Name: from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow at JoVE.com

Auteurs willen Dr. Jennifer VanderKelen en Andrea Laubscher bedanken voor technische ondersteuning. Auteurs willen ook Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington en Jillian Kasman bedanken voor de nuttige discussies. Auteurs erkennen ook de financieringssteun van het Bill and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly en de National Science Foundation (NSF-1708919).

1. Media groei
<ol><li>Bereid 960 ml CFAI-media zoals beschreven in tabel 1 en pas de pH aan op 7,2 met KOH.</li>
	<li>Breng de kweekmedia gedurende 30 minuten bij 121 °C over in een verbijsterde kolf en autoclaaf van 2,5 L.</li>
	<li>Bereid een suikeroplossing van 40 ml zoals beschreven in tabel 1. Filter-steriliseer de oplossing in een aparte geautoclaveerde glazen container. OPMERKING: De suikeroplossing kan tot verder gebruik in een incubator van 30 °C worden bewaard.</li>
	<l...

<ol>
	<li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+guide+to+cell-free+protein+synthesis.">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene+expression:+an+expanded+repertoire+of+applications.">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li><li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+supplement+mixtures:+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract.">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li><li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis.">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li><li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism.">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li><li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis:+Protocols+for+a+robust,+flexible,+and+accessible+platform+technology.">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression.">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable,+on-demand+biomolecular+manufacturing.">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li><li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering.">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li><li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis.">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li><li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems.">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li><li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li><li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions.">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+the+preparation+of+"endotoxin-free"+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase.">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li><li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing.">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li><li>Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fast-growing+bacteria+robustly+tune+their+ribosome+concentration+to+approximate+growth-rate+maximization.">How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization.</a> FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).</li><li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations.">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li><li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system:+Practical+laboratory+guideline.">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression.">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li><li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids.">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li><li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+A+highly+productive,+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource.">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li><li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells.">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li><li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform.">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li></ol>

Toezicht door onderzoekers is traditioneel nodig voor twee belangrijke acties tijdens celgroei: de inductie van T7 RNAP en het oogsten van cellen bij een specifieke OD600. CFAI voorkomt beide vereisten om de tijd van de onderzoeker te verminderen en de technische training die nodig is om celextracten van hoge kwaliteit te bereiden. Auto-inductie van T7 RNAP wordt bereikt door glucose te vervangen door lactose als de primaire suiker in de media, waardoor de eerdere noodzaak om de groei actief te controleren en ...

Het gebruik van celvrije eiwitsynthese (CFPS) voor biotechnologische toepassingen is de afgelopen jaren aanzienlijk toegenomen 1,2,3. Deze ontwikkeling kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan de toegenomen inspanningen om de processen die zich voordoen in CFPS en de rol van elk onderdeelte begrijpen 4,5. Bovendien hebben lagere kosten als gevolg van geoptimaliseerde opstellingen en alternatieve energiebronnen celvrije technologie gemakkelijker te implementeren gemaakt voor nieuwe gebruikers 6,7,8,9. Om de noodzakelijke transcriptie- en translatiefactoren voor eiwitsynthese te implementeren, wordt celextract vaak gebruikt om celvrije reactiesaan te sturen 10. Onlangs gepubliceerde gebruikershandleidingen hebben eenvoudige protocollen voor het produceren van functioneel extract, waardoor het gemakkelijker te implementeren is voor zowel nieuwe als ervaren gebruikers 1,11,12,13,14. Celextract wordt meestal verkregen door de lysis van een celkweek, die kan worden gekweekt met behulp van verschillende organismen, afhankelijk van het specifieke gebruik dat gewenst is 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) is snel uitgegroeid tot een van de meest gebruikte gastheerorganismen voor de productie van functionele extracten17. De BL21 Star (DE3) stam heeft de voorkeur omdat het de proteasen uit het buitenmembraan (OmpT protease) en het cytoplasma (Lon protease) verwijdert, waardoor een optimale omgeving wordt geboden voor de recombinante eiwitexpressie. Bovendien bevat de DE3 het λDE3 dat het gen voor T7 RNA-polymerase (T7 RNAP) draagt onder controle van de lacUV5-promotor; de stercomponent bevat een gemuteerd RNaseE-gen dat splitsing van mRNA 4,14,18,19 voorkomt. Onder de lacUV5-promotor maakt isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) inductie de expressie van T7 RNAP20,21 mogelijk. Deze stammen worden gebruikt om cellen te kweken en te oogsten, die grondstof geven voor de bereiding van extracten. Cellyse kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende methoden, waaronder kralen kloppen, Franse pers, homogenisatie, ultrasoonapparaat en stikstof cavitatie 1,11,12,22.
Het proces van bacteriekweek en oogsten is consistent op de meeste platforms bij het gebruik van E. coli, maar vereist meerdere dagen en intensief toezicht van de onderzoeker 1,11,13. Dit proces begint over het algemeen met een nachtelijke zaadkweek in LB-bouillon, die bij nachtelijke groei vervolgens wordt ingeënt tot een grotere cultuur van 2xYTPG (gist, trypton, fosfaatbuffer, glucose) de volgende dag. De groei van deze grotere cultuur wordt gemonitord totdat deze de vroege tot midden logfase bereikt, bij een optische dichtheid (OD) van 2,514,20. Constante meting is vereist omdat eerder is aangetoond dat de componenten van transcriptie en translatie zeer actief zijn in de vroege tot midden logfase23,24. Hoewel dit proces reproduceerbare extracten kan creëren, heeft ons laboratorium onlangs een nieuwe methode ontwikkeld met behulp van Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media, die het toezicht van onderzoekers vermindert, de totale opbrengst van extract voor een bepaalde liter celkweek verhoogt en de toegang tot E. coli-gebaseerde extractbereiding voor zowel ervaren als nieuwe gebruikers verbetert (figuur 1 ). Hier bieden we de stapsgewijze handleiding voor het implementeren van de CFAI-workflow, om binnen 24 uur van een gestreepte plaat cellen naar een voltooide CFPS-reactie te gaan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MPC-425Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT5F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Lactose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(Glu)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(OAc)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTPs</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0382124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0379904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunair 2.5L Baffled Shake Flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Processor</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q125-230V/50HZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow

Celvrije eiwitsynthese (CFPS) is uitgegroeid tot een biotechnologisch platform dat transcriptie- en vertaalmachines in vitro vastlegt. Talrijke ontwikkelingen hebben het CFPS-platform toegankelijker gemaakt voor nieuwe gebruikers en hebben het scala aan toepassingen uitgebreid. Voor op lysaat gebaseerde CFPS-systemen kunnen celextracten worden gegenereerd uit een verscheidenheid aan organismen, waarbij de unieke biochemie van die gastheer wordt gebruikt om de eiwitsynthese te vergroten. In de afgelopen 20 jaar is Escherichia coli (E. coli) een van de meest gebruikte organismen geworden voor het ondersteunen van CFPS vanwege de betaalbaarheid en veelzijdigheid. Ondanks tal van belangrijke ontwikkelingen is de workflow voor de bereiding van E. coli-celextract een belangrijk knelpunt gebleven voor nieuwe gebruikers om CFPS voor hun toepassingen te implementeren. De workflow voor de voorbereiding van extracten is tijdrovend en vereist technische expertise om reproduceerbare resultaten te bereiken. Om deze barrières te overwinnen, meldden we eerder de ontwikkeling van een 24-uurs celvrije auto-inductie (CFAI) -workflow die de input van gebruikers en de vereiste technische expertise vermindert. De CFAI-workflow minimaliseert de arbeid en technische vaardigheden die nodig zijn om celextracten te genereren en verhoogt tegelijkertijd de totale hoeveelheden verkregen celextracten. Hier beschrijven we die workflow stap voor stap om de toegang te verbeteren en de brede implementatie van op E. coli gebaseerde CFPS te ondersteunen.

Bij het bereiden van CFAI-media werd glucose ingeruild voor een toename van lactose en glycerol als het belangrijkste energiesubstraat in de media. Daarnaast werd ook de buffercapaciteit van de CFAI-media verhoogd. Deze specifieke componenten zijn weergegeven in tabel 1.
De cellen werden vervolgens gekweekt tot zowel een OD600 van 10 als de standaard 2,5 in CFAI-media om consistentie met extractkwaliteit te tonen ondanks verschillende extracthoeveelheden. De 2,5 OD<...

Watch this Scientific Journal Video about From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow at JoVE.com

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Dit werk beschrijft de bereiding van celextract van Escherichia coli (E. coli) gevolgd door celvrije eiwitsynthese (CFPS) reacties in minder dan 24 uur. Uitleg van het celvrije auto-inductie (CFAI) protocol beschrijft verbeteringen die zijn aangebracht om het toezicht van onderzoekers te verminderen en de verkregen hoeveelheden celextract te verhogen.

Van cellen naar celvrije eiwitsynthese binnen 24 uur met behulp van celvrije auto-inductieworkflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

De celvrije auto-inductiemethode vermindert het toezicht van onderzoekers en de tijd die nodig is om functionele celextracten te produceren. Dit vereenvoudigt eerdere in vitro eiwitsyntheseprotocollen die tijdrovender en intensiever waren. Deze techniek is minder ingewikkeld en ook hoogproductief, waardoor een groter publiek celvrije expressie kan implementeren.Deze methode benadrukt het belang van energiemetabolisme tijdens celgroei en binnen celvrije reacties. Begin met het bereiden van 960 milliliter celvrije auto-inductiemedia. Steriliseer vervolgens de media in een verbijsterde kolf van 2,5 liter door gedurende 30 minuten te autoclaveren bij 121 graden Celsius.Vervolgens, na het bereiden van 40 milliliter van de suikeroplossing, filter-steriliseer het in een aparte geautoclaveerde glazen container. Na het autoclaveren, wanneer de kweekmedia zijn afgekoeld tot minder dan 40 graden Celsius, voegt u de filtergesteriliseerde suikeroplossing rechtstreeks aan de media toe. Ent vervolgens de media door een lus vol kolonies van een eerder gestreepte verse E.coli BL21-sterplaat te vegen en de lus rechtstreeks in de media in te brengen.Draai de lus in het medium zonder de zijkanten van de container aan te raken. Plaats vervolgens de ingeënte media een nacht in een incubator van 30 graden Celsius met schudden bij 200 RPM. Oogst de volgende dag de cellen door een liter van het medium over te brengen in een centrifugefles van één liter en centrifugeer op 5.000 keer G tussen vier en 10 graden Celsius gedurende 10 minuten.Gebruik na het weggooien van het supernatant een steriele spatel om de pellet over te brengen naar een voorgekoelde en eerder gewogen conische buis van 50 milliliter. Was de pellet vervolgens eenmaal met 30 tot 40 milliliter koude S30-buffer door de pellet via vortexing in bursts van 30 seconden met rustperioden op ijs opnieuw te suspenderen. Nadat de pellet volledig is geresuspendeerd, centrifugeert u de celreuspensie, gooit u het supernatant weg en veegt u met een schoon weefsel overtollig supernatant van de binnenwanden van de 50-milliliterbuis af zonder de pellet aan te raken.Weeg vervolgens de pellet voordat u deze invriest in vloeibare stikstof en bewaar deze bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. Om het celextract te bereiden, voegt u één milliliter S30-buffer per gram bevroren celkorrel toe en laat u de pellet 30 tot 60 minuten op ijs ontdooien. Resuspend de ontdooide pellet vervolgens via vortexing in uitbarstingen van 30 seconden met rustperioden op ijs totdat er geen zichtbare celklonten overblijven.Breng voor cellysis 1,4 milliliter aliquots van de celsuspensie over in microfugebuizen van 1,5 milliliter. Soniceer vervolgens de celsuspensie in elke buis met een frequentie van 20 kilohertz en 50% amplitude gedurende drie uitbarstingen van 45 seconden met 59 seconden rust per cyclus in een ijsbad Keer de buis tussen cycli om en voeg na de laatste ultrasoonapparaatcyclus onmiddellijk 4,5 microliter één molair dithiothreitol toe. Na het soniceren van de celsuspensie in alle buizen, centrifugeer de buizen en verzamel het supernatant in aliquots van 600 microliter in verse 1,5-milliliter microfugebuizen.Flash bevries en bewaar de aliquots bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. Om 15 microliter celvrije eiwitsynthesereactie uit te voeren in microfugebuizen van 1,5 milliliter in quadruplicaat, ontdooit u één aliquot van het celextract. Laat na het bereiden van elk 15-microliter reactiemengsel de reactie minstens vier uur lopen bij 37 graden Celsius.Om het reporter-eiwit te kwantificeren, combineert u 48 microliter 50-millimolaire HEPES-buffer bij pH 7,2 met twee microliter van elk celvrij eiwitsynthesereactieproduct in een zwarte polystyreen 96-well plaat. Kwantificeer de fluorescentie-intensiteit van het superfolder groene fluorescerende eiwit, of sfGFP, met behulp van een excitatiegolflengte van 485 en een emissiegolflengte van 528 nanometer. Converteer vervolgens de relatieve fluorescentie-eenheden naar de volumetrische opbrengst van sfGFP door een standaardcurve te maken met behulp van gezuiverd pJL1 sfGFP-plasmide.Hier worden celvrije auto-inductiemediapellets getoond na celoogst bij verschillende optische dichtheden gemeten bij 600 nanometer. De media groeiden tot een optische dichtheid van 10 produceerden een hogere hoeveelheid celkorrel in totaal extract dan de media groeiden tot een optische dichtheid van 2,5. Verdere analyse van de totale eiwitconcentratie toonde geen significant verschil in totaal eiwit tussen beide extracten.Hoewel de media werden gekweekt tot verschillende optische dichtheidsniveaus, vertoonden beide extracten vergelijkbare resultaten in celvrije reacties die sfGFP tot expressie brachten. Het handhaven van steriele omstandigheden tijdens het bereiden van de media en suikeroplossing is belangrijk. Deze CFAI-celextractmethode kan worden gebruikt voor de meeste toepassingen van celvrije expressie.Deze variëren van biotechnologisch onderwijs tot eiwittechnologie, evenals point-of-care diagnostiek. Deze methode vermindert de hoeveelheid tijd en technische vaardigheden die nodig zijn, verbetert de reproduceerbaarheid en produceert grotere hoeveelheden extract.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Combinatoriële Synthese van en high-throughput eiwit Op de markt van Polymer Film en Nanodeeltje bibliotheken

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Isolatie en karakterisering van chimerische menselijke fc-uitdrukkende eiwitten met behulp van eiwitten een membraanadsorbers en een gestroomlijnde workflow

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

De inkapseling van de Cell-free transcriptie en vertaling Machines in Blaasjes voor de bouw van Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Afsluitbare Femtoliter Kamer Arrays voor Celvrije Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cel-vrije eiwit expressie met behulp van de snel groeiende bacterie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Een Multilayer microfluidic platform voor de geleiding van langdurige cel-vrije genexpressie

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

OnePot PURE Cell-Free System

OnePot PURE Celvrij Systeem

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...