Name: from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow at JoVE.com

Os autores gostariam de reconhecer a Dra. Os autores também gostariam de agradecer a Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington e Jillian Kasman por discussões úteis. Os autores também reconhecem o apoio financeiro do Bill and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly e national science foundation (NSF-1708919).

1. Crescimento da mídia
<ol><li>Prepare 960 mL de mídia CFAI conforme descrito na Tabela 1 e ajuste o pH para 7.2 usando KOH.</li>
	<li>Transfira a mídia cultural para um frasco de 2,5 L e autoclave por 30 min a 121 °C.</li>
	<li>Prepare uma solução de açúcar de 40 mL conforme descrito na Tabela 1. Esterilize a solução em um recipiente de vidro autoclavado separado. NOTA: A solução de açúcar pode ser armazenada em uma incubadora de 30 °C até que seja usada.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+guide+to+cell-free+protein+synthesis.">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene+expression:+an+expanded+repertoire+of+applications.">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li><li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+supplement+mixtures:+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract.">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li><li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis.">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li><li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism.">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li><li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis:+Protocols+for+a+robust,+flexible,+and+accessible+platform+technology.">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression.">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable,+on-demand+biomolecular+manufacturing.">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li><li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering.">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li><li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis.">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li><li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems.">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li><li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li><li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions.">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+the+preparation+of+"endotoxin-free"+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase.">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li><li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing.">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li><li>Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fast-growing+bacteria+robustly+tune+their+ribosome+concentration+to+approximate+growth-rate+maximization.">How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization.</a> FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).</li><li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations.">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li><li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system:+Practical+laboratory+guideline.">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression.">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li><li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids.">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li><li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+A+highly+productive,+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource.">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li><li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells.">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li><li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform.">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li></ol>

A supervisão dos pesquisadores é tradicionalmente necessária para duas ações-chave durante o crescimento celular: a indução de T7 RNAP e a colheita de células em um OD600 específico. O CFAI evita ambos os requisitos para diminuir o tempo e o treinamento técnico do pesquisador necessários para preparar extratos celulares de alta qualidade. A autoindução do T7 RNAP é obtida substituindo a glicose por lactose como o açúcar primário na mídia, evitando a necessidade anterior de monitorar ativament...

O uso de síntese de proteínas livres de células (CFPS) para aplicações de biotecnologia cresceu substancialmente nos últimos anos 1,2,3. Esse desenvolvimento pode ser atribuído, em parte, ao aumento dos esforços na compreensão dos processos que ocorrem no CFPS e ao papel de cada componente 4,5. Além disso, os custos reduzidos atribuídos a configurações otimizadas e fontes alternativas de energia tornaram a tecnologia livre de células mais fácil de implementar para novos usuários 6,7,8,9. Para implementar os fatores necessários de transcrição e tradução para a síntese proteica, o extrato celular é frequentemente usado para conduzir reações livres de células10. Os guias de usuários publicados recentemente forneceram protocolos simples para a produção de extrato funcional, facilitando a implementação de usuários novos e experientes, tanto 1,11,12,13,14. O extrato celular é geralmente obtido através da lise de uma cultura celular, que pode ser cultivada usando diferentes organismos dependendo do uso específico desejado 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) tornou-se rapidamente um dos organismos hospedeiros mais utilizados para a produção de extratos funcionais17. A cepa BL21 Star (DE3) é preferida porque remove as proteases da membrana externa (OmpT protease) e do citoplasma (Lon protease), proporcionando um ambiente ideal para a expressão proteica recombinante. Além disso, o DE3 contém o λDE3 que carrega o gene para a polimerase T7 RNA (T7 RNAP) sob o controle do promotor lacUV5; o componente estelar contém um gene RNaseE mutado que previne o decote de mRNA 4,14,18,19. Sob o promotor lacUV5, a indução isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) permite a expressão de T7 RNAP20,21. Essas cepas são usadas para cultivar e colher células, que dão matéria-prima para preparação de extratos. A lise celular pode ser realizada usando uma variedade de métodos, incluindo batida de contas, prensa francesa, homogeneização, sônica e cavitação de nitrogênio 1,11,12,22.
O processo de cultura bacteriana e colheita é consistente na maioria das plataformas ao usar E. coli, mas requer vários dias e intensa supervisão de pesquisadores 1,11,13. Este processo geralmente começa com uma cultura de sementes durante a noite no caldo LB, que após o crescimento da noite para o dia é então inoculado em uma cultura maior de 2xYTPG (levedura, triptona, tampão de fosfato, glicose) no dia seguinte. O crescimento dessa cultura maior é monitorado até chegar à fase de troncos do início ao meio, a uma densidade óptica (OD) de 2,514,20. A medição constante é necessária, pois os componentes da transcrição e da tradução foram previamente demonstrados como altamente ativos na fasede log 23,24 do início ao meio. Embora esse processo possa criar extrato reprodutível, nosso laboratório desenvolveu recentemente um novo método usando a Mídia de Autoindução Livre de Células (CFAI), que reduz a supervisão dos pesquisadores, aumenta o rendimento global do extrato para um determinado litro de cultura celular e melhora o acesso à preparação de extratos baseados em E. coli para usuários experientes e novos (Figura 1 ). Aqui fornecemos o guia passo-a-passo para implementar o fluxo de trabalho DO CFAI, para passar de uma placa de células listradas para uma reação CFPS completa dentro de 24 horas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MPC-425Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT5F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Lactose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(Glu)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(OAc)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTPs</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0382124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0379904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunair 2.5L Baffled Shake Flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Processor</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q125-230V/50HZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow

A síntese de proteínas sem células (CFPS) cresceu como uma plataforma de biotecnologia que captura a transcrição e a máquina de tradução in vitro. Inúmeros desenvolvimentos tornaram a plataforma CFPS mais acessível aos novos usuários e expandiram a gama de aplicativos. Para sistemas cfps baseados em lysate, extratos celulares podem ser gerados a partir de uma variedade de organismos, aproveitando a bioquímica única desse hospedeiro para aumentar a síntese proteica. Nos últimos 20 anos, escherichia coli (E. coli) tornou-se um dos organismos mais utilizados para apoiar cfps devido à sua acessibilidade e versatilidade. Apesar de inúmeros avanços importantes, o fluxo de trabalho para a preparação do extrato de células E. coli tem permanecido um gargalo fundamental para que novos usuários implementem CFPS para suas aplicações. O fluxo de trabalho de preparação do extrato é demorado e requer conhecimento técnico para alcançar resultados reprodutíveis. Para superar essas barreiras, relatamos anteriormente o desenvolvimento de um fluxo de trabalho de autoindução livre de células 24 horas (CFAI) que reduz a entrada do usuário e a experiência técnica necessária. O fluxo de trabalho do CFAI minimiza a habilidade laboral e técnica necessária para gerar extratos celulares, ao mesmo tempo em que aumenta as quantidades totais de extratos celulares obtidos. Aqui descrevemos esse fluxo de trabalho de forma passo a passo para melhorar o acesso e apoiar a ampla implementação do CFPS baseado em E. coli .

Ao preparar a mídia CFAI, a glicose foi trocada por um aumento da lactose e glicerol como o principal substrato energético na mídia. Além disso, a capacidade de tampão da mídia CFAI também foi aumentada. Estes componentes específicos são dados na Tabela 1.
As células foram então cultivadas para um OD600 de 10 e o padrão 2.5 em mídia CFAI para mostrar consistência com a qualidade do extrato, apesar das diferentes quantidades de extrato. A mídia 2.5 OD<...

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From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Este trabalho descreve a preparação do extrato celular de Escherichia coli (E. coli) seguido de reações de síntese proteica livre de células (CFPS) em menos de 24 horas. Explicação do protocolo de autoindução automática livre de células (CFAI) detalha melhorias feitas para reduzir a supervisão dos pesquisadores e aumentar as quantidades de extrato celular obtidos.

De células à síntese de proteínas livres de células dentro de 24 horas usando fluxo de trabalho de autoindução sem células

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

O método de autoindução sem células reduz a supervisão dos pesquisadores e o tempo necessário para produzir extratos funcionais de células. Isso simplifica protocolos anteriores de síntese de proteínas in vitro que eram mais demorados e intensivos. Essa técnica é menos complicada e também de alto rendimento, o que permitirá que um público maior implemente a livre expressão celular.Este método destaca a importância do metabolismo energético durante o crescimento celular e dentro de reações livres de células. Comece preparando 960 mililitros de mídia de autoindução sem células. Em seguida, esterilize a mídia em um frasco perplexo de 2,5 litros por autoclaving por 30 minutos a 121 graus Celsius.Em seguida, depois de preparar 40 mililitros da solução de açúcar, esterilize-o em um recipiente de vidro autoclavado separado. Após o autoclaving, quando a mídia cultural esfriar para abaixo de 40 graus Celsius, adicione a solução de açúcar esterilizada diretamente à mídia. Em seguida, inocular a mídia deslizando um loop cheio de colônias de uma placa estelar E.coli BL21 anteriormente listrada e inserindo o loop diretamente na mídia.Gire o laço na mídia sem tocar nas laterais do recipiente. Em seguida, coloque a mídia inoculada durante a noite em uma incubadora de 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM. No dia seguinte, colde as células transferindo um litro da mídia em uma garrafa de centrífuga de um litro e centrifugando a 5.000 vezes G entre quatro e 10 graus Celsius por 10 minutos.Depois de descartar o supernatante, use uma espátula estéril para transferir a pelota para um tubo cônico pré-refrigerado e anteriormente pesado de 50 mililitros. Em seguida, lave a pelota uma vez com 30 a 40 mililitros de tampão S30 frio, reutilizando a pelota através de vórtice em rajadas de 30 segundos com períodos de descanso no gelo. Depois que a pelota estiver completamente ressuspendida, centrifugar a ressupensão celular, descartar o supernasal e usar um tecido limpo, limpe qualquer excesso de sobrenante das paredes internas do tubo de 50 mililitros sem tocar na pelota.Em seguida, pese a pelota antes de piscar congelando-a em nitrogênio líquido e armazene-a a menos 80 graus Celsius até usar mais. Para preparar o extrato celular, adicione um mililitro de tampão S30 por grama da pelota de célula congelada e deixe a pelota descongelar no gelo por 30 a 60 minutos. Em seguida, resuspenda a pelota descongelada através de vórtice em rajadas de 30 segundos com períodos de descanso no gelo até que não permaneçam aglomerados de células visíveis.Para lise celular, transfira 1,4 mililitros da suspensão celular para tubos de microfuge de 1,5 mililitro. Em seguida, sonicar a suspensão celular em cada tubo com uma frequência de 20 kilohertz e 50% de amplitude para três rajadas de 45 segundos com 59 segundos de descanso por ciclo em um banho de gelo Inverter o tubo entre os ciclos, e após o último ciclo de sonicação, adicione imediatamente 4,5 microliters de um molar dithiothreitol. Depois de sonicar a suspensão celular em todos os tubos, centrifugar os tubos e coletar o supernatante em alíquotas de 600 microliter em tubos frescos de microfuça de 1,5 mililitro.Flash congele e armazene as alíquotas a menos 80 graus Celsius até que use mais. Para realizar 15 microlitres de reação de síntese de proteínas livres de células em tubos de microfuge de 1,5 mililitros em quadruplicato, descongele uma alíquota do extrato celular. Depois de preparar cada mistura de reação de 15 microliter, permita que a reação se escorra por pelo menos quatro horas a 37 graus Celsius.Para quantificar a proteína repórter, combine 48 microliters de 50 mililitros de tampão HEPES de 50 mililitros no pH 7.2 com dois microliters de cada produto de reação de proteína livre de células em uma placa de poliestireno preto 96-well. Quantifique a intensidade de fluorescência da proteína fluorescente verde superpatos, ou sfGFP, usando um comprimento de onda de excitação de 485 e comprimento de onda de emissão de 528 nanômetros. Em seguida, converta as unidades relativas de fluorescência para o rendimento volumoso do sfGFP criando uma curva padrão usando plasmídeo pJL1 sfGFP purificado.Aqui são mostradas pelotas de mídia de autoindução sem células após a colheita celular em diferentes densidades ópticas medidas a 600 nanômetros. A mídia cresceu para uma densidade óptica de 10 produziu uma quantidade maior de pelotas de células no extrato global do que a mídia cultivada a uma densidade óptica de 2,5. Uma análise mais aprofundada da concentração total de proteínas não demonstrou diferença significativa na proteína global entre ambos os extratos.Embora a mídia tenha sido cultivada para diferentes níveis de densidade óptica, ambos os extratos demonstraram resultados semelhantes em reações livres de células expressando sfGFP. Manter condições estéreis enquanto prepara a solução de mídia e açúcar é importante. Este método de extração celular CFAI pode ser usado para a maioria das aplicações de expressão livre de células.Estes vão desde a educação em biotecnologia até a engenharia de proteínas, bem como diagnósticos de ponto de cuidado. Este método reduz a quantidade de tempo e habilidade técnica necessária, melhora a reprodutibilidade e produz maiores quantidades de extrato.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Síntese combinatória de alta capacidade e liberação de proteínas a partir de polímero de Cinema e Bibliotecas Nanopartículas

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Bioengenharia

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Isolamento e caracterização de proteínas quimricas que expressam fc humanos usando adsorbers de membrana de proteína e um fluxo de trabalho simplificado

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

O encapsulamento de transcrição livre de células e Tradução Máquinas em vesículas para a Construção de Mimics celulares

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Arrays Sealable Femtoliter Câmara de Biologia livre-Cell

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Proteína celular livre expressão usando o rapidamente crescendo bactéria Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Uma plataforma Microfluídico multicamada para a condução de expressão gênica sem células prolongada

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

OnePot PURE Cell-Free System

Sistema sem células OnePot PURE

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...