Name: analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates
Uploaded: 2021-08-06T14:30:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates at JoVE.com

We bedanken het Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology Core-personeel voor dierenverzorging. Dit onderzoek werd mede ondersteund door de National Institute of Health subsidies U54GM104940 (JPK) en KL2TR003097 (LAG). Alle experimenten en procedures met dieren werden goedgekeurd door het Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+cancer+metabolism.">Fundamentals of cancer metabolism.</a> Science Advances. 2 (5), 1600200 (2016).</li><li>Bajzikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+dihydroorotate+dehydrogenase-driven+pyrimidine+biosynthesis+restores+tumor+growth+of+respiration-deficient+cancer+cells.">Reactivation of dihydroorotate dehydrogenase-driven pyrimidine biosynthesis restores tumor growth of respiration-deficient cancer cells.</a> Cell Metabolism. 29 (2), 399-416 (2019).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ubiquinol+oxidation+is+necessary+for+tumour+growth.">Mitochondrial ubiquinol oxidation is necessary for tumour growth.</a> Nature. 585 (7824), 288-292 (2020).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6 (3), 18317 (2011).</li><li>Saks, V. A., et al., Saks, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics of the Cell: Quantitative Aspects. , 81-100 (1998).</li><li>Kaambre, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+control+analysis+of+cellular+respiration+in+situ+in+intraoperational+samples+of+human+breast+cancer.">Metabolic control analysis of cellular respiration in situ in intraoperational samples of human breast cancer.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (5), 539-558 (2012).</li><li>Koit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+in+human+colorectal+and+breast+cancer+clinical+material+is+regulated+differently.">Mitochondrial respiration in human colorectal and breast cancer clinical material is regulated differently.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 1372640 (2017).</li><li>Holland, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+mitochondrial+respiration+in+the+human+placenta+over+gestation.">Changes in mitochondrial respiration in the human placenta over gestation.</a> Placenta. 57, 102-112 (2017).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li><li>Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry+for+simultaneous+measurement+of+oxygen+and+hydrogen+peroxide+fluxes+in+permeabilized+cells,+tissue+homogenate+and+isolated+mitochondria.">High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria.</a> Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).</li><li>Kondrashova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+native+properties+of+mitochondria+in+rat+liver+homogenate.">Preservation of native properties of mitochondria in rat liver homogenate.</a> Mitochondrion. 1 (3), 249-267 (2001).</li><li>Pecinov&#225;, A., Drahota, Z., N&#367;skov&#225;, H., Pecina, P., Hou&#353;t&#283;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates.">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (1), 125-136 (2007).</li><li>Hlozkov&#225;, K., Starkov&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+metabolic+profile+of+primary+leukemia+cells.">Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e58426 (2018).</li><li>Zhang, J., Zhang, Q., Haznadar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Metabolism: Methods and Protocols. , 353-363 (2019).</li><li>Wigner, P., Zielinski, K., Labieniec-Watala, M., Marczak, A., Szwed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin-transferrin+conjugate+alters+mitochondrial+homeostasis+and+energy+metabolism+in+human+breast+cancer+cells.">Doxorubicin-transferrin conjugate alters mitochondrial homeostasis and energy metabolism in human breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4544 (2021).</li><li>Sch&#246;pf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+phosphorylation+and+mitochondrial+function+differ+between+human+prostate+tissue+and+cultured+cells.">Oxidative phosphorylation and mitochondrial function differ between human prostate tissue and cultured cells.</a> The FEBS Journal. 283 (11), 2181-2196 (2016).</li><li>Ye, F., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+oxidative+phosphorylation+in+human+skin+fibroblasts.">Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts.</a> Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).</li><li>Le Naour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EO771,+the+first+luminal+B+mammary+cancer+cell+line+from+C57BL/6+mice.">EO771, the first luminal B mammary cancer cell line from C57BL/6 mice.</a> Cancer Cell International. 20, 328 (2020).</li><li>Gnaiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+physiology.">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetics Communications. 1, 44 (2020).</li><li>Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respirometric+oxidative+phosphorylation+assessment+in+saponin-permeabilized+cardiac+fibers.">Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).</li><li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling.">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (9), 1621-1635 (2011).</li><li>Munday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+superoxide+radical,+hydrogen+peroxide+and+hydroxyl+radical+during+the+autoxidation+of+N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine.">Generation of superoxide radical, hydrogen peroxide and hydroxyl radical during the autoxidation of N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine.</a> Chemico-Biological Interactions. 65 (2), 133-143 (1988).</li><li>Moser, M. D., Matsuzaki, S., Humphries, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+succinate-linked+respiration+and+complex+II+activity+by+hydrogen+peroxide.">Inhibition of succinate-linked respiration and complex II activity by hydrogen peroxide.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 488 (1), 69-75 (2009).</li><li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G., Kapelko, V. I., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue:+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers.">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 892 (2), 191-196 (1987).</li><li>Gnaiger, E., Heldmaier, G., Klingenspor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+Cold.">Mitochondria in the Cold.</a> Life in the Cold. , 431-442 (2000).</li><li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+fluorespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells,+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle,+and+isolated+mitochondria.">High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li><li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+disruption+of+respiratory+supercomplexes+as+a+new+strategy+to+suppress+Her2(high)+breast+cancer.">Selective disruption of respiratory supercomplexes as a new strategy to suppress Her2(high) breast cancer.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 26 (2), 84-103 (2017).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathways+and+respiratory+control.">Mitochondrial pathways and respiratory control.</a> Bioenergetics Communications. 5th ed. , (2020).</li><li>Barksdale, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+viability+in+mouse+and+human+postmortem+brain.">Mitochondrial viability in mouse and human postmortem brain.</a> FASEB Journal. 24 (9), 3590-3599 (2010).</li><li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions.">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reportys. 10 (1), 13179 (2020).</li><li>Jorgensen, L. B., Overgaard, J., Hunter-Manseau, F., Pichaud, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+changes+in+mitochondrial+substrate+use+at+critically+high+temperatures:+a+comparative+study+using+Drosophila.">Dramatic changes in mitochondrial substrate use at critically high temperatures: a comparative study using Drosophila.</a> Journal of Experimental Biology. 224, (2021).</li><li>Salin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+ATP+production+in+tissue+homogenates+and+calculation+of+effective+P/O+ratios.">Simultaneous measurement of mitochondrial respiration and ATP production in tissue homogenates and calculation of effective P/O ratios.</a> Physiological Reports. 4 (20), 13007 (2016).</li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten met betrekking tot dit werk.

Benaderingen voor het evalueren van mitochondriale ademhaling bij kanker zijn grotendeels beperkt tot in vitro modellen13,14,15,16. Er is enig succes geboekt bij het meten van mitochondriale ademhaling in tumoren met behulp van chemische permeabilisatie6,7,17,maar er is geen uniforme, gouden standaardbenadering die universeel kan worden toegepast en vergeleken tussen tumortypen. Bovendien heeft een gebrek aan consistente gegevensanalyse en -rapportage de generaliseerbaarheid en reproduceerbaarheid van gegevens beperkt. De hierin beschreven methode biedt een eenvoudige, relatief snelle aanpak om mitochondriale ademhaling18 te meten in mitochondriale preparaten uit vers weggesneden vaste tumormonsters. Tumoren werden gekweekt uit orthotopisch geïmplanteerde muriene luminale B, ERα-negatieve EO771 borstkankercellen19.
Zorgvuldigheid en zorg met weefselbehandeling zullen de nauwkeurigheid en normalisatie van de zuurstofverbruiksnelheden aanzienlijk verbeteren. Het weefsel en de mitochondriën kunnen gemakkelijk worden beschadigd als het monster niet koud wordt gehouden, niet consequent wordt ondergedompeld in conserveringsmedia of te veel wordt behandeld, wat resulteert in suboptimale routine en OXPHOS-snelheden. Bovendien is een nauwkeurig nat gewicht van het gehomogeniseerde weefsel van cruciaal belang, omdat dit de primaire normalisatiemethode is. Andere normalisatiemethoden kunnen worden overwogen, zoals totaal eiwit of mitochondriale specifieke markers, zoals citraatsynthase-activiteit20. Bovendien zal weefselheterogeniteit moeten worden aangepakt, waarbij beslissingen over tumorregio's a priori in experimenten moeten worden opgenomen. Necrotisch, fibrotisch en bindweefsel homogeniseren en/of ademen mogelijk niet goed en moeten worden vermeden, tenzij deze tumorgebieden opzettelijk worden getest. Met name kan de tumor erg kleverig zijn, afhankelijk van het type en het excisiegebied, waardoor nauwkeurig wegen en overbrengen uitdagender wordt. Het aantal slagen dat wordt gebruikt voor homogenisaties moet worden geoptimaliseerd om een volledige voorbereiding van de mitochondriën te garanderen en tegelijkertijd de schade aan de buitenste mitochondriale membranen te beperken.
Voor verbeterde nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid raden we aan optimalisatie-experimenten uit te voeren voor het aantal slagen voor homogenaatpreparaat, weefselconcentratie en substraat-, ontkoppelings- en remmerconcentraties. Studies kunnen het verschillende aantal beroertes vergelijken en hoe ze overeenkomen met de respons op de toevoeging van cytochroom c binnen de studie, evenals de maximale mitochondriale ademhalingscapaciteit 21. Hoewel er een algemene acceptatie is dat minder cytochroom c-respons beter is, omdat een toename van het zuurstofverbruik na de toevoeging van cytochroom c kan wijzen op schade aan het buitenste mitochondriale membraan, is er geen gouden standaard over wat deze drempel is voor elk weefsel en moet experimenteel worden onderzocht om ervoor te zorgen dat het weefsel niet overwerkt of onvoldoende voorbereid is. In dit tumorweefsel werd gevonden dat een cytochroom c-respons onder ~ 30% de ademhalingsfunctie niet verminderde. Cytochroom c gebruik wordt van cruciaal belang voor nauwkeurige kwantificering van de ademhalingscapaciteit als de test positief is. In dit geval vult de toevoeging endogene cytochroom c aan, wat, indien uitgeput, een onderschatting van de ademhalingsfrequenties zal veroorzaken.
Weefselconcentratietitratie-experimenten kunnen worden uitgevoerd over een reeks haalbare concentraties en zouden idealiter worden uitgevoerd met SUITs die tijdens het onderzoek zullen worden onderzocht. De ademhalingscapaciteit varieert per tumortype en samenstelling. Tumoren dicht bij mitochondriën of hoge ademhalingscapaciteit vereisen dus lagere concentraties (0,5-5 mg / ml). Tumoren met weinig mitochondriën of een lage ademhalingscapaciteit vereisen hogere concentraties (7-12 mg / ml). Bovendien hebben SUITs die lang zijn of veel substraten hebben, mogelijk minder weefsel nodig om reoxygenatie van de kamer of ADP-beperking te voorkomen. Sommige weefsels zullen een lineaire relatie hebben in zuurstofverbruik, terwijl andere een verbeterde gevoeligheid en maximale oxidatie vertonen bij bepaalde concentratiebereiken. De gekozen weefselconcentratie moet worden geoptimaliseerd om de zuurstofflux te maximaliseren en tegelijkertijd het aantal reoxygenatiegebeurtenissen te beperken. Daarnaast is het vaak beter om de behoefte te overschatten of te streven naar de bovenkant van het concentratiebereik. De remmers, die essentieel zijn voor de kwantificering van ademhalingsfluxen, zijn nauwkeuriger wanneer ze worden gebruikt in grotere pools van mitochondriën.
Een andere essentiële overweging is de concentratie van de geneesmiddelen die tijdens de protocollen worden gebruikt. Veranderingen in de homogenaatconcentratie kunnen de concentraties van substraten, ontkoppelaars en remmers die nodig zijn voor een maximale respons veranderen. Zodra het optimale concentratiebereik is gekozen, moet dus een experiment worden uitgevoerd waarbij de doses worden getest die nodig zijn voor het SUIT-protocol. Extra ADP kan worden toegevoegd om ervoor te zorgen dat de adenylaatconcentraties niet beperkt blijven tot ademhalingsfluxen. Chemische ontkoppelaars zoals FCCP of CCCP remmen de ademhaling bij hogere concentraties22. Als zodanig is het essentieel om in kleine hoeveelheden te titreren om de maximaal bereikte snelheid te onthullen. Remmers, zoals rotenon en antimycine A, kunnen het beste worden gebruikt wanneer ze verzadigd zijn binnen de eerste injectie. Hoewel optimale concentraties werden bepaald in voorlopige experimenten, hebben we ook behandelingsgerelateerde verschillen in respons op remmers waargenomen en dus vaak één extra injectie van remmers toegevoegd om maximale remming aan te tonen, omdat de resulterende snelheden dienen als basis voor kwantificering. Chemische remming van ascorbaat/TPMD is essentieel voor een nauwkeurige analytische reductie aangezien TMPD autooxidatie ondergaat23. We controleerden op auto-oxidatie van ascorbaat/TMPD/cytochroom c door de toevoeging van natriumazide, een gevestigde CIV-remmer. Voor de Km-studies voorkomt de toevoeging van rotenon in aanwezigheid van succinaat alleen oxaalacetaataccumulatie die de succinaatdehydrogenaseactiviteit bij lage concentraties kan remmen24. Het volume en de concentratie van ADP zijn sterk afhankelijk van de gevoeligheid van de mitochondriën voor de heersende substraatcombinatie. Mitochondriale preparaten die zeer gevoelig zijn voor ADP vereisen lagere startconcentraties. Bovendien zijn gevalideerde chemicaliën en een goede medicijnbereiding met aandacht voor pH, gevoeligheid voor licht indien van toepassing en opslagtemperatuur essentieel voor succesvolle experimenten.
Instrumentopstelling en routinezorg zijn van cruciaal belang voor het succes van deze experimenten. Adequate en goede reiniging van de kamers is essentieel voor de reproduceerbaarheid en preventie van biologische, eiwit-, remmer- of ontkoppelingsbesmetting. Clark-type elektroden en O2k-systemen maken gebruik van glazen reactiekamers, wat een aanzienlijk kostenvoordeel is voor op platen gebaseerde systemen die afhankelijk zijn van verbruiksartikelen. De glazen kamers moeten echter krachtig worden gereinigd en kunnen in latere onderzoeken een bron van inhibitorbesmetting zijn. Incubatie met mitochondria-rijke monsters tijdens het wasproces (geïsoleerde hart- of levermitochondriën, bijvoorbeeld) kan het risico op experimentele besmetting verminderen en wordt aanbevolen naast verdunnings- en op alcohol gebaseerde wasprocedures. Als opeenvolgende studies worden uitgevoerd, minimaliseert reiniging met ethanol en mitochondriën de kans op inhibitorbesmetting. Kalibratie van de zuurstofsensor wordt aanbevolen voorafgaand aan elk experiment om nauwkeurige metingen van de ademhaling te verkrijgen ten opzichte van de heersende partiële druk van zuurstof. Als meerdere kalibraties niet haalbaar zijn, kan één kalibratie per dag voldoende zijn als de zuurstofconcentratie stabiel en consistent blijft na de wasprocedure.
De hierboven beschreven procedures maken gebruik van het Oroboros O2k-instrument voor het meten van zuurstofverbruik in tumorweefsel binnen 4 uur na tumorexcisie met behulp van eerder ontworpen en geoptimaliseerde conserveringsoplossing en ademhalingsmedia25,26,27. Meerdere parameters in dit protocol kunnen worden gewijzigd voor volgende toepassingen. De instrumentopstelling en kalibratie, de homogenisatoren die worden gebruikt voor weefselvoorbereiding en optimale homogenaat- en kamerzuurstofconcentratie kunnen allemaal worden aangepast voor gebruik op andere instrumenten met zuurstofbewakingspotentieel. De kamers waren bijvoorbeeld iets overvol bij het toevoegen van homogenaat, en dus wanneer de kamer volledig gesloten is, blijft het capillair van de kamer vol. Dit zal wat zuurstof in de kamer verbruiken, maar met optimalisatie van de monsterconcentratie kunnen we rekening houden met dit verbruik bij het bepalen van het zuurstofniveau waarmee we moeten beginnen. Als alternatief kan het monster worden toegestaan om te balanceren met omgevingszuurstof voordat de kamer wordt gesloten, maar dit zal vaak de hoeveelheid tijd voordat het experiment begint verlengen en de toevoeging van substraten vertragen. Hoewel de homogenisatoren die in dit protocol worden gebruikt, breed toegankelijk zijn, kunnen andere commerciële homogenisatietechnieken worden gebruikt, zoals een weefselversnipperaar of geautomatiseerde homogenisator28.
Bovendien kunnen de weefselpreparaat- en instrumentprocedures worden gebruikt met een aantal verschillende SUITs om ademhalingscontrole te bestuderen door een verscheidenheid aan koppelings- en routecontroletoestanden29. Deze SUIT-protocollen zijn ontwikkeld om de functionele capaciteit te meten en dus heeft de bijdrage van potentiële endogene substraten geen invloed op de capaciteitsmeting. We houden analytisch rekening met niet-mitochondriaal zuurstofverbruik en /of restverbruik van het homogenaat door aftrek van de antimycine A-rotenon, of natriumazide ongevoeligheden, naargelang het geval. Mitochondriën kunnen levensvatbaar blijven in BIOPS of vergelijkbaar geconstrueerde conserveringsoplossingen gedurende langere tijd (>24 uur), afhankelijk van het weefseltype en de intactheid30,31. Er kunnen vooraf studies worden uitgevoerd om de tijdelijke opslaglimieten te bepalen, aangezien OXPHOS van bepaalde substraten verschillende beperkingen kan hebben. Dit is essentieel als het experiment niet binnen enkele uren na weefselexcisie/biopsie kan worden uitgevoerd. 37°C is een optimale en fysiologische temperatuur voor de evaluatie van de ademhalingsfunctie in de meeste zoogdiersystemen. Als de testtemperatuur echter de evaluatie lijkt te verstoren32,kunnen vergelijkende studies worden uitgevoerd over een breed temperatuurbereik (25-40 °C) om een adequate responsiviteit te garanderen. Instrumentele beperkingen kunnen het vermogen om dergelijke studies uit te voeren beperken.
Belangrijke beperkingen van de hierboven beschreven methode zijn 1) het potentieel voor schade aan mitochondriën door mechanische homogenisatie, 2) aanwezigheid van ATPasen of andere subcellulaire biochemische stoffen in homogenaatpreparaten die kunnen interfereren met gelijktijdige bepaling van ATP of andere variabelen van belang en mogelijk aanvullende correctiemethoden of remmergebruik vereisen33 , en 3) evaluatie van veel monsters en/of meerdere SUITs per monster is tijdrovend omdat één instrument twee experimenten tegelijk kan huisvesten en tussen opeenvolgende experimenten moet worden gereinigd en opgezet. Optimalisatie-experimenten en consistente voorbereiding van monsters kunnen aanzienlijke mitochondriale schade minimaliseren die zou bijdragen aan inconsistente gegevens.
De betekenis van de methode ten opzichte van bestaande/alternatieve methoden is verbeterde haalbaarheid in vergelijking met de hoeveelheid uitgangsmateriaal, uitdaging van het isoleren van mitochondriën of technische uitdaging bij het permeabiliseren van weefsel. De bereiding van homogenaten is sneller, zuurstof is lang niet zo beperkend en is minder gevoelig voor variabiliteit tussen personeel in vergelijking met gepermeabiliseerd weefsel. Belangrijk is dat bijna alle monstertypen geschikt zijn voor homogenaatpreparaat, waardoor vergelijkende analyse tussen weefsels mogelijk is. Hoge resolutie respirometrie is de gouden standaard meting van mitochondriaal OXPHOS en ET. De toepassing van deze methode in preklinisch en klinisch kankeronderzoek heeft de capaciteit om het huidige in vitro onderzoek uit te breiden naar ex vivo studies. Bovendien biedt het potentiële toepassingen in klinische en diagnostische omgevingen.

Alle cellen zijn nauw verbonden door hun behoefte om adenosinetrifosfaat (ATP), de moleculaire energievaluta, te produceren en te consumeren. Aangezien cellulaire mutaties aanleiding geven tot de vorming van tumoren, zorgen mitochondriën voor overleving door diversificatie van de energieproductie die vaak fenotypisch te onderscheiden is van niet-kankerweefsel1,2,3. Als zodanig is er een kritieke behoefte aan snelle en diepe profilering van de mitochondriale ademhalingsfunctie om de classificatie van tumortype, kankerinitiatie, progressie en behandelingsrespons te vergemakkelijken.
Respiratoire functies van weggesneden weefselmonsters kunnen niet intact worden geëvalueerd omdat de primaire substraten voor OXPHOS niet celdoorlatend zijn. Om deze beperking te overwinnen, kunnen mitochondriën worden bereid door isolatie, chemische permeabilisatie of mechanische homogenisatie. Mitochondriale isolatie wordt lang beschouwd als een gouden standaard voor de evaluatie van de ademhalingsfunctie. Het vereist echter grote hoeveelheden weefsel, is tijdrovend en heeft een lage opbrengst met mogelijke selectiebias voor bepaalde fracties van mitochondriën4. Permeabilisatie bestaat uit mechanische scheiding en blootstelling van weefselsecties of vezelbundels aan een mild reinigingsmiddel dat selectief het plasmamembraan afbreekt5. Permeabilisatie wordt vaak gebruikt in dwarsgestreepte weefsels zoals skelet- en hartspier, omdat individuele vezelbundels uit elkaar kunnen worden geplaagd. In vergelijking met isolatie levert permeabilisatie meer mitochondriën op in hun oorspronkelijke cellulaire omgeving en fysieke vorm5. Permeabilisatie is met succes toegepast in andere weefsels zoals tumor6,7 en placenta8; de reproduceerbaarheid van gepermeabiliseerde vezelpreparaten kan echter moeilijk zijn vanwege de consistentie van dissectie en zuurstofbehoeften om diffusiebeperkingen te overwinnen9. Bovendien kunnen gepermeabiliseerde vezels ongeschikt zijn in bepaalde tumortypen die dichtcellig cellulair en zeer fibrotisch zijn. Weefselhomogenaten worden gegenereerd door mechanische verstoring van het plasmamembraan en zijn vergelijkbaar met gepermeabiliseerde vezels in termen van mitochondriale opbrengst en integriteit10. Weefselhomogenaten minimaliseren ook de beperkingen van zuurstofdiffusie en kunnen gemakkelijk worden gebruikt in weefseltypen door optimalisatie van mechanische kracht11,12.
Hier schetsen we een eenvoudige en snelle methode om de snelheid van oxidatieve fosforylering (OXPHOS) en elektronenoverdracht (ET) capaciteit in vers weggesneden vaste tumorhomogenaten te kwantificeren. Het protocol is optimaal ontworpen om vers weefsel te evalueren met behulp van de Oxygraph-2k (O2k) respirometer met hoge resolutie, die voorkennis vereist van instrumentele installatie en kalibratie, maar op dezelfde manier kan worden aangepast met behulp van elke Clark-type elektrode, Seahorse-analyzer of plaatlezer. Het protocol kan reproduceerbaar worden toegepast op soorten en tumortypen en worden aangepast om een diversiteit aan mitochondriale ET-routes te evalueren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 50 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab 7.4 software</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Calipers 150 mm/6 in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EO771 cells</td>
			<td>CH3 BioSystems</td>
			<td>SKU:&#160;94APV1-vial-prem</td>
			<td>Pathogen Tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6J mice</td>
			<td>&#160;Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock #000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10023-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k FluoRespirometer</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10003-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (disodium)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter Paper, grade 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1005-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>357424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5914SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Safety Scalpel No. 11</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1029065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 18 G x 1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Slip Tip Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Very High Fat Diet,&#160; 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Watch Glass, 100 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S34819</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates

Mitochondriën zijn essentieel voor het ontstaan en de progressie van kanker door middel van energieproductie, reactieve regulering van zuurstofsoorten en macromolecuulsynthese. Genetische en functionele aanpassingen van mitochondriën aan de tumoromgeving stimuleren proliferatief en gemetastaseerd potentieel. De komst van DNA- en RNA-sequencing verwijderde kritische barrières voor de evaluatie van genetische mediatoren van tumorigenese. Tot op heden blijven methodologische benaderingen om de mitochondriale functie van de tumor te evalueren echter ongrijpbaar en vereisen ze technische vaardigheid die de haalbaarheid beperkt, waardoor uiteindelijk de diagnostische en prognostische waarde in zowel experimentele als klinische omgevingen afneemt. Hier schetsen we een eenvoudige en snelle methode om de snelheid van oxidatieve fosforylering (OXPHOS) en elektronenoverdracht (ET) capaciteit in vers weggesneden vaste tumorhomogenaten te kwantificeren met behulp van respirometrie met hoge resolutie. Het protocol kan reproduceerbaar worden toegepast op soorten en tumortypen en worden aangepast om een diversiteit aan mitochondriale ET-routes te evalueren. Met behulp van dit protocol tonen we aan dat muizen met een luminale B-borstkanker defecte nicotinamide-adenine dinucleotide-gebonden ademhaling vertonen en afhankelijk zijn van succinaat om adenosinetrifosfaat te genereren via OXPHOS.

Uit de eerste studies bleek dat EO771-tumoren laag oxidatief waren en dus hoge homogenaatconcentraties nodig hadden voor een adequate beoordeling van de O2-flux. Optimalisatie-experimenten werden uitgevoerd om het optimale weefselhomogenaatconcentratiebereik voor de studie te bepalen. Tumorhomogenaten werden aanvankelijk bereid bij 40 mg / ml en vervolgens lineair verdund. De O2-flux genormaliseerd tot weefselmassa was consistent in alle concentraties (figuren 1A-D). Er werd waargenomen dat 40 mg /ml resulteerde in snelle zuurstofdepletie en niet geschikt was voor experimenten(figuur 1A). Het zuurstofverbruik vertraagde aanzienlijk met 30 mg/ml en 20 mg/ml, maar nam nog steeds snel af in korte tijd bij afwezigheid van substraten of ADP (figuur 1B, C). De concentratie van 10 mg/ml resulteerde in het optimale zuurstofverbruik(figuur 1D)dat een langer SUIT-protocol van 90 minuten zou ondersteunen.
Een SUIT-protocol werd gebruikt om NADH- en succinaat-gekoppelde OXPHOS en ET te evalueren, evenals CIV-activiteit(figuur 2A). Pyruvaat en malaat werden toegevoegd aan het weefselhomogenaat in afwezigheid van ADP om lek (L) door NADH te drijven. Saturating ADP werd vervolgens toegevoegd om maximale NADH-gekoppelde OXPHOS (P) aan te drijven, gevolgd door de toevoeging van glutamaat. Cytochroom c werd vervolgens toegevoegd om de integriteit van het buitenmembraan te waarborgen; de toename van de ademhalingsfrequentie was minder dan 20% in alle monsters(figuur 2B). Gezien de zeer lage respons op NADH-gebonden substraten, werd cytochroom c afgifte ook beoordeeld in de aanwezigheid van succinaat en rotenon en waargenomen minimale cytochroom c stimulatie (Figuur 2B). Interessant is dat NADH-gebonden OXPHOS verwaarloosbaar was in EO771-tumoren(figuur 2C). Succinaat werd vervolgens toegevoegd in aanwezigheid van pyruvaat, malaat en glutamaat om de elektronenstroom door succinaatdehydrogenase te stimuleren. FCCP werd vervolgens getitreerd om de maximale elektronenstroom (E) te stimuleren, waaruit bleek dat in EO771-tumoren fosforylering in plaats van oxidatie beperkt was tot ademhaling(figuur 2C). Rotenon en antimycine A werden vervolgens getitreerd om respectievelijk complex I en complex III te remmen. Ascorbaat en TMPD werden vervolgens toegevoegd om de maximale elektronenstroom door CIV te sturen, die vervolgens wordt geremd door natriumazide. Tabel 1 illustreert analytische reductievergelijkingen van de ruwe gegevens ( tabel 2 ) om de in figuur 2Cuitgezette ademhalingsparameters te kwantificeren. Over het algemeen zijn de tumorhomogenaat respiratoire profielen (figuur 2C) vergelijkbaar met die van niet-geïmplanteerde digitonine-gepermeabiliseerde EO771-cellen (figuur 2D) met uitzondering van verminderde maximale elektronenoverdracht ondersteund door N- en S-gebonden substraten in de tumor.
Aangezien nadh-gebonden ademhaling verwaarloosbaar was, werd de respiratoire kinetiek van succinaat verder geëvalueerd door stapsgewijze titraties van subverzadigende ADP totdat de maximale snelheid (VMAX)was bereikt (figuur 3A, 3B). De half-maximale concentratie (KM)van ADP in aanwezigheid van succinaat + rotenon was 37,5 μM, terwijl de VMAX ~10,5 pmol/s/mg was(figuur 3C). Dus, ondanks relatief slechte oxidatiesnelheden, waren EO771-tumoren zeer gevoelig voor ADP en hielden atp-synthese aan bij relatief lage ADP-concentraties.
Het selecteren van geschikte regio's van de ruwe gegevens voor extractie is van cruciaal belang voor de reproduceerbaarheid van experimenten en nauwkeurige kwantificering. Voor cytochroom cmoet onmiddellijk voorafgaand aan de injectie een markering worden geselecteerd bij de steady-state(figuur 4A,merk 1). Er is vaak een initieel injectieartefact dat kan worden gevolgd door een periode (ongeveer 5-10 minuten) waarin de O2-flux niet stabiel is. Evaluatie van cytochroom c efficiëntie wordt gemaakt door een extra selectie te maken zodra de O2 flux is gestabiliseerd(Figuur 4A,merk 2). Selecties na de toevoeging van substraten, ADP of de meeste remmers worden ook gemaakt na het injectieartefact en zodra de O2-flux is gestabiliseerd(figuur 4B). De selectie die wordt gebruikt om de maximale ontkoppelde ademhaling te bepalen, wordt gemaakt bij de piektoename die wordt bereikt tijdens titratie van FCCP, wat vaak niet de laatste injectie is die wordt gemaakt(figuur 4C). De selectie voor TMPD wordt gemaakt nadat zowel ascorbaat als TMPD zijn toegevoegd en op de piek toename van de ademhaling (Figuur 4D, merk 1). Net na deze piek wordt de remmer, natriumazide, toegevoegd, die de ademhaling snel vermindert, maar ook vaak een injectieartefact heeft dat lager is dan de geremde ademhalingssnelheid(figuur 4D). Het inhibitormerk wordt onmiddellijk na het injectieartefact gemaakt(figuur 4D,merkteken 2). De O2-flux zal meestal niet stabiliseren en blijven afnemen.
Tabel 1: Respiratoire notatie en analytische afleiding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%201.docx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2: Monster- en respiratoire kenmerken van luminale B-borsttumorhomogenaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%202.docx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig01.jpg"> Figuur 1: Optimalisatie van de tumorhomogenaatconcentratie. O2 Flux (rood) en O2 Concentratie (blauw) in borsttumorhomogenaten bereid bij (A) 40 mg / ml, (B) 30 mg / ml, (C) 20 mg / ml en (D) 10 mg / ml. Thom: Weefselhomogenaat ademhaling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig02.jpg"> Figuur 2: Evaluatie van OXPHOS- en ET-capaciteit door hoge-resolutie respirometrie in vers weggesneden tumorhomogenaten. (A) Representatieve plot van zuurstofverbruik (rood) en concentraties (blauw) in de loop van een substraat, remmer, ontkoppelingsprotocol. PM: Pyruvaat + Malaat, D: ADP, G: Glutamaat, c: Cytochroom c, S: Succinaat, F: FCCP, Rot: Rotenone, Ama: Antimycine A, Asc / TMPD: Ascorbaat / Tetramethyl-p-fenyleendiamine. (B) Procentuele toename van de O2-flux na toevoeging van cytochroom c. (C-D) Ademhaling ondersteund door malaat, pyruvaat, glutamaat en succinaat in aanwezigheid van ADP, FCCP en ascorbaat / TMPD in (C) EO771-afgeleide tumorhomogenaten en (D) niet-geïmplanteerde EO771 digitonine-permeabiliseerde cellen. Thom: Weefselhomogenaat ademhaling; PM: Pyruvaat + Malaat; PMG: Pyruvaat + Malaat + Glutamaat; PMGS: Pyruvaat + Malaat + Glutamaat + Succinaat; CIV: Complex IV; -L: Lektoestand; -P: Oxidatieve fosforyleringstoestand, -E: Elektronenoverdrachtstoestand; N-gebonden: O2-flux ondersteund door gedefinieerde NADH-genererende substraatcombinaties; NS-gebonden: O2 flux ondersteund door de convergentie van gedefinieerde NADH-gegenereerde substraatcombinaties en succinaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig03.jpg"> Figuur 3: EO771 borsttumoren vertoonden een hoge ADP (adenosine 5′-difosfaat) gevoeligheid. (A) Representatief plot van zuurstofverbruik (rood) en concentraties (blauw) in een S-gebonden ADP-titratieprotocol. Thom: Weefselhomogenaat ademhaling; S / Rot: Succinaat / Rotenone; D: ADP. (B) Ademhaling ondersteund door succinaat in aanwezigheid van rotenon en toenemende concentraties van ADP (0 μM ADP = S / Rot-L). (C) Maximale snelheid (VMAX) en half-maximale concentratie (KM) van ADP in aanwezigheid van succinaat + rotenon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig04.jpg"> Figuur 4: Representatieve tracering ter illustratie van de merkselectie van ruwe O2-fluxen voor gegevensextractie. (A) Cytochroom c-selectie: selectienummer 1 vóór de Cytochroom c-injectie en selectienummer 2 na de injectie wanneer de O2-flux is gestabiliseerd. c Cytochroom c. (B) Substraat, ADP en inhibitorselectie: selectie nummer 1 na de injectie (succinaat in deze representatieve grafiek) waar de O2-flux is gestabiliseerd. S: Succinaat. (C) Ontkoppelingsselectie: selectie nummer 1 bij de piektoename van de ademhaling tijdens de ontkoppelingstitratie. In deze representatieve FCCP-titratieplot vermindert de derde injectie de ademhaling enigszins en wordt dus niet gebruikt voor selectie. F: ACCP. (D) TMPD-selectie: selectie nummer 1 bij de piektoename van de ademhaling na de ascorbaat- en TMPD-injecties. Natriumazideselectie: selectie nummer 2 na het acute injectieartefact wanneer de ademhaling aanvankelijk afneemt. As/ Tm: Ascorbaat /TMPD; Azd: Azide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates at JoVE.com

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

We ontwikkelden een praktisch protocol en een analytische benadering om mitochondriale oxidatieve fosforylering en elektronenoverdrachtscapaciteit in verse tumorhomogenaten te evalueren. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om verschillende mitochondriale functies te onderzoeken die bijdragen aan het initiëren, progressie en behandelingsrespons van kanker.

Analytische bepaling van mitochondriale functie van weggesneden vaste tumorhomogenaten

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en snelle methode voor het meten van de mitochondriale functie van de tumor. Het protocol is breed toepasbaar op klinische translationele oncologie en zal helpen bij het verbeteren van de diagnostische en mechanistische interpretatie van de rol van mitochondriën bij het ontstaan en de progressie van kanker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de toepassing van weefselhomogenisatie om de voorbereiding te vereenvoudigen en de opbrengst van mitochondriën te maximaliseren, terwijl de beperkingen van diffusie worden verminderd.Deze techniek biedt potentiële toepassingen in klinische en diagnostische omgevingen met een kwantitatieve beoordeling van de mitochondriale functie van de tumor met behulp van vers gebiopteerd of weggesneden tumorweefsel. Begin met het plaatsen van een glazen homogenisator met één milliliter mitochondriaal ademhalingsmedium, of MiR05, in een nauwsluitende glazen stamper op nat ijs. Plaats het weefsel in een milliliter biopsieconserveringsoplossing, of BIOPS, in een ijskoude petrischaal.Snijd de tumor in kleine stukjes van ongeveer 5 tot 10 milligram elk en plaats de resterende tumorstukken terug in 10 milliliter BIOPS die op ijs worden gehouden. Nadat u de tissuesecties zorgvuldig op een filterpapier hebt gedept, plaatst u ze op een kleine plastic geteerde weegboot en registreert u het initiële natte gewicht. Plaats de ongebruikte stukken terug in de conische buis van 10 milliliter van BIOPS voor verdere conservering.Dompel de weefselsecties onder in een ijskoude homogenisator met MiR05 en noteer het resterende gewicht op de weegboot. Gebruik een glazen stamper met een spelingsbereik van 0,09 tot 0,16 millimeter en verstoor het tumorweefsel voorzichtig door vijf tot zeven neerwaartse en hogere slagen te voltooien. Draai voor elke slag de stamper drie keer met de klok mee / tegen de klok in terwijl u de stamper naar beneden duwt en drie keer extra terwijl u de stamper weer omhoog trekt.Laat het weefsel tussen de slagen door naar de bodem van de homogenisator zakken, maar vermijd het volledig boven het vloeistofvolume te brengen om schuimvorming te voorkomen. Giet het homogenaat in een conische buis van 15 milliliter en leg het op ijs. Pipetteer één tot drie milliliter verse MiR05 over de stamper en in de homogenisator om eventueel achtergebleven weefselhomogenaat te wassen.Giet de MiR05-was in de conische buis met het homogenaat. Herhaal deze stap twee tot drie keer om een volledige overdracht van het homogenaat te garanderen. Om de weefselhomogenaatconcentratie nauwkeurig te berekenen, inspecteert u de homogenisator en het homogenaat zorgvuldig op achtergebleven niet-gehomogeniseerd materiaal, waaronder bindweefsel.Om het niet-gehomogeniseerde materiaal uit de homogenisator te verwijderen dat niet met een pincet kan worden bereikt, na toevoeging van MiR05 aan de homogenisator, zuigt u het volume, inclusief het weefsel, op met een pipet en verplaatst u de inhoud naar een petrischaal. Verwijder het niet-gehomogeniseerde materiaal dat in grote stukken aan de onderkant van de conische buis is bezinkt van het homogenaat door ze met een pipet aan te zuigen en plaats ze op de dop van de conische buis. Verwijder het zakdoekje met een pincet uit de petrischaal of conische buisdop en dep het op filterpapier.Voeg het resterende homogenaat van de conische buisdop terug in de conische buis. Sluit de buis af en keer om om te mengen. Herlees de homogenisatoren en homogenaat voor elk extra niet-gehomogeniseerd materiaal en herhaal de stappen om niet-gehomogeniseerd materiaal indien nodig te verwijderen.Weeg en noteer de massa van het niet-gehomogeniseerde materiaal dat uit de homogenisator wordt teruggewonnen. Inspecteer het homogenaatpreparaat op elk grof intact weefsel dat wordt overgedragen en verwijder de niet-gehomogeniseerde stukken en weeg indien nodig. Trek het weefselgewicht dat is teruggewonnen van de weegboot, homogenisator en homogenaat af van het oorspronkelijke natte gewicht om het uiteindelijke monstergewicht te berekenen.Voeg met behulp van het uiteindelijke monstergewicht extra MiR05 toe om homogenaat in de gewenste concentratie te brengen. Zodra het homogenaat is gewogen en bereid, gaat u zo snel mogelijk over tot de test. Bewaar het monster op nat ijs totdat het op het instrument wordt overgebracht.Zodra het instrument is gekalibreerd en het monster is voorbereid, verwijdert u de stoppen met een draaiende beweging en zuigt u de MiR05 uit de kamers, waarbij u het membraan in de kamer vermijdt. Meng het homogenaat goed en voeg 2,25 milliliter homogenaat toe aan de kamer. Stel dat één homogenaat aan meerdere kamers wordt toegevoegd, pipetteer dan één milliliter van het homogenaat per keer in elke kamer terwijl het homogenaat wordt gemengd om een gelijke weefselverdeling te garanderen.Klik op F4 om het evenement een naam te geven en een tijdstempel te geven en klik vervolgens op OK. Vul een spuit van 50 milliliter met zuurstof uit een zuurstoftank met een regelaar en een gasslang met een stompe naald van 18 gauge. Injecteer de zuurstof rechtstreeks in de kamers om ze te hyperoxygeneren tot ongeveer 500 micromolaire zuurstof.Plaats de stoppers losjes en wacht met sluiten totdat de zuurstof ongeveer 480 micromolair bereikt. Sluit met een draaiende beweging langzaam de kamer en laat de ademhaling ongeveer 15 tot 20 minuten in evenwicht brengen. Vul indien nodig het centrale capillair van de stop met MiR05.Gebruik speciale microsyringes om substraten, ontkoppelaars en remmers in volledig gesloten kamers te injecteren om de gebeurtenissen voor elke kamer in realtime te benoemen en te timen. Selecteer F6 om de zuurstofconcentratie en zuurstofhelling negatieve schalen zo nodig aan te passen. Was de spuit na elke injectie driemaal in water voor in water oplosbare verbindingen en 70% ethanol voor opgeloste ethanolverbindingen.Voeg vijf microliter 0,8-molair malaat toe en ga onmiddellijk over tot de volgende injectie. Was de injectiespuit driemaal in water. Voeg onmiddellijk vijf microliter 1-molair pyruvaat toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert.Voeg na het wassen van de spuit 10 microliter van 0,5-molaire ADP toe en wacht tot de ADP-respons is gestabiliseerd. Was de spuit en voeg vijf microliter 2-molair glutamaat toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Was de spuit, voeg vervolgens vijf microliter 4-millimolair cytochroom-C toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert.Voeg na het wassen van de spuit 20 microliter 1-molair succinaat toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Titreer stappen van 0,5 tot 1 microliter van 1 millimolaire FCCP en wacht tot de ademhaling na elke injectie stabiliseert. Ga door totdat er geen extra toename van de ademhaling is.Was de injectiespuit driemaal in 70% ethanol. Voeg twee microliter 150 micromolair rotenon toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Voeg nog een microliter rotenon toe om ervoor te zorgen dat er geen verdere remming is.Als er een afname van de ademhaling is, ga dan door met extra injecties totdat er geen afname van de ademhaling is en was de injectiespuit vervolgens drie keer in 70% ethanol. Voeg twee microliter 125 micromolair antimycine A toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Voeg nog een microliter antimycine A toe om ervoor te zorgen dat er geen verdere remming is.Als er een afname van de ademhaling is, ga dan door met extra injecties totdat er geen afname van de ademhaling is. Was de spuit driemaal met 70% ethanol. Controleer de zuurstofconcentratie van de kamer.Als de concentratie lager is dan 125 micromolair, reoxygeneer dan naar kamerlucht of mild hyperoxygenaat om ervoor te zorgen dat zuurstof de ademhalingsflux niet beperkt. Voeg vijf microliter 0,8-molair ascorbaat toe. Was de spuit driemaal in 70% ethanol.Voeg onmiddellijk 10 microliter 0,2-molaire TMPD toe en wacht op een toename van de ademhaling. Voeg na het wassen van de spuit met ethanol onmiddellijk 25 microliter 4-molair natriumazide toe wanneer de ademhalingsflux van ascorbaat TMPD plateaus. Beëindig de door te klikken op Bestand, Opslaan en loskoppelen.Er werd waargenomen dat 40 milligram per milliliter weefselhomogenaat resulteerde in een snelle zuurstofuitputting. Het zuurstofverbruik vertraagde aanzienlijk met 30 en 20 milligram per milliliter weefselhomogenaat, maar nam nog steeds snel af in korte tijd bij afwezigheid van substraten of ADP. De concentratie van 10 milligram per milliliter weefselhomogenaat resulteerde in het optimale zuurstofverbruik.Een SUIT-protocol werd gebruikt om NADH- en succinaat-gekoppelde oxidatieve fosforylering en elektronenoverdracht te evalueren, evenals Complex IV-activiteit. Cytochroom C-afgifte werd beoordeeld in aanwezigheid van pyruvaat en malaat, of succinaat en rotenon, die beide aantoonden dat het homogenaatpreparaat de mitochondriën niet beschadigde. Het bleek ook dat NADH-gebonden oxidatieve fosforylering verwaarloosbaar was in EO771-tumoren.Titratie van FCCP om de maximale elektronenstroom te stimuleren, onthulde dat in EO771-tumoren fosforylering, in plaats van oxidatie, beperkt was tot ademhaling. De tumorhomogenaat ademhalingsprofielen waren vergelijkbaar met die van niet-geïmplanteerde, digitonine-gepermeabiliseerde EO771-cellen, met uitzondering van verminderde maximale elektronenoverdracht ondersteund door N- en S-gebonden substraten in de tumor. De respiratoire kinetiek van succinaat werd verder geëvalueerd door stapsgewijze titraties van subsaturerende ADP totdat de maximale snelheid was bereikt.De half-maximale concentratie van ADP in aanwezigheid van succinaat en rotenon was 37,5-micromolair, terwijl de maximale snelheid ongeveer 10,5 picomol per seconde per milligram was. Instrumenten die zijn opgezet in routinezorg, evenals weefselbehandeling, zijn van cruciaal belang voor het succes van deze experimenten. Na deze procedures kunnen andere massa- of markerspecifieke benaderingen voor tariefnormalisatie worden toegepast op basis van de kwestie van interesse.Veel voorkomende maatregelen omvatten totale eiwitkwantificering en enzymatische activiteit van citraatsynthase, maar variëren op basis van het modelsysteem, statistisch ontwerp en onderzoeksvraag.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Evaluatie van de rol van mitochondriale functie in moeheid in verband met kanker

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Driedimensionale bot extracellulaire Matrix Model voor Osteosarcoom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse van zijpopulatie in vaste tumorcellijnen

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

Een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van Mitocan Cytotoxicity

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellering van primaire bottumoren en botmetastase met implantatie van solide tumortransplantaten in bot

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3D-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...