Name: analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates
Uploaded: 2021-08-06T14:30:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates at JoVE.com

Vi takker Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology Core personale for dyrepleje. Denne forskning blev delvist støttet af National Institute of Health Grants U54GM104940 (JPK) og KL2TR003097 (LAG). Alle forsøg og procedurer, der involverer dyr, blev godkendt af Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+cancer+metabolism.">Fundamentals of cancer metabolism.</a> Science Advances. 2 (5), 1600200 (2016).</li><li>Bajzikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+dihydroorotate+dehydrogenase-driven+pyrimidine+biosynthesis+restores+tumor+growth+of+respiration-deficient+cancer+cells.">Reactivation of dihydroorotate dehydrogenase-driven pyrimidine biosynthesis restores tumor growth of respiration-deficient cancer cells.</a> Cell Metabolism. 29 (2), 399-416 (2019).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ubiquinol+oxidation+is+necessary+for+tumour+growth.">Mitochondrial ubiquinol oxidation is necessary for tumour growth.</a> Nature. 585 (7824), 288-292 (2020).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6 (3), 18317 (2011).</li><li>Saks, V. A., et al., Saks, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics of the Cell: Quantitative Aspects. , 81-100 (1998).</li><li>Kaambre, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+control+analysis+of+cellular+respiration+in+situ+in+intraoperational+samples+of+human+breast+cancer.">Metabolic control analysis of cellular respiration in situ in intraoperational samples of human breast cancer.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (5), 539-558 (2012).</li><li>Koit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+in+human+colorectal+and+breast+cancer+clinical+material+is+regulated+differently.">Mitochondrial respiration in human colorectal and breast cancer clinical material is regulated differently.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 1372640 (2017).</li><li>Holland, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+mitochondrial+respiration+in+the+human+placenta+over+gestation.">Changes in mitochondrial respiration in the human placenta over gestation.</a> Placenta. 57, 102-112 (2017).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li><li>Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry+for+simultaneous+measurement+of+oxygen+and+hydrogen+peroxide+fluxes+in+permeabilized+cells,+tissue+homogenate+and+isolated+mitochondria.">High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria.</a> Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).</li><li>Kondrashova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+native+properties+of+mitochondria+in+rat+liver+homogenate.">Preservation of native properties of mitochondria in rat liver homogenate.</a> Mitochondrion. 1 (3), 249-267 (2001).</li><li>Pecinov&#225;, A., Drahota, Z., N&#367;skov&#225;, H., Pecina, P., Hou&#353;t&#283;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates.">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (1), 125-136 (2007).</li><li>Hlozkov&#225;, K., Starkov&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+metabolic+profile+of+primary+leukemia+cells.">Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e58426 (2018).</li><li>Zhang, J., Zhang, Q., Haznadar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Metabolism: Methods and Protocols. , 353-363 (2019).</li><li>Wigner, P., Zielinski, K., Labieniec-Watala, M., Marczak, A., Szwed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin-transferrin+conjugate+alters+mitochondrial+homeostasis+and+energy+metabolism+in+human+breast+cancer+cells.">Doxorubicin-transferrin conjugate alters mitochondrial homeostasis and energy metabolism in human breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4544 (2021).</li><li>Sch&#246;pf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+phosphorylation+and+mitochondrial+function+differ+between+human+prostate+tissue+and+cultured+cells.">Oxidative phosphorylation and mitochondrial function differ between human prostate tissue and cultured cells.</a> The FEBS Journal. 283 (11), 2181-2196 (2016).</li><li>Ye, F., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+oxidative+phosphorylation+in+human+skin+fibroblasts.">Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts.</a> Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).</li><li>Le Naour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EO771,+the+first+luminal+B+mammary+cancer+cell+line+from+C57BL/6+mice.">EO771, the first luminal B mammary cancer cell line from C57BL/6 mice.</a> Cancer Cell International. 20, 328 (2020).</li><li>Gnaiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+physiology.">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetics Communications. 1, 44 (2020).</li><li>Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respirometric+oxidative+phosphorylation+assessment+in+saponin-permeabilized+cardiac+fibers.">Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).</li><li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling.">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (9), 1621-1635 (2011).</li><li>Munday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+superoxide+radical,+hydrogen+peroxide+and+hydroxyl+radical+during+the+autoxidation+of+N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine.">Generation of superoxide radical, hydrogen peroxide and hydroxyl radical during the autoxidation of N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine.</a> Chemico-Biological Interactions. 65 (2), 133-143 (1988).</li><li>Moser, M. D., Matsuzaki, S., Humphries, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+succinate-linked+respiration+and+complex+II+activity+by+hydrogen+peroxide.">Inhibition of succinate-linked respiration and complex II activity by hydrogen peroxide.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 488 (1), 69-75 (2009).</li><li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G., Kapelko, V. I., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue:+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers.">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 892 (2), 191-196 (1987).</li><li>Gnaiger, E., Heldmaier, G., Klingenspor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+Cold.">Mitochondria in the Cold.</a> Life in the Cold. , 431-442 (2000).</li><li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+fluorespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells,+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle,+and+isolated+mitochondria.">High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li><li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+disruption+of+respiratory+supercomplexes+as+a+new+strategy+to+suppress+Her2(high)+breast+cancer.">Selective disruption of respiratory supercomplexes as a new strategy to suppress Her2(high) breast cancer.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 26 (2), 84-103 (2017).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathways+and+respiratory+control.">Mitochondrial pathways and respiratory control.</a> Bioenergetics Communications. 5th ed. , (2020).</li><li>Barksdale, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+viability+in+mouse+and+human+postmortem+brain.">Mitochondrial viability in mouse and human postmortem brain.</a> FASEB Journal. 24 (9), 3590-3599 (2010).</li><li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions.">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reportys. 10 (1), 13179 (2020).</li><li>Jorgensen, L. B., Overgaard, J., Hunter-Manseau, F., Pichaud, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+changes+in+mitochondrial+substrate+use+at+critically+high+temperatures:+a+comparative+study+using+Drosophila.">Dramatic changes in mitochondrial substrate use at critically high temperatures: a comparative study using Drosophila.</a> Journal of Experimental Biology. 224, (2021).</li><li>Salin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+ATP+production+in+tissue+homogenates+and+calculation+of+effective+P/O+ratios.">Simultaneous measurement of mitochondrial respiration and ATP production in tissue homogenates and calculation of effective P/O ratios.</a> Physiological Reports. 4 (20), 13007 (2016).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter relateret til dette arbejde.

Tilgange til evaluering af mitokondrie respiration i kræft har i vid udstrækning været begrænset til in vitro modeller13,14,15,16. En vis succes er opnået i måling mitokondrie respiration i tumorer ved hjælp af kemisk permeabilization6,7,17, men der er ingen ensartet, guld-standard tilgang, der kan anvendes universelt og sammenlignes på tværs af tumortyper. Derudover har mangel på konsekvent dataanalyse og -rapportering begrænset datageneralisering og reproducerbarhed. Metoden skitseret heri giver en enkel, relativt hurtig tilgang til måling mitokondrie respiration18 i mitokondrie præparater fra frisk excised solid tumor prøver. Tumorer blev dyrket fra ortotopisk implanteret murin Luminal B, ERα-negativ EO771 brystkræftceller19.
Omhu og pleje med vævshåndtering vil i høj grad forbedre nøjagtigheden og normaliseringen af iltforbruget. Vævet og mitokondrier kan let beskadiges, hvis prøven ikke holdes kold, ikke konsekvent nedsænkes i konserveringsmedier eller håndteres for meget, hvilket resulterer i suboptimal rutine og OXPHOS-satser. Derudover er nøjagtig vådvægt af det homogeniserede væv af afgørende betydning, da dette er den primære normaliseringsmetode. Andre normaliseringsmetoder kan overvejes, såsom totale protein- eller mitokondriespecifikke markører, såsom citratsyntaseaktivitet20. Derudover, væv heterogenitet skal behandles, med beslutninger om tumor regioner til at omfatte i eksperimenter foretaget på forhånd. Nekrotisk, fibrotisk, og bindevæv kan ikke homogenisere og / eller respire godt og bør undgås, medmindre forsætligt assaying disse tumor regioner. Især, tumoren kan være meget klæbrig afhængigt af typen og excision region, hvilket gør præcis vejning og overførsel mere udfordrende. Antallet af strøg, der anvendes til homogeniseringer, bør optimeres for at sikre fuldstændig forberedelse af mitokondrier, samtidig med at der formildes skader på de ydre mitokondriemembraner.
For forbedret nøjagtighed og reproducerbarhed anbefaler vi optimeringsforsøg for antallet af slagtilfælde til homogenatpræparat, vævskoncentration og substrat, uncoupler, inhibitorkoncentrationer. Undersøgelser kan sammenligne det forskellige antal slagtilfælde, og hvordan de svarer til respons på tilsætning af cytochrom c i undersøgelsen samt den maksimale mitokondrie respiratoriske kapacitet 21. Selv om der er en generel accept af, at mindre cytochrom c respons er bedre, da en stigning i iltforbruget efter tilsætning af cytochrom c kan indikere skader på den ydre mitokondriemembran, er der ingen guldstandard for, hvad denne tærskel er for hvert væv og bør eksperimentelt undersøges for at sikre, at vævet ikke bliver overbebyrdet eller underforberedt. I dette tumorvæv blev det konstateret, at en cytochrom c respons under ~ 30% ikke forringe respiratorisk funktion. Cytochrom c-brug bliver afgørende for nøjagtig kvantificering af åndedrætskapaciteten, hvis testen er positiv. I dette tilfælde genopfylder tilsætning endogene cytochrom c, som, hvis de er udtømt, vil forårsage en undervurdering af åndedrætsfrekvenserne.
Vævskoncentration titrering eksperimenter kan udføres over en række mulige koncentrationer og ideelt set ville ske med SUITs, der vil blive undersøgt i løbet af undersøgelsen. Respiratorisk kapacitet vil variere efter tumortype og sammensætning. Således tumorer tæt med mitokondrier eller høj respiratorisk kapacitet vil kræve lavere koncentrationer (0,5-5 mg/mL). Tumorer med få mitokondrier eller lav respiratorisk kapacitet vil kræve højere koncentrationer (7-12 mg/mL). Derudover kan SUITs, der er lange eller har meget forbrugte substrater, have brug for mindre væv for at forhindre reoxygenation af kammeret eller ADP-begrænsning. Nogle væv vil have en lineær sammenhæng i iltforbruget, mens andre vil vise forbedret følsomhed og maksimal oxidation på visse koncentrationsområder. Den valgte vævskoncentration skal optimeres for at maksimere iltstrøm og samtidig begrænse antallet af reoxygenationshændelser. Derudover er det ofte bedre at overvurdere behovet for eller sigte mod den højere ende af koncentrationsområdet. Hæmmerne, som er afgørende for kvantificeringen af respiratoriske fluxer, er mere præcise, når de anvendes i større puljer af mitokondrier.
En anden væsentlig overvejelse er koncentrationen af de lægemidler, der anvendes under protokollerne. Ændringer i homogenatkoncentrationen kan ændre koncentrationerne af substrater, uncouplers og hæmmere, der kræves for maksimal respons. Når det optimale koncentrationsområde er valgt, skal der således udføres et forsøg, der tester de doser, der kræves til SUIT-protokollen. Yderligere ADP kan tilføjes for at sikre, at adenylatkoncentrationer ikke begrænser sig til luftvejsstrøm. Kemiske afkoblere som FCK eller CCCP vil hæmme åndedrættet ved højere koncentrationer22. Som sådan er det vigtigt at titrere i små mængder for at afsløre den maksimale opnåede sats. Hæmmere, såsom rotenon og antimycin A, anvendes bedst, når de er mættet i den første injektion. Mens optimale koncentrationer blev bestemt i indledende forsøg, har vi også observeret behandlingsrelaterede forskelle som reaktion på hæmmere og tilføjer derfor ofte en ekstra injektion af hæmmere for at demonstrere maksimal hæmning, da de resulterende satser tjener som grundlag for kvantificering. Kemisk hæmning af Ascorbat/TPMD er afgørende for nøjagtig analytisk reduktion, da TMPD gennemgår autooxidation23. Vi kontrollerede for autooxidation af ascorbat/TMPD/cytochrom c gennem tilsætning af natriumazid, en etableret CIV-hæmmer. For Km-undersøgelserne forhindrer tilsætning af rotenon i nærværelse af succinate alene oxaloacetatakkumulering, som kan hæmme succinate dehydrogenaseaktivitet ved lave koncentrationer24. Volumen og koncentration af ADP er meget afhængig af mitokondriers følsomhed over for den fremherskende substratkombination. Mitokondriepræparater, der er meget følsomme over for ADP, vil kræve lavere startkoncentrationer. Derudover validerede kemikalier og korrekt lægemiddelpræparat med opmærksomhed på pH, følsomhed over for lys, hvis det er relevant, og opbevaringstemperatur er afgørende for vellykkede eksperimenter.
Instrument setup og rutinemæssig pleje er af afgørende betydning for succesen af disse eksperimenter. Tilstrækkelig og korrekt rengøring af kamrene er afgørende for reproducerbarhed og forebyggelse af biologisk, protein, hæmmer eller afkoblet forurening. Clark-type elektroder og O2k systemer udnytte glas reaktion kamre, som er en betydelig omkostningsfordel for plade-baserede systemer, der er afhængige af forbrugsstoffer. Glaskamrene skal dog rengøres kraftigt og kan være en kilde til kontaminering af hæmmere i efterfølgende undersøgelser. Inkubation med mitokondrier-rige prøver under vaskeprocessen (f.eks. isolerede hjerte- eller lever mitokondrier) kan reducere risikoen for eksperimentel forurening og anbefales ud over fortyndings- og alkoholbaserede vaskeprocedurer. Hvis der gennemføres på hinanden følgende undersøgelser, minimerer rengøring med ethanol og mitokondrier muligheden for inhibitorforurening. Kalibrering af iltsensoren anbefales forud for hvert forsøg for at opnå nøjagtige målinger af respiration i forhold til det fremherskende delvise ilttryk. Hvis det ikke er muligt at kalibrere flere kalibreringer, kan en kalibrering om dagen være tilstrækkelig, hvis iltkoncentrationen forbliver stabil og ensartet efter vaskeproceduren.
De procedurer, der er skitseret ovenfor udnytte Oroboros O2k instrument til måling af iltforbrug i tumorvæv inden for 4 timer efter tumor excision ved hjælp af tidligere designet og optimeret konservering løsning og respiration medier25,26,27. Flere parametre i denne protokol kan ændres til efterfølgende programmer. Instrumentopsætningen og kalibreringen, de homogenisatorer, der anvendes til vævspræparat, og den optimale homogenat- og kammer oxygenkoncentration kan alle tilpasses til brug på andre instrumenter med iltovervågningspotentiale. For eksempel blev kamrene lidt overfyldte, når de tilsættes homogenat, og når kammeret er helt lukket, forbliver kammerkapillæren fuld. Dette vil forbruge noget ilt i kammeret, men med optimering af prøvekoncentrationen kan vi redegøre for dette forbrug ved at bestemme, hvilket iltniveau der skal starte med. Alternativt kan prøven få lov til at ekvilibrere ved omgivende ilt, før kammeret lukkes, men dette vil ofte øge tiden, før eksperimentet starter og forsinke tilsætning af substrater. Mens de homogenisatorer, der anvendes i denne protokol, er bredt tilgængelige, kan der anvendes andre kommercielle homogeniseringsteknikker, såsom en vævs shredder eller automatiseret homogenisator28.
Derudover kan vævspræparatet og instrumentprocedurerne anvendes sammen med en række forskellige SUIT'er til at studere åndedrætskontrol ved en mangfoldighed af koblings- og vejkontroltilstande29. Disse SUIT-protokoller er udviklet til at måle funktionel kapacitet, og dermed har bidraget fra potentielle endogene substrater ingen indvirkning på kapacitetsmålingen. Vi analytisk tegner os for ikke-mitokondrie iltforbrug og / eller resterende forbrug af homogenatet gennem subtraktion af antimycin A-rotenone, eller natrium azid ufølsomme satser, alt efter hvad der er relevant. Mitokondrier kan forblive levedygtige i BIOPS eller lignende konstruerede konserveringsløsninger i længere tid (>24 timer) afhængigt af vævstype og intakthed30,31. Undersøgelser kan udføres på forhånd for at bestemme de tidsmæssige opbevaringsgrænser, da OXPHOS af visse substrater kan have forskellige begrænsninger. Dette er afgørende, hvis eksperimentet ikke kan udføres inden for få timer efter vævs excision/biopsi. 37 °C er en optimal og fysiologisk temperatur til evaluering af åndedrætsfunktion i de fleste pattedyrsystemer. Hvis analysetemperaturen imidlertid ser ud til at forstyrre evaluering32, kan der gennemføres sammenlignende undersøgelser på tværs af et bredt temperaturområde (25-40 °C) for at sikre tilstrækkelig reaktionsevne. Instrumentale begrænsninger kan begrænse evnen til at gennemføre sådanne undersøgelser.
Større begrænsninger af ovennævnte metode er 1) potentialet for skader på mitokondrier gennem mekanisk homogenisering, 2) tilstedeværelse af ATPaser eller andre subcellulære biokemikalier i homogenatpræparater, der kan forstyrre samtidig bestemmelse af ATP eller andre variabler af interesse og kan kræve yderligere korrektionsmetoder eller hæmmerbrug33 og 3) evaluering af mange prøver og/eller flere SUIT'er pr. prøve er tidskrævende, da ét instrument kan rumme to eksperimenter ad gangen og kræver rengøring og opsætning mellem efterfølgende forsøg. Optimering eksperimenter og konsekvent forberedelse af prøver kan minimere betydelige mitokondrie skader, der ville bidrage til inkonsekvente data.
Metodens betydning med hensyn til eksisterende/alternative metoder er forbedret gennemførlighed i forhold til mængden af udgangsmateriale, udfordring med at isolere mitokondrier eller teknisk udfordring i permeabilizing væv. Forberedelse af homogenater er hurtigere, ilt er ikke nær så begrænsende, og er mindre modtagelige for variation mellem personale sammenlignet med permeabiliseret væv. Det er vigtigt, at næsten alle prøvetyper er egnede til homogenatpræparat, som giver mulighed for sammenlignende analyse på tværs af væv. Respirometri i høj opløsning er guldstandardmålingen af mitokondrie OXPHOS og ET. Anvendelsen af denne metode i præklinisk og klinisk kræftforskning har kapacitet til at udvide de nuværende in vitro-undersøgelser til ex vivo-undersøgelser. Desuden tilbyder det potentielle anvendelser i kliniske og diagnostiske indstillinger.

Alle celler er tæt forbundet med deres behov for at producere og forbruge adenosin triphosphat (ATP), den molekylære energi valuta. Som cellulære mutationer giver anledning til dannelsen af tumorer, mitokondrier sikre overlevelse gennem diversificering af energiproduktion, der ofte er fænotypeligt skelnes fra ikke-kræft væv1,2,3. Som sådan, der er et kritisk behov for hurtig og dyb profilering af mitokondrie respiratorisk funktion for at lette klassificeringen af tumortype, kræft indledning, progression, og behandling respons.
Åndedrætsfunktioner i udskårne vævsprøver kan ikke vurderes intakt, da de primære substrater for OXPHOS ikke er celle-gennemtrængelige. For at overvinde denne begrænsning kan mitokondrier fremstilles enten ved isolation, kemisk permeabilisering eller mekanisk homogenisering. Mitokondrie isolation anses længe for at være en guldstandard for evaluering af åndedrætsfunktion. Det kræver dog store mængder væv, er tidskrævende og giver lav giver med mulig udvælgelse bias for visse fraktioner af mitokondrier4. Permeabilisering består af mekanisk adskillelse og eksponering af vævssektioner eller fiberbundter for et mildt vaskemiddel, der selektivt nedbryder plasmamembranen5. Permeabilisering er ofte ansat i striated væv såsom skelet og hjertemusklen som individuelle fiber bundter kan drilles fra hinanden. Sammenlignet med isolation giver permeabilisering mere mitokondrier i deres oprindelige cellulære miljø og fysiske form5. Permeabilisering er blevet anvendt med succes i andre væv såsom tumor6,7 og moderkage8; Reproducerbarheden af permeabiliserede fiberpræparater kan dog være vanskelig på grund af konsistensen af dissektion og iltbehov for at overvinde diffusionsbegrænsninger9. Derudover kan permeabiliserede fibre være uegnede i visse tumortyper, der er tæt cellulære og meget fibrotiske. Vævsar homogenater genereres gennem mekanisk forstyrrelse af plasmamembranen og ligner permeabiliserede fibre med hensyn til mitokondrieudbytte og integritet10. Vævs homogenater minimerer også begrænsningerne ved iltdiffusion og kan let anvendes på tværs af vævstyper gennem optimering af mekanisk kraft11,12.
Her skitserer vi en enkel og hurtig metode til at kvantificere oxidativ fosforylering (OXPHOS) og elektronoverførselskapacitet (ET) i friskudskårne faste tumor homogenater. Protokollen er optimalt designet til at evaluere frisk væv ved hjælp af Oxygraph-2k (O2k) høj opløsning respirometer, som kræver forudgående kendskab til instrumental opsætning og kalibrering, men kan ligeledes tilpasses ved hjælp af enhver Clark-type elektrode, Seahorse analysator, eller pladelæser. Protokollen kan reproducibly anvendes på tværs af arter og tumortyper samt tilpasset til at evaluere en mangfoldighed af mitokondrie ET veje.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 50 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab 7.4 software</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Calipers 150 mm/6 in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EO771 cells</td>
			<td>CH3 BioSystems</td>
			<td>SKU:&#160;94APV1-vial-prem</td>
			<td>Pathogen Tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6J mice</td>
			<td>&#160;Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock #000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10023-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k FluoRespirometer</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10003-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (disodium)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter Paper, grade 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1005-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>357424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5914SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Safety Scalpel No. 11</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1029065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 18 G x 1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Slip Tip Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Very High Fat Diet,&#160; 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Watch Glass, 100 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S34819</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates

Mitokondrier er afgørende for udbrud og progression af kræft gennem energiproduktion, reaktiv ilt arter regulering, og makromolekyle syntese. Genetiske og funktionelle tilpasninger af mitokondrier til tumormiljøet drev proliferativt og metastatisk potentiale. Fremkomsten af DNA og RNA sekventering fjernet kritiske barrierer for evaluering af genetiske mæglere af tumorigenese. Men til dato, metodiske tilgange til evaluering tumor mitokondrie funktion forbliver undvigende og kræver tekniske færdigheder begrænse gennemførligheden, i sidste ende faldende diagnostiske og prognostiske værdi i både eksperimentelle og kliniske indstillinger. Her skitserer vi en enkel og hurtig metode til at kvantificere oxidativ fosforylering (OXPHOS) og elektronoverførselskapacitet (ET) i friskudskårne faste tumor homogenater ved hjælp af høj opløsning respirometri. Protokollen kan reproducibly anvendes på tværs af arter og tumortyper samt tilpasset til at evaluere en mangfoldighed af mitokondrie ET veje. Ved hjælp af denne protokol viser vi, at mus med en lysende B brystkræft udviser defekt nicotinamid adenin dinucleotid-forbundet respiration og afhængighed af succinate at generere adenosin triphosphat via OXPHOS.

Indledende undersøgelser viste, at EO771 tumorer var ringe oxidative og dermed krævede høje homogenatkoncentrationer for tilstrækkelig O2 flux vurdering. Optimeringsforsøg blev udført for at bestemme det optimale vævs homogenatkoncentrationsområde for undersøgelsen. Tumor homogenater blev oprindeligt udarbejdet ved 40 mg / mL og derefter lineært fortyndet. O2-flux normaliseret til vævsmasse var konsistent på tværs af koncentrationer (Figur 1A-D). Det blev observeret, at 40 mg/mL resulterede i hurtig iltsvind og ikke var egnet til forsøg (figur 1A). Iltforbruget faldt betydeligt med 30 mg/mL og 20 mg/mL, men faldt stadig hurtigt på kort tid uden substrater eller ADP (figur 1B, C). 10 mg/mL-koncentrationen resulterede i den optimale iltforbrugshastighed (Figur 1D), som ville understøtte en længere SUIT-protokol på 90 min.
En SUIT-protokol blev brugt til at evaluere NADH- og succinate-linked OXPHOS og ET samt CIV-aktivitet (Figur 2A). Pyruvat og malat blev tilsat vævs homogenatet i mangel af ADP for at drive lækage (L) gennem NADH. Mættende ADP blev derefter tilføjet til drev maksimal NADH-forbundet OXPHOS (P), efterfulgt af tilsætning af glutamat. Cytochrom c blev derefter tilsat for at sikre ydre membranintegritet; stigningen i respirationsraten var mindre end 20 % i alle prøver (figur 2B). I betragtning af den meget lave respons på NADH-forbundne substrater blev cytochrom c-frigivelsen også vurderet i nærværelse af succinate og rotenon og observeret minimal cytochrom c stimulation ( Figur2B). Interessant, NADH-forbundet OXPHOS var ubetydelig i EO771 tumorer (Figur 2C). Succinate blev derefter tilføjet i nærværelse af pyruvat, malat og glutamat for at stimulere elektronstrømmen gennem succinate dehydrogenase. FCCP blev derefter titreret for at drive maksimal elektronstrøm (E), som afslørede, at i EO771 tumorer, fosforylering snarere end oxidation var begrænsende til respiration (Figur 2C). Rotenone og antimycin A blev efterfølgende titreret for at hæmme henholdsvis kompleks I og kompleks III. Ascorbat og TMPD blev derefter tilsat for at drive maksimal elektronstrøm gennem CIV, som derefter hæmmes af natrium-azid. Tabel 1 illustrerer analytiske reduktionsligninger af de rådata (tabel 2) for at kvantificere de luftvejsparametre , der er afbildet i figur 2C. Samlet set tumor homogenere respiratoriske profiler (Figur 2C) svarer til dem af ikke-implanterede digitonin-permeabilized EO771 celler (Figur 2D) med undtagelse af formindsket maksimal elektron overførsel understøttes af N- og S-forbundet substrater i tumoren.
Da NADH-forbundet respiration var ubetydelig, blev succinates respiratoriske kinetika yderligere evalueret ved trinvise titreringer af submættede ADP, indtil den maksimale hastighed (VMAX)blev opnået (figur 3A,3B). Den halvmaksimume koncentration (KM)af ADP i nærværelse af succinate + rotenone var 37,5 μM, mens VMAX var ~ 10,5 pmol / s / mg (Figur 3C). På trods af relativt dårlige oxidationshastigheder var EO771 tumorer således meget følsomme over for ADP og vedvarende ATP-syntese ved relativt lave ADP-koncentrationer.
Valg af egnede områder af de rå data til udvinding er afgørende for reproducerbarheden af eksperimenter og nøjagtig kvantificering. For cytochrom cskal der vælges et mærke i steady-state umiddelbart før injektion (Figur 4A, mærke 1). Der er ofte en indledende injektion artefakt, der kan efterfølges af en periode (ca. 5-10 min), hvor O2 flux er ikke stabil. Evaluering af cytokrom c-effektivitet foretages ved at foretage en yderligere udvælgelse, når O2-fluxen har stabiliseret sig ( Figur4A, mærke 2). Valg efter tilsætning af substrater, ADP eller de fleste hæmmere foretages også efter injektionsartefaktet, og når O 2-fluxen er stabiliseret (Figur 4B). Det valg, der anvendes til at bestemme maksimal ukoblet respiration, foretages ved den højeste stigning, der opnås under titreringen af FCCP, hvilket ofte ikke er den sidste injektion (Figur 4C). Udvælgelsen af TMPD foretages, efter at både ascorbate og TMPD er blevet tilføjet, og ved den maksimale stigning i respiration (Figur 4D, mark 1). Lige efter denne top tilsættes hæmmeren, natriumazid, hvilket hurtigt reducerer åndedrættet, men har også ofte en injektionsartefakt lavere end den hæmmede respirationshastighed (Figur 4D). Inhibitormærket foretages umiddelbart efter injektionsartefaktet (Figur 4D, mark 2). O2-fluxen vil typisk ikke stabilisere sig og fortsætte med at falde.
Tabel 1: Respirationsbesetation og analytisk afledning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%201.docx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 2: Prøve og respiratoriske egenskaber ved lysende B brystsvulst homogenater. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%202.docx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig01.jpg"> Figur 1: Optimering af tumor homogenatkoncentration. O2 Flux (rød) og O2 Koncentration (blå) hos brystsvulst homogenater fremstillet ved (A) 40 mg/mL, (B) 30 mg/mL, (C) 20 mg/mL og (D) 10 mg/mL. Thom: Væv homogenere respiration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig02.jpg"> Figur 2: Evaluering af OXPHOS- og ET-kapacitet ved høj opløsnings respirometri i friskopskårne tumor homogenater. (A) Repræsentativt grundstykke af iltforbrug (rød) og koncentrationer (blå) i løbet af en substrat, hæmmer, uncoupler protokol. PM: Pyruvat + Malate, D: ADP, G: Glutamat, c: Cytochrom c, S: Succinate, F: FCCP, Rot: Rotenone, Ama: Antimycin A, Asc/TMPD: Ascorbate/Tetramethyl-p-phenylenediamin. (B) Procentvis stigning i O2 flux ved tilsætning af cytochrom c. (C-D) Respiration understøttet af malat, pyruvat, glutamat og succinate i nærværelse af ADP, FCCP, og ascorbat/TMPD i (C) EO771-afledte tumor homogenater og (D) ikke-implanterede EO771 digitonin-permeabilized celler. Thom: Væv homogenat respiration; PM: Pyruvat + Malate; PMG: Pyruvat + Malate + Glutamat; PMGS: Pyruvat + Malate + Glutamat + Succinate; CIV: Kompleks IV; -L: Lækage tilstand; -P: Oxidativ fosforyleringstilstand, -E: Elektronoverførselstilstand; N-forbundet: O2 flux understøttet af definerede NADH-genererende substratkombinationer; NS-forbundet: O2 flux understøttet af konvergensen af definerede NADH-generere substrat kombinationer og succinate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig03.jpg"> Figur 3: EO771 brysttumorer vises høj ADP (adenosin 5′-diphosphat) følsomhed. (A) Repræsentativt grundstykke for iltforbrug (rød) og koncentrationer (blå) i hele en S-forbundet ADP-titreringsprotokol. Thom: Væv homogenat respiration; S/Rot: Succinate/Rotenone; D: ADP. (B) Respiration understøttet af succinate i nærværelse af rotenon og stigende koncentrationer af ADP (0 μM ADP = S /Rot-L). (C) Maksimal hastighed (VMAX) og halvmaksimumkoncentration (KM)af ADP i nærværelse af succinate + rotenon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig04.jpg"> Figur 4: Repræsentativ sporing, der illustrerer markering af rå O2-fluxer til dataudtræk. (A) Valg af cytokrom c: udvælgelsesnummer 1 før cytochrom c-injektionen og udvælgelse nummer 2 efter injektionen, når O2-fluxet har stabiliseret sig. c Cytochrom c. (B) Substrat, ADP og hæmning valg: udvælgelse nummer 1 efter injektionen (succinate i denne repræsentative plot), hvor O2 flux har stabiliseret. S: Succinate. (C) Udkodningsvalg: udvælgelsesnummer 1 ved den højeste stigning i respirationen under uncoupler titrationen. I dette repræsentative FCCP-titreringsplot reducerer den tredje injektion lidt åndedrættet og bruges derfor ikke til udvælgelse. F: ACCP. (D) TMPD-udvælgelse: udvælgelse nummer 1 ved den højeste stigning i respirationen efter ascorbat- og TMPD-injektionerne. Natrium azid udvælgelse: udvælgelse nummer 2 efter den akutte injektion artefakt, når respirationen i første omgang falder. As/Tm: Ascorbate/TMPD; Azd: Azide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates at JoVE.com

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

Vi udviklede en praktisk protokol og analytisk tilgang til evaluering af mitokondrieoxidativ fosforylering og elektronoverførselskapacitet i friske tumor homogenater. Denne protokol kan let tilpasses til at undersøge forskellige mitokondrie funktioner, der bidrager til kræft indledning, progression, og behandling respons.

Analytisk bestemmelse af mitokondriefunktion af udskårne faste tumor homogenater

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

Denne protokol beskriver en enkel og hurtig metode til måling af tumor mitokondrie funktion. Protokollen er bredt anvendelig for klinisk translationel onkologi, og vil bidrage til at forbedre diagnostiske og mekanistiske fortolkning af den rolle, mitokondrier i begyndelsen og progression af kræft. Den største fordel ved denne teknik er anvendelsen af vævs homogenisering for at forenkle forberedelsen og maksimere udbyttet af mitokondrier, samtidig med at begrænsningerne ved diffusion mindskes.Denne teknik tilbyder potentielle anvendelser i kliniske og diagnostiske indstillinger med en kvantitativ vurdering af tumor mitokondrie funktion ved hjælp af frisk biopsied eller fjernet tumorvæv. Begynd med at placere en glas homogenisator, der indeholder en milliliter mitokondrie respiration medium, eller MiR05, i en tætsiddende glas støder på våd is. Læg vævet i en milliliter biopsi konserveringsopløsning, eller BIOPS, i en iskold Petriskål.Skær tumoren i små stykker på ca 5 til 10 milligram hver, og læg de resterende tumorstykker tilbage i 10 milliliter BIOPS, der holdes på is. Efter blotting væv sektioner omhyggeligt på et filter papir, placere dem på en lille plast tjæret vejer båd og registrere den oprindelige våde vægt. Placer de ubrugte stykker tilbage i BIOPS's 10-milliliter koniske rør for fortsat konservering.Dyk vævssektionerne ned i en iskold homogenisator, der indeholder MiR05, og registrer den resterende vægt på vejebåden. Ved hjælp af et glas støder med en clearance rækkevidde på 0,09 til 0,16 millimeter, forsigtigt forstyrre tumorvæv ved at udfylde fem til syv ned og op slagtilfælde. For hvert slag, rotere støderen i uret / mod uret bevægelse tre gange, mens du skubber støderen ned, og tre ekstra gange, mens du trækker støderen op igen.Lad vævet slå sig ned til bunden af homogenisatoren mellem strøg, men undgå at bringe støderen helt over væskemængden for at forhindre skumdannelse. Hæld homogenatet i et 15 milliliter konisk rør og læg det på is. Pipette en til tre milliliter frisk MiR05 over støderen og ind i homogenisatoren for at vaske eventuelle resterende vævs homogenater.Hæld MiR05-vasken i det koniske rør, der indeholder homogenatet. Gentag dette trin to til tre gange for at sikre fuldstændig overførsel af homogenatet. For nøjagtigt at beregne vævs homogenatkoncentrationen skal homogenisatoren og homogenatet omhyggeligt inspiceres for resterende ikke-homogeniseret materiale, som omfatter bindevæv.For at fjerne det ikke-homogeniserede materiale fra homogenisatoren, der ikke kan nås med pincet, efter at have tilføjet MiR05 til homogenisatoren, aspirere volumen, herunder vævet, med en pipette og flytte indholdet til en Petriskål. Fjern det ikke-homogeniserede materiale, der er afgjort i store stykker i bunden af det koniske rør fra homogenatet ved at aspirere dem med en pipette, og læg dem på hætten af det koniske rør. Fjern vævet fra petriskålen eller konisk rørhætte med pincet, og blot det på filterpapir.Tilsæt den resterende homogenat fra den koniske rørhætte tilbage i det koniske rør. Cap røret, derefter invertere til at blande. Revurdere homogenisatorerne og homogenat for yderligere ikke-homogeniseret materiale, og gentag trinene for at fjerne ikke-homogeniseret materiale, hvis det er nødvendigt.Vægt og registrer massen af det ikke-homogeniserede materiale, der genvindes fra homogenisatoren. Undersøg homogenatpræparatet for eventuelt groft intakt væv, der overføres, og fjernet de ikke-homogeniserede stykker og vejes efter behov. Træk vævsvægten, der er genvundet fra vejebåden, homogenisatoren og homogenaten fra den oprindelige våde vægt for at beregne den endelige prøvevægt.Ved hjælp af den endelige prøvevægt tilsættes yderligere MiR05 for at bringe homogenat til den ønskede koncentration. Når homogenatet er vejet og forberedt, fortsæt til analysen så hurtigt som muligt. Hold prøven opbevaret på våd is, indtil den overføres til instrumentet.Når instrumentet er kalibreret, og prøven er forberedt, skal propperne fjernes med en vridningsbevægelse og aspirere MiR05 fra kamrene, så membranen udsættes inde i kammeret. Homogenaten blandes godt, og der tilsættes 2,25 milliliter homogenat til kammeret. Antag, at der tilsættes et homogenat til flere kamre, pipette en milliliter af homogenatet ad gangen i hvert kammer, mens homogenaten blandes for at sikre lige vævsfordeling.Klik på F4 for at navngive og tidsstempel begivenheden, og klik derefter på Okay. Fyld en 50-milliliter sprøjte med ilt fra en ilttank med en regulator og gasrør ved hjælp af en stump 18-gauge nål. Indsprøjt ilten direkte i kamrene for at hyperoxygenre dem til ca. 500 mikromolar ilt.Sæt propperne løst og vent med at lukke, indtil ilten når ca. 480 mikromolar. Med en snoet bevægelse skal du langsomt lukke kammeret og lade åndedrættet ekvilibrere i ca. 15 til 20 minutter. Fyld proppens centrale kapillær med MiR05, hvis det er nødvendigt.Brug dedikerede mikrosyrings til at injicere substrater, uncouplers og hæmmere i fuldt lukkede kamre for at navngive og tidsstempel begivenhederne for hvert kammer i realtid. Vælg F6 for at justere iltkoncentrationen og iltskråningens negative skalaer efter behov. Efter hver injektion vaskes sprøjten tre gange i vand for vandopløselige forbindelser og 70% ethanol til ethanol-opløste forbindelser.Tilsæt fem mikroliter af 0,8-molar malat og fortsæt straks til næste injektion. Vask injektionssprøjten tre gange i vand. Tilsæt straks fem mikroliter af 1-molar pyruvat, og vent på, at åndedrættet stabiliseres.Efter vask af sprøjten tilsættes 10 mikroliter af 0,5 molar ADP og venter på, at ADP-svaret stabiliseres. Vask sprøjten og tilsæt fem mikroliter af 2-molar glutamat og vent på, at åndedrættet stabiliseres. Vask sprøjten, tilsæt derefter fem mikroliter af 4-millimolar cytochrome-C, og vent på, at åndedrættet stabiliseres.Efter vask af sprøjten tilsættes 20 mikroliter 1-molar succinate og vent på, at åndedrættet stabiliseres. Titrere 0,5-til 1-mikroliter intervaller på 1-millimolar FCCP og vente på respiration at stabilisere efter hver injektion. Fortsæt, indtil der ikke er nogen yderligere stigning i åndedrættet.Vask injektionssprøjten tre gange i 70% ethanol. Tilsæt to mikroliter af 150-mikromolar rotenone og vent på respiration at stabilisere. Tilføj en anden mikroliter rotenone for at sikre, at der ikke er yderligere hæmning.Hvis der er et fald i åndedrættet, skal du fortsætte med yderligere injektioner, indtil der ikke er noget fald i åndedrættet, og vask derefter injektionssprøjten tre gange i 70% ethanol. Tilsæt to mikroliter af 125-mikromolar antimycin A og vent på respiration at stabilisere. Tilsæt en anden mikroliter af antimycin A for at sikre, at der ikke er yderligere hæmning.Hvis der er et fald i respiration, fortsætte med yderligere injektioner, indtil der ikke er noget fald i respiration. Vask sprøjten tre gange med 70% ethanol. Kontroller iltkoncentrationen af kammeret.Hvis koncentrationen er under 125-mikromolar, reoxygenere til rumluft, eller mildt hyperoxygenat for at sikre, at ilt ikke begrænser respiratorisk flux. Tilsæt fem mikroliter af 0,8-molar ascorbat. Vask sprøjten tre gange i 70% ethanol.Tilsæt straks 10 mikroliter på 0,2-molar TMPD, og vent på en stigning i åndedrættet. Efter vask af sprøjten med ethanol tilsættes 25 mikroliter 4-molar natriumzid straks, når luftvejsfluen af ascorbat TMPD plateauer. Afslut ved at klikke på Filer, Gem og afbryd forbindelsen.Det blev observeret, at 40 milligram per milliliter vævs homogenat resulterede i hurtig iltsvind. Iltforbruget faldt betydeligt med 30 og 20 milligram pr. milliliter vævs homogenat, men faldt stadig hurtigt på kort tid i mangel af substrater eller ADP. De 10 milligram pr milliliter koncentration af væv homogenat resulterede i den optimale iltforbrug sats.En SUIT-protokol blev brugt til at evaluere NADH-og succinate-forbundet oxidativ fosforylering og elektronoverførsel samt kompleks IV-aktivitet. Cytochrom C frigivelse blev vurderet i overværelse af pyruvat og malat, eller succinate og rotenone, som begge afslørede, at homogenatpræparatet ikke skadede mitokondrier. Det blev også konstateret, at NADH-forbundet oxidativ fosforylering var ubetydelig i EO771 tumorer.Titrering af FCCP til at drive maksimal elektron flow afslørede, at i EO771 tumorer, fosforylering, snarere end oxidation, var begrænsende til respiration. Tumor homogenat respiratoriske profiler lignede dem af ikke-implanterede, digitonin-permeabilized EO771 celler, bortset fra formindsket maksimal elektron overførsel understøttes af N-og S-forbundet substrater i tumoren. Succinates respiratoriske kinetikere blev yderligere evalueret ved trinvise titreringer af subsaturerende ADP, indtil maksimumshastigheden blev opnået.Den halvmaksimetale koncentration af ADP i nærværelse af succinate og rotenone var 37,5-mikromolar, mens den maksimale sats var ca. 10,5 picomoles per sekund, per milligram. Instrumenter, der er oprettet i rutinemæssig pleje, samt vævshåndtering, er af afgørende betydning for disse eksperimenters succes. Efter disse procedurer kan andre masse- eller markørspecifikke tilgange til renten normalisering anvendes på grundlag af spørgsmålet om interesse.Fælles foranstaltninger omfatter total protein kvantificering og enzymatisk aktivitet citrat synthase, men varierer baseret på model system, statistisk design, og forskningsspørgsmål.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Evaluering af rollen mitokondriel funktion i Cancer-relaterede træthed

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for den genetiske Variation i en sporadisk familiær adenomatøs polypose Patient med formatet Chip i rør

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tre-dimensionelle knogle ekstracellulære Matrix Model for osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro Tumor celle Rechallenge For intelligent evaluering af kimære Antigen Receptor T-celle Antitumor funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow Cytometrisk analyse af mitokondrie reaktive oxygen arter i murine hæmatopoietiske stamceller og Progenitorcellerne og MLL-AF9 drevet leukæmi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse af sidepopulation i faste tumorcellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En roman Stromal Fibroblast-Moduleret 3D Tumor Spheroid Model for at studere Tumor-Stroma Interaktion og Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

En automatiseret differentiale nuklear farvning assay til nøjagtig bestemmelse af Mitocan Cytotoxicity

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellering af primære knogletumorer og knoglemetastase med implantation af fast tumortransplantat i knogle

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Udforskning af mitokondrieenergimetabolisme af enkelt 3D-mikrotissu-sfroider ved hjælp af ekstracellulær fluxanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...