Name: from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow at JoVE.com

Författare vill tacka Dr Jennifer VanderKelen och Andrea Laubscher för teknisk support. Författarna vill också tacka Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington och Jillian Kasman för hjälpsamma diskussioner. Författare erkänner också finansieringsstöd från Bill och Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly och National Science Foundation (NSF-1708919).

1. Medietillväxt
<ol><li>Förbered 960 ml CFAI-media enligt beskrivningen i tabell 1 och justera pH-värdet till 7,2 med KOH.</li>
	<li>Överför odlingsmedier till en 2,5 L förbryllad kolv och autoklav i 30 minuter vid 121 °C.</li>
	<li>Bered en 40 ml sockerlösning enligt beskrivningen i tabell 1. Filtersterilisera lösningen i en separat autoklaverad glasbehållare. OBS: Sockerlösningen kan förvaras i en 30 °C inkubator tills vidare användning.</li>
	<li>Låt mediet svalna...

<ol>
	<li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+guide+to+cell-free+protein+synthesis.">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+gene+expression:+an+expanded+repertoire+of+applications.">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li><li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering:+An+overview.">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li><li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+supplement+mixtures:+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract.">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li><li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis.">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li><li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism.">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li><li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis:+Protocols+for+a+robust,+flexible,+and+accessible+platform+technology.">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression.">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable,+on-demand+biomolecular+manufacturing.">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li><li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering.">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li><li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis.">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li><li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems.">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li><li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology.">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li><li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions.">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+the+preparation+of+"endotoxin-free"+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase.">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li><li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing.">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li><li>Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fast-growing+bacteria+robustly+tune+their+ribosome+concentration+to+approximate+growth-rate+maximization.">How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization.</a> FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).</li><li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations.">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li><li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system:+Practical+laboratory+guideline.">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li><li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing,+stressed+Escherichia+coli.">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression.">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li><li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids.">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li><li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+A+highly+productive,+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource.">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li><li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells.">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li><li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform.">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li></ol>

Forskarövervakning behövs traditionellt för två nyckelåtgärder under celltillväxt: induktion av T7 RNAP och skörd av celler vid en specifik OD600. CFAI undanröjer båda dessa krav för att minska forskarens tid och tekniska utbildning som krävs för att förbereda högkvalitativa cellextrakt. Automatisk induktion av T7 RNAP uppnås genom att ersätta glukos med laktos som primärsocker i media, vilket undanröjer det tidigare behovet av att aktivt övervaka tillväxten och sedan inducera med IPTG vid...

Användningen av cellfri proteinsyntes (CFPS) för biotekniska tillämpningar har ökat avsevärt under de senaste åren 1,2,3. Denna utveckling kan delvis tillskrivas ökade ansträngningar för att förstå de processer som förekommer i CFPS och rollen för varje komponent 4,5. Dessutom har minskade kostnader som tillskrivs optimerade inställningar och alternativa energikällor gjort cellfri teknik enklare att implementera för nya användare 6,7,8,9. För att implementera de nödvändiga transkriptions- och translationsfaktorerna för proteinsyntes används cellextrakt ofta för att driva cellfria reaktioner10. Nyligen publicerade användarhandböcker har tillhandahållit enkla protokoll för att producera funktionellt extrakt, vilket gör det lättare att implementera för både nya och erfarna användare 1,11,12,13,14. Cellextrakt erhålls vanligtvis genom lys av en cellodling, som kan odlas med användning av olika organismer beroende på den specifika användningen som önskas 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) har snabbt blivit en av de vanligaste värdorganismerna för att producera funktionella extrakt17. STAMMEN BL21 Star (DE3) är att föredra eftersom den tar bort proteaserna från det yttre membranet (OmpT-proteas) och cytoplasman (Lon-proteas), vilket ger en optimal miljö för det rekombinanta proteinuttrycket. Dessutom innehåller DE3 λDE3 som bär genen för T7 RNA-polymeras (T7 RNAP) under kontroll av lacUV5-promotorn; stjärnkomponenten innehåller en muterad RNaseE-gen som förhindrar klyvning av mRNA 4,14,18,19. Under lacUV5-promotorn tillåter isopropyl-tiogolaktopyranosid (IPTG) induktion uttrycket av T7 RNAP20,21. Dessa stammar används för att odla och skörda celler, vilket ger råmaterial för extraktberedning. Celllys kan utföras med hjälp av en mängd olika metoder, inklusive pärlslagning, fransk press, homogenisering, ultraljudsbehandling och kvävekavitation 1,11,12,22.
Processen för bakteriekultur och skörd är konsekvent på de flesta plattformar vid användning av E. coli, men kräver flera dagar och intensiv forskarövervakning 1,11,13. Denna process börjar vanligtvis med en frökultur över natten i LB-buljong, som vid nattens tillväxt sedan inokuleras i en större kultur av 2xYTPG (jäst, trypton, fosfatbuffert, glukos) nästa dag. Tillväxten av denna större kultur övervakas tills den når den tidiga till mitten av logfasen, vid en optisk densitet (OD) på 2,514,20. Konstant mätning krävs eftersom komponenterna i transkription och översättning tidigare har visat sig vara mycket aktiva i den tidiga till mellersta logfas23,24. Även om denna process kan skapa reproducerbart extrakt, har vårt laboratorium nyligen utvecklat en ny metod med cellfri autoinduktion (CFAI) Media, vilket minskar forskarnas tillsyn, ökar det totala utbytet av extrakt för en viss liter cellodling och förbättrar tillgången till E. coli-baserad extraktberedning för både erfarna och nya användare (Figur 1 ). Här tillhandahåller vi steg-för-steg-guiden för att implementera CFAI-arbetsflödet, för att gå från en streckad cellplatta till en slutförd CFPS-reaktion inom 24 timmar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MPC-425Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3144-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT5F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Lactose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15508013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JLA-8.1000 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8094-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7219-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(Glu)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(OAc)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B30134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8535-15VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4(Glu)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09689-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTPs</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>860077-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0382124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Acros, Organics</td>
			<td>A0379904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K210007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D13208-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0266-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(OAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunair 2.5L Baffled Shake Flask</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z710822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Processor</td>
			<td>QSonica</td>
			<td>Q125-230V/50HZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>1/2/8013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow

Cellfri proteinsyntes (CFPS) har vuxit som en bioteknikplattform som fångar transkriptions- och översättningsmaskineri in vitro. Många utvecklingar har gjort CFPS-plattformen mer tillgänglig för nya användare och har utökat utbudet av applikationer. För lysatbaserade CFPS-system kan cellextrakt genereras från en mängd olika organismer, utnyttja värdens unika biokemi för att öka proteinsyntesen. Under de senaste 20 åren har Escherichia coli (E. coli) blivit en av de mest använda organismerna för att stödja CFPS på grund av dess överkomliga priser och mångsidighet. Trots många viktiga framsteg har arbetsflödet för beredning av E. coli-cellextrakt förblivit en viktig flaskhals för nya användare att implementera CFPS för sina applikationer. Arbetsflödet för extraktberedning är tidskrävande och kräver teknisk expertis för att uppnå reproducerbara resultat. För att övervinna dessa hinder rapporterade vi tidigare utvecklingen av ett 24-timmars cellfritt autoinduktionsarbetsflöde (CFAI) som minskar användarinmatning och teknisk expertis som krävs. CFAI-arbetsflödet minimerar det arbete och den tekniska skicklighet som krävs för att generera cellextrakt samtidigt som det ökar de totala mängderna cellextrakt som erhålls. Här beskriver vi det arbetsflödet på ett steg-för-steg-sätt för att förbättra tillgången och stödja det breda genomförandet av E. coli-baserade CFPS.

Vid beredning av CFAI-media byttes glukos ut mot en ökning av laktos och glycerol som det huvudsakliga energisubstratet i media. Dessutom ökades buffertkapaciteten för CFAI-media också. Dessa specifika komponenter anges i tabell 1.
Cellerna odlades sedan till både en OD600 av 10 och standard 2.5 i CFAI-media för att visa konsistens med extraktkvalitet trots varierande extraktmängder. 2,5 OD600 CFAI-mediet odlades efter inokulering från en frökult...

Watch this Scientific Journal Video about From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow at JoVE.com

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Detta arbete beskriver beredningen av cellextrakt från Escherichia coli (E. coli) följt av cellfria proteinsyntesreaktioner (CFPS) på under 24 timmar. Förklaring av det cellfria autoinduktionsprotokollet (CFAI) beskriver förbättringar som gjorts för att minska forskarnas tillsyn och öka mängden erhållet cellextrakt.

Från celler till cellfri proteinsyntes inom 24 timmar med hjälp av cellfritt autoinduktionsarbetsflöde

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

Den cellfria autoinduktionsmetoden minskar forskarnas tillsyn och tid som behövs för att producera funktionella cellextrakt. Detta förenklar tidigare in vitro-proteinsyntesprotokoll som var mer tidskrävande och intensiva. Denna teknik är mindre komplicerad och även högavkastande, vilket gör det möjligt för en större publik att implementera cellfritt uttryck.Denna metod belyser vikten av energimetabolism under celltillväxt och inom cellfria reaktioner. Börja med att förbereda 960 ml cellfria autoinduktionsmedier. Sterilisera sedan mediet i en 2,5-liters förbryllad kolv genom autoklavering i 30 minuter vid 121 grader Celsius.Därefter, efter beredning av 40 ml av sockerlösningen, filtrera-sterilisera den i en separat autoklaverad glasbehållare. Efter autoklavering, när odlingsmediet har svalnat till under 40 grader Celsius, tillsätt den filtersteriliserade sockerlösningen direkt till mediet. Därefter inokulera media genom att svepa en slinga full av kolonier från en tidigare strimmig färsk E.coli BL21-stjärnplatta och sätta in slingan direkt i media.Virvla slingan i mediet utan att röra vid behållarens sidor. Placera sedan det inokulerade mediet över natten i en 30 grader Celsius inkubator med skakning vid 200 RPM. Nästa dag, skörda cellerna genom att överföra en liter av mediet till en en-liters centrifugflaska och centrifugera vid 5 000 gånger G mellan fyra till 10 grader Celsius i 10 minuter.Efter att ha kasserat supernatanten, använd en steril spatel för att överföra pelleten till ett förkylt och tidigare vägt 50 ml koniskt rör. Tvätta sedan pelleten en gång med 30 till 40 ml kall S30-buffert genom att återsusponera pelleten via virvel i 30-sekunders skurar med viloperioder på is. Efter att pelleten är helt återsuspenderad, centrifugera cellens resuspension, kassera supernatanten och torka av överflödigt supernatant från insidan av 50-milliliterröret utan att röra vid pelleten med en ren vävnad.Väg sedan pelleten innan du blinkar fryser den i flytande kväve och förvara den vid minus 80 grader Celsius tills vidare användning. För att förbereda cellextraktet, tillsätt en milliliter S30-buffert per gram av den frysta cellpelleten och låt pelleten tina på is i 30 till 60 minuter. Resuspendera sedan den tinade pelleten via virvel i skurar på 30 sekunder med viloperioder på is tills inga synliga cellklumpar återstår.För celllys, överför 1,4 milliliter alikvoter av cellsuspensionen till 1,5 milliliter mikrofugerör. Sedan, ultraljudsbehandling cellsuspensionen i varje rör med en frekvens av 20 kilohertz och 50% amplitud för tre skurar av 45 sekunder med 59 sekunders vila per cykel i ett isbad Invertera röret mellan cyklerna, och efter den sista ultraljudsbehandlingscykeln, tillsätt omedelbart 4.5 mikroliter av en molär ditiotreitol. Efter ultraljudsbehandling av cellsuspensionen i alla rör, centrifugera rören och samla supernatanten i 600-mikroliter alikvoter i färska 1.5-milliliter mikrofugerör.Flashfrys och förvara alikvoterna vid minus 80 grader Celsius tills vidare användning. För att utföra 15 mikroliter av cellfri proteinsyntesreaktion i 1,5-milliliter mikrofugerör i fyrdubbla, tina en alikvot av cellextraktet. Efter beredning av varje 15-mikroliterreaktionsblandning, låt reaktionen pågå i minst fyra timmar vid 37 grader Celsius.För att kvantifiera reporterproteinet, kombinera 48 mikroliter 50-millimolär HEPES-buffert vid pH 7,2 med två mikroliter av varje cellfri proteinsyntesreaktionsprodukt i en svart polystyren 96-brunnsplatta. Kvantifiera fluorescensintensiteten hos superfoldergrönt fluorescerande protein, eller sfGFP, med en excitationsvåglängd på 485 och emissionsvåglängd på 528 nanometer. Konvertera sedan de relativa fluorescensenheterna till det volymetriska utbytet av sfGFP genom att skapa en standardkurva med renad pJL1 sfGFP-plasmid.Här visas cellfria autoinduktionsmediepellets efter cellskörd vid olika optiska densiteter uppmätta vid 600 nanometer. Mediet som odlades till en optisk densitet på 10 producerade en högre mängd cellpellets i totalt extrakt än mediet som odlades till en optisk densitet på 2,5. Ytterligare analys av total proteinkoncentration visade ingen signifikant skillnad i totalt protein mellan båda extrakten.Även om mediet odlades till olika optiska densitetsnivåer visade båda extrakten liknande resultat i cellfria reaktioner som uttryckte sfGFP. Att upprätthålla sterila förhållanden vid beredning av media och sockerlösning är viktigt. Denna CFAI-cellextraktmetod kan användas för de flesta tillämpningar av cellfritt uttryck.Dessa sträcker sig från bioteknikutbildning till proteinteknik samt patientnära diagnostik. Denna metod minskar den tid och tekniska skicklighet som krävs, förbättrar reproducerbarheten och producerar större mängder extrakt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Kombinatorisk syntes av och hög kapacitet Protein Release från Polymer Film och bibliotek nanopartiklar

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Isolering och karakterisering av chimeriska mänskliga fc-uttrycka proteiner med protein A membran adsorbatorer och ett strömlinjeformat arbetsflöde

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Inkapsling av Cellfritt Transkription och översättning Maskiner i vesiklar för uppförande av Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Förslutningsbar Femtoliter Chamber arrayer för Cellfri biologi

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntesen av infektiös bakteriofager i en E. coli -baserade Cell-free uttryck systemet

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cellfria Protein uttryck med den snabbt växande bakterien Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En Multilayer Microfluidic plattform för ledning av långvarig cell-fri genuttryck

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Förbereda proteinproducerande syntetiska celler med cellfria bakterieextrakt, liposomer och emulsion överföring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Encellig optisk åtgärd potentiell mätning hos mänskliga inducerade pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

OnePot PURE Cell-Free System

OnePot PURE cellfritt system

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...