coverglasses</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5H glass bottom dishes</td>
			<td>Willco</td>
			<td>GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-um beads</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>72986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mm glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020 GC100F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um polystyrene microbeads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>89904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-um red-fluorescent beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F8816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqcuisition cameras sCMOS</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Sona-4BV11-UNI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auxiliary camera (Figure 3, AUX)</td>
			<td>Blackfly, FLIR</td>
			<td>BFS-U3-200S6M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calbryte 520</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>520 AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double scotch tape</td>
			<td>Biesse Adesivi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPI-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2A-mCh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Fusion-Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>Type B: 16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR protection googles</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lap2b-eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro loader pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>GELoader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroManager 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromiter slide</td>
			<td>ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tweezers platform</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td>Sensocell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OTs software (LightAce)</td>
			<td>Impetux Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing agent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post processing software (Matlab)</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free water</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-950/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>Spincoat G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DragonFly 502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangular microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UNB 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct force measurements of subcellular mechanics in confinement using optical tweezers

Çok hücreli bir organizmanın gelişimi sırasında, tek bir döllenmiş hücre bölünür ve çeşitli işlevlere sahip birden fazla dokuya yol açar. Doku morfogenez, hücre altı mekanik özelliklerin varyasyonlarına neden olan tek hücre düzeyinde moleküler ve yapısal değişikliklerle elde gider. Sonuç olarak, aynı hücre içinde bile, farklı organeller ve bölmeler mekanik gerilmelere farklı dirençler; ve mekanotransdüksiyon yolları mekanik özelliklerini aktif olarak düzenleyebilir. Bir hücrenin doku nişinin mikroçevriciliğine uyum sağlama yeteneği kısmen mekanik gerilmeleri hissetme ve yanıt verme yeteneğinden kaynaklanmaktadır. Yakın zamanda, nükleer deformasyon ve konumlandırmanın bir hücrenin fiziksel 3D ortamı ölçmesini sağladığı ve hücre şeklindeki değişiklikleri çözmek için hücreye propriyosepsiyon duygusu sağladığı yeni bir mekanosensasyon paradigması önerdik. Bu yazıda, canlı hücrelerin içindeki hücre çekirdeğini şekillendiren, yapışık hücreler ve mekanik olarak sınırlı hücreler üzerinde örneklendirilen kuvvetleri ve malzeme özelliklerini ölçmek için yeni bir yöntem açıklıyoruz. Ölçümler, hücrelerin içindeki optik tuzaklarla invaziv olmayan bir şekilde gerçekleştirilebilir ve kuvvetlere ışık momentumunun kalibrasyonsuz olarak algılanması yoluyla doğrudan erişilebilir. Bu, çekirdeğin mekaniğini hücre yüzeyi deformasyonlarından bağımsız olarak ölçmeye ve dışlayıcı ve interoceptif mekanotransdüksiyon yollarının diseksiyona izin verir. Daha da önemlisi, yakalama deneyi, sitoskeleton, kalsiyum iyonları veya nükleer morfolojinin floresan görüntülemesi kullanılarak hücresel yanıtı ve hücre altı dinamikleri araştırmak için optik mikroskopi ile birleştirilebilir. Sunulan yöntemin uygulanması kolaydır, kuvvet ölçümleri için ticari çözümlerle uyumludur ve mitokondri, stres lifleri ve endozomlar gibi diğer hücre altı bölmelerin mekaniğini araştırmak için kolayca genişletilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers at JoVE.com

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

Burada, izole embriyonik zebra balığı hücrelerinin hücre içi mekanik özelliklerini optik bir tuzakla doğrudan kuvvet ölçümü ile üç boyutlu hapsetmede araştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Bu protokol, hücre çekirdeğinin hücre polarizasyonu, farklılaşması ve geçişi için mekanik bir ölçer haline getiren bireysel mekanik özelliklerini parçalara ayırır. Bu tekniğin ana avantajı, mekanik özellikleri ölçebilmesi ve membranın veya kortikal sitoskeletonun dış pertürbasyonu olmadan hücre altı bölmelere kuvvet uygulayabilmesidir. Protokol, farklı hücre hatlarındaki veya hayvan modellerindeki nükleer mekaniği incelemek için diğer organizmanın diğer hücrelerinin içindeki boncukları manipüle etmek için kolayca uyarlanabilir.Optik tuzakları oluşturan ve bırakan tüm ışığı yakalamak için doğrudan kuvvet sensörünün hizalanması önemlidir. Bu, bir hücrenin viskoelastik ortamında doğru ışık momentumu ölçümleri sağlayacaktır. Küre evre embriyolarını döllenmeden dört saat sonra plastik bir Pasteur pipet kullanarak E3 ortamı içeren bir cam tabağa yerleştirerek tek hücreli hazırlamaya başlayın.Daha sonra boncuklara pozitif olan embriyoları seçin ve mRNA enjeksiyonu durumunda floresan proteini ifade edin. Embriyoları manuel olarak decurionize etmek için uzunlayıp cam pastör pipet yardımıyla yaklaşık 10 ila 15 deklerionlu embriyoyu 1,5 mililitre reaksiyon kabına aktarın. E3 ortamını tüpten çıkarın ve önceden ısıtılmış 500 mikrolitre önceden ısıtılmış karbondioksitten bağımsız doku kültürü ortamı ekleyin.Kabarcık oluşumunu önleyen tüpü hafifçe sallayın ve hücreler gözle görülebilen büyük parçalar olmadan ayrıştıkça tüpün içeriğinin bulanık hale gelmesini sağlayın. Daha sonra tüpü üç dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarın ve hücre boyamaya devam etmek için peletin toplayın.Çekirdeği etiketlemek için, tüpe yeni hazırlanmış DNA Hoechst boya boyama çözeltisinin 500 mikrolitresini ekleyerek hücreleri yeniden biriktirin. Lekeli hücreleri karanlıkta yedi dakika kuluçkaya yatır. Daha sonra, hücreleri daha önce açıklandığı gibi santrifüj edin ve peleti süspansiyondaki numuneler için 50 mikrolitre DMEM'de veya hapsedilen hücreler için 20 mikrolitre DMEM'de yeniden biriktirin.Süspansiyondaki hücrelerle yapılan deneyler için optik bindirmelerin veya OT odasının hazırlanması için, merkezde yaklaşık 10 milimetre ile 10 milimetre kare delikli bir çift taraflı viski bandı parçası kesin. Bandın koruyucu katmanlarından birini soyun ve bandın açık tarafını 1,5 H cam alt kabın ortasına yerleştirin. Hava kabarcıklarından kaçınırken bandın tüm yüzeyini cama yapıştırmak için bandı hafifçe bastırın ve bandın kalan koruyucu tabakasını soyun.Yüzeyi 30 dakika boyunca mililitre başına 0,5 miligramda 100 mikrolitre Concanavalin A ile kuluçkaya yatırın. Ardından Concanavalin A damlasını çıkarın ve yüzeyi DMEM ile durulayın. Hücreleri içeren çözeltinin 30 mikrolitresini boşluk yüzeyine ekleyin.Daha sonra odayı 22'ye 22 milimetrelik bir kapak camı ile çok nazikçe kapatın. Gerekirse neşter veya nesle kullanın. Ardından, çıkış gücü kararlılığını optimize etmek için deneyden önce en az 30 dakika boyunca lazeri önemli ölçüde yüksek güçte açarak optik cımbız başlangıcına devam edin.Bittiğinde, optik mikro manipülasyon ve kuvvet ölçüm ünitelerinin elektronik modülünü açın. Optik kuvvet sensörunu hizalamadan önce, 60X 1.2 su daldırma hedefine bir damla su koyun ve hücreleri içeren odayı sahneye yerleştirin. Hücre örneklerinin yerleştirileceği odanın alt yüzeyine odaklanın.Numuneyi kaplayan kapak camı kaydırağı üzerine bir damla daldırma yağı ekledikten sonra, kuvvet sensörü ünitesinin toplama lensini yağ damlacığını temas edene kadar küt küt küt bırakın. Optik kuvvet sensörü hizalaması için standart prosedürü izleyerek, OT'leri konumlandırmak için kullanılacak yardımcı kameradaki örnek düzlem görüntüsüne bakın, ardından alan durdurması örnek düzleme konjuge edilene kadar optik kuvvet sensörünü kübünleyin. Bertrand lens ile hava kabarcıklarını kontrol etmek için yardımcı kameradan görüntüleme yolunu gözlemleyin.Herhangi bir kir veya hava kabarcığı görünürse, prosedürü açıklandığı gibi tekrarlamadan önce lensi ve hazneyi tozsuz lens dokusuyla temizleyin ve daha fazla daldırma yağı ekleyin. Optik kuvvet sensörünün tutucusuna yerleştirilen yanal vidaları kullanarak, alan durağını görüş alanına ortalayın. Doğruluk için, yardımcı kamerada görülebilen görüş alanını neredeyse işgal etmek için alan durağını açın.Numuneyi mikroskop içine yerleştirdikten ve optik kuvvet sensörini hizaladıktan sonra, çekirdeğin sertliği veya araştırılan hücreler arası yapı bilinmiyorsa, ilk tuzak gücünü 200 miliwatt'a ayarlamak için dönen yarım dalga plakasını kullanın. Tamamlandığında, iletilen Brightfield mikroskopisi aracılığıyla bir veya iki boncuklu bir hücre aramak için mikroskop aşaması yazılım denetleyicisini kullanın. Sayısal sayfaya, sonraki her yörünge adımının ötelemesini ve zamanını yazın.Alternatif olarak, ek malzemeden S1 tablosunu yükleyin. Stres/gevşeme deneyi için uygulanacak yamuk yükleri programla. OT yazılımında optik tuzakları etkinleştirin.Bir mikro küreyi bindirme için, görüntü düzlemlerini bir mikroskop aşaması yazılım denetleyicisiyle boncuk üzerinde biraz ayarlayın. Kalibre edilmiş yardımcı kamera görüntüleme penceresindeki polistiren mikrobead üzerine tıklayın. Boncukların optik tuzak tarafından başarılı bir şekilde hapsedilmesi, boncuk hareketini güçlü bir şekilde azaltacaktır.Tıklayın ve boncuk sitoplazm boyunca sürükleyin ve nükleer zarftan yaklaşık iki mikron mesafeye yerleştirin. Yörüngenin boncuk girintisinin nükleer zara dik olacak şekilde ayarlı olduğundan emin olun. Kurulum hazır olduğunda, görüntüleme yazılımına gidin ve görüntü alımını başlatmak için alma düğmesine tıklayın.Gerçek zamanlı kuvvet okuma penceresini açın, verilere tıklayın ve kaydetmek için gerçek zamanlı kuvvet okuma penceresinde kaydedin. Tuzak konumunu başlatın ve ölçüm verilerini zorla. Boncuk üzerine sağ tıklayarak ve başlangıç yörüngesini seçerek önceden yüklenmiş yörüngeyi başlatın.Bindirme kuvveti ölçüm verilerinin kaydını bitirmeden önce yörünge bitene ve sistem stabilize olana kadar bekleyin. Görüntü alımını durdurun ve işlem sonrası yazılımdaki sonuçları çizin. Temsili analizde, çekirdeğe yakın tek bir mikrokürece sahip izole bir zebra balığı progenitor kök hücresi görüntülenir.Bir embriyonun içine enjeksiyondan beş saat sonra polistiren mikrosferin dağılımı izlendi. Brightfield ve floresan görüntü boncukların embriyo dokusuna dağıldığını gösteriyor. Konfokal floresan Z yığınının maksimum projeksiyonu ve aynı bölgedeki bir alt yığının maksimum projeksiyonu, derin hücrelerin büyük bir kısmının bir ila iki boncuk içerdiğini doğrular.Döllenmeden 24 saat sonra boncuklar embriyonun tüm vücuduna dağıtıldı. Bir veya iki enjekte edilmiş boncuk ile sınırlı hücrelerdeki süspansiyon hücrelerinin Brightfield mikrografileri elde edildi. Ayrıca, birden fazla floresan etiket, hücreler arası membran, plazma membran, DNA ve transgenik çizgi gibi hücrelerin farklı yönlerinin araştırılmasını kolaylaştırdı.Temsili anlık görüntüler, Hoechst etiketli çekirdekleri optik olarak sıkışmış bir mikrokürecikle girintiden beş saniye önce/sırasında ve girintiden beş saniye sonra tanımladı. Askıda ve kapalı hücrelerin girinti deneyi sırasında çekirdeğin distal ve proksimal sınırlarının üç farklı çerçevesi ve yörüngesi için girinti segmenti boyunca yoğunluk profilleri çalışılmıştır. Tekrarlanan bir nükleer girinti deneyi sırasında optik olarak sıkışan mikro kürenin yaşadığı sıkışmış yörünge ve kuvvet ölçüldü.Süspansiyonlu ve hapsedilmiş hücrelerdeki çekirdek mekaniği, hapsedilmenin öngörülen alanın genişlemesine ve nükleer sertlikte önemsiz bir değişikliğe neden olduğunu doğruladı. Boncuklar bir hücre evresi embriyosuna enjekte edilirse, büyük olasılıkla sonraki aşamalarda eşit olarak dağıtılacaktır. Boncuk'un saplanarak tuzağa düşürülmesi gerektiğini unutmayın.Boncuk optik tuzaktan kaçarsa, yörüngeyi yeniden tanımlayın veya lazer gücünü artırın. Bu deneyler bir hücrenin içindeki birden fazla mikrobead üzerinde kolayca gerçekleştirilebilir ve aktif mikrorheoloji ölçümlerine genişletilebilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Osmotik Pompalar veya Doğrudan Kas Enjeksiyonu Kullanılarak Subkutanöz Neurotrophin 4 İnfüzyonu, Yaşlanan Farenin Larinks Kaslarını Arttırır

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Hücre mekanik ile boncuk-Alerjik Optik cımbız Drosophila embriyo sondalama

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...