Name: from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow at JoVE.com

Forfattere vil gerne anerkende Dr. Jennifer VanderKelen og Andrea Laubscher for teknisk support. Forfattere vil også gerne takke Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington og Jillian Kasman for nyttige diskussioner. Forfattere anerkender også finansieringsstøtte fra Bill og Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly og National Science Foundation (NSF-1708919).

1. Medievækst
<ol><li>960 ml CFAI-medier som beskrevet i tabel 1 forberedes, og pH-værdien justeres til 7,2 ved hjælp af KOH.</li>
	<li>Overfør kulturmedier til en 2,5 L forvirret kolbe og autoklave i 30 minutter ved 121 °C.</li>
	<li>Der fremstilles en 40 ml sukkeropløsning som beskrevet i tabel 1. Filtersteriliser opløsningen i en separat autoklaveret glasbeholder. BEMÆRK: Sukkeropløsningen kan opbevares i en 30 °C-inkubator indtil videre brug.</li>
	<li>Lad mediet køle...

<ol>
	<li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+guide+to+cell-free+protein+synthesis.">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene+expression:+an+expanded+repertoire+of+applications.">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li><li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+supplement+mixtures:+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract.">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li><li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis.">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li><li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism.">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li><li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis:+Protocols+for+a+robust,+flexible,+and+accessible+platform+technology.">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression.">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable,+on-demand+biomolecular+manufacturing.">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li><li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering.">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li><li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis.">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li><li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems.">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li><li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li><li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions.">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+the+preparation+of+"endotoxin-free"+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase.">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li><li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing.">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li><li>Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fast-growing+bacteria+robustly+tune+their+ribosome+concentration+to+approximate+growth-rate+maximization.">How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization.</a> FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).</li><li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations.">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li><li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system:+Practical+laboratory+guideline.">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression.">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li><li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids.">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li><li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+A+highly+productive,+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource.">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li><li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells.">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li><li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform.">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li></ol>

Forskertilsyn er traditionelt nødvendigt for to nøgleaktioner under cellevækst: induktion af T7 RNAP og høst af celler ved en bestemt OD600. CFAI undgår begge disse krav for at reducere forskerens tid og tekniske uddannelse, der kræves for at forberede celleekstrakter af høj kvalitet. Auto-induktion af T7 RNAP opnås ved at erstatte glucose med lactose som det primære sukker i medierne, hvilket undgår det tidligere behov for aktivt at overvåge væksten og derefter inducere med IPTG på et præcist ti...

Anvendelsen af cellefri proteinsyntese (CFPS) til bioteknologiske anvendelser er vokset betydeligt i løbet af de sidste par år 1,2,3. Denne udvikling kan til dels tilskrives en øget indsats for at forstå de processer, der forekommer i DE FÆLLES FISKERI-systemer, og den rolle, som hver komponent 4,5 spiller. Derudover har reducerede omkostninger, der tilskrives optimerede opsætninger og alternative energikilder, gjort cellefri teknologi lettere at implementere for nye brugere 6,7,8,9. For at implementere de nødvendige transkriptions- og oversættelsesfaktorer til proteinsyntese bruges celleekstrakt ofte til at drive cellefrie reaktioner10. Nyligt offentliggjorte brugervejledninger har givet enkle protokoller til fremstilling af funktionelt uddrag, hvilket gør det lettere at implementere for både nye og erfarne brugere 1,11,12,13,14. Celleekstrakt opnås normalt gennem lysis af en cellekultur, som kan dyrkes ved hjælp af forskellige organismer afhængigt af den ønskede specifikke anvendelse 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) er hurtigt blevet en af de mest almindeligt anvendte værtsorganismer til fremstilling af funktionelle ekstrakter17. BL21 Star (DE3) stammen foretrækkes, fordi den fjerner proteaserne fra den ydre membran (OmpT protease) og cytoplasmaet (Lon protease), hvilket giver et optimalt miljø for det rekombinante proteinekspression. Derudover indeholder DE3 λDE3, der bærer genet for T7 RNA-polymerase (T7 RNAP) under kontrol af lacUV5-promotoren; stjernekomponenten indeholder et muteret RNaseE-gen, som forhindrer spaltning af mRNA 4,14,18,19. Under lacUV5-promotoren tillader isopropyl-thiogalactopyranosid (IPTG) induktion ekspression af T7 RNAP20,21. Disse stammer bruges til at dyrke og høste celler, som giver råmateriale til ekstraktforberedelse. Cellelyse kan udføres ved hjælp af en række forskellige metoder, herunder perleslag, fransk presse, homogenisering, sonikering og nitrogenkavitation 1,11,12,22.
Processen med bakteriekultur og høst er konsistent på tværs af de fleste platforme, når man bruger E. coli, men kræver flere dage og intenst forskertilsyn 1,11,13. Denne proces starter generelt med en frøkultur natten over i LB bouillon, som ved nattens vækst derefter podes i en større kultur på 2xYTPG (gær, tryptone, fosfatbuffer, glucose) den næste dag. Væksten af denne større kultur overvåges, indtil den når den tidlige til midterste logfase ved en optisk densitet (OD) på 2,514,20. Konstant måling er påkrævet, da komponenterne i transkription og oversættelse tidligere har vist sig at være meget aktive i den tidlige til midterste logfase23,24. Selvom denne proces kan skabe reproducerbart ekstrakt, har vores laboratorium for nylig udviklet en ny metode ved hjælp af Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media, som reducerer forskertilsyn, øger det samlede udbytte af ekstrakt for en given liter cellekultur og forbedrer adgangen til E. coli-baseret ekstraktpræparat for både erfarne og nye brugere (figur 1 ). Her giver vi den trinvise vejledning til implementering af CFAI-arbejdsgangen for at gå fra en stribet plade af celler til en afsluttet CFPS-reaktion inden for 24 timer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MPC-425Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT5F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Lactose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(Glu)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(OAc)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTPs</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0382124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0379904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunair 2.5L Baffled Shake Flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Processor</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q125-230V/50HZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow

Cellefri proteinsyntese (CFPS) er vokset som en bioteknologisk platform, der fanger transkriptions- og oversættelsesmaskiner in vitro. Talrige udviklinger har gjort CFPS-platformen mere tilgængelig for nye brugere og har udvidet anvendelsesområdet. For lysatbaserede CFPS-systemer kan celleekstrakter genereres fra en række organismer, der udnytter den unikke biokemi hos denne vært til at øge proteinsyntesen. Inden for de sidste 20 år er Escherichia coli (E. coli) blevet en af de mest anvendte organismer til støtte for CFPS på grund af dens overkommelige priser og alsidighed. På trods af mange vigtige fremskridt er arbejdsgangen for E. coli-celleekstraktforberedelse forblevet en vigtig flaskehals for nye brugere til at implementere CFPS til deres applikationer. Arbejdsgangen til forberedelse af ekstrakter er tidskrævende og kræver teknisk ekspertise for at opnå reproducerbare resultater. For at overvinde disse barrierer har vi tidligere rapporteret om udviklingen af en 24-timers cellefri autoinduktionsarbejdsgang (CFAI), der reducerer brugerinput og den nødvendige tekniske ekspertise. CFAI-arbejdsgangen minimerer den arbejdskraft og tekniske færdighed, der kræves for at generere celleekstrakter, samtidig med at de samlede mængder celleekstrakter, der opnås, øges. Her beskriver vi denne arbejdsgang trin for trin for at forbedre adgangen til og understøtte den brede implementering af E. coli-baserede CFPS.

Ved fremstilling af CFAI-medier blev glucose udvekslet med en stigning i lactose og glycerol som det vigtigste energisubstrat i medierne. Derudover blev CFAI-mediernes bufferkapacitet også øget. Disse specifikke komponenter er angivet i tabel 1.
Cellerne blev derefter dyrket til både en OD600 på 10 og standard 2,5 i CFAI-medier for at vise konsistens med ekstraktkvaliteten på trods af varierende ekstraktmængder. 2,5 OD600 CFAI-mediet blev dyrket eft...

Watch this Scientific Journal Video about From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow at JoVE.com

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Dette arbejde beskriver fremstillingen af celleekstrakt fra Escherichia coli (E. coli) efterfulgt af cellefri proteinsyntese (CFPS) reaktioner på under 24 timer. Forklaring af den cellefri autoinduktion (CFAI) protokol beskriver forbedringer foretaget for at reducere forskertilsyn og øge mængderne af opnået celleekstrakt.

Fra celler til cellefri proteinsyntese inden for 24 timer ved hjælp af cellefri autoinduktionsarbejdsgang

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

Den cellefri autoinduktionsmetode reducerer forskernes tilsyn og den tid, der er nødvendig for at producere funktionelle celleekstrakter. Dette forenkler tidligere in vitro-proteinsynteseprotokoller, der var mere tidskrævende og intensive. Denne teknik er mindre kompliceret og også højtydende, hvilket vil gøre det muligt for et større publikum at implementere cellefri ekspression.Denne metode fremhæver vigtigheden af energimetabolisme under cellevækst og inden for cellefrie reaktioner. Begynd med at forberede 960 ml cellefrit autoinduktionsmedie. Steriliser derefter medierne i en 2,5-liters forvirret kolbe ved autoklavering i 30 minutter ved 121 grader Celsius.Efter fremstilling af 40 ml sukkeropløsningen filtreres det derefter i en separat autoklaveret glasbeholder. Efter autoklavering, når kulturmediet er kølet ned til under 40 grader Celsius, tilsættes den filtersteriliserede sukkeropløsning direkte til medierne. Derefter podes medierne ved at stryge en løkke fuld af kolonier fra en tidligere stribet frisk E.coli BL21-stjerneplade og indsætte løkken direkte i medierne.Hvirvl løkken ind i medierne uden at røre ved beholderens sider. Placer derefter de podede medier natten over i en 30 grader Celsius inkubator med rystelser ved 200 o / min. Den næste dag høstes cellerne ved at overføre en liter af medierne til en 1-liters centrifugeflaske og centrifugering ved 5.000 gange G mellem fire og 10 grader Celsius i 10 minutter.Efter kassering af supernatanten skal du bruge en steril spatel til at overføre pelleten til et forkølet og tidligere vejet 50 ml konisk rør. Vask derefter pillen en gang med 30 til 40 ml kold S30-buffer ved at genbruge pelleten via hvirvel i 30-sekunders udbrud med hvileperioder på is. Når pelleten er fuldstændigt resuspended, centrifugeresuspensionen, kasseres supernatanten, og ved hjælp af et rent væv tørres overskydende supernatant fra de indvendige vægge i 50 ml røret uden at røre pelleten.Vej derefter pillen, før den flashfryses i flydende nitrogen, og opbevar den ved minus 80 grader Celsius indtil videre brug. For at forberede celleekstraktet tilsættes en milliliter S30-buffer pr. Gram af den frosne cellepille og lader pelleten tø op på is i 30 til 60 minutter. Derefter suspenderes den optøede pellet via hvirvel i udbrud på 30 sekunder med hvileperioder på is, indtil der ikke er nogen synlige celleklumper tilbage.Til cellelyse overføres 1,4 milliliter aliquots af cellesuspensionen til 1,5 milliliter mikrofugerør. Derefter sonikere cellesuspensionen i hvert rør med en frekvens på 20 kilohertz og 50% amplitude i tre udbrud på 45 sekunder med 59 sekunders hvile pr. Cyklus i et isbad Inverter røret mellem cyklusser, og efter den sidste sonikeringscyklus tilsættes straks 4,5 mikroliter en-molær dithiothreitol. Efter sonikering af cellesuspensionen i alle rør, centrifuge rørene og opsaml supernatanten i 600 mikroliter aliquots i friske 1,5 milliliter mikrofuge rør.Flashfrys og opbevar aliquoterne ved minus 80 grader Celsius indtil videre brug. For at udføre 15 mikroliter cellefri proteinsyntesereaktion i 1,5 milliliter mikrofugerør i quadruplicate, optø en alikvot af celleekstraktet. Efter fremstilling af hver 15-mikroliter reaktionsblanding, lad reaktionen køre i mindst fire timer ved 37 grader Celsius.For at kvantificere reporterproteinet kombineres 48 mikroliter 50 millimolær HEPES-buffer ved pH 7,2 med to mikroliter af hvert cellefrit proteinsyntesereaktionsprodukt i en sort polystyrenplade med 96 brønde. Kvantificer fluorescensintensiteten af superfolderens grønne fluorescerende protein eller sfGFP ved hjælp af en excitationsbølgelængde på 485 og emissionsbølgelængde på 528 nanometer. Konverter derefter de relative fluorescensenheder til det volumetriske udbytte af sfGFP ved at oprette en standardkurve ved hjælp af renset pJL1 sfGFP-plasmid.Her er vist cellefri autoinduktionsmediepiller efter cellehøst ved forskellige optiske tætheder målt ved 600 nanometer. Mediet vokset til en optisk densitet på 10 producerede en højere mængde cellepellet i det samlede ekstrakt end mediet vokset til en optisk densitet på 2,5. Yderligere analyse af den samlede proteinkoncentration viste ingen signifikant forskel i det samlede protein mellem begge ekstrakter.Selvom medierne blev dyrket til forskellige optiske densitetsniveauer, viste begge ekstrakter lignende resultater i cellefrie reaktioner, der udtrykte sfGFP. Det er vigtigt at opretholde sterile forhold under tilberedning af medie- og sukkeropløsningen. Denne CFAI-celleekstraktmetode kan bruges til de fleste anvendelser af cellefri ekspression.Disse spænder fra bioteknologisk uddannelse til proteinteknik samt point-of-care diagnostik. Denne metode reducerer den tid og tekniske færdighed, der kræves, forbedrer reproducerbarheden og producerer større mængder ekstrakt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Kombinatorisk syntese af og Højkapacitetsforskning Protein Udgivelse fra Polymer Film og nanopartikel Biblioteker

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Isolation og karakterisering af Kimære Human Fc-udtrykke proteiner ved hjælp af Protein A Membrane Adsorbers og en strømlinet Workflow

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Indkapslingen af ​​Cell-fri Transskription og oversættelse Maskiner Blærer til opførelse af Cellular Efterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Forsegles Femtoliter Chamber Arrays for celle-fri Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntese af smitsomme Bakteriofager i en E. coli -baseret celle-gratis Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Celle-fri Protein udtryk ved hjælp af hurtigt voksende bakterie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En Mikrofluidic-platform med flere lag til overledning af forlænget celle frit genekspression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Forberedelse proteinproducerende syntetiske celler ved hjælp af cellefri bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsionoverførsel

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Single-Cell Optisk Action Potentiel måling i human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

OnePot PURE Cell-Free System

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...