Name: from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow at JoVE.com

저자는 Jennifer VanderKelen 박사와 Andrea Laubscher가 기술 지원을 받고 있음을 인정하고 싶습니다. 저자는 또한 니콜 그레고리오, 맥스 레빈, 알리사 멀린, 병철 소, 어거스트 브룩웰, 엘리자베스 (리지) 보이보다, 로건 버링턴, 질리언 카스만에게 도움이 된 토론에 감사드립니다. 저자는 또한 빌 앤 린다 프로스트 펀드, 생명 공학의 셰브론 생명 공학 응용 연구 기부 보조금 센터, 칼 폴리 연구, 학술 및 국립 과학 재단 (NSF-1708919)의 자금 지원을 인정합니다.

1. 미디어 성장
<ol><li>표 1에 기재된 바와 같이 CFAI 배지 960 mL를 제조하고 KOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정하였다.</li>
	<li>배양 배지를 2.5 L 배플 플라스크에 옮기고 121°C에서 30분 동안 오토클레이브한다.</li>
	<li>표 1에 기재된 바와 같이 당 용액 40 mL를 제조하였다. 용액을 별도의 오토클레이브 유리 용기에 여과 멸균하십시오. 참고: 설탕 용액은 추가 사용 시까지 30°C 인?...

<ol>
	<li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+guide+to+cell-free+protein+synthesis.">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene+expression:+an+expanded+repertoire+of+applications.">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li><li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+supplement+mixtures:+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract.">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li><li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis.">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li><li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism.">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li><li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis:+Protocols+for+a+robust,+flexible,+and+accessible+platform+technology.">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression.">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable,+on-demand+biomolecular+manufacturing.">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li><li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering.">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li><li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis.">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li><li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems.">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li><li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li><li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions.">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+the+preparation+of+"endotoxin-free"+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase.">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li><li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing.">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li><li>Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fast-growing+bacteria+robustly+tune+their+ribosome+concentration+to+approximate+growth-rate+maximization.">How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization.</a> FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).</li><li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations.">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li><li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system:+Practical+laboratory+guideline.">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression.">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li><li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids.">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li><li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+A+highly+productive,+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource.">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li><li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells.">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li><li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform.">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li></ol>

연구원의 감독은 전통적으로 세포 성장 동안 두 가지 주요 작용, 즉 T7 RNAP의 유도와 특정OD600에서 세포를 수확하는 데 필요합니다. CFAI는 고품질의 세포 추출물을 제조하기 위해 필요한 연구자의 시간과 기술 교육을 줄이기 위해 이러한 요구 사항을 모두 제거합니다. T7 RNAP의 자동 유도는 배지 내의 일차 당으로서 글루코스를 락토오스로 대체함으로써, 세포 성장 동안 정확한 지점에서 IPTG?...

생명 공학 응용 분야를위한 무세포 단백질 합성 (CFPS)의 사용은 지난 몇 년 동안 1,2,3 년 동안 크게 증가했습니다. 이러한 개발은 부분적으로 CFPS에서 발생하는 프로세스와 각 구성 요소 4,5의 역할을 이해하려는 노력이 증가했기 때문일 수 있습니다. 또한 최적화 된 설정 및 대체 에너지 원으로 인한 비용 절감으로 인해 새로운 사용자 6,7,8,9를 위해 무세포 기술을 쉽게 구현할 수있었습니다. 단백질 합성에 필요한 전사 및 번역 인자를 구현하기 위해, 세포 추출물은 종종 무세포 반응(10)을 구동하는데 사용된다. 최근 출판 된 사용자 가이드는 기능 추출을 생성하기위한 간단한 프로토콜을 제공하여 신규 및 숙련 된 사용자 모두에게 구현하기가 더 쉬워졌습니다1,11,12,13,14. 세포 추출물은 일반적으로 세포 배양물의 용해를 통해 얻어지며, 이는 원하는 특정 용도1,15,16에 따라 다른 유기체를 사용하여 성장할 수 있다.
대장균(E. coli)은 기능성 추출물(17)을 생산하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 숙주 유기체 중 하나가 되었다. 상기 BL21 스타(DE3) 균주는 외막으로부터 프로테아제(OmpT 프로테아제) 및 세포질(Lon protease)을 제거하여, 재조합 단백질 발현을 위한 최적의 환경을 제공하기 때문에 바람직하다. 추가적으로, DE3은 lacUV5 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 폴리머라제 (T7 RNAP)에 대한 유전자를 운반하는 λDE3을 함유하고; 스타 성분은 mRNA4,14,18,19의 절단을 방지하는 돌연변이된 RNaseE 유전자를 함유한다. lacUV5 프로모터 하에서, 이소프로필티오갈락토피라노시드 (IPTG) 유도는 T7 RNAP20,21의 발현을 허용한다. 이 균주는 세포를 재배하고 수확하는 데 사용되며, 이는 추출물 준비를위한 원료를 제공합니다. 세포 용해는 비드 박동, 프렌치 프레스, 균질화, 초음파 처리 및 질소 캐비테이션1,11,12,22를 포함한 다양한 방법을 사용하여 수행 할 수 있습니다.
박테리아 배양 및 수확 과정은 대장균을 사용할 때 대부분의 플랫폼에서 일관되지만 며칠이 걸리고 강렬한 연구자 감독1,11,13이 필요합니다. 이 과정은 일반적으로 LB 국물에서 하룻밤 종자 배양으로 시작되며, 이는 밤새 성장시 다음날 2xYTPG (효모, 트립톤, 인산염 완충액, 포도당)의 더 큰 배양물에 접종된다. 이러한 더 큰 배양물의 성장은 2.514,20의 광학 밀도 (OD)에서 초기 내지 중간 로그 단계에 도달할 때까지 모니터링된다. 전사 및 번역의 구성 요소가 이전에 초기 내지 중간 로그 단계23,24에서 고도로 활성인 것으로 입증되었기 때문에 지속적인 측정이 요구된다. 이 과정이 재현 가능한 추출물을 만들 수 있지만, 우리 연구실은 최근 연구원의 감독을 줄이고 주어진 1 리터의 세포 배양에 대한 추출물의 전반적인 수율을 높이며 숙련 된 사용자와 신규 사용자 모두를위한 대장균 기반 추출물 제제에 대한 액세스를 향상시키는 무세포 자동 유도 (CFAI) Media를 사용하는 새로운 방법을 개발했습니다 (그림 1 ). 여기서 우리는 CFAI 워크플로우를 구현하기 위한 단계별 가이드를 제공하며, 줄무늬가 있는 세포 플레이트에서 24시간 이내에 완료된 CFPS 반응으로 이동합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MPC-425Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT5F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Lactose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(Glu)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(OAc)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTPs</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0382124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0379904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunair 2.5L Baffled Shake Flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Processor</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q125-230V/50HZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow

무세포 단백질 합성(CFPS)은 시험관 내에서 전사 및 번역 기계를 포획하는 생명공학 플랫폼으로 성장했습니다. 수많은 개발로 인해 CFPS 플랫폼은 새로운 사용자가 더 쉽게 액세스 할 수있게되었으며 응용 프로그램의 범위를 확장했습니다. 용해물 기반 CFPS 시스템의 경우, 세포 추출물은 다양한 유기체로부터 생성될 수 있으며, 단백질 합성을 증강시키기 위해 숙주의 독특한 생화학을 이용한다. 지난 20 년 동안 대장균 (E. coli) 은 경제성과 다양성으로 인해 CFPS를 지원하는 데 가장 널리 사용되는 유기체 중 하나가되었습니다. 수많은 주요 발전에도 불구하고, 대장균 세포 추출물 제조를 위한 워크플로우는 신규 사용자가 자신의 애플리케이션에 CFPS를 구현하는 데 있어 중요한 병목 현상으로 남아 있습니다. 추출물 준비 작업 과정은 시간이 많이 걸리며 재현 가능한 결과를 얻기 위해 기술적 전문 지식이 필요합니다. 이러한 장벽을 극복하기 위해 우리는 이전에 사용자 입력 및 필요한 기술 전문 지식을 줄이는 24 시간 무세포 자동 유도 (CFAI) 워크 플로의 개발을보고했습니다. CFAI 워크플로우는 세포 추출물을 생성하는 데 필요한 노동력과 기술 기술을 최소화하는 동시에 획득한 세포 추출물의 총 양을 증가시킵니다. 여기에서는 접근성을 향상시키고 대장균 기반 CFPS의 광범위한 구현을 지원하기 위해 단계별로 워크 플로우를 설명합니다.

CFAI 배지를 제조할 때, 글루코스는 배지 내의 주요 에너지 기질로서 락토오스 및 글리세롤의 증가를 위해 교환되었다. 또한 CFAI 매체의 버퍼링 용량도 증가했습니다. 이들 특정 성분은 표 1에 제시되어 있다.
이어서, 세포를 CFAI 배지에서OD600 10 및 표준 2.5 둘 다로 성장시켜 다양한 추출물 양에도 불구하고 추출물 품질과의 일관성을 보여주었다. 상기 2.5 OD60...

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From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

이 연구는 에스케리치아 콜라이 (E. coli )에서 세포 추출물을 제조한 후 24 시간 이내에 무세포 단백질 합성 (CFPS) 반응을 설명합니다. 무세포 자동 유도 (CFAI) 프로토콜에 대한 설명은 연구자의 감독을 줄이고 얻은 세포 추출물의 양을 늘리기 위해 개선 된 내용을 자세히 설명합니다.

무세포 자동 유도 워크플로우를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 무세포 단백질 합성까지

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

무세포 자동 유도 방법은 기능성 세포 추출물을 생산하는 데 필요한 연구자의 감독과 시간을 줄여줍니다. 이것은 더 많은 시간과 집약적이었던 이전의 시험관내 단백질 합성 프로토콜을 단순화합니다. 이 기술은 덜 복잡하고 수율이 높기 때문에 더 많은 청중이 세포없는 표현을 구현할 수 있습니다.이 방법은 세포 성장 중 및 무세포 반응 내에서 에너지 대사의 중요성을 강조합니다. 960 밀리리터의 무세포 자동 유도 배지를 준비하여 시작하십시오. 그런 다음 섭씨 121도에서 30 분 동안 오토클레이빙하여 2.5 리터 배플 플라스크에서 미디어를 멸균하십시오.다음으로, 40 밀리리터의 설탕 용액을 준비한 후, 별도의 오토클레이브 유리 용기에 필터-멸균한다. 오토클레이빙 후, 배양 배지가 섭씨 40도 이하로 냉각되었을 때, 필터-멸균된 설탕 용액을 배지에 직접 첨가한다. 다음으로, 이전에 줄무늬가 있는 신선한 E.coli BL21 별판으로부터 콜로니로 가득 찬 루프를 스와이프하고 루프를 배지에 직접 삽입하여 배지를 접종한다.루프를 컨테이너의 측면을 만지지 않고 미디어로 소용돌이치십시오. 이어서, 접종된 배지를 섭씨 30도 배양기에 밤새 놓고 200 RPM에서 진탕시킨다. 다음날, 배지 1리터를 1리터 원심분리기 병으로 옮기고 섭씨 4~10도 사이에서 5, 000배 G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확한다.상청액을 버린 후, 멸균 주걱을 사용하여 펠렛을 미리 냉각되고 이전에 칭량된 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 다음에, 펠릿을 30 내지 40 밀리리터의 차가운 S30 버퍼로 한번 세척하고, 얼음 위에서 휴식 기간으로 30초 파열로 볼텍싱을 통해 펠릿을 재현탁시킨다. 펠렛이 완전히 재현탁된 후, 세포를 재현탁시키고, 상청액을 버리고, 깨끗한 조직을 사용하여, 펠릿을 건드리지 않고 50밀리리터 튜브의 내벽으로부터 과량의 상청액을 닦아낸다.그런 다음 플래시 냉동 전에 펠렛을 액체 질소에서 칭량하고 추가 사용 될 때까지 영하 80도에 보관하십시오. 세포 추출물을 제조하기 위해, 동결된 세포 펠릿의 그램 당 1 밀리리터의 S30 버퍼를 첨가하고, 펠릿이 30 내지 60분 동안 얼음 위에서 해동되도록 한다. 그런 다음, 가시적 인 세포 덩어리가 남지 않을 때까지 얼음 위에 휴식 기간으로 30 초의 버스트에서 볼텍싱을 통해 해동 된 펠릿을 재현탁하십시오.세포 용해를 위해, 세포 현탁액의 1.4 밀리리터 분취량을 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브로 옮긴다. 그런 다음 얼음 욕조에서 사이클 당 59 초의 휴식으로 45 초의 세 번의 버스트에 대해 20 킬로 헤르츠 및 50 % 진폭의 주파수로 각 튜브의 세포 현탁액을 초음파 처리하십시오 사이클 사이에 튜브를 반전시키고 마지막 초음파 처리 사이클 후에 즉시 4.5 마이크로 리터의 원몰 디티오 트레이톨을 첨가하십시오. 세포 현탁액을 모든 튜브에서 초음파 처리한 후, 튜브를 원심분리하고, 600-마이크로리터 분취액에서 상청액을 신선한 1.5-밀리리터 마이크로퍼지 튜브로 수집한다.플래시 동결 및 추가 사용 될 때까지 영하 80도에서 분취량을 저장합니다. 15 마이크로리터의 무세포 단백질 합성 반응을 사분면의 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브에서 수행하려면, 세포 추출물의 1 분취량을 해동시킨다. 각 15-마이크로리터 반응 혼합물을 준비한 후, 섭씨 37도에서 적어도 네 시간 동안 반응을 실행시킨다.리포터 단백질을 정량화하려면 pH 7.2에서 48마이크로리터의 50밀리몰 HEPES 버퍼를 검은색 폴리스티렌 96웰 플레이트에서 각 무세포 단백질 합성 반응 생성물 2마이크로리터와 결합한다. 초폴더 녹색 형광 단백질 또는 sfGFP의 형광 강도를 여기파장 485 및 방출 파장 528 나노미터를 사용하여 정량한다. 이어서, 정제된 pJL1 sfGFP 플라스미드를 사용하여 표준 곡선을 생성함으로써 상대적 형광 단위를 sfGFP의 부피 수율로 전환시킨다.여기에 나타낸 것은 600 나노미터에서 측정된 상이한 광학 밀도에서 세포 수확 후 무세포 자동 유도 배지 펠릿이다. 광학 밀도 10으로 성장한 배지는 광학 밀도 2.5로 성장한 배지보다 전체 추출물에서 더 많은 양의 세포 펠릿을 생성하였다. 총 단백질 농도의 추가 분석은 두 추출물 사이의 전체 단백질에서 유의 한 차이가 없음을 입증했다.배지가 상이한 광학 밀도 수준으로 성장했음에도 불구하고, 두 추출물 모두 sfGFP를 발현하는 무세포 반응에서 유사한 결과를 입증하였다. 배지와 설탕 용액을 준비하면서 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 이 CFAI 세포-추출 방법은 무세포 발현의 대부분의 적용에 사용될 수 있다.이들은 생명 공학 교육에서 단백질 공학뿐만 아니라 진료 시점 진단에 이르기까지 다양합니다. 이 방법은 필요한 시간과 기술 기술을 줄이고 재현성을 향상 시키며 더 많은 양의 추출물을 생산합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

조합의 합성과 고분자 필름과 Nanoparticle 도서관에서 높은 처리량 단백질 출시

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

연구

생체공학

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

단백질 A 멤브레인 흡착제 및 간소화된 워크플로우를 사용하여 키메라 인간 Fc 발현 단백질의 격리 및 특성화

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

휴대 모방 자의 건설을위한 소포는의 셀이없는 전사 및 번역 기계의 캡슐화

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

무 세포 생물학 밀봉 Femtoliter 상공 회의소 배열

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

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에는 대장균-감염 살 균 소의 합성 기반 셀 무료 식 시스템

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

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셀 무료 단백질 식을 사용 하 여 빠르게 성장 박테리아 비 브리 오 natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

장기간 무세포 유전자 발현의 전도를 위한 다층 미세유체 플랫폼

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Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다.

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

OnePot PURE Cell-Free System

원팟 퓨어 셀 프리 시스템

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...