Name: from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow at JoVE.com

Forfattere vil gjerne anerkjenne Dr. Jennifer VanderKelen og Andrea Laubscher for teknisk støtte. Forfattere vil også takke Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington og Jillian Kasman for nyttige diskusjoner. Forfattere anerkjenner også støtte fra Bill and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly og National Science Foundation (NSF-1708919).

1. Medievekst
<ol><li>Forbered 960 ml CFAI-medier som beskrevet i tabell 1 , og juster pH til 7.2 ved hjelp av KOH.</li>
	<li>Overfør kulturmedier til en 2,5 l forbløffet kolbe og autoklav i 30 min ved 121 °C.</li>
	<li>Klargjør en 40 ml sukkeroppløsning som beskrevet i tabell 1. Filtrer steriliser oppløsningen i en separat autoklavert glassbeholder. MERK: Sukkeroppløsningen kan oppbevares i en inkubator på 30 °C til videre bruk.</li>
	<li>La mediet avkjøles helt til under...

<ol>
	<li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+guide+to+cell-free+protein+synthesis.">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene+expression:+an+expanded+repertoire+of+applications.">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li><li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+supplement+mixtures:+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract.">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li><li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis.">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li><li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism.">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li><li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis:+Protocols+for+a+robust,+flexible,+and+accessible+platform+technology.">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression.">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable,+on-demand+biomolecular+manufacturing.">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li><li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering.">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li><li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis.">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li><li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems.">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li><li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li><li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions.">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+the+preparation+of+"endotoxin-free"+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase.">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li><li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing.">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li><li>Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fast-growing+bacteria+robustly+tune+their+ribosome+concentration+to+approximate+growth-rate+maximization.">How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization.</a> FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).</li><li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations.">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li><li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system:+Practical+laboratory+guideline.">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression.">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li><li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids.">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li><li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+A+highly+productive,+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource.">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li><li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells.">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li><li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform.">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li></ol>

Forskeroppsyn er tradisjonelt nødvendig for to viktige handlinger under cellevekst: induksjon av T7 RNAP og høsting av celler ved en bestemt OD600. CFAI hindrer begge disse kravene til å redusere forskerens tid og tekniske opplæring som kreves for å forberede celleekstrakter av høy kvalitet. Automatisk induksjon av T7 RNAP oppnås ved å erstatte glukose med laktose som det primære sukkeret i media, noe som hindrer det forrige behovet for å aktivt overvåke veksten og deretter indusere med IPTG på et ...

Bruken av cellefri proteinsyntese (CFPS) for bioteknologiske anvendelser har vokst betydelig de siste årene 1,2,3. Denne utviklingen kan delvis tilskrives økt innsats for å forstå prosessene som skjer i CFPS og rollen til hver komponent 4,5. I tillegg har reduserte kostnader knyttet til optimaliserte oppsett og alternative energikilder gjort cellefri teknologi enklere å implementere for nye brukere 6,7,8,9. For å implementere de nødvendige transkripsjons- og oversettelsesfaktorene for proteinsyntese, brukes celleekstrakt ofte til å drive cellefrie reaksjoner10. Nylig publiserte brukerveiledninger har gitt enkle protokoller for å produsere funksjonell ekstrakt, noe som gjør det enklere å implementere for både nye og erfarne brukere 1,11,12,13,14. Celleekstrakt oppnås vanligvis gjennom lysis av en cellekultur, som kan dyrkes ved hjelp av forskjellige organismer avhengig av ønsket bruk 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) har raskt blitt en av de mest brukte vertsorganismer for å produsere funksjonelle ekstrakter17. BL21 Star (DE3)-stammen foretrekkes fordi den fjerner proteasene fra den ytre membranen (OmpT-protease) og cytoplasma (Lon-protease), noe som gir et optimalt miljø for det rekombinante proteinuttrykket. I tillegg inneholder DE3 λDE3 som bærer genet for T7 RNA polymerase (T7 RNAP) under kontroll av lacUV5-promotoren; stjernekomponenten inneholder et mutert RNaseE-gen som forhindrer spalting av mRNA 4,14,18,19. Under lacUV5-promotoren tillater isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) induksjon uttrykket av T7 RNAP20,21. Disse stammene brukes til å vokse og høste celler, noe som gir råmateriale til ekstraktpreparat. Cellelys kan utføres ved hjelp av en rekke metoder, inkludert perleslag, fransk presse, homogenisering, sonikering og nitrogenkavitasjon 1,11,12,22.
Prosessen med bakteriekultur og høsting er konsistent på tvers av de fleste plattformer når du bruker E. coli, men krever flere dager og intens forskeroppsyn 1,11,13. Denne prosessen starter vanligvis med en over natten frøkultur i LB buljong, som ved nattvekst deretter inokulert til en større kultur på 2xYTPG (gjær, trypton, fosfatbuffer, glukose) neste dag. Veksten av denne større kulturen overvåkes til den når den tidlige til midtre loggfasen, med en optisk tetthet (OD) på 2,514,20. Konstant måling er nødvendig ettersom komponentene i transkripsjon og oversettelse tidligere har vist seg å være svært aktive i den tidlige til midtre loggfasen23,24. Selv om denne prosessen kan skape reproduserbart ekstrakt, har laboratoriet vårt nylig utviklet en ny metode ved hjelp av Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media, som reduserer forskeroppsyn, øker det totale utbyttet av ekstrakt for en gitt liter cellekultur, og forbedrer tilgangen til E. coli-basert ekstraktforberedelse for både erfarne og nye brukere (figur 1 ). Her gir vi den trinnvise veiledningen for implementering av CFAI-arbeidsflyten, for å gå fra en stripet plate med celler til en fullført CFPS-reaksjon innen 24 timer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MPC-425Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT5F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Lactose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(Glu)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(OAc)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTPs</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0382124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0379904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunair 2.5L Baffled Shake Flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Processor</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q125-230V/50HZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow

Cellefri proteinsyntese (CFPS) har vokst som en bioteknologisk plattform som fanger transkripsjon og oversettelsesmaskiner in vitro. Mange utviklinger har gjort CFPS-plattformen mer tilgjengelig for nye brukere og har utvidet utvalget av applikasjoner. For lysatebaserte CFPS-systemer kan celleekstrakter genereres fra en rekke organismer, og utnytte den unike biokjemien til den verten for å forsterke proteinsyntesen. I løpet av de siste 20 årene har Escherichia coli (E. coli) blitt en av de mest brukte organismene for å støtte CFPS på grunn av sin overkommelighet og allsidighet. Til tross for mange viktige fremskritt, har arbeidsflyten for E. coli-celleekstraktforberedelse forblitt en nøkkelflaskehals for nye brukere å implementere CFPS for sine applikasjoner. Arbeidsflyten for uttrekksforberedelse er tidkrevende og krever teknisk ekspertise for å oppnå reproduserbare resultater. For å overvinne disse barrierene rapporterte vi tidligere utviklingen av en 24-timers cellefri arbeidsflyt for autoinduksjon (CFAI) som reduserer brukerinndata og teknisk ekspertise som kreves. CFAI-arbeidsflyten minimerer arbeids- og tekniske ferdigheter som kreves for å generere celleekstrakter, samtidig som den øker de totale mengdene celleekstrakter som er oppnådd. Her beskriver vi denne arbeidsflyten trinnvis for å forbedre tilgangen og støtte den brede implementeringen av E. coli-basert CFPS.

Ved tilberedning av CFAI-medier ble glukose byttet mot en økning i laktose og glyserol som det viktigste energisubstratet i media. I tillegg ble bufferkapasiteten til CFAI-mediet også økt. Disse spesifikke komponentene er gitt i tabell 1.
Cellene ble deretter dyrket til både en OD600 av 10 og standard 2.5 i CFAI-medier for å vise konsistens med ekstraktkvalitet til tross for varierende ekstraktmengder. 2,5 OD600 CFAI-mediene ble dyrket etter å ha in...

Watch this Scientific Journal Video about From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow at JoVE.com

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Dette arbeidet beskriver fremstillingen av celleekstrakt fra Escherichia coli (E. coli) etterfulgt av cellefrie proteinsyntesereaksjoner (CFPS) på under 24 timer. Forklaring av den cellefrie autoinduksjonsprotokollen (CFAI) beskriver forbedringer som er gjort for å redusere forskerens tilsyn og øke mengden celleekstrakt oppnådd.

Fra celler til cellefri proteinsyntese innen 24 timer ved hjelp av cellefri arbeidsflyt for autoinduksjon

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

Den cellefrie autoinduksjonsmetoden reduserer forskeroppsyn og tid som trengs for å produsere funksjonelle celleekstrakter. Dette forenkler tidligere in vitro proteinsynteseprotokoller som var mer tidkrevende og intensive. Denne teknikken er mindre komplisert og også høy avkastning, noe som vil gjøre det mulig for et større publikum å implementere cellefritt uttrykk.Denne metoden fremhever viktigheten av energimetabolisme under cellevekst og innenfor cellefrie reaksjoner. Begynn med å forberede 960 milliliter cellefrie autoinduksjonsmedier. Steriliser deretter mediet i en 2,5-liters forbløffet kolbe ved autoklavering i 30 minutter ved 121 grader Celsius.Deretter, etter å ha forberedt 40 milliliter av sukkeroppløsningen, steriliserer du den i en separat autoklavert glassbeholder. Etter autoklavering, når kulturmediene har avkjølt seg til under 40 grader Celsius, legg til den filtersteriliserte sukkerløsningen direkte til media. Deretter inokulerer du mediene ved å sveipe en løkke full av kolonier fra en tidligere stripet frisk E.coli BL21-stjerneplate og sette løkken direkte inn i mediene.Virvle løkken inn i mediet uten å berøre sidene av beholderen. Plasser deretter de inokulerte mediene over natten i en 30 grader celsius inkubator med risting ved 200 RPM. Neste dag høster du cellene ved å overføre en liter av media til en en-liters sentrifugeflaske og sentrifugering ved 5000 ganger G mellom fire til 10 grader Celsius i 10 minutter.Etter å ha kastet supernatanten, bruk en steril spatel for å overføre pellet til et forhåndskjølt og tidligere veid 50 milliliter konisk rør. Deretter vasker du pellet en gang med 30 til 40 milliliter kald S30-buffer ved å resuspendere pellet via virvel i 30-sekunders brister med hvileperioder på is. Etter at pelletsen er helt resuspendert, sentrifugerer celleresuspensasjonen, kast supernatanten og bruk et rent vev, tørk overflødig supernatant fra innsiden av veggene i 50 milliliterrøret uten å berøre pelletsen.Vei deretter pellet før blitsen fryser den i flytende nitrogen og lagre den på minus 80 grader Celsius til videre bruk. For å forberede celleekstraktet, legg til en milliliter S30 buffer per gram av den frosne cellepelleten og la pelletsen tine på is i 30 til 60 minutter. Deretter resuspenderer du den tinte pellet via virveling i eksplosjoner på 30 sekunder med hvileperioder på is til ingen synlige celleklumper forblir.For cellelys, overfør 1,4 milliliter aliquots av cellefjæringen til 1,5 milliliter mikrofugerør. Deretter sonikerer du cellefjæringen i hvert rør med en frekvens på 20 kilohertz og 50% amplitude i tre utbrudd på 45 sekunder med 59 sekunder hvile per syklus i et isbad Inverter røret mellom sykluser, og etter den siste sonikeringssyklusen, tilsett umiddelbart 4,5 mikroliter av en-molar dithiothreitol. Etter sonikering av cellefjæringen i alle rør, sentrifuger rørene og samle supernatanten i 600-mikroliter aliquots i friske 1,5 milliliter mikrofugerør.Flash fryse og lagre aliquots på minus 80 grader Celsius inntil videre bruk. For å utføre 15 mikroliter cellefri proteinsyntesereaksjon i 1,5 milliliter mikrofugerør i firedoblet, tin en aliquot av celleekstraktet. Etter å ha forberedt hver 15-mikroliterreaksjonsblanding, la reaksjonen løpe i minst fire timer ved 37 grader Celsius.For å kvantifisere reporterproteinet kombinerer du 48 mikroliter 50 millimolar HEPES-buffer ved pH 7,2 med to mikroliter av hvert cellefrie proteinsyntesereaksjonsprodukt i en svart polystyren 96-brønnsplate. Kvantifisere fluorescensintensiteten til det superfoldergrønne fluorescerende proteinet, eller sfGFP, ved hjelp av en eksitasjonsbølgelengde på 485 og utslippsbølgelengde på 528 nanometer. Konverter deretter de relative fluorescensenhetene til volumetrisk utbytte av sfGFP ved å lage en standardkurve ved hjelp av renset pJL1 sfGFP-plasmid.Vist her er cellefrie autoinduksjonsmediepellets etter cellehøsting ved forskjellige optiske tettheter målt ved 600 nanometer. Mediene som vokste til en optisk tetthet på 10 produserte en høyere mengde cellepellet i totalt ekstrakt enn mediet vokste til en optisk tetthet på 2,5. Videre analyse av total proteinkonsentrasjon viste ingen signifikant forskjell i samlet protein mellom begge ekstraktene.Selv om mediene ble dyrket til forskjellige optiske tetthetsnivåer, viste begge ekstraktene lignende resultater i cellefrie reaksjoner som uttrykte sfGFP. Det er viktig å opprettholde sterile forhold mens du forbereder medie- og sukkeroppløsningen. Denne CFAI-celleekstraktmetoden kan brukes til de fleste bruksområder av cellefritt uttrykk.Disse spenner fra bioteknologisk utdanning til proteinteknikk, samt pleiediagnose. Denne metoden reduserer tiden og den tekniske ferdigheten som kreves, forbedrer reproduserbarheten og produserer høyere mengder ekstrakt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Kombinatorisk Syntese av og High-throughput Protein År fra Polymer Film og nanopartikler Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Isolasjon og karakterisering av chimeric human fc-uttrykkende proteiner ved hjelp av protein A membrane adsorbere og en strømlinjeformet arbeidsflyt

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Den Innkapsling av Cell-free transkripsjon og oversettelse Machinery i Blemmer for bygging av Cellular Etterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Lukkbar Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntese av smittsomme Bacteriophages i en E. coli -basert Cell-free uttrykk System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cellen gratis Protein uttrykk ved hjelp av den raskt voksende bakterie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En flerlags Mikrovæskebasert plattform for gjennomføring av langvarig Cell-gratis Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Forbereder proteinproduserende syntetiske celler ved hjelp av cellefrie bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsjonsoverføring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Enkeltcellet optisk virkningspotensial måling i humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

OnePot PURE Cell-Free System

OnePot PURE cellefritt system

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...