Name: from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00
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Die Autoren danken Dr. Jennifer VanderKelen und Andrea Laubscher für die technische Unterstützung. Die Autoren danken auch Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington und Jillian Kasman für hilfreiche Diskussionen. Die Autoren würdigen auch die finanzielle Unterstützung durch den Bill and Linda Frost Fund, den Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant des Center for Applications in Biotechnology, Cal Poly Research, Scholarly und die National Science Foundation (NSF-1708919).

1. Medienwachstum
<ol><li>Bereiten Sie 960 ml CFAI-Medien wie in Tabelle 1 beschrieben vor und stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,2 ein.</li>
	<li>Übertragen Sie Kulturmedien für 30 min bei 121 °C auf einen 2,5 l verblüfften Kolben und Autoklaven.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 40 ml Zuckerlösung vor, wie in Tabelle 1 beschrieben. Sterilisieren Sie die Lösung in einen separaten Autoklavglasbehälter. HINWEIS: Die Zuckerlösung kann bis zur weiteren Verwendung in einem 30 °C I...

<ol>
	<li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+guide+to+cell-free+protein+synthesis.">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene+expression:+an+expanded+repertoire+of+applications.">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li><li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+supplement+mixtures:+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract.">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li><li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis.">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li><li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism.">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li><li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis:+Protocols+for+a+robust,+flexible,+and+accessible+platform+technology.">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression.">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable,+on-demand+biomolecular+manufacturing.">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li><li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering.">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li><li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis.">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li><li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems.">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li><li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li><li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions.">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+the+preparation+of+"endotoxin-free"+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase.">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li><li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing.">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li><li>Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fast-growing+bacteria+robustly+tune+their+ribosome+concentration+to+approximate+growth-rate+maximization.">How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization.</a> FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).</li><li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations.">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li><li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system:+Practical+laboratory+guideline.">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression.">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li><li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids.">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li><li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+A+highly+productive,+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource.">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li><li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells.">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li><li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform.">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li></ol>

Die Aufsicht der Forscher wird traditionell für zwei Schlüsselaktionen während des Zellwachstums benötigt: die Induktion von T7-RNAP und die Gewinnung von Zellen bei einem spezifischen OD600. CFAI macht beide Anforderungen überflüssig, um die Zeit des Forschers und die technische Ausbildung zu verringern, die für die Herstellung hochwertiger Zellextrakte erforderlich sind. Die Autoinduktion von T7-RNAP wird erreicht, indem Glukose durch Laktose als primären Zucker in den Medien ersetzt wird, wodurch di...

Der Einsatz der zellfreien Proteinsynthese (CFPS) für biotechnologische Anwendungen hat in den letzten Jahren erheblich zugenommen 1,2,3. Diese Entwicklung ist zum Teil auf verstärkte Anstrengungen zum Verständnis der in CFPS auftretenden Prozesse und der Rolle jeder Komponentezurückzuführen 4,5. Darüber hinaus haben reduzierte Kosten, die auf optimierte Setups und alternative Energiequellen zurückzuführen sind, die Implementierung der zellfreien Technologie für neue Benutzer erleichtert 6,7,8,9. Um die notwendigen Transkriptions- und Translationsfaktoren für die Proteinsynthese zu implementieren, wird Zellextrakt häufig verwendet, um zellfreie Reaktionen anzutreiben10. Kürzlich veröffentlichte Benutzerhandbücher haben einfache Protokolle für die Erstellung von Funktionsextrakten bereitgestellt, die die Implementierung für neue und erfahreneBenutzer erleichtern 1,11,12,13,14. Zellextrakt wird normalerweise durch die Lyse einer Zellkultur gewonnen, die je nach gewünschter spezifischer Verwendung mit verschiedenen Organismen gezüchtet werden kann 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) hat sich schnell zu einem der am häufigsten verwendeten Wirtsorganismen für die Herstellung funktioneller Extrakteentwickelt 17. Der Stamm BL21 Star (DE3) wird bevorzugt, da er die Proteasen von der äußeren Membran (OmpT-Protease) und dem Zytoplasma (Lon-Protease) entfernt und eine optimale Umgebung für die rekombinante Proteinexpression bietet. Darüber hinaus enthält das DE3 das λDE3, das das Gen für die T7-RNA-Polymerase (T7-RNAP) unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors trägt; Die Sternkomponente enthält ein mutiertes RNaseE-Gen, das die Spaltung der mRNA 4,14,18,19 verhindert. Unter dem lacUV5-Promotor ermöglicht die Induktion von Isopropyl-Thiogalactopyranosid (IPTG) die Expression von T7-RNAP20,21. Diese Stämme werden verwendet, um Zellen zu züchten und zu ernten, die Rohstoffe für die Extraktherstellung liefern. Die Zelllyse kann mit einer Vielzahl von Methoden durchgeführt werden, einschließlich Perlenschlagen, French Press, Homogenisierung, Beschallung und Stickstoffkavitation 1,11,12,22.
Der Prozess der Bakterienkultur und -ernte ist bei der Verwendung von E. coli auf den meisten Plattformen konsistent, erfordert jedoch mehrere Tage und eine intensive Aufsicht durch die Forscher 1,11,13. Dieser Prozess beginnt im Allgemeinen mit einer Samenkultur über Nacht in LB-Brühe, die dann bei Wachstum über Nacht am nächsten Tag in eine größere Kultur von 2xYTPG (Hefe, Trypton, Phosphatpuffer, Glukose) eingeimpft wird. Das Wachstum dieser größeren Kultur wird überwacht, bis sie die frühe bis mittlere Log-Phase mit einer optischen Dichte (OD) von 2,514,20 erreicht. Eine konstante Messung ist erforderlich, da sich die Komponenten der Transkription und Translation bereits in der frühen bis mittleren Log-Phase23,24 als hochaktiv erwiesen haben. Während dieser Prozess reproduzierbaren Extrakt erzeugen kann, hat unser Labor kürzlich eine neue Methode mit Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media entwickelt, die die Aufsicht der Forscher reduziert, die Gesamtausbeute an Extrakt für einen bestimmten Liter Zellkultur erhöht und den Zugang zu E. coli-basierter Extraktvorbereitung für erfahrene und neue Benutzer verbessert (Abbildung 1 ). Hier bieten wir die Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Implementierung des CFAI-Workflows, um innerhalb von 24 Stunden von einer gestreiften Zellplatte zu einer abgeschlossenen CFPS-Reaktion zu gelangen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MPC-425Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT5F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Lactose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(Glu)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(OAc)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTPs</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0382124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0379904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunair 2.5L Baffled Shake Flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Processor</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q125-230V/50HZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow

Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) hat sich zu einer biotechnologischen Plattform entwickelt, die Transkriptions- und Translationsmaschinen in vitro erfasst. Zahlreiche Entwicklungen haben die CFPS-Plattform für neue Anwender zugänglicher gemacht und das Anwendungsspektrum erweitert. Für lysatbasierte CFPS-Systeme können Zellextrakte aus einer Vielzahl von Organismen erzeugt werden, wobei die einzigartige Biochemie dieses Wirts genutzt wird, um die Proteinsynthese zu verstärken. In den letzten 20 Jahren hat sich Escherichia coli (E. coli) aufgrund seiner Erschwinglichkeit und Vielseitigkeit zu einem der am häufigsten verwendeten Organismen zur Unterstützung von CFPS entwickelt. Trotz zahlreicher wichtiger Fortschritte ist der Workflow für die Herstellung von E. coli-Zellextrakten nach wie vor ein wichtiger Engpass für neue Anwender bei der Implementierung von CFPS für ihre Anwendungen . Der Workflow der Extraktaufbereitung ist zeitintensiv und erfordert technisches Know-how, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Um diese Barrieren zu überwinden, haben wir bereits über die Entwicklung eines 24-Stunden-CFAI-Workflows (Cell-Free Autoinduction) berichtet, der den Benutzeraufwand und das erforderliche technische Fachwissen reduziert. Der CFAI-Workflow minimiert den Arbeitsaufwand und die technischen Fähigkeiten, die für die Erzeugung von Zellextrakten erforderlich sind, und erhöht gleichzeitig die Gesamtmenge der erhaltenen Zellextrakte. Hier beschreiben wir diesen Workflow Schritt für Schritt, um den Zugang zu verbessern und die breite Implementierung von E. coli-basiertem CFPS zu unterstützen.

Bei der Herstellung von CFAI-Medien wurde Glukose gegen eine Erhöhung von Laktose und Glycerin als Hauptenergiesubstrat in den Medien ausgetauscht. Zusätzlich wurde auch die Pufferkapazität der CFAI-Medien erhöht. Diese spezifischen Komponenten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Die Zellen wurden dann sowohl zu einem OD600 von 10 als auch zum Standard 2,5 in CFAI-Medien gezüchtet, um trotz unterschiedlicher Extraktmengen Konsistenz mit der Extraktqualität zu zeige...

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From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Diese Arbeit beschreibt die Herstellung von Zellextrakt aus Escherichia coli (E. coli ) gefolgt von zellfreien Proteinsynthesereaktionen (CFPS) in weniger als 24 Stunden. Die Erläuterung des CFAI-Protokolls (Cell-Free Autoinduction) beschreibt Verbesserungen, die vorgenommen wurden, um die Aufsicht der Forscher zu reduzieren und die Mengen des erhaltenen Zellextrakts zu erhöhen.

Von der Zelle zur zellfreien Proteinsynthese innerhalb von 24 Stunden mit zellfreiem Autoinduktions-Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

Die zellfreie Autoinduktionsmethode reduziert die Aufsicht der Forscher und die Zeit, die für die Herstellung funktioneller Zellextrakte benötigt wird. Dies vereinfacht frühere In-vitro-Proteinsyntheseprotokolle, die zeitaufwendiger und intensiver waren. Diese Technik ist weniger kompliziert und auch ertragreich, was es einem größeren Publikum ermöglicht, zellfreien Ausdruck zu implementieren.Diese Methode unterstreicht die Bedeutung des Energiestoffwechsels während des Zellwachstums und innerhalb zellfreier Reaktionen. Beginnen Sie mit der Herstellung von 960 Millilitern zellfreier Autoinduktionsmedien. Sterilisieren Sie dann das Medium in einem 2,5-Liter-Kolben, indem Sie 30 Minuten bei 121 Grad Celsius autoklavieren.Als nächstes, nach der Zubereitung von 40 Millilitern der Zuckerlösung, sterilisieren Sie es in einen separaten Autoklavglasbehälter. Nach dem Autoklavieren, wenn das Nährmedium auf unter 40 Grad Celsius abgekühlt ist, geben Sie die filtersterilisierte Zuckerlösung direkt in das Medium. Als nächstes impfen Sie die Medien, indem Sie eine Schleife voller Kolonien von einer zuvor gestreiften frischen E.coli BL21-Sternplatte streichen und die Schleife direkt in das Medium einführen.Schwenken Sie die Schlaufe in das Medium, ohne die Seiten des Behälters zu berühren. Legen Sie dann das geimpfte Medium über Nacht in einen 30 Grad Celsius-Inkubator mit Schütteln bei 200 U / min. Am nächsten Tag ernten Sie die Zellen, indem Sie einen Liter des Mediums in eine Ein-Liter-Zentrifugenflasche geben und bei 5.000 mal G zwischen vier und 10 Grad Celsius für 10 Minuten zentrifugieren.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, verwenden Sie einen sterilen Spatel, um das Pellet in ein vorgekühltes und zuvor gewogenes 50-Milliliter-konisches Rohr zu überführen. Als nächstes waschen Sie das Pellet einmal mit 30 bis 40 Millilitern kaltem S30-Puffer, indem Sie das Pellet durch Vortexing in 30-Sekunden-Ausbrüchen mit Ruhephasen auf Eis wieder aufhängen. Nachdem das Pellet vollständig resuspendiert wurde, zentrifugieren Sie die Zellresuspension, entsorgen Sie den Überstand und wischen Sie mit einem sauberen Gewebe überschüssigen Überstand von den Innenwänden des 50-Milliliter-Rohrs, ohne das Pellet zu berühren.Dann wiegen Sie das Pellet, bevor Sie es in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und lagern Sie es bis zum weiteren Gebrauch bei minus 80 Grad Celsius. Um den Zellextrakt herzustellen, fügen Sie einen Milliliter S30-Puffer pro Gramm des gefrorenen Zellpellets hinzu und lassen Sie das Pellet 30 bis 60 Minuten auf Eis auftauen. Dann suspendieren Sie das aufgetaute Pellet durch Vortexing in Ausbrüchen von 30 Sekunden mit Ruhephasen auf Eis, bis keine sichtbaren Zellklumpen mehr übrig sind.Für die Zelllyse übertragen Sie 1,4 Milliliter Aliquots der Zellsuspension in 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen. Dann beschallen Sie die Zellsuspension in jeder Röhre mit einer Frequenz von 20 Kilohertz und 50% Amplitude für drei Ausbrüche von 45 Sekunden mit 59 Sekunden Ruhe pro Zyklus in einem Eisbad Kehren Sie die Röhre zwischen den Zyklen um und fügen Sie nach dem letzten Beschallungszyklus sofort 4,5 Mikroliter einmolares Dithiothreitol hinzu. Nachdem Sie die Zellsuspension in allen Röhrchen beschallt haben, zentrifugieren Sie die Röhrchen und sammeln Sie den Überstand in 600-Mikroliter-Aliquots in frischen 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen.Die Aliquots bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung einfrieren und lagern. Um 15 Mikroliter zellfreie Proteinsynthesereaktion in 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen in Vierfacher durchzuführen, tauen Sie ein Aliquot des Zellextrakts auf. Lassen Sie die Reaktion nach der Zubereitung jedes 15-Mikroliter-Reaktionsgemisches mindestens vier Stunden bei 37 Grad Celsius laufen.Um das Reporterprotein zu quantifizieren, kombinieren Sie 48 Mikroliter 50-millimolären HEPES-Puffer bei pH 7,2 mit zwei Mikrolitern jedes zellfreien Proteinsynthese-Reaktionsprodukts in einer schwarzen Polystyrol-96-Well-Platte. Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität des Superordners grün fluoreszierendes Protein (sfGFP) unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 485 und einer Emissionswellenlänge von 528 Nanometern. Konvertieren Sie dann die relativen Fluoreszenzeinheiten in die volumetrische Ausbeute von sfGFP, indem Sie eine Standardkurve mit gereinigtem pJL1-sfGFP-Plasmid erstellen.Hier sind zellfreie Autoinduktionsmedienpellets nach Zellernte bei unterschiedlichen optischen Dichten gezeigt, gemessen bei 600 Nanometern. Das auf eine optische Dichte von 10 gewachsene Medium produzierte eine höhere Menge an Zellpellet im Gesamtextrakt als das auf eine optische Dichte von 2,5 gewachsene Medium. Eine weitere Analyse der Gesamtproteinkonzentration zeigte keinen signifikanten Unterschied im Gesamtprotein zwischen beiden Extrakten.Obwohl das Medium auf unterschiedliche optische Dichtegrade gezüchtet wurde, zeigten beide Extrakte ähnliche Ergebnisse bei zellfreien Reaktionen, die sfGFP exprimierten. Die Aufrechterhaltung steriler Bedingungen während der Zubereitung der Medien und der Zuckerlösung ist wichtig. Diese CFAI-Zellextraktionsmethode kann für die meisten Anwendungen des zellfreien Ausdrucks verwendet werden.Diese reichen von der biotechnologischen Ausbildung über das Protein-Engineering bis hin zur Point-of-Care-Diagnostik. Diese Methode reduziert den Zeitaufwand und die erforderlichen technischen Fähigkeiten, verbessert die Reproduzierbarkeit und produziert höhere Mengen an Extrakt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

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Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Forschung

Biotechnik

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

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Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Die Verkapselung von Zellfreie Transkription und Übersetzung Machinery in Vesikel über die Errichtung von Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

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Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

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Synthese von infektiösen Bakteriophagen in einem E. Coli -basierte zellfreie Expressionssystems

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

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The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

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Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

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Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

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OnePot PURE Cell-Free System

OnePot PURE Zellfreies System

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...