Name: from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare la dott.ssa Jennifer VanderKelen e Andrea Laubscher per il supporto tecnico. Gli autori desiderano anche ringraziare Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington e Jillian Kasman per le discussioni utili. Gli autori riconoscono anche il sostegno finanziario del Bill and Linda Frost Fund, del Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, cal Poly Research, Scholarly e della National Science Foundation (NSF-1708919).

1. Crescita dei media
<ol><li>Preparare 960 mL di supporti CFAI come descritto nella Tabella 1 e regolare il pH a 7,2 utilizzando KOH.</li>
	<li>Trasferire i terreni di coltura in un matraccio sconcertato da 2,5 L e in autoclave per 30 minuti a 121 °C.</li>
	<li>Preparare una soluzione di zucchero da 40 ml come descritto nella Tabella 1. Filtrare la soluzione in un contenitore di vetro autoclavato separato. NOTA: La soluzione zuccherina può essere conservata in un incubatore a 30 ...

<ol>
	<li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+guide+to+cell-free+protein+synthesis.">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene+expression:+an+expanded+repertoire+of+applications.">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li><li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+supplement+mixtures:+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract.">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li><li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis.">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li><li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism.">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li><li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis:+Protocols+for+a+robust,+flexible,+and+accessible+platform+technology.">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression.">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable,+on-demand+biomolecular+manufacturing.">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li><li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering.">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li><li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis.">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li><li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems.">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li><li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li><li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions.">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+the+preparation+of+"endotoxin-free"+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase.">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li><li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing.">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li><li>Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fast-growing+bacteria+robustly+tune+their+ribosome+concentration+to+approximate+growth-rate+maximization.">How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization.</a> FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).</li><li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations.">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li><li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system:+Practical+laboratory+guideline.">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression.">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li><li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids.">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li><li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+A+highly+productive,+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource.">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li><li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells.">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li><li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform.">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li></ol>

La supervisione dei ricercatori è tradizionalmente necessaria per due azioni chiave durante la crescita cellulare: l'induzione di T7 RNAP e la raccolta di cellule a uno specifico OD600. CFAI ovvia a entrambi questi requisiti per ridurre il tempo del ricercatore e la formazione tecnica necessaria per preparare estratti cellulari di alta qualità. L'autoinduzione di T7 RNAP si ottiene sostituendo il glucosio con il lattosio come zucchero primario nel mezzo, ovviando alla precedente necessità di monitorare atti...

L'uso della sintesi proteica senza cellule (CFPS) per applicazioni biotecnologiche è cresciuto notevolmente negli ultimi anni 1,2,3. Questo sviluppo può essere attribuito in parte a maggiori sforzi nella comprensione dei processi che si verificano nelle CFPS e del ruolo di ciascun componente 4,5. Inoltre, i costi ridotti attribuiti a configurazioni ottimizzate e fonti di energia alternative hanno reso la tecnologia senza celle più facile da implementare per i nuovi utenti 6,7,8,9. Al fine di implementare i fattori di trascrizione e traduzione necessari per la sintesi proteica, l'estratto cellulare viene spesso utilizzato per guidare le reazioni prive di cellule10. Le guide per l'utente pubblicate di recente hanno fornito protocolli semplici per la produzione di estratti funzionali, rendendo più facile l'implementazione per gli utenti nuovi ed esperti 1,11,12,13,14. L'estratto cellulare è solitamente ottenuto attraverso la lisi di una coltura cellulare, che può essere coltivata utilizzando diversi organismi a seconda dell'uso specifico desiderato 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) è diventato rapidamente uno degli organismi ospiti più comunemente utilizzati per la produzione di estratti funzionali17. Il ceppo BL21 Star (DE3) è preferito perché rimuove le proteasi dalla membrana esterna (proteasi OmpT) e dal citoplasma (proteasi Lon), fornendo un ambiente ottimale per l'espressione proteica ricombinante. Inoltre, il DE3 contiene il λDE3 che trasporta il gene per la T7 RNA polimerasi (T7 RNAP) sotto il controllo del promotore lacUV5; la componente stellare contiene un gene RNaseE mutato che impedisce la scissione dell'mRNA 4,14,18,19. Sotto il promotore lacUV5, l'induzione isopropil-tiogalattopiranoside (IPTG) consente l'espressione di T7 RNAP20,21. Questi ceppi sono usati per coltivare e raccogliere cellule, che danno materia prima per la preparazione dell'estratto. La lisi cellulare può essere eseguita utilizzando una varietà di metodi, tra cui il battito delle perline, la stampa francese, l'omogeneizzazione, la sonicazione e la cavitazione dell'azoto 1,11,12,22.
Il processo di coltura e raccolta batterica è coerente nella maggior parte delle piattaforme quando si utilizza E. coli, ma richiede più giorni e un'intensa supervisione del ricercatore 1,11,13. Questo processo inizia generalmente con una coltura di semi durante la notte in brodo LB, che dopo la crescita durante la notte viene poi inoculata in una coltura più ampia di 2xYTPG (lievito, triptone, tampone fosfato, glucosio) il giorno successivo. La crescita di questa coltura più grande viene monitorata fino a raggiungere la fase logaritmica dall'inizio alla metà, ad una densità ottica (OD) di 2,514,20. È necessaria una misurazione costante in quanto i componenti della trascrizione e della traduzione hanno precedentemente dimostrato di essere altamente attivi nella fase di log dall'inizio alla metà23,24. Mentre questo processo può creare estratto riproducibile, il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato un nuovo metodo che utilizza Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media, che riduce la supervisione dei ricercatori, aumenta la resa complessiva di estratto per un dato litro di coltura cellulare e migliora l'accesso alla preparazione dell'estratto a base di E. coli sia per gli utenti esperti che per quelli nuovi (Figura 1 ). Qui forniamo la guida passo-passo per l'implementazione del flusso di lavoro CFAI, per passare da una piastra striata di cellule a una reazione CFPS completata entro 24 ore.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MPC-425Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT5F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Lactose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(Glu)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(OAc)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTPs</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0382124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0379904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunair 2.5L Baffled Shake Flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Processor</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q125-230V/50HZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow

La sintesi proteica senza cellule (CFPS) è cresciuta come piattaforma biotecnologica che cattura i macchinari di trascrizione e traduzione in vitro. Numerosi sviluppi hanno reso la piattaforma CFPS più accessibile ai nuovi utenti e hanno ampliato la gamma di applicazioni. Per i sistemi CFPS a base di lisato, gli estratti cellulari possono essere generati da una varietà di organismi, sfruttando la biochimica unica di quell'ospite per aumentare la sintesi proteica. Negli ultimi 20 anni, Escherichia coli (E. coli) è diventato uno degli organismi più utilizzati per sostenere la CFPS grazie alla sua convenienza e versatilità. Nonostante i numerosi progressi chiave, il flusso di lavoro per la preparazione dell'estratto di cellule di E. coli è rimasto un collo di bottiglia chiave per i nuovi utenti per implementare CFPS per le loro applicazioni. Il flusso di lavoro di preparazione dell'estratto richiede molto tempo e richiede competenze tecniche per ottenere risultati riproducibili. Per superare queste barriere, abbiamo precedentemente segnalato lo sviluppo di un flusso di lavoro CFAI (Cell-Free Autoinduction) 24 ore su 24 che riduce l'input dell'utente e le competenze tecniche richieste. Il flusso di lavoro CFAI riduce al minimo il lavoro e le competenze tecniche necessarie per generare estratti di cellule, aumentando al contempo le quantità totali di estratti cellulari ottenuti. Qui descriviamo quel flusso di lavoro in modo graduale per migliorare l'accesso e supportare l'ampia implementazione della CFPS basata su E. coli .

Durante la preparazione dei mezzi CFAI, il glucosio è stato scambiato per un aumento del lattosio e del glicerolo come principale substrato energetico nel mezzo. Inoltre, è stata aumentata anche la capacità di buffering dei media CFAI. Questi componenti specifici sono riportati nella Tabella 1.
Le cellule sono state quindi coltivate sia a un OD600 di 10 che allo standard 2,5 nei mezzi CFAI per mostrare coerenza con la qualità dell'estratto nonostante le diverse ...

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From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Questo lavoro descrive la preparazione dell'estratto cellulare di Escherichia coli (E. coli) seguito da reazioni di sintesi proteica senza cellule (CFPS) in meno di 24 ore. La spiegazione del protocollo CFAI (Cell-Free Autoinduction) descrive i miglioramenti apportati per ridurre la supervisione dei ricercatori e aumentare le quantità di estratto cellulare ottenuto.

Dalle cellule alla sintesi proteica senza cellule entro 24 ore utilizzando il flusso di lavoro di autoinduzione senza cellule

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

Il metodo di autoinduzione senza cellule riduce la supervisione dei ricercatori e il tempo necessario per produrre estratti di cellule funzionali. Ciò semplifica i precedenti protocolli di sintesi proteica in vitro che erano più dispendiosi in termini di tempo e intensivi. Questa tecnica è meno complicata e anche ad alto rendimento, il che consentirà a un pubblico più ampio di implementare l'espressione senza cellule.Questo metodo evidenzia l'importanza del metabolismo energetico durante la crescita cellulare e all'interno delle reazioni prive di cellule. Inizia preparando 960 millilitri di mezzi di autoinduzione senza cellule. Quindi, sterilizzare il fluido in un pallone sconcertato da 2,5 litri mediante autoclave per 30 minuti a 121 gradi Celsius.Successivamente, dopo aver preparato 40 millilitri della soluzione zuccherina, sterilizzarla con filtro in un contenitore di vetro autoclavato separato. Dopo l'autoclave, quando il terreno di coltura si è raffreddato a meno di 40 gradi Celsius, aggiungere la soluzione zuccherina sterilizzata con filtro direttamente al supporto. Quindi, inoculare il mezzo facendo scorrere un anello pieno di colonie da una piastra stellare E.coli BL21 fresca precedentemente striata e inserendo il loop direttamente nel supporto.Ruotare il loop nel supporto senza toccare i lati del contenitore. Quindi, posizionare il supporto inoculato durante la notte in un'incubatrice a 30 gradi Celsius con agitazione a 200 RPM. Il giorno successivo, raccogliere le cellule trasferendo un litro del supporto in una bottiglia di centrifuga da un litro e centrifugando a 5.000 volte G tra quattro e 10 gradi Celsius per 10 minuti.Dopo aver scartato il surnatante, utilizzare una spatola sterile per trasferire il pellet in un tubo conico da 50 millilitri pre-refrigerato e precedentemente pesato. Quindi, lavare il pellet una volta con 30-40 millilitri di tampone S30 freddo risospendendo il pellet tramite vortice in raffiche di 30 secondi con periodi di riposo sul ghiaccio. Dopo che il pellet è stato completamente risospeso, centrifugare la risospensione cellulare, scartare il surnatante e, utilizzando un tessuto pulito, pulire qualsiasi surnatante in eccesso dalle pareti interne del tubo da 50 millilitri senza toccare il pellet.Quindi, pesare il pellet prima di congelarlo in azoto liquido e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Per preparare l'estratto cellulare, aggiungere un millilitro di tampone S30 per grammo del pellet cellulare congelato e lasciare che il pellet si scongeli sul ghiaccio per 30-60 minuti. Quindi, risospese il pellet scongelato tramite vortice in raffiche di 30 secondi con periodi di riposo sul ghiaccio fino a quando non rimangono grumi cellulari visibili.Per la lisi cellulare, trasferire aliquote da 1,4 millilitri della sospensione cellulare in tubi di microfuga da 1,5 millilitri. Quindi, sonicare la sospensione cellulare in ciascun tubo con una frequenza di 20 kilohertz e un'ampiezza del 50% per tre raffiche di 45 secondi con 59 secondi di riposo per ciclo in un bagno di ghiaccio Invertire il tubo tra i cicli e, dopo l'ultimo ciclo di sonicazione, aggiungere immediatamente 4,5 microlitri di ditiotreitolo monofusolare. Dopo aver sonicato la sospensione cellulare in tutti i tubi, centrifugare i tubi e raccogliere il surnatante in aliquote da 600 microlitri in tubi di microfuga freschi da 1,5 millilitri.Congelamento flash e conservare le aliquote a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Per eseguire 15 microlitri di reazione di sintesi proteica senza cellule in tubi di microfuga da 1,5 millilitri in quadruplicato, scongelare un'aliquota dell'estratto cellulare. Dopo aver preparato ogni miscela di reazione a 15 microlitri, lasciare che la reazione funzioni per almeno quattro ore a 37 gradi Celsius.Per quantificare la proteina reporter, combinare 48 microlitri di tampone HEPES da 50 millimolari a pH 7,2 con due microlitri di ciascun prodotto di reazione di sintesi proteica privo di cellule in una piastra di polistirene nero a 96 pozzetti. Quantificare l'intensità di fluorescenza della proteina fluorescente verde superfolder, o sfGFP, utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 e una lunghezza d'onda di emissione di 528 nanometri. Quindi, convertire le unità di fluorescenza relative alla resa volumetrica di sfGFP creando una curva standard utilizzando il plasmide pJL1 sfGFP purificato.Qui sono mostrati i pellet di fluidi di autoinduzione senza cellule dopo la raccolta delle cellule a diverse densità ottiche misurate a 600 nanometri. Il supporto cresciuto fino a una densità ottica di 10 ha prodotto una quantità maggiore di pellet cellulare nell'estratto complessivo rispetto al mezzo cresciuto fino a una densità ottica di 2,5. Un'ulteriore analisi della concentrazione totale di proteine non ha dimostrato alcuna differenza significativa nella proteina complessiva tra i due estratti.Anche se il mezzo è stato coltivato a diversi livelli di densità ottica, entrambi gli estratti hanno dimostrato risultati simili in reazioni prive di cellule che esprimono sfGFP. Mantenere condizioni sterili durante la preparazione del mezzo e della soluzione di zucchero è importante. Questo metodo di estrazione cellulare CFAI può essere utilizzato per la maggior parte delle applicazioni di espressione senza cellule.Questi vanno dall'educazione biotecnologica all'ingegneria proteica, nonché alla diagnostica point-of-care. Questo metodo riduce la quantità di tempo e abilità tecnica richiesta, migliora la riproducibilità e produce maggiori quantità di estratto.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Sintesi combinatoria di e High-throughput di rilascio di proteine ​​da film polimerico e Biblioteche nanoparticelle

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Ricerca

Bioingegneria

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Isolamento e caratterizzazione delle proteine chimeriche che esprimono fc umano utilizzando proteine A adsorbenti di membrana e un flusso di lavoro semplificato

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

L&#39;incapsulamento di trascrizione privo di cellule e macchinari traduzione in vescicole per la costruzione di Mimics cellulari

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

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Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

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The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

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