Name: from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow at JoVE.com

يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم للدكتورة جنيفر فاندركيلين وأندريا لاوبشر على الدعم الفني. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا نيكول غريغوريو وماكس ليفين وأليسا مولين وبيونغ تشول سو وأوغست بروكويل وإليزابيث (ليزي) فويفودا ولوغان بورينغتون وجيليان كاسمان على المناقشات المفيدة. يعترف المؤلفون أيضا بدعم التمويل من صندوق بيل وليندا فروست ، ومركز التطبيقات في منحة شيفرون للبحوث التطبيقية للتكنولوجيا الحيوية ، وأبحاث كال بولي ، والعلمية ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF-1708919).

1. نمو وسائل الإعلام
<ol><li>قم بإعداد 960 مل من وسائط CFAI كما هو موضح في الجدول 1 واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 باستخدام KOH.</li>
	<li>انقل وسائط الثقافة إلى قارورة محيرة سعة 2.5 لتر وأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية.</li>
	<li>تحضير محلول سكر 40 مل كما هو موضح في الجدول 1. قم بتصفية ال...

<ol>
	<li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+guide+to+cell-free+protein+synthesis.">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene+expression:+an+expanded+repertoire+of+applications.">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li><li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+supplement+mixtures:+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract.">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li><li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis.">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li><li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism.">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li><li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis:+Protocols+for+a+robust,+flexible,+and+accessible+platform+technology.">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression.">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable,+on-demand+biomolecular+manufacturing.">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li><li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering.">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li><li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis.">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li><li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems.">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li><li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li><li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions.">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+the+preparation+of+"endotoxin-free"+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase.">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li><li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing.">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li><li>Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fast-growing+bacteria+robustly+tune+their+ribosome+concentration+to+approximate+growth-rate+maximization.">How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization.</a> FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).</li><li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations.">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li><li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system:+Practical+laboratory+guideline.">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression.">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li><li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids.">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li><li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+A+highly+productive,+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource.">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li><li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells.">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li><li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform.">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li></ol>

هناك حاجة تقليديا إلى إشراف الباحث لإجراءين رئيسيين أثناء نمو الخلايا: تحريض T7 RNAP وحصاد الخلايا في OD600 محدد. CFAI يتجنب كل من هذه المتطلبات لتقليل وقت الباحث والتدريب الفني المطلوب من أجل إعداد مستخلصات الخلايا عالية الجودة. يتم تحقيق الحث التلقائي ل T7 RNAP عن طريق استبدال الجلوكوز باللا...

نما استخدام تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية بشكل كبير خلال السنوات القليلة الماضية1،2،3. ويمكن أن يعزى هذا التطور جزئيا إلى زيادة الجهود المبذولة لفهم العمليات التي تحدث في CFPS ودور كل مكون 4,5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن انخفاض التكاليف المنسوبة إلى الإعدادات المحسنة ومصادر الطاقة البديلة جعلت التكنولوجيا الخالية من الخلايا أسهل في التنفيذ للمستخدمين الجدد6،7،8،9. من أجل تنفيذ عوامل النسخ والترجمة اللازمة لتخليق البروتين ، غالبا ما يستخدم مستخلص الخلايا لدفع التفاعلات الخالية من الخلايا10. قدمت أدلة المستخدم المنشورة مؤخرا بروتوكولات بسيطة لإنتاج مستخلص وظيفي ، مما يسهل تنفيذه للمستخدمين الجدد وذوي الخبرة على حد سواء 1،11،12،13،14. عادة ما يتم الحصول على مستخلص الخلايا من خلال تحلل مزرعة الخلايا ، والتي يمكن زراعتها باستخدام كائنات حية مختلفة اعتمادا على الاستخدام المحدد المطلوب1،15،16.
أصبحت الإشريكية القولونية (E. coli) بسرعة واحدة من الكائنات الحية المضيفة الأكثر استخداما لإنتاج مقتطفات وظيفية17. يفضل سلالة BL21 Star (DE3) لأنها تزيل البروتياز من الغشاء الخارجي (OmpT protease) والسيتوبلازم (Lon protease) ، مما يوفر بيئة مثالية لتعبير البروتين المؤتلف. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي DE3 على λDE3 الذي يحمل جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (T7 RNAP) تحت سيطرة مروج lacUV5 ؛ يحتوي المكون النجمي على جين RNaseE متحور يمنع انقسام الحمض النووي الريبوزي المرسال4،14،18،19. تحت مروج lacUV5 ، يسمح تحريض الأيزوبروبيل ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG) بالتعبير عن T7 RNAP20,21. تستخدم هذه السلالات لزراعة وحصاد الخلايا ، والتي تعطي المواد الخام لإعداد المستخلص. يمكن إجراء تحلل الخلايا باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق ، بما في ذلك ضرب الخرز ، والصحافة الفرنسية ، والتجانس ، والصوتنة ، وتجويف النيتروجين1،11،12،22.
عملية الزراعة البكتيرية والحصاد متسقة عبر معظم المنصات عند استخدام الإشريكية القولونية، ولكنها تتطلب عدة أيام وإشرافا مكثفا من الباحثين1،11،13. تبدأ هذه العملية عموما بزراعة البذور بين عشية وضحاها في مرق LB ، والذي عند النمو بين عشية وضحاها يتم تلقيحه بعد ذلك في ثقافة أكبر من 2xYTPG (الخميرة ، التربتون ، الفوسفات العازل ، الجلوكوز) في اليوم التالي. تتم مراقبة نمو هذه الثقافة الأكبر حتى تصل إلى مرحلة السجل المبكرة إلى المتوسطة ، بكثافة بصرية (OD) تبلغ 2.514,20. مطلوب قياس مستمر حيث ثبت سابقا أن مكونات النسخ والترجمة نشطة للغاية في مرحلة السجل المبكر إلى المتوسط23,24. في حين أن هذه العملية يمكن أن تخلق مستخلصا قابلا للتكرار ، فقد طور مختبرنا مؤخرا طريقة جديدة باستخدام وسائط الحث التلقائي الخالية من الخلايا (CFAI) ، مما يقلل من إشراف الباحثين ، ويزيد من العائد الإجمالي للمستخلص للتر معين من زراعة الخلايا ، ويحسن الوصول إلى إعداد المستخلص القائم على الإشريكية القولونية لكل من المستخدمين ذوي الخبرة والجدد (الشكل 1 ). نقدم هنا الدليل خطوة بخطوة لتنفيذ سير عمل CFAI ، للانتقال من لوحة مخططة من الخلايا إلى تفاعل CFPS مكتمل في غضون 24 ساعة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MPC-425Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT5F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Lactose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(Glu)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(OAc)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTPs</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0382124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0379904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunair 2.5L Baffled Shake Flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Processor</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q125-230V/50HZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow

نمت توليف البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) كمنصة للتكنولوجيا الحيوية تلتقط آلات النسخ والترجمة في المختبر. جعلت العديد من التطورات منصة CFPS أكثر سهولة للمستخدمين الجدد ووسعت نطاق التطبيقات. بالنسبة لأنظمة CFPS القائمة على التحلل ، يمكن توليد مستخلصات الخلايا من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية ، وتسخير الكيمياء الحيوية الفريدة لهذا المضيف لزيادة تخليق البروتين. خلال السنوات ال 20 الماضية ، أصبحت الإشريكية القولونية (E. coli) واحدة من أكثر الكائنات الحية استخداما على نطاق واسع لدعم CFPS بسبب قدرتها على تحمل التكاليف وتنوعها. على الرغم من العديد من التطورات الرئيسية ، ظل سير العمل لإعداد مستخلص خلايا E. coli عنق الزجاجة الرئيسي للمستخدمين الجدد لتنفيذ CFPS لتطبيقاتهم. يستغرق سير عمل إعداد المستخلص وقتا طويلا ويتطلب خبرة فنية لتحقيق نتائج قابلة للتكرار. للتغلب على هذه الحواجز، أبلغنا سابقا عن تطوير سير عمل الحث التلقائي (CFAI) الخالي من الخلايا على مدار 24 ساعة والذي يقلل من مدخلات المستخدم والخبرة التقنية المطلوبة. يقلل سير عمل CFAI من العمالة والمهارة التقنية المطلوبة لتوليد مستخلصات الخلايا مع زيادة إجمالي كميات مستخلصات الخلايا التي تم الحصول عليها. هنا نصف سير العمل هذا بطريقة خطوة بخطوة لتحسين الوصول ودعم التنفيذ الواسع النطاق ل CFPS القائم على E. coli.

عند تحضير وسائط CFAI ، تم استبدال الجلوكوز بزيادة اللاكتوز والجلسرين كركيزة الطاقة الرئيسية في الوسائط. بالإضافة إلى ذلك ، تم زيادة سعة التخزين المؤقت لوسائط CFAI أيضا. وترد هذه المكونات المحددة في الجدول 1.
ثم نمت الخلايا إلى كل من OD600 من 10 والمعيار 2.5 في وسائط CFAI ?...

Watch this Scientific Journal Video about From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow at JoVE.com

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

يصف هذا العمل تحضير مستخلص الخلايا من الإشريكية القولونية (E. coli ) متبوعا بتفاعلات تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) في أقل من 24 ساعة. يشرح شرح بروتوكول الحث الذاتي الخالي من الخلايا (CFAI) بالتفصيل التحسينات التي تم إجراؤها لتقليل إشراف الباحثين وزيادة كميات مستخلص الخلايا التي تم الحصول عليها.

من الخلايا إلى تخليق البروتين الخالي من الخلايا في غضون 24 ساعة باستخدام سير عمل الحث التلقائي الخالي من الخلايا

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

تقلل طريقة الحث الذاتي الخالية من الخلايا من إشراف الباحث والوقت اللازم لإنتاج مستخلصات الخلايا الوظيفية. هذا يبسط بروتوكولات تخليق البروتين السابقة في المختبر التي كانت أكثر استهلاكا للوقت ومكثفة. هذه التقنية أقل تعقيدا وعالية الإنتاجية أيضا ، مما سيمكن جمهورا أكبر من تنفيذ التعبير الخالي من الخلايا.تسلط هذه الطريقة الضوء على أهمية استقلاب الطاقة أثناء نمو الخلايا وضمن التفاعلات الخالية من الخلايا. ابدأ بإعداد 960 ملليلتر من وسائط الحث التلقائي الخالية من الخلايا. ثم قم بتعقيم الوسائط في قارورة محيرة سعة 2.5 لتر عن طريق التعقيم لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية.بعد ذلك ، بعد تحضير 40 ملليلتر من محلول السكر ، قم بتصفيته وتعقيمه في وعاء زجاجي معقم منفصل. بعد التعقيم ، عندما تبرد وسائط الثقافة إلى أقل من 40 درجة مئوية ، أضف محلول السكر المعقم بالمرشح مباشرة إلى الوسائط. بعد ذلك ، قم بتلقيح الوسائط عن طريق تمرير حلقة مليئة بالمستعمرات من لوحة نجوم E.coli BL21 الطازجة التي تم خطها مسبقا وإدخال الحلقة مباشرة في الوسائط.قم بتدوير الحلقة في الوسائط دون لمس جوانب الحاوية. ثم ، ضع الوسائط الملقحة بين عشية وضحاها في حاضنة 30 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، قم بحصاد الخلايا عن طريق نقل لتر واحد من الوسائط إلى زجاجة طرد مركزي سعة لتر واحد والطرد المركزي بسرعة 5000 مرة من G بين أربع إلى 10 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.بعد التخلص من السوبرناتانت ، استخدم ملعقة معقمة لنقل الكريات إلى أنبوب مخروطي مبرد مسبقا ووزن 50 ملليلتر. بعد ذلك ، اغسل الكريات مرة واحدة باستخدام 30 إلى 40 ملليلتر من المخزن المؤقت S30 البارد عن طريق تعليق الكريات عن طريق الدوامة في رشقات نارية مدتها 30 ثانية مع فترات راحة على الجليد. بعد إنعاش الكريات بالكامل ، قم بالطرد المركزي لإعادة تعليق الخلية ، وتخلص من السوبرناتانت ، وباستخدام منديل نظيف ، امسح أي مادة زائدة من الجدران الداخلية لأنبوب 50 ملليلتر دون لمس الكرية.ثم قم بوزن الكريات قبل تجميدها في النيتروجين السائل وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى مزيد من الاستخدام. لتحضير مستخلص الخلية ، أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت S30 لكل غرام من حبيبة الخلية المجمدة واترك الكريات تذوب على الجليد لمدة 30 إلى 60 دقيقة. ثم ، أعد تعليق الكريات المذابة عبر الدوامة في رشقات نارية مدتها 30 ثانية مع فترات راحة على الجليد حتى لا تبقى كتل خلايا مرئية.بالنسبة لتحلل الخلايا ، انقل 1.4 ملليلتر من تعليق الخلية إلى أنابيب microfuge سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بسونيك تعليق الخلية في كل أنبوب بتردد 20 كيلوهرتز وسعة 50٪ لمدة ثلاث رشقات نارية من 45 ثانية مع 59 ثانية من الراحة لكل دورة في حمام جليدي عكس الأنبوب بين الدورات ، وبعد دورة الصوتنة الأخيرة ، أضف على الفور 4.5 ميكرولتر من ثنائي ثيوثريتول واحد مولار. بعد صوتنة تعليق الخلية في جميع الأنابيب ، قم بالطرد المركزي للأنابيب وجمع supernatant في أليكوت سعة 600 ميكرولتر في أنابيب microfuge جديدة سعة 1.5 ملليلتر.قم بتجميد الفلاش وتخزين الأليكوتس عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى مزيد من الاستخدام. لإجراء 15 ميكرولتر من تفاعل تخليق البروتين الخالي من الخلايا في أنابيب microfuge سعة 1.5 ملليلتر في أربعة أضعاف ، قم بإذابة أليكوت واحد من مستخلص الخلية. بعد تحضير كل خليط تفاعل سعة 15 ميكرولتر، اسمح للتفاعل بالعمل لمدة أربع ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية.لتحديد كمية البروتين المراسل ، اجمع 48 ميكرولتر من مخزن HEPES العازل 50 ملليمولار عند درجة الحموضة 7.2 مع ميكرولترين من كل منتج تفاعل تخليق البروتين الخالي من الخلايا في صفيحة سوداء من البوليسترين 96 بئرا. حدد كثافة التألق للبروتين الفلوري الأخضر الفائق ، أو sfGFP ، باستخدام طول موجي مثير يبلغ 485 وطول موجي للانبعاثات يبلغ 528 نانومتر. بعد ذلك ، قم بتحويل وحدات التألق النسبية إلى العائد الحجمي ل sfGFP عن طريق إنشاء منحنى قياسي باستخدام بلازميد pJL1 sfGFP المنقى .تظهر هنا كريات وسائط الحث الذاتي الخالية من الخلايا بعد حصاد الخلايا بكثافات بصرية مختلفة تقاس عند 600 نانومتر. نمت الوسائط إلى كثافة بصرية من 10 أنتجت كمية أكبر من بيليه الخلية في المستخلص الكلي من الوسائط نمت إلى كثافة بصرية من 2.5. أظهر مزيد من التحليل لتركيز البروتين الكلي عدم وجود فرق كبير في البروتين الكلي بين كلا المستخلصين.على الرغم من أن الوسائط نمت إلى مستويات كثافة بصرية مختلفة ، إلا أن كلا المستخلصين أظهرا نتائج مماثلة في تفاعلات خالية من الخلايا تعبر عن sfGFP. من المهم الحفاظ على ظروف معقمة أثناء إعداد الوسائط ومحلول السكر. يمكن استخدام طريقة استخراج الخلايا CFAI هذه لمعظم تطبيقات التعبير الخالي من الخلايا.وتتراوح هذه من تعليم التكنولوجيا الحيوية إلى هندسة البروتين، فضلا عن التشخيص في نقاط الرعاية. تقلل هذه الطريقة من مقدار الوقت والمهارة التقنية المطلوبة ، وتحسن قابلية الاستنساخ ، وتنتج كميات أكبر من المستخلص.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

اندماجي تجميع وعالية الإنتاجية الإصدار البروتين من فيلم البوليمر ومكتبات جسيمات متناهية الصغر

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

عزل وتوصيف البروتينات التعبير عن مدينة Chimeric الإنسان باستخدام البروتين A غشاء Adsorbers وسير عمل مبسطة

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

وتغليف من النسخ خالية من الخلايا وآلات الترجمة في الحويصلات لتشييد المقلدون الخلوية

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

صالحة قابل للغلق غرفة فيمتولتر مجانا خلية علم الأحياء

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

توليف "باكتيريوفاجيس المعدية" في كولاي-استناداً إلى "نظام التعبير" الخلية الحرة

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

الخلية الحرة "استخدام تعبير البروتين" "سرعة نمو بكتيريا" الضمة ناتريجينس

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

منصة ميكروفلويدريك متعددة الطبقات لتوصيل التعبير الجيني الخالي من الخلايا لفترات طويلة

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

إعداد البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام مقتطفات البكتيريا الحرة الخلية، Liposomes ونقل المستحلب

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

OnePot PURE Cell-Free System

نظام خلية ونبوت PURE الخالي من الخلايا

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...