Name: from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier jennifer VanderKelen et Andrea Laubscher pour leur soutien technique. Les auteurs tiennent également à remercier Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington et Jillian Kasman pour leurs discussions utiles. Les auteurs reconnaissent également le soutien financier du Bill and Linda Frost Fund, de la Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant du Center for Applications in Biotechnology, de Cal Poly Research, Scholarly et de la National Science Foundation (NSF-1708919).

1. Croissance des médias
<ol><li>Préparer 960 mL de milieu CFAI comme décrit dans le tableau 1 et ajuster le pH à 7,2 à l’aide de KOH.</li>
	<li>Transférer le milieu de culture dans une fiole et un autoclave déconcertés de 2,5 L pendant 30 min à 121 °C.</li>
	<li>Préparer une solution de sucre de 40 ml comme décrit dans le tableau 1. Filtrer-stériliser la solution dans un récipient en verre autoclavé séparé. REMARQUE: La solution de sucre peut être stockée dans ...

<ol>
	<li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+guide+to+cell-free+protein+synthesis.">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene+expression:+an+expanded+repertoire+of+applications.">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li><li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+supplement+mixtures:+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract.">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li><li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis.">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li><li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism.">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li><li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis:+Protocols+for+a+robust,+flexible,+and+accessible+platform+technology.">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression.">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable,+on-demand+biomolecular+manufacturing.">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li><li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering.">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li><li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis.">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li><li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems.">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li><li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li><li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions.">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+the+preparation+of+"endotoxin-free"+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase.">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li><li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing.">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li><li>Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fast-growing+bacteria+robustly+tune+their+ribosome+concentration+to+approximate+growth-rate+maximization.">How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization.</a> FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).</li><li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations.">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li><li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system:+Practical+laboratory+guideline.">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression.">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li><li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids.">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li><li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+A+highly+productive,+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource.">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li><li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells.">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li><li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform.">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li></ol>

La surveillance des chercheurs est traditionnellement nécessaire pour deux actions clés au cours de la croissance cellulaire : l’induction de l’ARNR T7 et la récolte de cellules à un OD600 spécifique. CFAI élimine ces deux exigences pour réduire le temps du chercheur et la formation technique requise pour préparer des extraits cellulaires de haute qualité. L’auto-induction de l’ARNR T7 est obtenue en remplaçant le glucose par du lactose comme sucre primaire dans le milieu, éliminant ainsi le...

L’utilisation de la synthèse de protéines sans cellules (CFPS) pour les applications biotechnologiques a considérablement augmenté au cours des dernières années 1,2,3. Cette évolution peut être attribuée en partie aux efforts accrus déployés pour comprendre les processus qui se produisent dans le SCFFC et le rôle de chaque composante 4,5. En outre, la réduction des coûts attribuée aux configurations optimisées et aux sources d’énergie alternatives a rendu la technologie sans cellules plus facile à mettre en œuvre pour les nouveaux utilisateurs 6,7,8,9. Afin de mettre en œuvre les facteurs de transcription et de traduction nécessaires à la synthèse des protéines, l’extrait cellulaire est souvent utilisé pour conduire des réactions sans cellules10. Les guides d’utilisation récemment publiés ont fourni des protocoles simples pour produire un extrait fonctionnel, ce qui le rend plus facile à mettre en œuvre pour les utilisateurs nouveaux et expérimentés 1,11,12,13,14. L’extrait cellulaire est généralement obtenu par la lyse d’une culture cellulaire, qui peut être cultivée en utilisant différents organismes en fonction de l’utilisation spécifique souhaitée 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) est rapidement devenu l’un des organismes hôtes les plus couramment utilisés pour produire des extraits fonctionnels17. La souche BL21 Star (DE3) est préférée car elle élimine les protéases de la membrane externe (protéase OmpT) et du cytoplasme (protéase Lon), fournissant un environnement optimal pour l’expression de la protéine recombinante. De plus, le DE3 contient l’λDE3 qui porte le gène de l’ARN polymérase T7 (T7 RNAP) sous le contrôle du promoteur lacUV5; la composante étoile contient un gène RNaseE muté qui empêche le clivage de l’ARNm 4,14,18,19. Sous le promoteur lacUV5, l’induction isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) permet l’expression de T7 RNAP20,21. Ces souches sont utilisées pour cultiver et récolter des cellules, qui donnent de la matière première pour la préparation de l’extrait. La lyse cellulaire peut être effectuée à l’aide de diverses méthodes, y compris le battage des billes, la presse à Français, l’homogénéisation, la sonication et la cavitation de l’azote 1,11,12,22.
Le processus de culture et de récolte bactériennes est cohérent sur la plupart des plates-formes lors de l’utilisation d’E. coli, mais nécessite plusieurs jours et une surveillance intensedes chercheurs 1,11,13. Ce processus commence généralement par une culture de graines pendant la nuit dans un bouillon LB, qui, après une croissance nocturne, est ensuite inoculée dans une culture plus grande de 2xYTPG (levure, tryptone, tampon phosphate, glucose) le lendemain. La croissance de cette culture plus grande est surveillée jusqu’à ce qu’elle atteigne la phase logarithmique précoce à moyenne, à une densité optique (OD) de 2,514,20. Une mesure constante est nécessaire car il a déjà été démontré que les composants de la transcription et de la traduction sont très actifs dans la phase logarithmique23,24 du début au milieu de la phase. Bien que ce processus puisse créer un extrait reproductible, notre laboratoire a récemment mis au point une nouvelle méthode utilisant des milieux d’auto-induction sans cellules (CFAI), qui réduit la surveillance des chercheurs, augmente le rendement global de l’extrait pour un litre donné de culture cellulaire et améliore l’accès à la préparation d’extraits à base d’E. coli pour les utilisateurs expérimentés et nouveaux (Figure 1 ). Nous fournissons ici le guide étape par étape pour la mise en œuvre du flux de travail CFAI, pour passer d’une plaque striée de cellules à une réaction CFPS terminée dans les 24 heures.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MPC-425Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT5F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Lactose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(Glu)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(OAc)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTPs</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0382124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0379904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunair 2.5L Baffled Shake Flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Processor</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q125-230V/50HZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow

La synthèse de protéines sans cellules (CFPS) s’est développée en tant que plate-forme biotechnologique qui capture les mécanismes de transcription et de traduction in vitro. De nombreux développements ont rendu la plate-forme CFPS plus accessible aux nouveaux utilisateurs et ont élargi la gamme d’applications. Pour les systèmes CFPS à base de lysat, des extraits cellulaires peuvent être générés à partir d’une variété d’organismes, exploitant la biochimie unique de cet hôte pour augmenter la synthèse des protéines. Au cours des 20 dernières années, Escherichia coli (E. coli) est devenu l’un des organismes les plus largement utilisés pour soutenir le SFC en raison de son prix abordable et de sa polyvalence. Malgré de nombreuses avancées clés, le flux de travail pour la préparation de l’extrait de cellules d’E. coli est resté un goulot d’étranglement clé pour les nouveaux utilisateurs qui souhaitent mettre en œuvre CFPS pour leurs applications. Le flux de travail de préparation des extraits prend beaucoup de temps et nécessite une expertise technique pour obtenir des résultats reproductibles. Pour surmonter ces obstacles, nous avons déjà signalé le développement d’un flux de travail d’auto-induction sans cellule (CFAI) 24 heures sur 24 qui réduit les entrées des utilisateurs et l’expertise technique requise. Le flux de travail CFAI minimise le travail et les compétences techniques nécessaires pour générer des extraits de cellules tout en augmentant les quantités totales d’extraits de cellules obtenues. Nous décrivons ici ce flux de travail étape par étape afin d’améliorer l’accès et de soutenir la mise en œuvre à grande échelle du CFPS basé sur E. coli .

Lors de la préparation des milieux CFAI, le glucose a été échangé contre une augmentation du lactose et du glycérol en tant que principal substrat énergétique dans le milieu. De plus, la capacité de mise en mémoire tampon des médias CFAI a également été augmentée. Ces composantes spécifiques sont données dans le tableau 1.
Les cellules ont ensuite été cultivées à la fois à un OD600 de 10 et à la norme 2,5 dans les milieux CFAI pour montrer une...

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From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Ce travail décrit la préparation de l’extrait cellulaire d’Escherichia coli (E. coli) suivie de réactions de synthèse de protéines sans cellules (CFPS) en moins de 24 heures. L’explication du protocole d’auto-induction sans cellule (CFAI) détaille les améliorations apportées pour réduire la surveillance des chercheurs et augmenter les quantités d’extrait cellulaire obtenues.

Des cellules à la synthèse de protéines sans cellules en 24 heures à l’aide d’un flux de travail d’auto-induction sans cellules

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

La méthode d’auto-induction sans cellule réduit la surveillance des chercheurs et le temps nécessaire pour produire des extraits cellulaires fonctionnels. Cela simplifie les protocoles précédents de synthèse de protéines in vitro qui prenaient plus de temps et étaient plus intensifs. Cette technique est moins compliquée et aussi à haut rendement, ce qui permettra à un public plus large de mettre en œuvre l’expression sans cellule.Cette méthode souligne l’importance du métabolisme énergétique pendant la croissance cellulaire et dans les réactions sans cellules. Commencez par préparer 960 millilitres de milieux d’auto-induction sans cellules. Ensuite, stérilisez le média dans une fiole déconcertée de 2,5 litres en autoclavant pendant 30 minutes à 121 degrés Celsius.Ensuite, après avoir préparé 40 millilitres de la solution de sucre, filtrez-stérilisez-la dans un récipient en verre autoclavé séparé. Après l’autoclavage, lorsque le milieu de culture a refroidi à moins de 40 degrés Celsius, ajoutez la solution de sucre stérilisée par filtre directement au milieu. Ensuite, inoculez le média en balayant une boucle pleine de colonies à partir d’une plaque étoilée E.coli BL21 fraîche précédemment striée et en insérant la boucle directement dans le média.Faites tourbillonner la boucle dans le support sans toucher les côtés du récipient. Ensuite, placez le média inoculé pendant la nuit dans un incubateur de 30 degrés Celsius en secouant à 200 tr / min. Le lendemain, récoltez les cellules en transférant un litre du milieu dans une bouteille de centrifugeuse d’un litre et en centrifugant à 5 000 fois G entre quatre et 10 degrés Celsius pendant 10 minutes.Après avoir jeté le surnageant, utilisez une spatule stérile pour transférer la pastille dans un tube conique de 50 millilitres pré-refroidi et précédemment pesé. Ensuite, lavez la pastille une fois avec 30 à 40 millilitres de tampon S30 froid en resusmpant la pastille par vortex en rafales de 30 secondes avec des périodes de repos sur la glace. Une fois la pastille complètement remise en suspension, centrifugez la remise en suspension de la cellule, jetez le surnageant et, à l’aide d’un mouchoir propre, essuyez tout excès de surnageant des parois intérieures du tube de 50 millilitres sans toucher la pastille.Ensuite, pesez la pastille avant de la congeler dans de l’azote liquide et conservez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Pour préparer l’extrait de cellule, ajoutez un millilitre de tampon S30 par gramme de granulé de cellule congelé et laissez le granulé décongeler sur la glace pendant 30 à 60 minutes. Ensuite, remettez en suspension la pastille décongelée par vortex par rafales de 30 secondes avec des périodes de repos sur la glace jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’amas cellulaires visibles.Pour la lyse cellulaire, transférer des aliquotes de 1,4 millilitre de la suspension cellulaire dans des tubes de microfuge de 1,5 millilitre. Ensuite, soniquez la suspension cellulaire dans chaque tube avec une fréquence de 20 kilohertz et une amplitude de 50% pendant trois rafales de 45 secondes avec 59 secondes de repos par cycle dans un bain de glace Inverser le tube entre les cycles, et après le dernier cycle de sonication, ajouter immédiatement 4,5 microlitres de dithiothréitol à une molaire. Après avoir soniqué la suspension cellulaire dans tous les tubes, centrifugez les tubes et collectez le surnageant dans des aliquotes de 600 microlitres dans des tubes de microfuge frais de 1,5 millilitre.Congeler et conserver les aliquotes à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Pour effectuer 15 microlitres de réaction de synthèse de protéines sans cellule dans des tubes de microfuge de 1,5 millilitre en quadruplicate, décongeler une aliquote de l’extrait cellulaire. Après avoir préparé chaque mélange réactionnel de 15 microlitres, laissez la réaction fonctionner pendant au moins quatre heures à 37 degrés Celsius.Pour quantifier la protéine rapporteure, combinez 48 microlitres de tampon HEPES de 50 millimolaires à pH 7,2 avec deux microlitres de chaque produit de réaction de synthèse de protéines sans cellule dans une plaque de polystyrène noir à 96 puits. Quantifiez l’intensité de fluorescence de la protéine fluorescente verte superdosseuse, ou sfGFP, en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 485 et une longueur d’onde d’émission de 528 nanomètres. Ensuite, convertissez les unités de fluorescence relatives au rendement volumétrique de sfGFP en créant une courbe standard à l’aide du plasmide pJL1 sfGFP purifié.On voit ici des pastilles de milieux d’auto-induction sans cellules après récolte cellulaire à différentes densités optiques mesurées à 600 nanomètres. Le milieu atteint une densité optique de 10 a produit une plus grande quantité de pastilles cellulaires dans l’extrait global que le milieu atteint une densité optique de 2,5. Une analyse plus approfondie de la concentration en protéines totales n’a montré aucune différence significative dans les protéines globales entre les deux extraits.Même si le milieu a été cultivé à des niveaux de densité optique différents, les deux extraits ont démontré des résultats similaires dans les réactions sans cellules exprimant sfGFP. Il est important de maintenir des conditions stériles lors de la préparation du milieu et de la solution de sucre. Cette méthode d’extrait de cellule CFAI peut être utilisée pour la plupart des applications d’expression sans cellule.Celles-ci vont de l’enseignement de la biotechnologie à l’ingénierie des protéines, en passant par le diagnostic au point de service. Cette méthode réduit le temps et les compétences techniques requises, améliore la reproductibilité et produit de plus grandes quantités d’extrait.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Synthèse combinatoire des protéines et de décharge à haut débit à partir du film polymère et bibliothèques nanoparticules

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Recherche

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Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Isolation et caractérisation de protéines humaines chimériques exprimant fc à l’aide d’adsorbeurs membranaires de protéine a et d’un flux de travail rationalisé

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

L&#39;encapsulation de transcription cellulaire et sans traduction machines dans des vésicules pour la construction de Mimics cellulaires

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Tableaux Scellable femtolitre Chambre pour la biologie acellulaire

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

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A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

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The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

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